CN113913545A - 一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分子标记 - Google Patents

一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分子标记，属于作物分子遗传技术领域。本发明针对减数分裂基因基因PAIR2、CRC1及PRD1基因内部序列开发特异性分子标记，应用于检测水稻减数分裂基因PAIR2、CRC1及PRD1基因的纯合突变体、杂合型或野生型水稻，分别使用核酸内切酶BsII、BccI及AluI酶切扩增产物，电泳后即可判断基因型。本发明所提供的鉴定方法，能够高通量的一次性进行大量样品的鉴定，区分不育单株、杂合株，具有操作简便、低成本、特异性好以及高通量等特点，能快速应用于雄性不育材料在水稻育种中的研究，并降低育种成本。

Description

一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分 子标记
技术领域
本发明属于作物分子遗传技术领域，更具体地说，涉及一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分子标记。
背景技术
水稻作为人类最主要的粮食作物之一，它为全球约一半以上人口提供主食。中国的水稻种植面积约占全世界的23％左右，但目前中国的水稻产量却占全世界的37％左右。从国内来看，水稻种植面积约占全国粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半。从单位面积产量上来看，水稻比整个粮食作物高出45.17％，其中一个重要因素就是水稻雄性不育系的发掘以及其在水稻三系育种等中的应用和推广。水稻中的“三系法”制种也是利用核-质互作雄性不育系、保持系和恢复系来实现三系配套来配置杂种一代。雄性不育水稻可分为细胞核质互作雄性不育与细胞核雄性不育。细胞核雄性不育包括显性核不育与隐性核不育两类。其中核不育又因其育性是否受光照、温度等外界条件影响分为光(温)敏核不育和普通核不育两种类型。多数水稻核不育为隐性核不育，隐性核不育多受单隐性核基因控制。本专利所分析的基因突变均为单隐性核基因控制的减数分裂型不育突变。
研究人员在前期研究中发现，PAIR2基因控制水稻花粉母细胞减数分裂过程中同源染色体的配对。该基因的突变导致同源染色体在减数分裂过程中不能正常配对，从而形成24个单价体。目前认为PAIR2对水稻雌雄生殖细胞减数分裂过程中同源染色体的配对是必要的(Nonomura et al.2004)。此外，通过细胞学分析发现PAIR2蛋白与联会复合体的轴向元件形成有关(Nonomura et al.2006)。水稻CRC1是一个保守的的AAA-ATPase家族蛋白，该蛋白与酿酒酵母Pch2和小鼠TRIP13具有较高的同源性。减数分裂过程中，CRC1与联会复合体横丝蛋白ZEP1及侧向原件蛋白PAIR1互作，形成功能复合体，从而促进DNA双链断裂(DSB)的形成，CRCl还参与将PAIR2募集到染色体上(Miao et al.2013)。此外，CRC1还与P31comet蛋白互作共同参与联会复合体组装和DSB形成(Ji et al.2016)。水稻PRD1是拟南芥AtPRD1的同源蛋白，突变表现为正常的营养生长，且具有正常的植株高度，但雌雄配子体均不育。通过构建双突变体mtopVIB prd1-1表现出多极纺锤体，这一表型与单突prd1-1或mtopVIB具有相似表型，表明PRD1可能通过参与DSB形成从而促进水稻双极纺锤体组装(Shiet al.2021)。
前期研究中，通过敲除水稻基因组中的三个减数分裂控制基因OsOSD1、PAIR1和OsREC8，使控制生殖发育的减数分裂过程转变为控制营养生长的有丝分裂过程，且不发生染色体交换，从而创建了MiMe材料，产生与亲本体细胞基因型一致的双倍体雌雄配子(Mieulet et al.2016)。以MiMe技术为基础，中美两个科研团队均实现了对杂交稻种子胚的克隆。来自中国水稻研究所的王克剑团队，在MiMe基础上，再敲除MTL基因(MTL能诱导雄配子基因组降解)，获得Fix(Fixation of hybrids)材料，Fix自交形成后代过程中，因减数分裂失败形成双倍体的雌、雄配子，双倍体雌雄配子融合后形成四倍体，但同时有一定概率发生雄配子的基因组降解，即融合后的孤雌发育，发生雄配子基因组降解的合子胚与F1亲本在基因型上保持一致，从而实现了对杂种胚的克隆(Wang et al.2019)；在减数分裂过程中，PAIR2、CRC1及PRD1三个基因突变体在染色体表型上与PAIR1突变以后完全一样，因此利用这些基因替代PAIR1在水稻无融合生殖研究具有重要应用价值。此外，在其他育性发育基因的功能研究中，也可以利用PAIR2、CRC1及PRD1相关基因突变体配置双突变体或三突变体等，从而研究候选基因在减数分裂DSB双链断链形成中的功能。然而，在利用水稻不育基因系进行品种选育过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出纯合或杂合的单株，用于进行后续回交或自交。由于在DNA编码序列上，杂合Aa型和aa型仅存在数个核苷酸的差异，在检测相关不育基因时如果采用PCR产物扩增后再测序的话，耗时长，且成本较高。