CN113151540B

CN113151540B - 一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113151540B
Application number: CN202110274488.7A
Authority: CN
Inventors: 纪剑辉; 周海英; 赵祥祥; 罗玉明; 周颖君; 刘廷武; 高清松; 李正鹏
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-03-15
Also published as: CN113151540A

Abstract

本发明公开了一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记及其应用，所述应用是通过特异性分子标记OsNP1‑SCAR实现，OsNP1‑SCAR分子标记是通过特异性引物对从水稻DNA中扩增出的核苷酸序列，扩增产物经过AvaII内切酶酶切后，相关带型能够有效区分群体内基因型，从而明确其表型。本发明是第一个针对OsNP1基因内部序列所开发的特异性SCAR标记。本发明所提供的鉴定方法，能够高通量的一次进行大量样品的鉴定，区分不育单株、杂合株，具有操作简便、低成本、特异性好以及高通量等特点，能快速应用于雄性不育材料在水稻育种中的研究，并降低育种成本。

Description

一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记及其应用

技术领域

本发明属于作物分子遗传技术领域，更具体地说，涉及一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记及其应用。

背景技术

水稻是人类最主要的粮食作物之一，全球约有一半以上人口以水稻为主食。中国的水稻种植面积约占全世界的23％左右，但目前中国的水稻产量却占全世界的37％左右。从国内来看，水稻种植面积约占全国粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半。从平均单位面积产量上来看，水稻比整个粮食作物高出45.17％，其中一个重要因素就是水稻雄性不育系的发掘并不断推广和利用。雄性不育常指雄蕊发育缺陷，不能产生有功能花粉或雄配子，而其雌蕊发育正常且能接受正常花粉而受精结实。水稻中经典的“三系法”制种主要也是利用核-质互作雄性不育系、保持系和恢复系来实现三系配套来配置杂种一代。雄性不育水稻可分为细胞核质互作雄性不育与细胞核雄性不育。细胞核雄性不育包括显性核不育与隐性核不育两类。其中核不育又因其育性是否受光照、温度等外界条件影响分为光(温)敏核不育和普通核不育两种类型。至今较为成功应用的是隐性光(温)敏核不育。此外，多数水稻核不育为隐性核不育，隐性核不育多受单隐性核基因控制。本专利所分析的雄性不育即为单隐性核基因控制的雄性不育突变。

研究人员利用一个命名为OsNP1的核基因，构建了一个水稻雄性不育系。OsNP1编码一个假定的葡萄糖——调节绒毡层和花粉外壁形成的甲醇-胆碱氧化还原酶；它在绒毡层和小孢子中是特异表达的。osnp1突变体植株表现出正常营养生长，但却是对环境条件不敏感的完全雄性不育(Chang et a1.，2016)。

在利用OsNP1基因进行品种选育的过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出纯合或杂合的单株，用于进一步的回交或自交。由于在DNA编码序列上，杂合Aa型和aa型仅存在数个核苷酸的差异，在检测OsNP1基因时如果采用PCR产物扩增后再测序的话，耗时长，且成本较高。因此，有必要开发针对水稻雄性不育基因OsNP1的更快捷经济的分子标记，并将其用于后代单株的分子鉴定，以达到缩短育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记OsNP1-SCAR，利用该特异性分子标记设计的引物可有效对水稻OsNP1纯合突变体、野生型、杂合性进行基因型鉴定。本发明所要解决的技术问题之二在于提供所述的水稻特异性OsNP1-SCAR分子标记在水稻育种和生产中对水稻OsNP1纯合突变体、野生型、杂合性进行基因型鉴定的具体应用方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种水稻核雄性不育基因OsNP1的特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的水稻核雄性不育基因OsNP1的特异性分子标记在鉴定突变位点为突变位点为第二外显子405-410bp位置的TTCCGC突变为GTCCCTC的水稻核雄性不育系、杂合型或野生型水稻中的应用。

