CN117025834B - 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列及其应用。本发明基于转基因玉米VB15，获得其外源插入片段的旁侧序列，包括5'端旁侧序列和/或3'端旁侧序列；所述5'端旁侧序列为SEQ ID NO.1所示的序列或SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段；所述3'端旁侧序列为SEQ ID NO.2所示的序列或SEQ ID NO.2所示序列的特异性片段，基于所述旁侧序列能够对转基因玉米VB15及其相关材料进行特异性检测和鉴定，能更好的对转基因玉米进行监督管理。

Description

一种转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列及其应用。
背景技术
虫害（尤其是玉米螟害）会造成玉米的严重减产，抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔，从而使昆虫代谢紊乱而死亡。抗虫转基因玉米MON810和MON863已经进入商品化生产多年。在MON810转基因玉米中表达的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟，在MON863中表达的Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达集团也开发了表达Cry1Ab蛋白的转基因抗虫玉米BT11和BT176。先锋公司和陶氏化学公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。
截止目前，国产转基因植酸酶玉米BVLA430101、抗虫耐除草剂玉米DBN9936、瑞丰125和耐除草剂玉米DBN9858等已被认为符合安全标准，将外源插入片段转入玉米种构建转基因玉米品种是常用手段。随着转基因玉米的商业化应用将加快玉米产业升级。为今后转基因玉米的可持续利用，有必要研发更多的抗性优良转化体。外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此，有必要获得抗性优良转化玉米品种的旁侧序列，并建立鉴定体系，对抗虫转基因玉米品种进行有效监管。
发明内容
本发明的目的在于提供转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列，以实现对转基因玉米VB15进行有效监管。
为了实现上述目的，本发明提供了转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列包括5'端旁侧序列和/或3'端旁侧序列；
所述5'端旁侧序列为SEQ ID NO.1所示的序列或SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段；
所述3'端旁侧序列为SEQ ID NO.2所示的序列或SEQ ID NO.2所示序列的特异性片段；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的DNA片段，所述DNA片段包括DNA片段1和/或DNA片段2；
所述DNA片段1为SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段；
所述DNA片段2为SEQ ID NO.6所示的序列或SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段。
优选的，所述SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的序列；
所述SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段为SEQ ID NO.9所示的序列。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的引物，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.15中的任意一种所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16中的任意一种所示。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物。
本发明还提供了上述技术方案所述旁侧序列或DNA片段或引物或试剂盒在检测转基因玉米VB15和/或转基因玉米VB15相关材料中的应用。
优选的，所述转基因玉米VB15相关材料包括转基因玉米VB15的亲本和/或后代。
优选的，所述检测的对象包括植株、组织、种子、转基因玉米VB15制品和转基因玉米VB15相关材料的制品中的一种或多种。
本发明还提供了一种检测转基因玉米VB15或转基因玉米VB15相关材料的方法，包括如下步骤：提取待测材料的DNA，利用上述技术方案所述的引物对所述DNA进行扩增，若得到阳性扩增产物，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分。
本发明还提供了一种对昆虫具有抗性的玉米的种植方法，包括种植玉米种子；
所述玉米种子的基因组中包含上述技术方案所述的DNA片段；所述玉米种子为转基因玉米VB15。
有益效果：
本发明将改造的cry1Ab基因（专利申请号CN202010553538.0）和vip3基因（专利申请号CN202010554016.2）构建转化载体p3301UbiAbUbiVip3，通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米品种：玉米VB15，基于转基因玉米VB15获得其外源插入片段的旁侧序列，包括5'端旁侧序列和/或3'端旁侧序列；所述5'端旁侧序列为SEQ IDNO.1所示的序列或其特异性片段；所述3'端旁侧序列为SEQ ID NO.2所示的序列或其特异性片段，基于所述旁侧序列能够对转基因玉米VB15及其相关材料进行特异性检测和鉴定，能更好的对转基因玉米进行监督管理。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为转化载体p3301UbiAbUbiVip3的图谱示意图；
图2为实施例1步骤3中PCR检测结果；其中，A：cry1Ab基因；B：vip3基因；C：bar基因；M：DNA分子量marker；1：水；2：非转基因玉米综31；3：质粒p3301UbiAbUbiVip3；4~12，不同世代转基因玉米VB15；
图3为实施例2的抗虫实验结果图；
图4为转基因玉米VB15外源插入序列示意图；
图5为转基因玉米VB15转化体外源插入片段的5’旁侧序列特异性PCR结果图；
图6为转基因玉米VB15转化体外源插入片段的3’旁侧序列特异性PCR结果图；
图7为实施例4转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列的PCR结果图；
