CN104119431B - 植物耐逆相关蛋白ndx及其编码基因与应用 - Google Patents

植物耐逆相关蛋白ndx及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物耐逆相关蛋白NDX及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自哥伦比亚生态型拟南芥，命名为NDX蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物气孔调控相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明针对植物现有调控气孔运动有效功能基因的不足，提供了一种新的植物气孔调控相关蛋白及其编码基因。将NDX基因灭活（或沉默）后，植物表现为失水快、旱敏感的特点。本发明可应用于基因工程育种，有利于培育出新的调控气孔运动作物品种。

Description

植物耐逆相关蛋白NDX及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种植物耐逆相关蛋白NDX及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于拟南芥并通过调节气孔来增加植物耐逆性的蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术
粮食问题是一个世界性的重大问题。我国始终坚持以农业为基础，采用各种方式争取粮食总量稳定增长，如通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入、改造中低产田等途径来增加粮食产量。但无论通过何种方式，均需克服自然逆境限制或减轻逆境造成的减产等问题。因此，通过基础研究认识植物如何应对逆境胁迫，以此改善和提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重要手段，倍受世界各国政府和科学家的关注。
干旱胁迫是植物正常生长发育的主要限制因素。随着社会经济的迅速发展，人口膨胀以及生物种群的破坏，水资源短缺现象日趋严重，它严重地影响了农业生产和生态环境，已成为全球关注的问题，如何提高作物对有限水资源的利用效率，增强作物的抗旱性，对于提高农作物产量具有重大的意义。在作物生长发育过程中，采用基因工程育种技术，通过调控水分蒸腾速率，从而提高农作物对水分利用率，已经成为科技工作者所关注的领域之一。
拟南芥是一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物或农作物的研究。因此，对拟南芥抗逆境分子机制的研究将极大地有助于找到提高农作物产量的方法。
拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的，二倍体共有约1.3亿个碱基对，约2.6万个基因。目前很多基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，已经成功解析了一些调控干旱相关的基因的作用机制，如DREB、CBF、ABRE等，通过超量表达这些基因，已经使转基因植物获得了一定的抗性，具有一定的可行性。因此，寻找新的功能基因并阐明其功能，具有重要的理论及实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆相关蛋白NDX及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，获自哥伦比亚生态型拟南芥，命名为NDX蛋白，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物气孔调控相关的由序列1衍生的蛋白质；
（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由序列1衍生的蛋白质；
（d）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对脱落酸的耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
上述（b）或（c）或（d）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）或（c）或（d）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述NDX蛋白的基因（NDX基因）也属于本发明的保护范围。
所述NDX基因为如下1）或2）或3）或4）或5）或6）或7）或8）的DNA分子：
1）其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2）序列表中序列2自5ˊ末端第2264至6703位所示的DNA分子；
3）序列表中序列2所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有25-50%同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；
6）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有50-75%同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；
7）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有75-90%同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；
8）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是抑制出发植物中所述NDX基因的表达，得到对干旱和/或脱落酸的耐逆性低于所述出发植物的转基因植物。
