KR100998133B1 - 고추의 유전자적 웅성불임성 유전자 ms3과 연관된 분자표지개발과 이를 이용한 선발 및 새로운 계통 육성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고추에서 잡종강세 육종에 의한 일대잡종 종자생산에 있어서 유럽에서 사용하고 있는 유전자적 웅성불임(GMS) 유전자 중의 하나인 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자와 연관된 분자표지를 개발하고 이 분자표지를 이용하여 새로운 품종 육성 과정 중에 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자좌의 유전자형을 판별하여 선발하는 방법은 물론 이 분자표지를 이용하여 새로운 고추 계통 및 품종을 단기간에 육성하는 방법과 전략에 관한 것이다.
고추 일대잡종 종자생산에 이용되는 방법 중에 세포질-유전자적 웅성불임성(CGMS)을 이용하는 방법이 채종효율과 품종보호 기능면에 있어서 가장 우수하다고 알려져 있으나 환경이나 특정한 고추 형태에 있어서 웅성불임성이 불안정한 문제 때문에 지금까지는 이를 모든 고추에 이용할 수 없는 상황이다. 따라서 이들 고추에 대해서는 또 다른 유전자적 웅성불임성(GMS)을 많이 사용하고 있다. 그러나 지금까지 알려졌거나 이용되고 있는 모든 유전자적 웅성불임 유전자는 열성이므로 새로운 계통 및 품종육종 과정에 있어서 유전자적 웅성불임성(GMS)을 우리가 원하는 계통에 도입하고자 할 때, 열성 유전자 여교잡 육종법을 이용하게 되는데, 이는 가임 개체들 중에 동형접합체(homozygote, Ms 3 Ms 3 )와 이형접합체(heterozygote, Ms 3 Ms 3 )를 당대에 표현형으로 구분할 수 없으므로 반드시 후대검정을 통해 이를 구분하고 원하는 이형접합체 개체를 선발하여야 한다. 따라서 신품종을 개발하는데 필요한 육종연한이 길어짐은 물론 많은 노동력과 넓은 포장을 필요로 하게 된다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는 사용하고자 하는 유전자적 웅성불임성 유전자와 연관된 분자표지를 개발하고 이를 이용하여 육종 과정 중에 세대별로 개체 간 유전자형을 판별하여 원하는 유전자형을 당대에 선발할 수 있는 기술을 개발하여야 한다. 본 발명에서는 유럽에서 주로 사용되고 있는 유전자적 웅성불임 유전자의 하나인 엠에스쓰리(ms 3 )에 대한 연관마커를 개발하고 이를 이용하여 새로운 계통 및 품종을 육성하는 방법 및 전략에 관한 것으로서 엠에스쓰리(ms 3 )에 의해 웅성 가임과 불임이 분리가 일어나는 집단을 만드는 단계, 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법과 벌크분리분석(BSA) 방법을 함께 사용하여 연관 분자표지를 탐색하는 단계, 그리고 육종 프로그램에 쉽게 적용할 수 있는 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 전환하는 단계, 개발된 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자형을 판별하고 선발하는 단계 및 본 기술을 이용하여 새로운 계통 및 품종을 개발하는 전략을 제시하는 것에 특징이 있다.
이 분자표지는 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용하여 새로운 웅성불임친을 개발하는 것에 적용될 수 있으며, 분리 집단에서 웅성 가임의 동형접합체와 이형접합체를 구분할 수 있어 후대검정을 할 필요가 없기 때문에 기존의 전통적인 육종 방법에 비하여 웅성불임친 육종 연한을 획기적으로 단축시킬 수 있어 육종효율을 향상 시킬 수 있을 뿐만 아니라 적은 노동력 투입과 육종에 필요한 포장 사용량 감소 등에 따른 육종비용 절감 효과가 매우 클 것으로 판단된다.