其中，图5~7中，M：DNA分子量marker；1：质粒p3301UbiAbUbiVip3；2：非转基因玉米综31；3：水；4~6：T2代转基因玉米VB15植株；7~9：T3代转基因玉米VB15植株；10~12：T4代VB15植株。
生物保藏信息
转基因玉米VB15，分类命名：玉米 Zea mays，于2023年07月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.27565。
具体实施方式
本发明提供了转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列包括5'端旁侧序列和/或3'端旁侧序列；
所述5'端旁侧序列为SEQ ID NO.1所示的序列或SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段；
所述3'端旁侧序列为SEQ ID NO.2所示的序列或SEQ ID NO.2所示序列的特异性片段；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27565。
在本发明中，所述SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段优选为SEQ ID NO.3所示的序列；所述SEQ ID NO.2所示序列的特异性片段优选为SEQ ID NO.4所示的序列。
本发明所述SEQ ID NO.1~4的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.1：5'-ggtaaccggatgattgggcggacgtggggctggtcttggaggcacatgatgctgatcacgaccagctggttcagtgccgacgacgggtagcagcccagcagagccgggtcagcgagcctgtagaacttcctcttgtcatgcaggaacggcctcgactgcaaaaatccaaacgatgaggcgctccgtgctgctgcctgtacgaacaggaaaggctctagctaacaacaaggcaaagctgcttacccatgtcaacagactctgctccggtttaggcctcgaggcgtcgtagatcctcctccccgtgatcagttccagcaacagcacgccgaaactgtatatgtcggatttcatggtgagcttgccgctcacgacgtagtcaggagcgcagtagccataggtgcccatgactctcgtggacacgtgagtcctgtctccaaccggcccgaccttcgcgagcccgaagtcggagagcctcgggctgaagtcctcgcccagcagaatgttggcggccttcatgtcgcggtagatcacaggcgggtcggctacgttgtgcaggtaggaaaccccttccgcgactcccacggctatcctcacgcgcgtgttccagtcgagtggtttcttgccgagaggcacgtctgttcattcaa-3'；
SEQ ID NO.2：5'-gtgccccgcggagtacctttcatccatctatcttagccattgttcgcagctcatcaacacatgtaacaaggatctactagtcaaaaaatgactcagttaagcctgaaaagaaaactgtgtgtgtgagagagaacggtttacgtaaacaaaatgtctcgtgctgcgagctcttagatcattgtatattctgctatacgcatcgagcaactcgcatgccacgcagcacatcaggcacgaggcgctgggccggagaggaagatcaggttaatccgtccaatgattcagaggtgaccgctgattaccaaagcctaaacacccttccaacttcggaatacgtgactacgtgagtcgtacagttggaagccagctagca-3'；
SEQ ID NO.3：5'-ggtcagcgagcctgtagaacttcctcttgtcatgcaggaacggcctcgactgcaaaaatccaaacgatgaggcgctccgtgctgctgcctgtacgaacaggaaaggctctagctaacaacaaggcaaagctgcttacccatgtcaacagactctgctccggtttaggcctcgaggcgtcgtagatcctcctccccgtgatcagttccagcaacagcacgccgaaactgtatatgtcggatttcatggtgagcttgccgctcacgacgtagtcaggagcgcagtagccataggtgcccatgactctcgtggacacgtgagtcctgtctccaaccggcccgaccttcgcgagcccgaagtcggagagcctcgggctgaagtcctcgcccagcagaatgttggcggccttcatgtcgcggtagatcacaggcgggtcggctacgttgtgcaggtaggaaaccccttccgcgactcccacggctatcctcacgcgcgtgttccagtcgagtggtttcttgccgagaggcacgtctgttcattcaa-3'；
SEQ ID NO.4：5'-gtgccccgcggagtacctttcatccatctatcttagccattgttcgcagctcatcaacacatgtaacaaggatctactagtcaaaaaatgactcagttaagcctgaaaagaaaactgtgtgtgtgagagagaacggtttacgtaaacaaaatgtctcgtgctgcgagctcttagatcattgtatattctgctatacgcatcgagca-3'；
本发明将改造的cry1Ab基因（专利申请号CN202010553538.0）和vip3基因（专利申请号CN202010554016.2）构建转化载体p3301UbiAbUbiVip3，通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个新的玉米品种：玉米VB15，今后有可能进入商业化种植。本发明基于转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列，能够对转基因玉米VB15及其相关材料进行特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的DNA片段，所述DNA片段包括DNA片段1和/或DNA片段2；
所述DNA片段1为SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段；
所述DNA片段2为SEQ ID NO.6所示的序列或SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
在本发明中，所述SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段优选为SEQ ID NO.7或SEQID NO.8所示的序列；所述SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段优选为SEQ ID NO.9所示的序列。