因此，有必要开发针对水稻雄性不育基因快速经济的分子标记检测方法，并将其用于后代单株的分子鉴定，以达到缩短育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种水稻减数分裂不育基因PAIR2、CRC1及PRD1基因型的特异性分子标记，利用特异性分子标记设计的引物对水稻PAIR2、CRC1、PRD1纯合突变体、野生型、杂合性进行快速基因型鉴定。本发明所要解决的技术问题之二在于提供所述的水稻特异性分子标记在水稻育种和生产中对水稻PAIR2、CRC1及PRD1纯合突变型、野生型及杂合型进行基因型鉴定的具体应用方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法：以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的特异性分子标记分别鉴定突变位点如下的纯合突变体、杂合型或野生型水稻：
本发明所阐述的突变位置为水稻减数分裂基因PAIR2在CDS序列第17外显子中第1261-1270bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000031
突变为agccagaca(下划加粗碱基缺失)，导致后续氨基酸移码突变；水稻减数分裂基因CRC1在CDS序列第10外显子中第851-863bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000032
突变为tccaggagagt(下划加粗碱基缺失)，导致后续氨基酸移码突变；水稻减数分裂基因PRD1在CDS序列第1外显子中第5-15bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000033
突变为
Figure BDA0003321665460000034
(下划加粗碱基转换)，导致该位置氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，以上突变均导致相关基因功能缺陷，导致完全不育。
所述的方法包括：
1)设计所述特异性分子标记的上下游引物对；
2)利用水稻DNA为模板，使用步骤1)设计的引物对扩增所述特异性分子标记；
3)PAIR2、CRC1及PRD1分别使用核酸内切酶BsII、BccI及AluI酶切扩增产物，并将酶切产物进行电泳检测；
4)根据电泳检测结果，判断水稻基因型。
进一步地，所述的引物对具体为：
正向引物PAIR2-F1：5′-gcactgtaccatgcacttcc-3′，
反向引物PAIR2-R1：5′-aaggtaatcacttgaagttg-3′；
正向引物CRC1-F2：5′-gttcagcaagtggttttctg-3′，
反向引物CRC1-R2：5′-ggaatctgaaggttcagatc-3′；
正向引物PRD1-F3：5′-tgctgaattagtggcaacaac-3′，
反向引物PRD1-R3：5′-agagtttgtatagtacaaag-3′。
进一步地，根据电泳检测结果，判断水稻基因型的方法为：
在鉴定PAIR2基因型中，纯合突变体aa不能被BsII酶切，为358bp；野生型AA被BsII完全酶切，出现两条281bp和78bp双带型；杂合型Aa出现359bp、281bp和78bp三条带型；
在鉴定CRC1基因型中，纯合突变体aa不能被BccI酶切，仍然为838bp；野生型AA被BccI完全酶切，出现两条540bp和300bp双带型；杂合型水Aa出现840bp、540bp和300bp三条带型；
在鉴定PRD1基因型中，纯合突变体aa不能被AluI酶切，仍然为320bp；野生型AA被AluI完全酶切，出现两条230bp和90bp双带型；杂合型Aa出现320bp、230bp和90bp三条带型。
进一步地，所述的电泳检测是琼脂糖凝胶电泳检测。
所述水稻减数分裂基因PAIR2、CRC1及PRD1的特异性分子标记，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
所述的水稻减数分裂基因PAIR2、CRCl及PRD1特异性分子标记的引物对，具体序列为：
正向引物PAIR2-F1：5′-gcactgtaccatgcacttcc-3′，
反向引物PAIR2-R1：5′-aaggtaatcacttgaagttg-3′；
正向引物CRC1-F2：5′-gttcagcaagtggttttctg-3′，
反向引物CRC1-R2：5′-ggaatctgaaggttcagatc-3′；
正向引物PRD1-F3：5′-tgctgaattagtggcaacaac-3′，
反向引物PRD1-R3：5′-agagtttgtatagtacaaag-3′。
所述的水稻减数分裂基因PAIR2、CRC1及PRD1特异性分子标记的引物对在制备用于鉴定水稻减数分裂基因基因型的试剂盒中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的分子标记特异性高：本发明提供的三个基因的分子标记是发明人经过分析突变体和野生型基因序列差异并通过实验验证得到，其检测位点不仅位于基因内部，同时也包含突变位点，并且能准确地将纯合突变体aa、野生型AA、杂合型Aa进行区分，从而使所获得的纯合突变型或杂合型后期能快速应用于育种中。