进一步地，所述的应用包括：

1)设计所述特异性分子标记的上下游引物对；

2)利用水稻DNA为模板，使用步骤1)设计的引物对扩增所述特异性分子标记；

3)使用核酸内切酶AvaII酶切扩增产物，并将酶切产物进行电泳检测；

4)根据电泳检测结果，判断水稻基因型。

进一步地，所述的引物对为：

正向引物：5′-agcaactggagaacctgcgg-3′，

反向引物：5′-cttggcttttgaagaggatacg-3′。

进一步地，根据电泳检测结果，判断水稻基因型的方法为：PCR产物不能被AvaII酶切，仍然为642bp的水稻为野生型(AA基因型)；PCR产物酶切后出现两条407bp和236bp双带型的是纯合突变体(aa基因型)；PCR产物酶切后出现642bp、407bp和236bp三条带型为杂合型水稻(Aa基因型)。

进一步地，所述的电泳检测是琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记的引物对如下：

正向引物：5′-agcaactggagaacctgcgg-3′，

反向引物：5′-cttggcttttgaagaggatacg-3′。

所述的引物对在制备用于鉴定突变位点为第二外显子405-410bp位置的TTCCGC突变为GTCCCTC的水稻核雄性不育系、杂合型或野生型水稻的试剂盒中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的分子标记特异性高：本发明提供的分子标记是本发明人经过分析突变体和野生型基因序列差异并通过实验验证得到的，能明显地将OsNP1基因纯合突变体aa、野生型AA、杂合Aa基因型进行区分，从而使本实验室所获得的籼稻品种中籼3037的OsNP1突变体后期能快速应用于育种中。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中具有低成本、高通量：目前，水稻雄性不育材料无论在育种和遗传研究中，由于其突变体完全不育，无法在当代进行保存，一般都保存杂合单株，并在第二年种植时，利用PCR扩增后测序来鉴定群体中的基因型，该过程费时费钱，同时无法大规模在生产实践中应用。本发明提供的分子标记只需进行PCR扩增和酶切，在3小时以内就可以得到最终结果，同时可以一次做几百致上千样本，且其成本极低。我们以100个样品为例，PCR和测序的费用基本在2000元左右，而通过PCR及酶切，成本在20元左右，仅为1/100左右。由于本发明的分子标记成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。此外，该分子标记可以在水稻生长的苗期进行非破坏性检测等优点，适用于商业化育种中对OsNP1基因进行检测。

(3)本发明是第一个针对OsNP1基因内部序列所开发的OsNP1基因型鉴定的特异共显性分子标记：本发明能通过一次PCR、酶切以及电泳检测的方法成功地将纯合型、杂合型和野生型进行区分。本发明所提供的OsNP1特异性分子标记是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记，可直接判断目标材料是杂合型、纯合突变型还是野生型。本发明可应用于OsNP1转基因鉴定，基因聚合以及基于MAS技术的水稻育种工作中。该标记存在于OsNP1基因内部，因此对OsNP1杂合株以及纯合突变体株的筛选能力理论值可达100％。

(4)本发明提供的分子标记应用范围广：水稻核雄性不育基因OsNP1群体后代基因型鉴定的特异性分子标记OsNP1-SCAR的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

附图说明

图1是OsNP1突变体的表型分析图，在开花期，野生型花粉形态正常，含有大量的黄色花药(图1A)，而突变体花粉空瘪皱缩，完全不育，花药呈现苍白色(图1B)，标尺：50μm；从穗形上分析，野生型能够正常结实，突变体完全不结实(图1C)；野生型植株(图1D)和突变体植株(1E)形态对比；野生型花粉KI染色(1F)和突变体花粉KI染色形态(1G)；

图2是OsNP1基因结构突变位点及基因型鉴定方法图，突变位点测序比较野生型(A)和突变体(B)；野生型和突变型基因DNA序列比较(C)；在突变位点存在AvaII内切酶酶切位点，而野生型中不存在此酶切位点(D)；