고추, 일대잡종종자, 에프원, 채종, 유전자적 웅성불임성, 지엠에스, 분자표지, 마커, 에이에프엘피, 캡스

Description

고추의 유전자적 웅성불임성 유전자 ms3과 연관된 분자표지 개발과 이를 이용한 선발 및 새로운 계통 육성 방법{Development of molecular markers linked to the ms3 gene in pepper genic male sterility and their use for identifying the ms3 allele and developing new inbred lines}
본 발명은 고추에서 잡종강세 육종에 의한 일대잡종 종자생산에 있어서 유럽에서 사용하고 있는 유전자적 웅성불임(GMS) 유전자 중의 하나인 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자와 연관된 분자표지를 개발하고 이 분자표지를 이용하여 새로운 품종 육성 과정 중에 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자좌의 유전자형을 판별하여 선발하는 방법은 물론 이 분자표지를 이용하여 새로운 고추 계통 및 품종을 단기간에 육성하는 방법과 전략에 관한 것이다.
우리나라와 미국을 비롯하여 유럽의 많은 농업선진국의 재배용 고추는 대부분 교잡육종법과 잡종강세육종법을 이용한 일대잡종 품종(F1)이며, 이들 품종의 종자생산(채종)을 위해서는 제웅교배 및 웅성불임성이 이용 되고 있다. 제웅교배를 이용한 일대잡종(F1) 종자 생산에는 많은 노동력과 비용이 소요 되어 채종 경제성이 낮지만 여러 가지 제한 요인 때문에 웅성불임성 사용이 곤란한 경우이거나 웅성불임성을 이용한 채종 기술이 확립되지 못한 후진 농업 국가에서는 아직까지도 이 방법이 성행하고 있다.
일대잡종 종자 생산에 사용되고 있는 웅성불임성은 불임을 유도하는 유전자가 핵 내에 존재하는지 또는 세포질 내에 존재하는지에 따라서 유전자적 웅성불임성(GMS)과 세포질-유전자적 웅성불임성(CGMS)으로 크게 구분할 수 있다. 유전자적 웅성불임성은 불임을 야기하는 유전자가 핵 내에 존재하며 열성 동형접합체의 경우에만 불임이 표현형으로 나타나게 되며 전 세계적으로 약 20개의 유전자가 보고되고 있다. 반면 세포질-유전자적 웅성불임성은 불임을 만드는 유전자는 세포질의 미토콘드리아에 존재하며 우성으로 작용하는 핵 내의 회복유전자가 존재할 경우에는 가임이 되지만 회복유전자가 열성 동형접합체일 경우에는 불임이 된다. 전자의 경우에는 반드시 매세대마다 웅성불임 유전자좌가 열성 동형접합체인 불임개체와 이형접합체와의 교잡을 통해서 웅성불임성을 유지해야 하는 반면 후자의 경우에는 세포질이 불임이고 회복유전자좌가 열성 동형접합체인 불임개체와 세포질은 정상이면서 회복유전자좌가 열성 동형접합체인 가임개체와의 교잡을 통해서 불임을 유지할 수 있다.
최근에는 육종기술의 발달에 힘입어 거의 대부분의 나라에서 일대잡종 고추 종자생산 방법이 제웅교배보다는 채종효율성이 높은 웅성불임성을 이용하는 쪽으로 바뀌어 가고 있는 추세이다. 유전자적 웅성불임성은 거의 대부분의 유럽 국가들과 중국, 미국 등의 나라에서 가장 많이 사용되고 있는 방법이며 우리나라의 경우에도 하우스 재배용 풋고추 품종이나 단기간에 새로운 품종을 개발할 목적으로 사용되고 있으나, 이 방법은 전술한 바와 같이 웅성불임성이 열성유전자에 의해 조절되기 때문에 모계를 육성하는데 많은 시간과 노력이 필요하며, 세포질-유전자적 웅성불임성에 비하여 채종포의 면적이 2배 이상 소모되어 종자 생산비가 증가된다는 단점이 있다.