(2)本发明提供的分子标记在实际应用中具有低成本、高通量：目前，水稻减数分裂型不育材料无论在育种和遗传研究中，由于其突变表现为完全不育，无法在当代进行保存，因此一般都保存杂合单株后代(Aa)，并在第二年种植时，利用PCR扩增后经测序来鉴定群体中的不同基因型，该过程费时费力且费钱，无法大规模在生产实践中应用，限制了生产中的应用。本发明提供的分子标记只需进行PCR扩增和酶切，在2-3小时以内就可以得到最终结果，同时可以一次做几百上千样本，且成本极低。以100个样品为例，PCR和测序的费用基本在2000元左右，而通过PCR及酶切检测，成本在20元左右，仅为测序的百分之一左右。由于本发明的分子标记成本低、通量高、特异性高，特别适用于生产实践中。此外，该分子标记可以在水稻生长的苗期进行非破坏性检测等优点，适用于商业化育种中对基因进行检测。
(3)本发明是目前第一个针对水稻三个减数分裂基因PAIR2、CRC1及PRD1基因内部序列所开发的基因型鉴定的共显性分子标记：本发明能通过一次PCR、酶切及电泳检测的方法成功地将纯合型、杂合型和野生型进行区分。本发明所提供的PAIR2、CRC1及PRD1的特异性分子标记均为共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性均优于显性标记，可直接判断目标材料是杂合型(Aa)、纯合突变型(aa)还是野生型(AA)。本发明可应用于PAIR2、CRC1及PRD1转基因鉴定、基因突变型鉴定、基因聚合以及基于MAS技术的水稻育种工作中。相关标记均存在于PAIR2、CRC1及PRD1基因内部，因此对PAIR2、CRC1、PRD1杂合株以及纯合突变体株的筛选能力理论值为100％。
(4)本发明提供的分子标记应用范围广：水稻减数分裂不育基因PAIR2、CRC1及PRD1群体后代基因型鉴定的特异性分子标记的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。
附图说明
图1是PAIR2基因突变测序分析及基因型鉴定方法图：突变位点测序比较野生型、杂合型及纯合突变型(A)；野生型和突变型基因DNA序列比较(B)；在突变位点存在BsII内切酶酶切位点，而野生型中不存在此酶切位点(C)；
图2是CRC1基因突变测序分析及基因型鉴定方法图：突变位点测序比较野生型、杂合体以及纯合突变体(A)；野生型和突变型基因DNA序列比较(B)；在突变位点存在BccI内切酶酶切位点，而野生型中不存在此酶切位点(C)；
图3是PRD1基因突变测序分析及基因型鉴定方法图：突变位点测序比较野生型、杂合体以及纯合突变体(A)；野生型和突变型基因DNA序列比较(B)；在突变位点存在AluI内切酶酶切位点，而野生型中不存在此酶切位点(C)：
图4是PAIR2基因型的分子标记鉴定图：纯合突变体(aa)不能被BsII酶切，仍然为358bp；野生型(AA)被BsII完全酶切，出现两条281bp和78bp双带型；杂合型(Aa)出现359bp、281bp和78bp三条带型(实际扩增中，78bp带型太小，一般无法观测到)。泳道1为DL2000DNAmarker，泳道2-23为不同基因型鉴定结果；
图5是CRC1基因型的分子标记鉴定图：纯合突变体(aa)不能被BccI酶切，仍然为838bp；野生型(AA)被BccI完全酶切，出现两条540bp和300bp双带型；杂合型(Aa)出现840bp、540bp和300bp三条带型；泳道1为DL2000DNAmarker，泳道2-16为不同基因型鉴定结果；
图6是PRD1基因型的分子标记鉴定图：纯合突变体(aa)不能被AluI酶切，仍然为320bp；野生型(AA)被AluI完全酶切，出现两条230bp和90bp双带型；杂合型(Aa)出现320bp、230bp和90bp三条带型(实际扩增中，90bp带型太小，一般无法观测到)；泳道1为DL2000DNAmarker，泳道2-13为不同基因型鉴定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。
材料：水稻品种中籼3037：记载
“Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.，Xue，Y.and Cheng，Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice.Plos Genetics，6”一文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1：PAIR2、CRC1及PRD1基因特异性分子标记及其引物设计与检测
(1)设计引物及PCR扩增、酶切和电泳扩增产物
由于PAIR2突变在目标基因的CDS序列第17外显子中第1261-1270bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000071
突变为agccagaca(下划加粗碱基缺失)，导致后续氨基酸移码突变，导致在野生型中存在BsII内切酶酶切位点，而突变体中不存在此酶切位点(图1C)。因此，利用该水稻突变位点存在的BsII酶切位点，根据分子标记的设计原理，设计一段水稻核雄性不育基因PAIR2的特异性分子标记PAIR2-SCAR(SEQ ID NO.1)，利用PCR扩增该特异性分子标记的产物进行BsII酶切电泳，野生型由于形成BsII酶切位点可被酶切，而纯合突变体中无此酶切位点无法被酶切，电泳即可区分不同基因型。在突变位点上下游设计水稻核雄性不育基因PAIR2的特异性分子标记的扩增引物对如下所示：
