CN104788549A - 水稻抗病性相关蛋白rir1及其编码基因和应用 - Google Patents

水稻抗病性相关蛋白rir1及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻抗病性相关蛋白RIR1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中所述RIR1基因的表达，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。本发明对于抗病植物的育种，特别是抗白叶枯病菌植物的育种具有重大的应用价值。

Description

水稻抗病性相关蛋白RIR1及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种水稻抗病性相关蛋白RIR1及其编码基因和应用。
背景技术
水稻作为重要的粮食作物之一，为世界上一半以上的人口提供食物来源。水稻病害的种类很多，其中稻瘟病、纹枯病和白叶枯病发生面积大、流行性强、危害严重，是水稻的“三大重要病害”。不断提高水稻产量、品质及抗病性，对保障国家粮食安全和农业可持续发展有重要意义。
在真核生物中广泛存在的非编码小RNA（nonconding small RNAs）包括miRNAs(microRNAs)和siRNA(short interfering RNAs)，可以通过对靶标RNA的剪切或翻译抑制，以及DNA或染色体的甲基化等调控靶标基因的表达。miRNA由非编码核基因转录而来，越来越多的研究表明，非编码小RNA广泛参与生物的生长发育和抗病应答过程。小RNA介导的基因沉默是植物和动物抵抗病毒侵染的重要分子机制，最新的研究发现小RNA也参与植物抗细菌的基础免疫反应。因此，小RNA为开发新的水稻抗病途径提供良好的基因资源。
对水稻小RNA抗病基因资源的挖掘不但在植物抗病机理的研究上可能有新的重大发现，同时分析小RNA靶向的水稻抗病/植物免疫途径中的新靶标，可为水稻抗病育种提供拥有自主知识产权基因资源，建立水稻抗病育种的新策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗病性相关蛋白RIR1及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来自水稻品种日本晴，命名为RIR1蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述RIR1蛋白的基因（RIR1基因）也属于本发明的保护范围。所述RIR1基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：（1）编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；（2）序列表的序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中所述RIR1基因的表达，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。所述方法中，可通过干扰RNA（siRNA）实现“抑制目的植物中所述RIR1基因的表达”。所述方法中，可通过导入干扰载体实现“抑制目的植物中所述RIR1基因的表达”。所述干扰RNA具体可为序列表的序列7所示的双链RNA、序列表的序列8所示的双链RNA或序列表的序列9所示的双链RNA。所述干扰载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子、序列表的序列5所示的双链DNA分子或序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。所述表达载体具体可为PCAMBIA1300-HAN载体。所述多克隆位点具体可为EcoRI和XbaI酶切位点。所述干扰载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物。所述抗病性可体现为对白叶枯病菌的抗性，具体可为对PXO99菌株的抗病性。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如水稻品种日本晴。
本发明还保护一种干扰RNA（siRNA），为序列表的序列7所示的双链RNA、序列表的序列8所示的双链RNA或序列表的序列9所示的双链RNA。
本发明还保护一种干扰载体，为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子、序列表的序列5所示的双链DNA分子或序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。所述表达载体具体可为PCAMBIA1300-HAN载体。所述多克隆位点具体可为EcoRI和XbaI酶切位点。
本发明还保护所述干扰RNA或所述干扰载体在培育抗病性增高的转基因植物中的应用。所述抗病性可体现为对白叶枯病菌的抗性，具体可为对PXO99菌株的抗病性。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如水稻品种日本晴。
本发明对于抗病植物的育种，特别是抗白叶枯病菌植物的育种具有重大的应用价值。
附图说明
图1为干扰载体的部分元件示意图；35S：CaMV35S组成型启动子；Intron：内含子；OCS：终止子；FS：RNAi设计片段的正向序列；RS：RNAi设计片段的反向序列。
图2为实施例2中的部分杂交结果。
图3为实施例2中，HAN-A1A2RNAi干扰株系、HAN-B1B2RNAi干扰株系、HAN-C1C2RNAi干扰株系的T1代植株中RIR1基因的相对表达量结果。
图4为实施例2中的抗病性检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pCAMBIA1300-HAN载体(又称pCAMBIA1300-HAN质粒)参见文献：Lisheng Chen,Guosheng Xiong,Xia Cui,Meixian Yan,Ting Xu,Qian Qian,Yongbiao Xue,JiayangLi and Yonghong Wang.OsGRAS19 May Be a Novel Component Involved in theBrassinosteroid Signaling Pathway in Rice.Molecular Plant 2013,6(3),988–991.。