우리나라에서는 고추 일대잡종 종자생산에 있어서 제웅교배와 유전자적 웅성불임성 (GMS)의 단점을 보완하고 채종효율 향상은 물론 신품종의 유출을 막기 위한 적극적인 방법으로서 세포질-유전자적 웅성불임성(cytoplasmic-genic male sterility, CGMS)의 이용 체계를 확립하여 사용해 오고 있으며 이 기술은 전 세계적으로 유일할 뿐만 아니라 가장 경제적인 채종방법으로 알려져 있다. 그러나 세포질-유전자적 웅성불임(CGMS) 체계를 이용하기 위해서는 웅성불임을 유지하기 위한 방법으로 반드시 자연계에 존재하는 육성소재로부터 안정적인 유지친(B line)을 선발하거나 선발된 자원으로부터 우수한 특성을 갖는 계통을 재육성해야 하는데 이 과정에서 환경이나 유전적인 요인에 의하여 웅성불임성이 불안정성하게 나타나는 현상 등으로 인해 신품종을 조속히 육성하는데 많은 어려움이 있다. 이러한 이유로 인하여 우리나라를 제외한 거의 모든 나라에서 아직도 이 방법을 일대잡종 종자생산에 사용하지 못하고 있는 상황이다.
따라서 많은 나라에서 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용한 일대잡종 종자생산 체계를 확립하는 것이 매우 중요한 육종과정 임은 두말할 나위도 없다. 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용하여 웅성불임친을 개발하는 기존의 방법을 살펴보면, 일반적인 열성 유전자 여교잡 육종 방법을 사용하게 되는데, 크게 우량한 특성을 가지고 잡종강세를 많이 보이는 계통(모계)에 유전자적 웅성불임성(GMS)을 도입하는 단계와 형매교배(sib crossing)를 통한 유전자적 웅성불임성(GMS) 유지하는 단계로 나눌 수 있다. 우선 유전자적 웅성불임성(GMS)을 도입하는 방법을 살펴보면, i) 모계를 교배하여 일대잡종(F1, Ms 3 ms 3 )을 얻고 이 후에 자가수정하여 에프투(F2) 세대에서 웅성불임 개체(ms 3 ms 3 )를 선발하고 여기에 다시 모계를 여교잡하는 방법과 ii) 바로 모계와 여교잡하여 이들을 각각 자가수정하여 분리가 일어나는 집단에서 웅성불임 개체(ms 3 ms 3 )를 선발하는 방법이 있다. 실제 육종에서는 전자보다 후자의 방법이 주로 많이 이용되는데, 이는 육종 연한이 전자의 방법보다 짧기 때문이다. 위의 두 방법에서 대부분의 원예적 특성이 모계 쪽으로 고정이 된 후에는 형매교배(sib crossing)를 통하여 웅성불임성을 유지하게 되는데 가임(Ms 3 Ms 3 또는 Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )이 분리되었을 때, 가임을 불임에 교배한 후대에서 모두 가임이 나오는 경우는 교배한 가임이 Ms 3 Ms 3 이고, 가임과 불임이 분리가 일어나는 경우는 교배한 가임이 Ms 3 ms 3 이다. 따라서 분리가 일어나는 집단을 선발하고 여기에서 가임(Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )을 교배하면 계속 1:1 (가임:불임) 웅성불임 계통을 유지할 수가 있다.
또한 위의 방법과는 다르게 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용한 상용 품종 (F1 varieties)으로부터 새로운 웅성불임계통을 개발하는 방법이 있다. 우선 일대잡종종자(F1)를 자가수정하여 그 후대(F2)에서 특성이 좋은 가임 개체(Ms 3 ms 3 또는 Ms 3 ms 3 )를 선발하고 자가수정하여 다음 세대(F3)에서 모두 가임이 나타나면 에프투(F2) 개체의 유전자형은 Ms 3 Ms 3 이고, 에프쓰리(F3)에서 가임과 불임이 분리되면 에프투(F2) 개체의 유전자형은 Ms 3 ms 3 이다. 이 때 동형접합체(Ms 3 Ms 3 )는 선발하지 않고, 이형접합체(Ms 3 ms 3 )만 선발하여 자가수정한다. 또 이와 함께 웅성불임성이 육성 중간에 소실되는 것을 막기 위해 에프투(F2) 세대의 가임 개체와 불임 개체를 교배하는 형매교배(sib crossing)를 매 세대마다 실시하게 된다. 그리고 선발된 이형접합체(Ms 3 ms 3 )의 자가수정을 계속 반복 및 선발하여 나머지 특성들이 상당히 고정(homozygous)되었을 때, 위의 두 방법에서와 마찬가지로 형매교배(sib-crossing)를 통하여 불임 모계를 유지하게 된다. 위에 열거한 어떠한 방법을 사용하더라도 유전자적 웅성불임성을 이용한 일대잡종 종자생산에 있어서는 채종포에서 웅성불임 계통에서 발생하는 50％의 가임주를 반드시 제거해야 하는 번거로움이 따르게 된다.