SEQ ID NO.4：Primer F：5′-gcactgtaccatgcacttcc-3′
SEQ ID NO.5：Primer R：5′-aaggtaatcacttgaagttg-3′
由于CRC1突变体在目标基因的CDS序列中第10外显子第851-863bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000072
突变为tccaggagagt(下划加粗碱基缺失)，导致后续氨基酸移码突变，导致在野生型中存在BccI内切酶酶切位点，而突变体中不存在此酶切位点(图2C)。因此，利用该水稻突变位点存在的BccI内切酶酶切位点，根据分子标记的设计原理，设计一段水稻核雄性不育基因PAIR2的特异性分子标记CRC1-SCAR(SEQ ID NO.2)，利用PCR扩增该特异性分子标记的产物进行BccI酶切电泳，野生型由于形成核酸内切酶BccI酶切位点可被酶切，而纯合突变体中无此酶切位点无法被酶切，电泳即可区分不同基因型。在突变位点上下游设计水稻核雄性不育基因CRC1的特异性分子标记的扩增引物对如下所示：
SEQ ID NO.6：Primer F：5′-gttcagcaagtggttttctg-3′
SEQ ID NO.7：Primer R：5′-ggaatctgaaggttcagatc-3′
由于PRD1突变体在目标基因的CDS序列中第1外显子第5-15bp位置的碱基序列
Figure BDA0003321665460000073
突变为
Figure BDA0003321665460000074
(下划加粗碱基转换)，导致该位置氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸，在野生型中存在AluI内切酶酶切位点，而突变体中不存在此酶切位点(图3C)。因此，利用该水稻突变位点存在的AluI内切酶酶切位点，根据分子标记的设计原理，设计一段水稻核雄性不育基因PRD1的特异性分子标记PRD1-SCAR(SEQ ID NO.3)，利用PCR扩增该特异性分子标记的产物进行AluI酶切电泳，野生型由于形成核酸内切酶AluI酶切位点可被酶切，而纯合突变体中无此酶切位点无法被酶切，电泳即可区分不同基因型。在突变位点上下游设计水稻核雄性不育基因PRD1的特异性分子标记的扩增引物对如下所示：
SEQ ID NO.8：Primer F：5′-tgctgaattagtggcaacaac-3′
SEQ ID NO.9：Primer R：5′-agagtttgtatagtacaaag-3′
利用该引物组合，在水稻DNA模板(市售DNA提取试剂盒提取的水稻基因组)中PCR扩增根据电泳检测结果，判断水稻基因型的方法为：在鉴定PAIR2基因型中，纯合突变体(aa)不能被BsII酶切，仍然为358bp；野生型水稻(AA)被BsII完全酶切，出现两条281bp和78bp双带型；杂合型水稻(Aa)出现359bp、281bp和78bp三条带型(图4)(实际扩增中，78bp带型太小，一般无法观测到)。在鉴定CRC1基因型中，纯合突变体(aa)不能被BccI酶切，仍然为838bp；野生型水稻(AA)被BccI完全酶切，出现两条540bp和300bp双带型；杂合型水稻(Aa)出现838bp、540bp和300bp三条带型为(图5)。在鉴定PRD1基因型中，纯合突变体(aa)不能被AluI酶切，仍然为320bp；野生型水稻(AA)被AluI完全酶切，出现两条230bp和90bp双带型；杂合型水稻(Aa)出现320bp、230bp和90bp三条带型(图6)(实际扩增中，90bp带型太小，一般无法观测到)。
扩增反应体系为：反应体系(2×Reaction Mix)12.5μL，正向引物(Primer F，10μM)10μL，反向引物(Primer R，10μM)10μL，聚合酶(Golden DNA Polymerase，2.5U/μL)0.2μL，模板(Template)＜1μg，水(ddH2O)补至25μL。
PCR条件为：94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
取适量PCR产物进行内切酶酶切，酶切体系为：PCR扩增产物18μL，内切酶0.1μL，内切酶Buffer 2μL。酶切体系在37℃(BccI及AluI内切酶)或者55℃(BsII内切酶)恒温培养箱放置4h后取酶切产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，电泳条件为140v，1小时。
后期通过分析其表型结果发现完全和上述基因型测序结果吻合，说明水稻减数分裂基因基因PAIR2、CRC1及PRD1的特异性分子标记的引物对可用于相关基因鉴定、杂交群体后代鉴定等。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 淮阴师范学院
<120> 一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法及其特异性分子标记