本发明所述SEQ ID NO.5~9的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.5：5'-ggtaaccggatgattgggcggacgtggggctggtcttggaggcacatgatgct gatcacgaccagctggttcagtgccgacgacgggtagcagcccagcagagccgggtcagcgagcctgtagaacttc ctcttgtcatgcaggaacggcctcgactgcaaaaatccaaacgatgaggcgctccgtgctgctgcctgtacgaaca ggaaaggctctagctaacaacaaggcaaagctgcttacccatgtcaacagactctgctccggtttaggcctcgagg cgtcgtagatcctcctccccgtgatcagttccagcaacagcacgccgaaactgtatatgtcggatttcatggtgag cttgccgctcacgacgtagtcaggagcgcagtagccataggtgcccatgactctcgtggacacgtgagtcctgtct ccaaccggcccgaccttcgcgagcccgaagtcggagagcctcgggctgaagtcctcgcccagcagaatgttggcgg ccttcatgtcgcggtagatcacaggcgggtcggctacgttgtgcaggtaggaaaccccttccgcgactcccacggc 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ID NO.5所示序列中下划线部分为SEQ ID NO.1所示的序列，即5'端旁侧序列，其余部分为外源插入序列，记为SEQ ID NO.10。
SEQ ID NO.6：5'-aggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagtcaaatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggtaccggcaggctgaagtccagctgccagaaacccacgtcatgccagttcccgtgcttgaagccggccgcccgcagcatgccgcggggggcatatccgagcgcctcgtgcatgcgcacgctcgggtcgttgggcagcccgatgacagcgaccacgctcttgaagccctgtgcctccagggacttcagcaggtgggtgtagagcgtggagcccagtcccgtccgctggtggcggggggagacgtacacggtcgactcggccgtccagtcgtaggcgttgcgtgccttccaggggcccgcgtaggcgatgccggcgacctcgccgtccacctcggcgacgagccagggatagcgctcccgcagacggacgaggtcgtccgtccactcctgcggttcctgcggctcggtacggaagttgaccgtgcttgtctcgatgtagtggttgacgatggtgcagaccgccggcatgtccgcctcggtggcacggcggatgtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagactcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacatgattacgaattggcatgcaagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggtcgactctagaggatccatggacaacaacccgaacatcaacgagtgcatcccgtacaactgcctgtccaacccggaggtggaggtgctgggcggcgagaggatcgagaccggctacaccccgatcgacatctccctgtccctgacccagttcctgctgtccgagttcgtgccgggcgccggcttcgtgctgggcctggtggacatcatctggggcatcttcggcccgtcccagtgggacgccttcctggtgcagatcgagcagctgatcaaccagaggatcgaggagttcgccaggaaccaggccatctccaggctggagggcctgtccaacctgtaccagatctacgccgagtccttcagggagtgggaggccgacccgaccaacccggccctgagggaggagatgcgcatccagttcaacgacatgaactccgccctgaccaccgccatcccgctgttcgccgtgcagaactaccaggtgccgctgctgtccgtgtacgtgcaggccgccaacctgcacctgtccgtgctgagggacgtgtccgtgttcggccagaggtggggcttcgacgccgccaccatcaactccaggtacaacgacctgaccaggctgatcggcaactacaccgaccacgccgtgaggtggtacaacaccggcctggagagggtgtggggcccggactccagggactggatcaggtacaaccagttcaggagggagctgaccctgaccgtgctggacatcgtgtccctgttcccgaactacgactccaggacctacccgatcaggaccgtgtcccagctgaccagggagatctacaccaacccggtgctggagaacttcgacggctccttcaggggctccgcccagggcatcgagggctccatcaggtccccgcacctgatggacatcctgaactccatcaccatctacaccgacgcccacaggggcgagtactactggtccggccaccagatcatggcctccccggtgggcttctccggcccggagttcaccttcccgctgtacggcaccatgggcaacgccgccccgcagcagaggatcgtggcccagctgggccagggcgtgtacaggaccctgtcctccaccctgtacaggaggccgttcaacatcggcatcaacaaccagcagctgtccgtgctggacggcaccgagttcgcctacggcacctcctccaacctgccgtccgccgtgtacaggaagtccggcaccgtggactccctggacgagatcccgccgcagaacaacaacgtgccgccgaggcagggcttctcccacaggctgtcccacgtgtccatgttcaggtccggcttctccaactcctccgtgtccatcatcagggccccgatgttctcctggatacacaggtccgccgagttcaacaacatcatcccgtcctcccagatcacccagatcccgctgaccaagtccaccaacctgggctccggcacctccgtggtgaagggcccgggcttcaccggcggcgacatcctgaggaggacctccccgggccagatctccaccctgagggtgaacatcaccgccccgctgtcccagaggtacagggtgaggatcaggtacgcctccaccaccaacctgcagttccacacctccatcgacggcaggccgatcaaccagggcaacttctccgccaccatgtcctccggctccaacctgcagtccggctccttcaggaccgtgggcttcaccaccccgttcaacttctccaacggctcctccgtgttcaccctgtccgcccacgtgttcaactccggcaacgaggtgtacatcgacaggatcgagttcgtgccggccgaggtgaccttcgaggccgagtacgacctggagagggcccagaaggccgtgaacgagctgttcacctcctccaaccagatcggcctgaagaccgacgtgaccgactaccacatcgaccaggtgtccaacctggtggagtgcctgtccgacgagtgaggtaccgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcaagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggtcgactctagaggatccatgaacaagaacaacaccaagctcagcacccgcgccctcccgagcttcatcgactacttcaacggcatctacggcttcgccaccggcatcaaggacatcatgaacatgatcttcaagaccgacaccggcggcgacctcaccctcgacgagatcctcaagaaccagcagctcctcaacgacatcagcggcaagctcgacggcgtgaacggcagcctcaacgacctcatcgcccagggcaacctcaacaccgagctcagcaaggagatcctcaagatcgccaacgagcagaaccaggtgctcaacgacgtgaacaacaagctcgacgccatcaacaccatgctccgcgtgtacctcccgaagatcaccagcatgctcagcgacgtgatgaagcagaactacgccctcagcctccagatcgagtacctcagcaagcagctccaggagatcagcgacaagctcgacatcatcaacgtgaacgtgctcatcaacagcaccctcaccgagatcaccccggcctaccagcgcatcaagtacgtgaacgagaagttcgaggagctcaccttcgccaccgagaccagcagcaaggtgaagaaggacggcagcccggccgacatcctcgacgagctcaccgagctcaccgagctcgccaagagcgtgaccaagaacgacgtggacggcttcgagttctacctcaacaccttccacgacgtgatggtgggcaacaacctcttcggccgcagcgccctcaagaccgccagcgagctcatcaccaaggagaacgtgaagaccagcggcagcgaggtgggcaacgtgtacaacttcctcatcgtgctcaccgccctccaggcccaggccttcctcaccctcaccacctgccgcaagctcctcggcctcgccgacatcgactacaccagcatcatgaacgagcacctcaacaaggagaaggaggagttccgcgtgaacatcctcccgaccctcagcaacaccttcagcaacccgaactacgccaaggtgaagggcagcgacgaggacgccaagatgatcgtggaggccaagccgggccacgccctcatcggcttcgagatcagcaacgacagcatcaccgtgctcaaggtgtacgaggccaagctcaagcagaactaccaggtggacaaggacagcctcagcgaggtgatctacggcgacatggacaagctcctctgcccggaccagagcgagcagatctactacaccaacaacatcgtgttcccgaacgagtacgtgatcaccaagatcgacttcaccaagaagatgaagaccctccgctacgaggtgactgccaacttctacgacagcagcaccggcgagatcgacctcaacaagaagaaggtggagagcagcgaggccgagtaccgcaccctcagcgccaacgacgacggcgtgtacatgccgctcggcgtgatcagcgagaccttcctcaccccgatcaacggcttcggcctccaggccgacgagaacagccgcctcatcaccctcacctgcaagagctacctccgcgagctcctcctcgccaccgacctcagcaacaaggagaccaagctcatcgtgccgccgagcggcttcatcagcaacatcgtggagaacggcagcatcgaggaggacaacctcgagccgtggaaggccaacaacaagaacgcctacgtggaccacaccggcggcgtgaacggcaccaaggccctctacgtgcacaaggacggcggcatcagccagttcatcggcgacaagctcaagccgaagaccgagtacgtgatccagtacaccgtgaagggcaagccgagcatccacctcaaggacgagaacaccggctacatccactacgaggacaccaacaacaacctcgaggactaccagaccatcaacaagcgcttcaccaccggcaccgacctcaagggcgtgtacctcatcctcaagagccagaacggcgacgaggcctggggcgacaacttcatcatcctcgagatcagcccgagcgagaagctcctcagcccggagctcatcaacaccaacaactggaccagcaccggcagcaccaacatcagcggcaacaccctcaccctctaccagggcggccgcggcatcctcaagcagaacctccagctcgacagcttcagcacctaccgcgtgtacttcagcgtgagcggcgacgccaacgtgcgcatccgcaacagccgcgaggtgctcttcgagaagcgctacatgagcggcgccaaggacgtgagcgagatgttcaccaccaagttcgagaaggacaacttctacatcgagctcagccagggcaacaacctctacggcggcccgatcgtgcacttctacgacgtgagcatcaagtgagagctcgagctcggtgaccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgttttcaccgtgccccgcggagtacctttcatccatctatcttagccattgttcgcagctcatc