[문헌 1] Daskaloff, S. 1968. A male sterile pepper (C. annuum L.) mutant. Teor. Appl. Genet. 38:370-372.
[문헌 2] Lee, J., Yoon, J.B., and H.G. Park. 2007. A CAPS marker associated with the partial restoration of cytoplasmic male sterility in chili pepper (C. annuum L.). Mol. Breed. 21:95-104.
[문헌 3] Shifriss, C. 1973. Additional spontaneous male-sterile mutant in C. annuum L. Euphytica 22:527-529.
[문헌 4] Shifriss, C. 1997. Male sterility in pepper (Capsicum annuum L.). Euphytica 93:83-88.
[문헌 5] Shifriss, C and I. Rylsky. 1972. A male sterile (ms-2) gene in 'California Wonder' pepper (C. annuum L.). HortScience 7(1):36.
최근 우리나라를 비롯한 미국, 유럽 등의 다른 나라에서는 GMS 이용이 점차적으로 증대되고 있는 추세이나, 열성유전에 따른 선발의 어려움, 긴 육종연한, 그리고 채종포에서의 과도한 가임주 제거 노력 등이 문제점으로 남아 있다. 그 일례로서 가임 개체들 중에 동형접합체(homozygote, Ms 3 Ms 3 )와 이형접합체(heterozygote, Ms 3 ms 3 )를 표현형으로 구분할 수 없어 후대검정을 수행해야 하기 때문에 육종 연한이 많이 걸리게 될 뿐만 아니라 많은 노동력과 넓은 포장을 필요로 하게 된다. 또한 형매교배(sib crossing) 시, 표현형으로 선발된 가임주 모두 (Ms 3 Ms 3 와 Ms 3 ms 3 )를 불임주(ms 3 ms 3 )와 교배하게 된다. 하지만 당대에 유전자형만 알 수 있다면, 가임주 중에 동형가임주(Ms 3 Ms 3 )는 교배할 필요없이 이형가임주(Ms 3 ms 3 )만 교배하면 된다. 따라서 유전자형을 구분할 수 있는 공우성(codominant) 분자표지를 개발한다면 이러한 문제들을 해결할 수 있을 것이다.
본 발명은 유전자적 웅성불임성(GMS)을 일으키는 것으로 확인된 유전자 중의 하나인 엠에스쓰리(ms 3 )와 연관된 공우성 분자표지를 개발한 것으로, ms 3 에 의해 웅성 가임과 불임이 분리가 일어나는 집단을 만드는 단계, 증폭단편길이다형성(AFLP, amplified fragment length polymorphism) 방법과 벌크분리분석(BSA, bulked segregant analysis) 방법을 함께 사용하여 연관 분자표지를 탐색하는 단계, 그리고 육종 프로그램에 쉽게 적용할 수 있는 증폭단편절단다형성(CAPS, cleavage amplified polymorphic sequences) 분자표지로 전환하는 단계, 개발된 증폭단편제한다형성(CAPS) 분자표지로 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자형을 판별하고 선발하는 단계 및 개발된 분자표지를 이용하여 새로운 웅성불임 계통을 육성하는 방법과 전략에 관한 단계로 이루어진 것에 특징이 있다.
본 발명은 유전자적 웅성불임성(GMS)을 일으키는 유전자인 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자와 연관된 공우성 분자표지를 개발한 것으로서, 도1와 2에서와 같이 유전자적 웅성불임(GMS)이 분리되는 집단에서 가임과 불임의 구분 및 가임 중에 동형접합체(Ms 3 Ms 3 )와 이형접합체(Ms 3 ms 3 )를 구분할 수 있어, 불필요한 가임의 자가수정을 수행하지 않아도 되고 유전자적 웅성불임성(GMS)의 소실 위험 방지를 위한 형매교배(sib crossing)를 할 필요도 없게 된다. 또한 불임 모계의 고정화를 빨리 진행시킬 수 있어서 불임 모계 유지를 위한 형매교배(sib crossing) 시 일어나는 표현형의 불안정성도 해결할 수 있다.