所述“抑制出发植物中所述NDX基因的表达”的实现方式具体如下：将干扰载体导入所述出发植物；所述干扰载体为在植物表达载体中插入序列表的序列2自5’末端第5746-5925位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。可用现有的植物表达载体构建所述干扰载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。构建所述干扰载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，构建所述干扰载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。所述干扰载体具体可为：在载体pHellsgate8的attR1和attR2位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第5746-5925位核苷酸所示的双链DNA分子。
所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
含有所述NDX基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述NDX基因的全长及其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述NDX基因在培育转基因植物中的应用。所述转基因植物为耐逆植物。所述耐逆植物为耐旱和/或耐脱落酸的植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述NDX基因导入植物，得到对干旱和/或脱落酸的耐逆性高于所述出发植物的转基因植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护所述NDX蛋白在调控植物气孔中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明针对植物现有调控气孔运动有效功能基因的不足，提供了一种新的植物气孔调控相关蛋白及其编码基因。将NDX基因灭活（或沉默）后，植物表现为失水快、旱敏感的特点。本发明可应用于基因工程育种，有利于培育出新的调控气孔运动作物品种。
附图说明
图1为实施例4中植株的生长状态照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)：参考文献：Plant Cell.(2012)24(6):2546-61，A plasma membrane receptor kinase, GHR1, mediates abscisicacid and hydrogen peroxide-regulated stomatal movement in Arabidopsis.，Hua D, Wang C, He J, Liao H, Duan Y, Zhu Z, Guo Y, Chen Z, Gong Z.。
载体pDNOR201和载体pHellsgate 8均为Life technologies公司的phellsgate试剂盒（目录编号：11782018）的组件；载体pHellsgate 8如GENBANK ACCESSION NO.AF489904.1所示；参考文献：Plant J (2001) 27:581-590，Construct design forefficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. ，WesleySV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP,Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM, ，Methods. 2003 Aug;30(4):289-95.，Constructs and methods for high-throughputgene silencing in plants.，Helliwell C, Waterhouse P.，Source，CSIRO PlantIndustry, GPO Box 1600, Canberra ACT 2601, Australia.。
通过化学诱变剂乙基磺酸乙酯EMS诱导哥伦比亚生态型拟南芥，从中进行逆境胁迫相关表型的筛选和突变基因的图位克隆，发现了NDX蛋白以及NDX基因。NDX基因一个碱基的改变将会导致突变体产生干旱敏感表型。NDX蛋白如序列表的序列1所示，由886个氨基酸残基组成。编码NDX蛋白的基因命名为NDX基因。NDX基因的基因组基因如序列表的序列2所示。NDX基因的cDNA中的开放阅读框如序列表的序列3所示。
实施例1、干扰载体的构建
1、设计一对引物如下（波浪线标注attB1序列或attB2序列）：
attB1NDX-F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAAGCTCTAACAGAGGGAAGGGTC-3’；
attB2NDX-R:5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTTGATCAGCATTCATA-3’。
2、提取哥伦比亚生态型拟南芥幼苗的基因组DNA。
3、以步骤2得到的基因组DNA为模板，用attB1NDX-F和attB2NDX-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
4、步骤3得到的PCR扩增产物与载体pDNOR201发生BP反应，得到重组质粒。
用于鉴定重组质粒的引物如下（如果得到约180bp的条带证明得到的目的质粒）：
attP1：5’-GCTAGCATGGATCTCGG-3’
attP2：5’-GAGCTGCAGCTGGATGG-3’
5、步骤4得到的重组质粒与载体pHellsgate8发生LR反应，得到干扰载体。
干扰载体分别进行XbaI和XhoI单酶切鉴定和测序鉴定（对于单酶切鉴定来说，如果得到约500bp的条带证明结果为阳性）。根据测序结果，对干扰载体进行结构描述如下：在载体pHellsgate8的attR1和attR2位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第5746-5925位核苷酸所示的双链DNA分子。
实施例2、抑制表达NDX基因植株获得
一、抑制表达NDX基因植株的获得
1、将实施例1构建的干扰载体转化农杆菌菌株GV3101（购自北京全式金生物技术有限公司，目录号：AG108），得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌通过花序侵染法转化哥伦比亚生态型拟南芥，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS培养基上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到抑制表达NDX基因拟南芥单拷贝纯合株系（简称为抑制表达NDX基因株系，用ndx表示）。