aacacatgtaacaaggatctactagtcaaaaaatgactcagttaagcctgaaaagaaaactgtgtgtgtgagagag aacggtttacgtaaacaaaatgtctcgtgctgcgagctcttagatcattgtatattctgctatacgcatcgagcaa ctcgcatgccacgcagcacatcaggcacgaggcgctgggccggagaggaagatcaggttaatccgtccaatgattc agaggtgaccgctgattaccaaagcctaaacacccttccaacttcggaatacgtgactacgtgagtcgtacagttg gaagccagctagca-3'；SEQ ID NO.6所示序列中下划线部分为SEQ ID NO.2所示的序列，即3'端旁侧序列，其余部分为SEQ ID NO.10所示的外源插入序列。
SEQ ID NO.7：5'-ggtcagcgagcctgtagaacttcctcttgtcatgcaggaacggcctcgactgc aaaaatccaaacgatgaggcgctccgtgctgctgcctgtacgaacaggaaaggctctagctaacaacaaggcaaag ctgcttacccatgtcaacagactctgctccggtttaggcctcgaggcgtcgtagatcctcctccccgtgatcagtt ccagcaacagcacgccgaaactgtatatgtcggatttcatggtgagcttgccgctcacgacgtagtcaggagcgca gtagccataggtgcccatgactctcgtggacacgtgagtcctgtctccaaccggcccgaccttcgcgagcccgaag tcggagagcctcgggctgaagtcctcgcccagcagaatgttggcggccttcatgtcgcggtagatcacaggcgggt cggctacgttgtgcaggtaggaaaccccttccgcgactcccacggctatcctcacgcgcgtgttccagtcgagtgg tttcttgccgagaggcacgtctgttcattcaaaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaa-3'；其中，下划线部分为SEQ ID NO.3所示的序列的特异性片段，其余部分为SEQ ID NO.10所示序列的特异性片段；
SEQ ID NO.8：5'-tcctcgcccagcagaatgttggcggccttcatgtcgcggtagatcacaggcgg gtcggctacgttgtgcaggtaggaaaccccttccgcgactcccacggctatcctcacgcgcgtgttccagtcgagt ggtttcttgccgagaggcacgtctgttcattcaaaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcga-3'；其中，下划线部分为SEQ ID NO.3所示的序列的特异性片段，其余部分为SEQ ID NO.10所示序列的特异性片段；
SEQ ID NO.9：5'-tgcacttctacgacgtgagcatcaagtgagagctcgagctcggtgaccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgttttcaccgtgccccgcggagt acctttcatccatctatcttagccattgttcgcagctcatcaacacatgtaacaaggatctactagtcaaaaaatg actcagttaagcctgaaaagaaaactgtgtgtgtgagagagaacggtttacgtaaacaaaatgtctcgtgctgcga gctcttagatcattgtatattctgctatacgcatcgagca-3'；其中，下划线部分为SEQ ID NO.4所示的序列，即为3'端旁侧序列的特异性片段，其余部分为SEQ ID NO.10所示序列的特异性片段。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的引物，所述引物优选包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.15中的任意一种所示；所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16中的任意一种所示；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
本发明SEQ ID NO.11~16所示的序列信息具体如下：
SEQ ID NO.11：5'-GGTCAGCGAGCCTGTAGAAC-3'；
SEQ ID NO.12：5'-TGCACTTCTACGACGTGAGC-3'；
SEQ ID NO.13：5'-TTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCA-3'；
SEQ ID NO.14：5'-TGCTCGATGCGTATAGCAGA-3'；
SEQ ID NO.15：5'-TCCTCGCCCAGCAGAATGTT-3'；
SEQ ID NO.16：5'-TCGCTCATGTGTTGAGCATA-3'。
本发明利用SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.13所示的下游引物能够特异性扩增SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；利用SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ IDNO.16所示的下游引物能够特异性扩增SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；利用SEQ ID NO.12所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物能够特异性扩增SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；上述引物组合均可用于检测转基因玉米VB15。
本发明还提供了用于检测转基因玉米VB15的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物。
本发明还提供了上述技术方案所述DNA片段或引物或试剂盒在检测转基因玉米VB15和/或转基因玉米VB15相关材料中的应用。
在本发明中，所述转基因玉米VB15相关材料优选包括转基因玉米VB15的亲本和/或后代；所述后代优选包括杂种F1代；所述检测的对象优选包括植株、组织、种子、转基因玉米VB15制品和转基因玉米VB15相关材料的制品中的一种或多种。