본 발명에서는 유전자적 웅성불임성(GMS)을 일으키는 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자와 연관된 공우성 분자표지를 개발하기 위해서, 우선 엠에스쓰리(ms 3 )에 의해 웅성 가임(Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )이 분리되는 집단을 만들었다. 유전자적 웅성불임 엠에스쓰리(ms 3 )를 사용하여 개발된 유럽형 F1 품종(Ms 3 ms 3 )을 자가수정하여 작성한 F2 분리집단에서 불임개체(ms 3 ms 3 )를 선발한 후 한국형 세장과인 가임 개체(Ms 3 Ms 3 )와 교잡하였다. 이들의 F1 개체들은 모두 이형접합가임체(Ms 3 ms 3 )일 것이므로 이를 다시 불임개체에 교배하여 후대에서 가임(Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )이 1:1로 분리되는 집단을 작성하였다. 이와 같이 작성된 집단에서 가임개체와 불임개체간 두 번의 형매교배(sib crossing)를 통해 가임(Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )이 1:1로 분리가 일어나는 집단을 육성하였다.
다음은 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법과 벌크분리분석(BSA) 방법을 함께 사용하여 엠에스쓰리(ms 3 ) 연관 분자표지를 탐색하였는데, 이는 고춧잎에서 DNA를 추출하는 단계 및 증폭단편길이다형성(AFLP)분석과 벌크분리분석(BSA) 단계로 나눌 수 있는데, 고춧잎에서 DNA를 추출하는 단계는 아래 실시예A에서 자세하게 설명하였다. 벌크분리분석(BSA)은 Michelmore 등(1991, Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832)의 방법을 응용하여 수행하였는데, 가임(Ms 3 ms 3 )과 불임(ms 3 ms 3 )이 1:1로 분리되는 집단에서 표현형 분석을 통하여 가임 8개체, 불임 8개체의 DNA를 각각 풀링(pooling)하였다. 증폭단편길이다형성(AFLP)분석은 Vos 등(1995, AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23:4407-4414)의 방법에 따라 전선택증폭(pre-selective amplification) 과정 후에 선택증폭(selective amplification)을 수행하였다. 총 768개의 프라이머(primer) 조합(E-ANN/M-GNN, E-ANN/M-CNN 및 E-CNN/M-TNN)에 대한 분석을 실시하였다. 그 결과 3개의 분자표지[E-CAG/M-TGC (201-bp), E-AGC/M-CTT (178-bp), E-AGG/M-CCC (276-bp)]를 최종적으로 선발하였고(도3), 이를 분리집단의 188개체에 적용한 결과 표현형과 마커유형이 정확히 일치함을 확인하였다(도3).
그리고 이 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지를 육종 프로그램에 쉽게 적용할 수 있는 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 전환하기 위해서 증폭단편길이다형성(AFLP) 단편의 내부 및 외부의 염기서열을 다음과 같이 분석하였다. 증폭단편길이다형성(AFLP) 젤로부터 목적하는 단편을 잘라낸 다음 증폭된 DNA를 용출하고 이를 기질(template)로 사용하여 동일 프라이머 조합으로 선택증폭(selective amplification)을 수행하였다. 증폭 산물을 아가로스(agarose) 젤에서 확인하고 DNA를 용출한 다음 증폭산물(PCR product)을 바로 염기서열결정(direct sequencing)하였다. 이 염기서열 정보를 바탕으로 게놈워커키트[GenomeWalker Kit, 클론텍(Clonetech)사]를 이용하여 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지 주변에 연결되어 있는 염기서열을 분석하였다(서열목록1, 2 및 3). 그 다음 가임개체(Ms 3 ms 3 )와 불임개체(ms 3 ms 3 )의 염기서열을 비교하였다. 그 결과 서열목록3의 염기서열에서 이코알원(EcoRI) 제한효소 자리에서 염기서열차이가 있음을 확인하였고 이를 이용하여 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지를 개발하였다(도4). 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지 실험 방법은 아래 실시예B에서 자세하게 기술하였다.