实施例3、转空载体对照植株的获得
用载体pHellsgate 8代替干扰载体进行实施例2的操作，得到转空载体植株。
实施例4、耐干旱胁迫实验
实验组：将实施例2得到的抑制表达NDX基因株系的T3代植株、实施例3得到的转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥的3周龄苗分别置于20-23°C、相对湿度为40-60%、16小时光/8小时黑暗条件下，3周不浇水，然后恢复浇水3天，观察表型并拍照同时进行存活率统计。
对照组：将实施例2得到的抑制表达NDX基因株系的T3代植株、实施例3得到的转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥的3周龄苗分别置于20-23°C、相对湿度为40-60%、16小时光/8小时黑暗条件下，正常培养3周，观察表型并拍照同时进行存活率统计。
实验共设三次重复，每次重复中，每种处理方式所测试的各株系的植株均分别为60株。
对照组，各个株系植株的存活率均为100%。实验组，哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为96±4%，转空载体对照植株的存活率为95±3%，抑制表达NDX基因株系的存活率为10±4%。结果表明，在正常培养条件下各个株系的生长情况没有明显差异，在干旱条件下抑制表达NDX基因株系的存活率明显低于哥伦比亚生态型拟南芥。
植株的生长状态照片见图1。
Control（对照）显示对照组处理中，正常培养3周的植株的生长表型。抑制表达NDX基因株系植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥的表型没有显著差异。转空载对照植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥的表型没有显著差异。
Dehydration（脱水）显示实验组处理中，3周不浇水后植株的表型。哥伦比亚生态型拟南芥生长良好，显著优于抑制表达NDX基因株系植株的表型。转空载对照植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥的表型没有显著差异。
Rewater（复水）显示实验组处理中，恢复浇水3天后植株的表型。哥伦比亚生态型拟南芥生长良好，而抑制表达NDX基因株系植株几乎不能恢复生长，已经干旱致死。转空载对照植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥的表型没有显著差异。
实施例5、耐脱落酸胁迫实验
用脱落酸分别处理实施例2得到的抑制表达NDX基因株系的T3代植株、实施例3得到的转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥，处理方法如下：取植株完全伸展的叶片，用镊子小心的撕取叶片的下表皮，用毛笔将下表皮上粘附的叶绿体轻轻的涮干净，将撕取的下表皮放入到MES缓冲液中（该缓冲液可以使植物的气孔完全张开，使气孔在脱落酸处理前处于一致的状态；MES缓冲液的溶剂为水，含有如下溶质：30mM KCl、10mM Mes-KOH,pH6.15）浸泡3小时，使气孔完全打开；然后将叶片下表皮转移到0.5μM ABA水溶液中，浸泡不同时间后分别检测处理前植株的气孔和处理后植株的气孔。
检测气孔的具体方法如下：将植株的叶片下表皮平铺到载玻片上，盖上盖玻片，利用光学显微镜在适当的放大倍数（40X）下观察气孔，并且测量记录气孔的孔径（即：气孔开放的最大宽度处的长度，每个样品的每个处理至少记录60个气孔，使用的显微镜为奥林帕斯的B60professional series显微镜）。
抑制表达NDX基因株系的植株（10株的平均值）：ABA处理前气孔孔径为3.5±0.16μM，ABA处理1小时后气孔孔径为3.0±0.08μM，ABA处理2小时后气孔孔径为3.0±0.08μM，ABA处理3小时后气孔孔径为2.4±0.06。
哥伦比亚生态型拟南芥（10株的平均值）：ABA处理前气孔孔径为3.8±0.04μM，ABA处理1小时后气孔孔径为2.8±0.04μM，ABA处理2小时后气孔孔径为2.0±0.03，ABA处理3小时后气孔孔径为2.0±0.03。
转空载体对照植株（10株的平均值）：ABA处理前气孔孔径为3.7±0.03μM，ABA处理1小时后气孔孔径为2.7±0.03μM，ABA处理2小时后气孔孔径为2.1±0.02，ABA处理3小时后气孔孔径为2.0±0.02。
结果表明：在脱落酸处理条件下，可以观察到，抑制表达NDX基因株系的植株的气孔孔径都要比哥伦比亚生态型拟南芥的气孔孔径大。当哥伦比亚生态型拟南芥气孔因脱落酸处理而关闭时，抑制表达NDX基因株系的植株的气孔却基本没有变化，说明NDX基因缺失后，植株表现出气孔运动对ABA不敏感的特征。

Claims (8)

1.一种蛋白质，是如序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2)序列表中序列2自5ˊ末端第2264至6703位所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子。
4.一种培育干旱和/或脱落酸耐逆性降低的转基因植物的方法，是抑制出发植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到对干旱和/或脱落酸的耐逆性低于所述出发植物的转基因植物；所述植物为拟南芥。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：抑制出发植物中权利要求2或3所述基因的表达的实现方法如下：将干扰载体导入所述出发植物；所述干扰载体为在植物表达载体中插入序列表的序列2自5’末端第5746-5925位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
7.权利要求2或3所述基因在培育干旱和/或脱落酸耐逆性降低的转基因植物中的应用；所述植物为拟南芥。
8.权利要求1所述蛋白质在调控植物气孔中的应用；所述植物为拟南芥。
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