由于特定的转基因事件（即抗性玉米）其外源插入片段的旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件，用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带等。本发明基于转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列和/或DNA片段，在5'旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3'旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段，能够实现转基因玉米VB15及其相关材料的检测。
本发明还提供了一种检测转基因玉米VB15或转基因玉米VB15相关材料的方法，包括如下步骤：提取待测材料的DNA，利用上述技术方案所述的引物对所述DNA进行扩增，若得到阳性扩增产物，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分。
本发明优选利用SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.13所示的下游引物对所述待测材料的DNA进行PCR扩增，若扩增产物条带大小为681bp，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分。本发明对所述PCR扩增的体系和条件均没有严格要求，常规操作即可。
本发明优选利用SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物对所述待测材料的DNA进行PCR扩增，若扩增产物条带大小为376bp，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分。本发明对所述PCR扩增的体系和条件均没有严格要求，常规操作即可。
本发明优选利用SEQ ID NO.12所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物对所述待测材料的DNA进行PCR扩增，若扩增产物条带大小为549bp，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分。本发明对所述PCR扩增的体系和条件均没有严格要求，常规操作即可。
本发明提供的外源插入片段的旁侧序列，DNA片段以及用于检测该DNA片段的PCR引物、方法等可对是否成功获得转基因玉米VB15进行有效判断，为监管转基因玉米VB15及其后代等提供了有力的保障。
本发明还提供了一种对昆虫具有抗性的玉米的种植方法，包括种植玉米种子；所述玉米种子的基因组中包含上述技术方案所述的DNA片段。
在本发明中，本发明所述昆虫优选包括鳞翅目昆虫，进一步优选为草地贪夜蛾和/或玉米螟；所述玉米种子优选包括转基因玉米VB15。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
转基因玉米VB15的获得
1、转化载体p3301UbiAbUbiVip3的构建
将载体pCambia3301（购买自北京博迈德公司）上的gus基因换成vip3基因（专利申请号202010554016.2），35S启动子换成玉米Ubiquitin启动子，构建植物表达载体p3301UbiVip3；同时，将玉米Ubiquitin启动子-Cry1Ab-NOS终止子表达框构建到载体p3301UbiVip3上，从而构建植物表达载体p3301UbiAbUbiVip3。在T-DNA区结构为35SpolyA终止子-bar基因-35S启动子-ubiquitin启动子-cry1Ab基因-NOS终止子-ubiquitin启动子-vip3基因-NOS终止子，大小约为10.2kb。载体图谱如图1所示。
2、农杆菌转化玉米幼胚获得转基因植株
将步骤1得到的载体p3301UbiAbUbiVip3通过冻融法转化到农杆菌LBA4404中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米综31幼胚为材料，将幼胚放到侵染液中一个小时后，用侵染液洗一次，再浸入添加100μM乙酰丁香酮的侵染液的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，放至含1.5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石（1：3）的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得种子，将其命名为玉米VB15。
3、转基因植株的PCR鉴定
3.1植物总DNA的提取，采用CTAB法分别快速提取转基因玉米VB15和非转基因玉米综31的叶片总DNA，具体步骤如下：
（1）取30~50ml离心管，加入7.5ml CTAB提取缓冲液（100mM Tris，1.4M NaCl，20mMEDTA，2%CTAB，0.1%巯基乙醇和余量的蒸馏水），在60℃恒温水浴中预热30min；
（2）取适量玉米叶片置于2ml离心管中，在液氮速冻下利用2000GENO/GRINDER组织磨碎仪将叶片磨成粉末状；
（3）打开离心管，加入700μl CTAB提取缓冲液（100mM Tris，1.4M NaCl。20mMEDTA，2%CTAB，0.1%巯基乙醇和余量的蒸馏水），60℃水浴中保温30min，其间轻摇几次；
（4）取出离心管，每管中加入1ml饱和酚，摇动均匀后再加700μl氯仿/异戊醇（氯仿和异戊醇体积比为24：1）轻微而彻底地混合，放置10min以上，待蛋白质变性后，室温下以12000r/min离心10min，收集上清液；
（5）将上清液转移到新的离心管中，加三分之二体积的异丙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状，12000r/min离心5min，弃上清。
（6）在沉淀中加入1ml 70%乙醇，用手指轻弹几下，放置20min以上；
（7）12000r/min离心2min，弃上清；
（8）在超净台上吹干沉淀，溶于适量无菌水（100~200μl）中。
（9）将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。
3.2鉴定引物设计
根据Cry1Ab基因（专利申请号CN202010553538.0）序列信息，设计扩增引物如下：上游引物5’-GATCTACGCCGAGTCCTTCA-3’(SEQ ID No.17)；下游引物5’-ATGTTGAACGGCCTCCTGTA-3’(SEQ ID No.18)；扩增片段长度为795bp。
根据vip3基因（专利申请号CN202010554016.2）序列信息，设计扩增引物如下：上游引物5’-ATCCTCAAGAACCAGCAGCT-3’(SEQ ID No.19)；下游引物5’-AAGTTGTACACGTTGCCCAC-3’(SEQ ID No.20)，扩增片段长度为671bp。