水稻白叶枯病菌PXO99菌株，英文全称为Xanthomonas oryzae pv.Oryzae(XooPXO99)，参考文献：DAVID O.PAMELA C.RONALD，ADAM J.BOGDANOVE；Xanthomonas oryzae pathovars:model pathogens of a model crop；MOLECULAR PLANTPATHOLOGY 2006，7(5),303–324。
水稻品种日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)：中国水稻杂交育种中心(中国，长沙)。
实施例中所用到的引物的核苷酸序列见表2。
表2 实施例中所用到的引物的核苷酸序列
引物名称 引物序列 酶切位点
A1-F 5’-gggaattcATGGGGGTTTCTCCATGGAT-3’ EcoRI
A1-R 5’-ggggtaccTGTCCTGTGCGTTCGTATC-3’ KpnI
A2-F 5’-gctctagaATGGGGGTTTCTCCATGGAT-3’ XbaI
A2-R 5’-cgggatccTGTCCTGTGCGTTCGTATC-3’ BamHI
B1-F 5’-gggaattcGGAAATCCATATTGCAACC-3’ EcoRI
B1-R 5’-ggggtaccCCATTAGCAAAGGAGTAGGT-3’ KpnI
B2-F 5’-gctctagaGGAAATCCATATTGCAACC-3’ XbaI
B2-R 5’-cgggatccCCATTAGCAAAGGAGTAGGT-3’ BamHI
C1-F 5’-gggaattcGTACCTGGACCCGGAGTACTAC-3’ EcoRI
C1-R 5’-ggggtaccTCACTTGGGCTCCACCCTCA-3’ KpnI
C2-F 5’-gctctagaGTACCTGGACCCGGAGTACTAC-3’ XbaI
C2-R 5’-cgggatccTCACTTGGGCTCCACCCTCA-3’ BamHI
基于序列扩增、比对、分析与功能验证，从水稻中发现了一个新蛋白，命名为RIR1蛋白，如序列表的序列1所示。将编码RIR1蛋白的基因命名为RIR1基因，RIR1基因如序列表的序列2所示（基因组），其开放阅读框如序列表的序列3所示（cDNA）。
实施例1、干扰载体的构建
一、干扰载体甲的构建
1、提取水稻品种日本晴的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用A1-F和A1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切PCAMBIA1300-HAN载体，回收约12000bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、以步骤1得到的cDNA为模板，采用A2-F和A2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收酶切产物。
8、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤5得到的重组质粒，回收约12100bp的载体骨架。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到干扰载体甲。根据测序结果，对干扰载体甲进行结构描述如下：将PCAMBIA1300-HAN载体EcoRI和XbaI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列4所示的双链DNA分子。干扰载体甲表达序列表的序列7所示的双链RNA分子。
二、干扰载体乙的构建
1、提取水稻品种日本晴的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用B1-F和B1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切PCAMBIA1300-HAN载体，回收约12000bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、以步骤1得到的cDNA为模板，采用B2-F和B2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收酶切产物。
8、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤5得到的重组质粒，回收约12500bp的载体骨架。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到干扰载体乙。根据测序结果，对干扰载体乙进行结构描述如下：将PCAMBIA1300-HAN载体EcoRI和XbaI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列5所示的双链DNA分子。干扰载体乙表达序列表的序列8所示的双链RNA分子。
三、干扰载体丙的构建
1、提取水稻品种日本晴的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用C1-F和C1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切PCAMBIA1300-HAN载体，回收约12000bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、以步骤1得到的cDNA为模板，采用C2-F和C2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收酶切产物。
8、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤5得到的重组质粒，回收约12500bp的载体骨架。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到干扰载体丙。根据测序结果，对干扰载体丙进行结构描述如下：将PCAMBIA1300-HAN载体EcoRI和XbaI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列6所示的双链DNA分子。干扰载体丙表达序列表的序列9所示的双链RNA分子。