마지막으로 개발된 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 엠에스쓰리(ms 3 ) 유전자형을 판별하고 선발하는 방법은 다음과 같다. 도4에서 보듯이 하나의 윗밴드만 나타나는 개체는 유전자형이 ms 3 ms 3 로 웅성불임개체이고, 세 개의 밴드가 보이는 개체는 유전자형이 Ms 3 ms 3 로 웅성가임개체이다(도4). 그리고 도1와 2에서와 같이 여교잡(도1)이나 자가수정(도2)을 하여 이형접합체(Ms 3 ms 3 )만을 계속 선발하여 새로운 웅성불임친을 개발하게 되는데, 도1의 경우 육종 과정 중간에 생기는 분리집단에서 표현형적으로 모두 가임이기 때문에 동형접합체(Ms 3 Ms 3 )와 이형접합체(Ms 3 ms 3 )를 구분할 수 없으나, 본 발명에서 개발한 분자표지를 사용하면 이를 구분할 수 있고 이형접합체(Ms 3 ms 3 )만을 선발할 수 있다. 그리고 도2의 경우도 육종 과정 중간에 생기는 분리집단에서 본 발명의 분자표지를 사용하면 웅성가임 중에 동형접합체(Ms 3 Ms 3 ) 와 이형접합체(Ms 3 ms 3 )를 구분할 수 있기 때문에 쉽게 이형접합체(Ms 3 ms 3 )를 선발할 수 있으므로 육종연한을 크게 단축시킬 수 있다.
A. DNA 추출
1. 어린 고추 잎 0.1g을 1.5㎖ 튜브에 채취하여 액체질소를 이용하여 잎을 완전히 파쇄하고, 60℃에 보관한 DNA 추출 버퍼(DNA extraction buffer) (50mM 트리스-염산(Tris-HCl); 20mM 이디티에이(EDTA); 1.4M 염화나트륨(NaCl), 0.5％ 에스디에스(SDS))를 550㎕씩 첨가하고, 0.05g 피브이피(PVP)와 12.5㎕ 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 넣어 잘 섞은 다음 65℃ 진동수조에서 2시간 반응시켰다.
2. 반응 후 동량의 클로로포름:아이소아밀알콜(24:1)을 첨가하고 충분히 섞은 후 12,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 상등액을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 그리고 2배의 에탄올(ethanol)을 넣고 조심스럽게 섞으며 DNA를 침전시켰다.
3. 침전된 DNA를 건져내고 70％ 에탄올로 두 번 씻어낸 후, 65℃ 오븐에 넣어 말리고 멸균된 3차증류수(autoclaved TDW)를 넣어 DNA를 녹인다.
4. 티이 버퍼(TE buffer)에 녹아있는 DNA 튜브에 RNA 분해효소(RNase) 1㎕를 넣고 37℃에 1시간 넣어둔다. 그리고 DNA 농도는 DNA 형광계(fluorometer, Hoefer Co.)를 이용하여 10ng/㎕ 농도로 맞추었다.
B. 증폭산물절단다형성(CAPS) 분석
1. 위에서 추출한 DNA를 다음 두 개의 프라이머(primer) 5'-CCTGTTGGGTC-ACCACCTCAGCAA-3'와 5'-TGCGGATGACGTTGTTCACCTTTTCA-3'로 중합효소반응(PCR) 증폭[94℃ 3분 전변성(pre-denaturation); 94℃ 45초 변성(denaturation); 66℃ 1분 프라이머접합(annealing); 72℃ 1분 중합반응(extension); 40회 반복 후; 72℃ 5분 추가중합반응(post-extension)]하였다.
2. 증폭산물(PCR product)을 EcoRI 제한효소(New England Biolab사)로 37℃ 2시간 처리한 후, 1.2％ 아가로스(agarose) 젤에 고정전압 200V로 1.5시간 동안 전기영동하여 자외선투과조명기(ultraviolet transilluminator) 위에서 디지털 카메라로 이미지를 얻었다(도4).