根据bar基因序列信息，设计扩增引物如下：上游引物5’-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3’(SEQ ID No.21)；下游引物5’-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3’(SEQ ID No.22)，扩增片段长度为370bp。
3.3 PCR扩增体系及反应程序
PCR反应体系：ddH2O 13.4μl、10×PCR缓冲液2μl、dNTP(10mM)0.4μl、上游引物(10μM)0.4μl、下游引物(10μM)0.4μl、DMSO 2μl、Taq酶(5U/μl)0.4μl、玉米总DNA 1μl，总计20μl；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；25℃保温。
利用上述体系及程序进行PCR反应，获得转基因阳性植株，结果如图2所示；其中，A：cry1Ab基因；B：vip3基因；C：bar基因；M：DNA分子量marker；1：水；2：非转基因玉米综31；3：质粒p3301UbiAbUbiVip3；4-12，不同世代转基因玉米VB15。
根据图2可以看出，cry1Ab、vip3和bar基因整合到转基因玉米VB15基因组中。
实施例2
转基因玉米VB15的抗虫性鉴定
种植在温室田间的转基因玉米VB15 T3代长至拔节期时，取样玉米叶片放入培养皿中，每皿接2头初孵草地贪夜蛾幼虫。试验在相对湿度为70%~80%、温度为26~28℃、光照周期为16h:8h(L:D)的培养室里进行，每24h统计昆虫的死亡率，根据组织被取食消耗情况添加或更换相同来源的新组织，试验在相同条件下重复三次，另设一组采用非转基因玉米综31作为对照进行平行试验，结果如表1和图3所示。
表1 转基因玉米对草地贪夜蛾抗性鉴定
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
根据表1和图3可以看出，非转基因玉米综31叶片高感草地贪夜蛾，转基因玉米VB15高抗草地贪夜蛾，说明本发明提供的转基因玉米VB15属于抗虫品种，并于2023年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心（CGMCC），保藏编号CGMCC No.27565。
实施例3
转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列的获得及应用
通过PacBio三代测序技术对转基因玉米VB15基因组DNA进行测序，获得外源插入序列（SEQ ID No.10）、5’旁侧序列（SEQ ID No.1）和3’旁侧序列（SEQ ID No.2），具体序列示意图见图4。
1）5’旁侧序列特异性PCR鉴定
利用转基因玉米VB15外源插入片段的5’端旁侧序列及外源片段中的bar基因序列，针对两个不同的插入位点分别设计一对引物，建立VB15事件5’端旁侧序列的PCR鉴定方法，其中，一个外源片段中整合位点5’端玉米基因组设计的上游引物如SEQ ID No.11所示；依据bar基因序列设计的下游引物如SEQ ID No.13所示；
按照实施例1步骤3.1的方式提取玉米基因组DNA，以提取的玉米基因组DNA为模板，利用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增；
PCR反应体系：ddH2O 13.4μl、10×PCR缓冲液2μl、dNTP(10mM)0.4μl、上游引物(10μM)0.4μl、下游引物(10μM)0.4μl、DMSO 2μl、Taq酶(5U/μl)0.4μl、玉米总DNA 1μl，总计20μl；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示；其中M：DNA分子量marker；1：质粒p3301UbiAbUbiVip3；2：非转基因玉米综31；3：水；4~6：T2代转基因玉米VB15植株；7~9：T3代转基因玉米VB15植株；10~12：T4代VB15植株。
根据图5可以看出，利用本发明提供的上下游引物进行PCR扩增时，水、非转基因玉米综31或质粒p3301UbiAbUbiVip3均无扩增条带，只有转基因玉米VB15的DNA扩增序列有特异性681bp目的条带，具体序列如SEQ ID No.7所示。基于这一结果进行3次重复试验，所反映的结果一致。
2）3’旁侧序列特异性PCR鉴定
利用转基因玉米VB15外源插入片段的3’端旁侧序列及外源片段中的vip3基因序列分别设计一对引物，建立VB15事件3’端旁侧序列的PCR鉴定方法，其中，依据vip3基因序列设计的上游引物如SEQ ID No.15所示，一个外源片段中整合位点3’端玉米基因组设计的下游引物如SEQ ID No.16所示。
按照实施例1步骤3.1的方式提取玉米基因组DNA，以提取的玉米基因组DNA为模板，利用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增；
PCR反应体系：ddH2O 13.4μl、10×PCR缓冲液2μl、dNTP(10mM)0.4μl、上游引物(10μM)0.4μl、下游引物(10μM)0.4μl、DMSO 2μl、Taq酶(5U/μl)0.4μl、玉米总DNA 1μl，总计20μl；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示；其中M：DNA分子量marker；1：质粒p3301UbiAbUbiVip3；2：非转基因玉米综31；3：水；4~6：T2代转基因玉米VB15植株；7~9：T3代转基因玉米VB15植株；10~12：T4代VB15植株。
根据图6可以看出，利用本发明提供的上下游引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株或质粒p3301UbiAbUbiVip3均无扩增条带，只有转基因玉米VB15的DNA扩增序列有特异性549bp目的条带，具体序列如SEQ ID No.9所示。基于这一结果进行3次重复试验，所反映的结果一致。
实施例4
转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧序列的应用拓展
利用转基因玉米VB15外源插入片段的5’端旁侧序列及外源片段中的bar基因序列，随机设计一对引物，同样可以对VB15事件5’端旁侧序列进行PCR鉴定，其中，一个外源片段中整合位点5’端玉米基因组设计的上游引物如SEQ ID No.12所示；依据bar基因序列设计的下游引物如SEQ ID No.14所示；
按照实施例1步骤3.1的方式提取玉米基因组DNA，以提取的转基因玉米VB15和非转基因玉米综31的基因组DNA为模板，利用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增；