实施例2、应用干扰载体沉默出发水稻中的RIR1基因
一、沉默株的获得
1、将实施例1构建的干扰载体（干扰载体甲、干扰载体乙或干扰载体丙）导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌侵染水稻品种日本晴的胚性愈伤组织，然后依次进行潮霉素抗性筛选、分化和生根，得到再生植株（T0代）。
提取T0代再生植株的总RNA，进行变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用RNA探针进行杂交(通过杂交带所对应的分子量可以区分siRNA或RIR1基因编码的RNA)。如果采用序列表的序列7所示的单链RNA作为探针进行杂交时显示存在杂交阳性的siRNA，该T0代植株为HAN-A1A2 RNAi干扰植株。如果采用序列表的序列8所示的单链RNA作为探针进行杂交时显示存在杂交阳性的siRNA，该T0代植株为HAN-B1B2 RNAi干扰植株。如果采用序列表的序列9所示的单链RNA作为探针进行杂交时显示存在杂交阳性的siRNA，该T0代植株为HAN-C1C2 RNAi干扰植株。
部分杂交结果见图2。图2中，CK代表水稻品种日本晴（阴性对照），泳道1至3代表导入干扰载体甲得到的T0代再生植株（采用序列7所示单链RNA作为探针进行杂交时均显示存在杂交阳性的siRNA），泳道4至5代表导入干扰载体乙得到的T0代再生植株（采用序列8所示单链RNA作为探针进行杂交时均显示存在杂交阳性的siRNA），泳道6至9代表导入干扰载体丙得到的T0代再生植株（采用序列9所示单链RNA作为探针进行杂交时只有泳道8显示存在杂交阳性的siRNA）。
3、T0代植株（HAN-A1A2 RNAi干扰植株、HAN-B1B2 RNAi干扰植株或HAN-C1C2 RNAi干扰植株）自交获得T1代种子，T1代种子培育得到的植株为T1代植株，T1代植株自交获得T2代种子。
分别提取各个T0代植株和T1代植株的总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板，将actin基因作为内参基因，通过实时定量PCR鉴定RIR1基因的相对表达量。
用于鉴定RIR1基因的引物对如下：
LRT4-F:5'-CAGATCACCACCCAAGTCAA-3'；LRT4-R：5'-AGGCCGTACATGTCCTTGC-3'。
用于鉴定actin基因的引物对如下：
Actin-F：5'-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3'；Actin-R：5'-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3'。
对于某一T0代植株来说，如果该T0代植株及其自交得到的T1代植株中RIR1基因的相对表达量与水稻品种日本晴相比均下降50%以上，该植株及其自交后代为一个RNAi干扰株系。导入干扰载体甲得到的RNAi干扰株系命名为HAN-A1A2 RNAi干扰株系。导入干扰载体乙得到的RNAi干扰株系命名为HAN-B1B2RNAi干扰株系。导入干扰载体丙得到的RNAi干扰株系命名为HAN-C1C2 RNAi干扰株系。
HAN-A1A2 RNAi干扰株系、HAN-B1B2 RNAi干扰株系、HAN-C1C2 RNAi干扰株系的T1代植株中RIR1基因的相对表达量结果见图3。
二、对照株的获得
用PCAMBIA1300-HAN载体代替干扰载体进行步骤一，得到转空载体株系，作为步骤一得到的RNAi干扰株系的对照。
三、抗病性检测
分别将HAN-A1A2 RNAi干扰株系的T2代种子（50粒）、HAN-B1B2 RNAi干扰株系的T2代种子（50粒）、HAN-C1C2 RNAi干扰株系的T2代种子（50粒）、转空载体株系的T2代种子（50粒）和水稻品种日本晴的种子进行如下检测：
将种子按常规条件进行播种、育苗和管理，萌发40天后剪叶法接种水稻白叶枯病菌PXO99菌株（将剪刀在OD600=0.25的水稻白叶枯病菌PXO99菌株的菌悬液中浸湿，然后用剪刀减去水稻叶片的叶尖，每株水稻对三个叶片进行剪叶处理；描述剪叶法的参考方法：2007 OEPP/EPPO,Bulletin OEPP/EPPO Bulletin，37,543–553），接种2周后测量原叶（即进行剪叶处理的叶片）上的病斑长度，结果见图4（每个株系均为50株植株的平均值）。结果显示，三个干扰株系的病斑长度显著低于水稻品种日本晴，转空载体株系的病斑长度与水稻品种日本晴基本相同，即通过沉默RIR1基因可以显著提高植株对白叶枯病菌的抗性。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：
（1）编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；
（2）序列表的序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。
4.一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，通过干扰RNA实现“抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达”。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，通过导入干扰载体实现“抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达”。
7.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：所述抗病性体现为对白叶枯病菌的抗性。
8.一种干扰RNA，为序列表的序列7所示的双链RNA、序列表的序列8所示的双链RNA或序列表的序列9所示的双链RNA。
9.一种干扰载体，为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子、序列表的序列5所示的双链DNA分子或序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
10.权利要求8所述双链RNA或权利要求9所述干扰载体在培育抗病性增高的转基因植物中的应用。
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