3. 도4에서 보듯이 하나의 윗밴드만 나타나는 개체는 유전자형이 ms 3 ms 3 로 웅성불임개체이고, 세 개의 밴드가 보이는 개체는 유전자형이 Ms 3 ms 3 로 웅성가임개체이다.
제1도는 고추 잡종강세육종에서 유전자적 웅성불임성(GMS)과 연관된 분자표지를 사용하여 선발했을 때, 유전자적 웅성불임친을 개발하고 이를 유지하는 새로운 육종 전략의 개요도
제2도는 고추 잡종강세육종에서 유전자적 웅성불임성(GMS)과 연관된 분자표지를 사용하여 선발했을 때, 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용하여 개발된 상용 품종에서부터 새로운 웅성불임친을 개발하고 이를 유지하는 새로운 육종 전략의 개요도
제3도는 고추에서 유전자적 웅성불임성(GMS) 유기 유전자인 ms 3 과 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지들
제4도는 고추에서 유전자적 웅성불임성(GMS) 유기 유전자인 ms 3 과 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지인 E-CAG/M-TGC를 증폭단편제한다형성(CAPS) 분자표지로 전환한 그림
<110> Yoon Jae Bok; Pepper and Breeding Institute <120> Development of molecular markers linked to the ms3 gene in pepper genic male sterility and their use for identifying the ms3 allele and developing new inbred lines <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 651 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 gaattcaggc tatccaaggc tggatatagg tggttggatt gggtaacagg gggcggtcct 60 tggtcctgga tggacttggg atgcccatta caataaggcc cagggttggg tcgtgtcaga 120 tctccatgga caacctgcta agagaatcaa caaccacgtt agatttactt gggtgatagt 180 gtagagtcat atcatagtcc tttagaaact caagacatct cctttgcctc aaattctttt 240 ccttctgggt taacgcatac tacaagctct tgtgatcaga ataaatgtca acatgagctc 300 cataaaagta ctggcgctag atcttcaagg caaatacaca tccaataact ccaaatcatg 360 ggtcagataa ttctgctcac gtactttcaa ctgcctagaa ggatatataa ccacctctcc 420 atactacacc aacacacaac ccagtcctac acggtacaca tcaccatata ccacgaagcc 480 atcagtaccc tagggcaggg tcaaaatagg agcagaagtc aacttgtctt tcaacttctc 540 aaagcttccc tcataggcat cggaccatag aaacttcacc ttcttcttgg tcaacatagt 600 caatagagca acaataaatg ataagctctc tccacaaacc tcttataata a 651 <210> 2 <211> 1079 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 2 ctgtagtgtt tgccttaaag atttggaggc attacttgta tggggtgcat gtagatgtgt 60 tcacagatca caaaagcctg cagtatgtgt tctctcagaa agatttgaat ttgcgtcaga 120 gaaggtggtt agagttattg aaagattatg acatgagtgt tctgtatcat ccgggcaagg 180 ccaatgtagt ggatgatgct ctcagtagat tgtctatggg tagtgttgct catgttgagg 240 atgataagaa gaattcagct caggaagttc atcagctttc ccgactaggt gttctcctag 300 ttgattcagg agagggaaat atatgggttc agagtagttc agaatcatct ctagtttccg 360 aggtgaaaga aaattaggat agagatccca gtcttgtcaa gttaaaaaag tcagtcaagg 420 atcagaaagt agagatttta tcccaaaggg gagatggtgt tttgtgttgt cagggtcgcc 480 tatgtgtgcc aggtatagat gacttgaggc aacgaattct tgtagaagtg catggtgcat 540 gctactctat tcatccatgg gtcattaaga tataccgcga cttatgggag atttattaat 600 ggagtgagat gaagagagat actatagagt ttgtggataa gtgctctaca taccagcagg 660 ttaagataga gcatcagaaa cctagtgggt ccatatagga gtttaatatt cctacttgga 720 agtgagaaaa agtgaacatg gaattcgtga