PCR反应体系：ddH2O 13.4μl、10×PCR缓冲液2μl、dNTP(10mM)0.4μl、上游引物(10μM)0.4μl、下游引物(10μM)0.4μl、DMSO 2μl、Taq酶(5U/μl)0.4μl、玉米总DNA 1μl，总计20μl；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示；其中M：DNA分子量marker；1：质粒p3301UbiAbUbiVip3；2：非转基因玉米综31；3：水；4~6：T2代转基因玉米VB15植株；7~9：T3代转基因玉米VB15植株；10~12：T4代VB15植株。
根据图7可以看出，利用本发明提供的上下游引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株或质粒p3301UbiAbUbiVip3均无扩增条带，只有转基因玉米VB15的DNA扩增序列有特异性376 bp目的条带，具体序列如SEQ ID No.8所示。基于这一结果进行3次重复试验，所反映的结果一致。
根据上述内容可以看出，本发明提供的技术方案能够对转基因玉米VB15及其相关材料进行特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.转基因玉米VB15外源插入片段的旁侧核酸分子，其特征在于，所述旁侧核酸分子包括5'端旁侧核酸分子和3'端旁侧核酸分子；
所述5'端旁侧核酸分子为SEQ ID NO.1所示的序列或SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段；
所述3'端旁侧核酸分子为SEQ ID NO.2所示的序列或SEQ ID NO.2所示序列的特异性片段；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
2.用于检测转基因玉米VB15或转基因玉米VB15相关材料的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括DNA片段1和DNA片段2；
所述DNA片段1为SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段；
所述DNA片段2为SEQ ID NO.6所示的序列或SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565；
所述SEQ ID NO.5所示序列的特异性片段为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的序列；
所述SEQ ID NO.6所示序列的特异性片段为SEQ ID NO.9所示的序列。
3.用于检测权利要求2所述DNA片段的引物，其特征在于，所述引物包括第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对为引物对1或引物对2；所述引物对1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的下游引物；所述引物对2包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物；
所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO.14所示的下游引物。
4.用于检测转基因玉米VB15的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的引物；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
5.权利要求1所述的旁侧核酸分子或权利要求2所述的DNA片段或权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒在检测转基因玉米VB15和/或转基因玉米VB15相关材料中的应用；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转基因玉米VB15相关材料包括转基因玉米VB15的亲本和/或后代。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测的对象包括植株、组织、种子、转基因玉米VB15制品和转基因玉米VB15相关材料的制品中的一种或多种。
8.一种检测转基因玉米VB15或转基因玉米VB15相关材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测材料的DNA，利用权利要求3所述的引物对所述DNA进行扩增，若得到阳性扩增产物，则所述待测材料含有转基因玉米VB15的成分；
所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
9.一种对昆虫具有抗性的玉米的种植方法，其特征在于，包括种植玉米种子；
所述玉米种子的基因组中包含权利要求2所述的DNA片段；
所述玉米种子为转基因玉米VB15的种子；所述转基因玉米VB15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27565。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788549A (zh) * 2014-01-16 2015-07-22 中国科学院微生物研究所 水稻抗病性相关蛋白rir1及其编码基因和应用
CN111647608A (zh) * 2020-06-17 2020-09-11 中国农业科学院作物科学研究所 抗虫基因VIP3m及其应用
CN113151258A (zh) * 2021-04-14 2021-07-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种抗虫转基因玉米am63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788549A (zh) * 2014-01-16 2015-07-22 中国科学院微生物研究所 水稻抗病性相关蛋白rir1及其编码基因和应用
CN111647608A (zh) * 2020-06-17 2020-09-11 中国农业科学院作物科学研究所 抗虫基因VIP3m及其应用
CN113151258A (zh) * 2021-04-14 2021-07-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种抗虫转基因玉米am63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析;刘明等;《东北农业大学学报》;第48卷(第9期);第36-42页 *
Transgenic cotton co-expressing chimeric Vip3AcAa and Cry1Ac confers effective protection against Cry1Ac-resistant cotton bollworm;Wen-bo Chen等;《Transgenic Res》;第26卷;第763-774页 *

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