图3是OsNP1基因型的分子标记鉴定图，AA基因型不能被AvaII酶切，仍然为642bp；aa基因型经过充分酶切，呈现两条407bp和236bp双带型；Aa基因型则出现642bp、407bp和236bp三带型。泳道1为DL2000DNAmarker，泳道2-4为纯合突变基因型aa，纯合野生基因型AA，杂合基因型Aa，泳道5-50为群体后代鉴定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

材料：水稻品种中籼3037：记载

“Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.，Xue，Y.and Cheng，Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice.Plos Genetics，6”一文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1：OsNP1基因特异性分子标记及其引物设计与检测

(1)水稻核雄性不育基因OsNP1突变体的获得

将籼稻品种3037的OsNP1基因的第二外显子405-410bp位置的TTCCGC突变为GTCCCTC得到水稻核雄性不育基因OsNP1突变体。

实验表明，该OsNP1突变体在营养生长阶段与野生型没有明显差异，如图1所示，抽穗以后突变体才表现出典型的雄性不育表型，具体表现为花药呈白色透明状，不会开裂散出花粉，最终也无法产生正常的种子。将OsNP1突变体授予野生型的花粉，发现它能正常结实，且这种杂交种子能正常萌发生长，其植株在存活率与野生型植株无明显差异，表明该突变体雌性可育，因此OsNP1基因突变体的表型鉴定显示其为无花粉不育突变。

(2)设计引物及PCR扩增、酶切和电泳扩增产物

由于OsNP1突变体在目标基因的第2个外显子发生突变的位点(由TTCCGC变成GTCCCTC)存在AvaII内切酶酶切位点，而野生型中不存在此酶切位点(图2D)。因此，利用该水稻突变位点存在的AvaII内切酶酶切位点，根据分子标记的设计原理，设计一段水稻核雄性不育基因OsNP1的特异性分子标记OsNP1-SCAR(SEQ ID NO.1)，利用PCR扩增该特异性分子标记的产物进行AvaII酶切电泳，突变体由于突变形成核酸内切酶AvaII酶切位点可被酶切，而野生型中无此酶切位点无法被酶切，电泳即可区分不同基因型。在突变位点上下游设计水稻核雄性不育基因OsNP1的特异性分子标记的扩增引物对如下所示：

SEQ ID NO.2：Primer F：5′-agcaactggagaacctgcgg-3′

SEQ ID NO.3：Primer R：5′-cttggcttttgaagaggatacg-3′

利用该引物组合，在水稻DNA模板(市售DNA提取试剂盒提取的水稻基因组)中PCR扩增出642bp片段，这一片段在经过AvaII内切酶酶切以后，在野生型和突变体以及杂合材料中形成不同大小片段。野生AA型不能被AvaII酶切，仍然为642bp；纯合突变aa基因型经过充分酶切，呈现两条407bp和236bp双带型；杂合Aa基因型则出现642bp、407bp和236bp三带型(图3)(Aa实则为642bp、407bp和236bp三带型，实际上642和643在实际情况中根本不能区分大小，可以用642来代替。)

此外，为检测利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组合设计的引物是否为优化引物，在突变位点两侧还设计了其他两组引物组合(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)以及(SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7)，SEQ ID NO.4和5扩增大小为150bp，在纯合突变体中被切成57bp和94bp两个带型，但这两个带型与未酶切的150bp带型过于靠近，导致在鉴定时候带型容易混杂在一起。SEQ ID NO.6和7扩增大小为1000bp，在纯合突变体中酶切后形成589bp和412bp两个带型，但由于扩增产物偏大，增加了扩增难度，有时会导致部分样品无法扩增出产物。因此，在综合比较扩增清晰度和扩增有效性方面，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3进行扩增是优化的选择。

SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5：

SEQ ID NO.4：5′-tgggacgcgcggctggtgaa-3′

SEQ ID NO.5：5′-gacgtggtcgaaggtgaagc-3′

SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7：

SEQ ID NO.6：5′-atggcagcacttggccgcgc-3′

SEQ ID NO.7：5′-tcttgtcgccgtcgcggagg-3′

扩增反应体系为：反应体系(2×Reaction Mix)12.5μL，正向引物(Primer F，10μM)10μL，反向引物(Primer R，10μM)10μL，聚合酶(Golden DNA Polymerase，2.5U/μL)0.2μL，模板(Template)＜1μg，水(ddH₂O)补至25μL。

PCR条件为：94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

取适量PCR产物进行AvaII内切酶酶切，酶切体系为：PCR扩增产物18μL，AvaII内切酶0.1μL，AvaII内切酶Buffer 2μL。酶切体系在37℃恒温培养箱放置4h后取酶切产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，电泳条件为140v，1小时。

根据酶切产物电泳检测的带型结果判断所检测水稻基因型，AA基因型不能被AvaII酶切，仍然为642bp；aa基因型经过充分酶切，呈现两条407bp和236bp双带型；Aa基因型则出现642bp、407bp和236bp三带型(图3)，后期通过分析其表型结果发现完全和上述基因型判断结果吻合，说明雄性不育基因OsNP1基因特异性分子标记可用于OsNP1基因鉴定、杂交群体后代鉴定等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记及其应用

<130> 100

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 643

<212> DNA

<213> OsNP1-SCAR(Artificial)

<400> 1

agcaactgga gaacctgcgg ttcgtgcggc acgcgcagga cgcgccgctg gtgtcgagct 60

acaactacat cgtcatcggc ggcggcacgg cggggtgccc gctggcggcg acgctgtcgg 120

agcactcgcg cgtgctgctg ctggagcgcg gcggcctgcc gtacgccaac atgtcgagcg 180

agcagcactt cacggacgcg ctggccgaca cgtcgccggc gtcgccggcg cagcggttca 240

tctcggagga cggcgtggtg aacgcccggg cgcgggtgct cggcggcggg agctgcctca 300

acgccgggtt ctacacgcgg gcgagcaacg agtacgtgcg cgcctccggg tgggacgcgc 360

ggctggtgaa ctcgtcgtac cggtgggtgg agcgctcgct ggtggtccct ccccgacgtg 420

ccgccgtggc aggcggcgct ccgcgacgcg ctgctcgagg tcggcgtcac gcccgacaac 480

ggcttcacct tcgaccacgt caccggcacc aagatcggcg gcaccatctt cgacaactcc 540

ggccagcgcc acaccgccgc cgacttcctc cgccacgccc gcccccgcgg cctcaccgtc 600

ctcctctacg ccaccgtctc ccgtatcctc ttcaaaagcc aag 643

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2(Artificial)

<400> 2

agcaactgga gaacctgcgg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 3(Artificial)

<400> 3

cttggctttt gaagaggata cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 4(Artificial)

<400> 4

tgggacgcgc ggctggtgaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 5(Artificial)

<400> 5

gacgtggtcg aaggtgaagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 6(Artificial)

<400> 6

atggcagcac ttggccgcgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 7(Artificial)

<400> 7

tcttgtcgcc gtcgcggagg 20

Claims

1.一种水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.权利要求1所述的水稻核雄性不育基因OsNP1基因型的特异性分子标记在鉴定突变位点为第二外显子405-410bp位置的六个碱基TTCCGC突变为GTCCCTC的中籼3037水稻核雄性不育系、杂合型或野生型水稻中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括：

1)设计所述特异性分子标记的上下游引物对；

4)根据电泳检测结果，判断水稻基因型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的引物对为：

正向引物：5′-agcaactggagaacctgcgg-3′，

反向引物：5′-cttggcttttgaagaggatacg-3′。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，根据电泳检测结果，判断水稻基因型的方法为：不能被AvaII酶切，仍然为642bp的水稻是野生型；出现两条407bp和236bp双带型是纯合突变型水稻核雄性不育系；出现642bp、407bp和236bp三条带型为杂合型水稻。

6.根据权利要求3-5任一所述的应用，及其特征在于，所述的电泳检测是琼脂糖凝胶电泳检测。