cggttttgcc ttgtactcgt cattagcata 780 attcagtttg ggtcattgta gacaggatga caaatatcct atttttttcc agtacatacc 840 tcttattcgg ctgaggatta cgccaaattt tacatcagag agttggtcag attgcacggt 900 gttccattat ctattatctc aaacagaggt acccggttca cctctcattt ctggaaagct 960 ttccaaaaag gtcttggtac ccaagttctt ctcagtacag ccttccatac tcagacagat 1020 ggtcaagaag aaaggatcat tcagacttta gaagatatgc taacggggtg tgcaatgat 1079 <210> 3 <211> 1520 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 3 caatgtgttg aacaaagata ggggcatcaa gttgatactt tcccctaagt cactcagagc 60 atggaccact tcactattac caatctgaat gggaagggtg aacctctctg agtccttaag 120 ctttttgggc atctttttgg taatcgtaaa actgcactct tcagtgagta ctaccacttt 180 tacatcctgc aatttaactt tattagccac cacatccctc aagtacttag catacttggg 240 cataccctgc aaaatatcta acaaagttaa gttaatgtga agctctctga acgtgtcaaa 300 gaacttcttg aaacaagaat cctccttcat ttttatttac ctctgaggaa aagaaagtgg 360 tggcatctgc ttcttctctg gttgagtaac ttttgttttt aagtactcag acttctttga 420 attatcaaca actttttcaa atacctgttg ggtcaccacc tcagcaacta cctccttagc 480 aacctttgag gttctccatg aagctctcta ctactcctca aggtgattgc cataacttgt 540 tttggatttt ctatatctac gggcaaccca ccttgaggcg tagcatttaa tttttgtgat 600 aactacccca actgtaactc taaacttcat gtggtagctt gttgattttt tatatccaca 660 gccaactgtg tctggttagc tagaatctgc ttgattatat cttccaagta gctacttgaa 720 tgatttcctt gtgcctgtgg ttactgtatt tgttgttgtt gggaattcca gggctgattt 780 agtggctgag tatgccattt catgttgtag aaatttccat aatttttcct ttgagcattt 840 cctacatata tcgcatattc aggattggac gcacatatgg ccgcagaatg accactatgt 900 ccgcaaacct tgcaccaatc actagtttgt tgaactgcat taactattgt tttaggctgt 960 gtagctccta atttcaggct gctgaattga gtcaatcata tatttcaatg tcgcaaccta 1020 agattataaa gcagtaaatt ggtccacctc caatacacct gcaattttct ttgtggcact 1080 cctagaatca ccatgccatt atggatttcc ttgagctatg tggttcagta aagtgtacag 1140 ctcatcatat gacatctcaa gagcttgacc acctgcagct gaatctaaca aagttttcat 1200 attctgatta agagcctcta caaaagtatg agcaagtacc tcattggact attaatgatg 1260 tgtacagtct cgaagaagag tcttgaacct ctcctaagca tgataaatat tgtcttctag 1320 atttttttga attacactat ttcactacga agtcacacag tcttacgaga cgggaagaac 1380 tgaataagga attttctggc tatgtcatcc aatgatgcga ttgaattttt tggttttgca 1440 ttcaactatt ttttttcttt accaattaat gaaaaggtga acaacgtcat ccgcacatag 1500 tctgcattca cacccgtagg 1520

Claims (4)

  1. 고추에 있어서 유전자적 웅성불임성 유전자 엠에스 쓰리(ms3 )에 의해 일어나는 유전자적 웅성불임성의 유전자형(Ms3Ms3 , Ms3ms3 또는 ms3ms3 )을 판별하기 위해 사용하는 염기서열1 또는 염기서열3으로 표시되는 마커.
  2. 청구항 제1항에 따른 마커를 사용하여 유전자적 웅성불임성 유전자 엠에스 쓰리(ms3 )에 의해 일어나는 유전자적 웅성불임성의 유전자형(Ms3Ms3 , Ms3ms3 또는 ms3ms3 )을 판별한 후 유전자형 Ms3ms3 와 ms3ms3 를 선발하여 모계로 사용하는 것을 포함하는 고추의 웅성불임 계통 육성방법
  3. 삭제
  4. 삭제
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