<130> 100
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 359
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gcactgtacc atgcacttcc aatggattat gtgtcagtag gcaaacttca tggcaagcta 60
gatggggagg ccagccagaa catggttcgt aagttgattg aaaaaatggt gcaagacgga 120
tatgtcaaga attcagccaa ccgaagacta ggtaacacct tgaactaatc tcttgcaaaa 180
tctcaaatgc ttctattcta tggtacatta tttacttttc tggtttagtc tgtcagccag 240
gagcaagtta tgtattgttt gctcaattct gttacaactg tgaaaggaga ataactgaat 300
caacatgcca actgagtgtc attttctaca tagattgtgc aacttcaagt gattacctt 359
<210> 2
<211> 840
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
gttcagcaag tggttttctg aaagcggaaa actggtatgc cttttttgtg ctaaccgaaa 60
gactgttata tgcatgtgat gattcatatg ctgaatgcta ttatctaatg acacttggct 120
tgctcatgat tttgcatgtg gtggctttta ttcttatgat tcatttcgac ctttttatac 180
tggactttac ctggtataat tagccaatgg atatgcatct ttattcgcat cttaaattcc 240
gtgtactctg tgcaatcctt cattttaggt ggccaaactt ttccagaaga tccaggagat 300
ggtggaagaa gaaagcaacc tggtatttgt attgataggt acgtcagtac gtccttgagc 360
agtgacaagt taacactata tattgacaac taggcaacta gcccaaagtg atgaaatgac 420
tatacgagtc ttcactgtat ggtctgtgaa gtgattagat gagtccacca ggttcatttt 480
gtatatgaat agtttaggaa ggttaatttt catgtcaaat tgtcaatttg gctgagttca 540
atttaagctt ccattatcta aaaatgttga attgtcaatc acgtttctcc ttaaagatac 600
acccctatac taatgattat gtatcaacct tggccacctg tttgacatat gactatatga 660
gcgaaggatc cttacaatct atattatact ctttcacatg gagtttgatt tgctcgatgt 720
tgtatatatt gaatcttaac cttatgtgtg ttattattga tttttcaatt tctagatgaa 780
gttgaaagcc tagctgctgc cagacaggct gccatatctg gatctgaacc ttcagattcc 840
<210> 3
<211> 320
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
tgctgaatta gtggcaacaa cactattgta gttttactga atatatttgc tgccgtaatt 60
tctgacccgt acatttatgt cagtacagct acactgtttg gggatcctgc taaattctac 120
caaagatgct gcaacttaca ttggagataa acaatctctt tacttaaacc ttgtcaacaa 180
tctccggcta ccaaggttaa taccattgca tattgacact ttcctcgcct tgcgaataac 240
cttatctgac agcatcctta acttgttctg gtacagtgat gaaattcgtg gagagatact 300
ctttgtacta tacaaactct 320
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> PAIR2-F1(Artificial)
<400> 4
gcactgtacc atgcacttcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> PAIR2-R1(Artificial)
<400> 5
aaggtaatca cttgaagttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> CRC1-F2(Artificial)
<400> 6
gttcagcaag tggttttctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> CRC1-R2(Artificial)
<400> 7
ggaatctgaa ggttcagatc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> PRD1-F3(Artificial)
<400> 8
tgctgaatta gtggcaacaa c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> PRD1-R3(Artificial)
<400> 9
agagtttgta tagtacaaag 20

Claims (8)

1.一种快速鉴定水稻减数分裂基因基因型的方法，其特征在于，以SEQID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示的特异性分子标记分别鉴定突变位点如下的纯合突变体、杂合型或野生型水稻：
水稻减数分裂基因PAIR2在第17外显子CDS序列中第1261-1270bp位置的碱基序列agccagaaca突变为agccagaca，导致的后续氨基酸移码突变；水稻减数分裂基因CRC1在第10外显子CDS序列中第851-863bp位置的碱基序列tccaggagatggt突变为tccaggagagt，导致的后续氨基酸移码突变；水稻减数分裂基因PRD1在第1外显子CDS序列中第5-15bp位置的碱基序列cagtacagcta突变为cagtacagcga，导致该位置氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸的突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
1)设计所述特异性分子标记的上下游引物对；
2)利用水稻DNA为模板，使用步骤1)设计的引物对扩增所述特异性分子标记；
3)PAIR2、CRC1及PRD1分别使用核酸内切酶BsII、BccI及AluI酶切扩增产物，并将酶切产物进行电泳检测；
4)根据电泳检测结果，判断水稻基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物对具体为：
正向引物PAIR2-F1：5′-gcactgtaccatgcacttcc-3′，
反向引物PAIR2-R1：5′-aaggtaatcacttgaagttg-3′；
正向引物CRC1-F2：5′-gttcagcaagtggttttctg-3′，
反向引物CRC1-R2：5′-ggaatctgaaggttcagatc-3′；
正向引物PRD1-F3：5′-tgctgaattagtggcaacaac-3′，
反向引物PRD1-R3：5′-agagtttgtatagtacaaag-3′。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，根据电泳检测结果，判断水稻基因型的方法为：
在鉴定PAIR2基因型中，纯合突变体aa不能被BsII酶切，为358bp；野生型AA被BsII完全酶切，出现两条281bp和78bp双带型；杂合型Aa出现359bp、281bp和78bp三条带型；
在鉴定CRC1基因型中，纯合突变体aa不能被BccI酶切，仍然为838bp；野生型AA被BccI完全酶切，出现两条540bp和300bp双带型；杂合型水Aa出现840bp、540bp和300bp三条带型；
在鉴定PRD1基因型中，纯合突变体aa不能被AluI酶切，仍然为320bp；野生型AA被AluI完全酶切，出现两条230bp和90bp双带型；杂合型Aa出现320bp、230bp和90bp三条带型。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的电泳检测是琼脂糖凝胶电泳检测。
6.权利要求1所述水稻减数分裂基因PAIR2、CRCl及PRD1的特异性分子标记，如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3序列所示。
7.权利要求6所述的水稻减数分裂基因PAIR2、CRC1及PRD1特异性分子标记的引物对，其特征在于，所述的引物对具体序列为：
正向引物PAIR2-F1：5′-gcactgtaccatgcacttcc-3′，
反向引物PAIR2-R1：5′-aaggtaatcacttgaagttg-3′；
正向引物CRC1-F2：5′-gttcagcaagtggttttctg-3′，
反向引物CRC1-R2：5′-ggaatctgaaggttcagatc-3′；
正向引物PRD1-F3：5′-tgctgaattagtggcaacaac-3′，
反向引物PRD1-R3：5′-agagtttgtatagtacaaag-3′。
8.权利要求7所述的引物对在制备用于鉴定水稻减数分裂基因基因的试剂盒中的应用，所述水稻减数分裂基因为PAIR2、CRC1及PRD1。
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