CN117551807A - 一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用，属于分子遗传学技术领域。所述InDel分子标记为InDel‑NR53；分子标记InDel‑NR53位于玉米6号染色体105125244‑105125378bp处；所述分子标记InDel‑NR53的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明的InDel分子标记可以检测鉴定玉米窄叶性状，可简便、快捷、高通量的用于育种实践，加速了玉米的育种进程。

Description

一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用。
背景技术
玉米是全球重要的粮食作物和经济作物，也是重要的能源和工业原料，随着畜牧业、工业及能源产业的不断发展，玉米需求量也在逐年增加。我国可耕地面积出现减少趋势，依靠增加种植面积来提高玉米产量的空间有限，提高单产成为增加我国玉米产量的重要措施，对于确保我国粮食安全具有重要作用。
近年来，玉米育种方向逐渐由追求单株产量向群体产量转变，增加种植密度来提高玉米单位面积产量，是解决我国耕地面积减少与玉米需求量增加这一问题的有效方法，而种植密度的增加需要耐密理想株型的改良。作物株型包括叶型、根型、茎型和穗型等几个方面，玉米理想株型要求植株的穗上叶较窄且上冲，穗下叶平展宽大且叶片厚实，叶脉坚挺以维持植株挺立姿态，因此玉米的叶片宽度和长度等特性是影响种植密度的重要农艺性状。
叶片是玉米进行光合作用的重要场所，也是进行蒸腾作用和抗逆作用的主要器官，高密度种植条件下，叶片较宽的群体容易出现叶片重叠相互遮荫的问题，造成冠层发育不良，通风透光性差，加剧病虫害发生的风险，最终影响玉米产量。合理的叶片宽度能够减少植株的避荫反应，改善植株形态和群体的光照分布及通风透气性，提高光合作用，有利于干物质的积累，使个体间竞争最小化。选育适宜高密度种植的窄叶品种是改善植株群体效应和提高玉米产量的一种重要途径。
分子标记具有数量大、简便快速、不受环境条件影响等优点，同时能提供丰富完整的遗传信息，广泛应用于种质资源鉴定、QTL定位和分子标记辅助选择等方面。其中，插入缺失(Insertion Deletion,InDel)标记是一种常用的基于DNA水平差异的分子标记，根据插入缺失位点可以设计扩增这些位点的PCR引物。利用与目的基因紧密连锁的InDel标记，可以通过辅助回交选择及辅助系谱选择的方法，减轻连锁累赘，聚集优异基因，提高选择效率，推动育种工作的进展。
目前对玉米宽窄叶基因的研究还不多，有报道表明，叶宽基因ZmNL4(Gao et al.,2021)和叶窄基因DNL2(Han et al.,2022)分别定位在玉米4号染色体和9号染色体上。专利CN111088389A在玉米4号染色体中发现了控制玉米窄叶基因型的SSR分子标记NL16-409和控制玉米宽叶基因型的SSR分子标记NL16-665。专利CN112029897A在玉米2号染色体中发现了与玉米雄穗下连续多叶位叶宽主效QTL紧密连锁的SNP标记。但玉米6号染色体上控制窄叶的基因未见报道，且在ZZY53和ZZY78两个分子标记之间也没有与窄叶基因相关的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记及其应用。利用本发明的InDel分子标记可以检测鉴定玉米窄叶性状，可简便、快捷、高通量的用于育种实践，加速了玉米的育种进程。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记为分子标记InDel-NR53；所述分子标记InDel-NR53的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
CTGGAGTAGCGCAGTAGAGTGGCTGCCGTGTGCAGCTTATAGGCAGGCAAGCA GGCAGGCAGGCAGCCTATATAGGTAACGCAGCTGTCGAATGGAAGGCGCAAATCCCT AATTCCAGAATGAACCAGCAAGCACAACT。(SEQ ID NO.1)
本发明的分子标记InDel-NR53与野生型相比，存在2个位点的多态性和13个核苷酸的插入。
本发明的第二方面，提供上述InDel分子标记在如下(1)或(2)中的应用：
(1)早期筛选或鉴定玉米种质资源的叶宽性状；
(2)玉米分子标记辅助育种。
进一步的，上述应用中，所述玉米玉米分子标记辅助育种具体为玉米窄叶耐密种质创新及杂交种选育。
本发明的第三方面，提供用于扩增上述分子标记InDel-NR53的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；具体如下：
上游引物：5’-CTGGAGTAGCGCAGTAGAGTG-3’；(SEQ ID NO.2)
下游引物：5’-AGTTGTGCTTGCTGGTTCAT-3’。(SEQ ID NO.3)
通过上述引物对扩增的与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记特征条带为139bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
若通过上述引物对扩增的条带大小为126bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表示叶片表型为正常叶宽。
CTGGAGTAGCGCAGTAGAGTGGCTGCCGAGTGCAGCTAGAGGCAGGCAGCCAG CCTATATAGGTAACGCAGCTGTCGAATGGAAGGCGCAAATCCCTAATTCCAGAATGA ACCAGCAAGCACAACT。(SEQ ID NO.4)
本发明的第三方面，提供含有上述引物对的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒中还包括：DNA模板、Taq Master Mix和ddH2O。
本发明的第四方面，提供上述引物对或试剂盒在如下(1)或(2)中的应用：
(1)早期筛选或鉴定玉米种质资源的叶宽性状；
(2)玉米分子标记辅助育种。
进一步的，上述应用中，所述玉米玉米分子标记辅助育种具体为玉米窄叶耐密种质创新及杂交种选育。
本发明的第五方面，提供一种检测玉米窄叶性状的方法，包括以下步骤：
以待测玉米的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID NO.1的纯合玉米的叶宽低于所得PCR产物序列为SEQ ID NO.4的纯合玉米的叶宽。
优选的，PCR扩增的反应体系为：0.5μl浓度为10μlmo1/L的SEQ ID No.2所示的单链DNA；0.5μl浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.3所示的单链DNA；1μl浓度为100ng/μl的基因组DNA；5μl 2×Taq Master Mix；3μl ddH2O。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；10℃保存。
本发明的第六方面，提供一种鉴定与窄叶性状相关的玉米基因型的方法，包括以下步骤：
以待测玉米的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若扩增出一条大小为139bp的条带，表明玉米为叶片表型为窄叶的纯合基因型；若扩增出一条大小为126bp的条带，表明玉米为叶片表型为正常叶宽的纯合基因型；若扩增出大小分别为139bp和126bp的条带，则表明玉米为杂合基因型。
本发明的有益效果：
本发明首次从玉米6号染色体上筛选鉴定出一个与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记，利用本发明的InDel分子标记能够在早期准确的鉴定玉米的窄叶性状，具有简便快捷、高效准确、重复性好、特异性高等优点，可用于玉米分子标记辅助育种。
附图说明
图1：本发明的分子标记InDel-NR53对W22和nal1突变体扩增产物序列的比对结果。
图2：本发明的分子标记InDel-NR53在F2群体中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，W为纯合W22基因型的扩增带型，N为纯合nal1基因型的扩增带型，H为杂合基因型的扩增带型，M为Marker，从下往上条带大小依次为100bp、250bp。
图3：本发明的分子标记InDel-NR53在F2群体中穗位叶叶片宽度的单标记分析结果。H代表杂合基因型植株，N代表纯合nal1基因型植株，W代表纯合W22基因型植株，***表示差异极显著(P<0.001)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
玉米窄叶性状：玉米自交系在开花期，穗位叶片叶宽一般在7-11厘米，而本专利中所提及的玉米窄叶性状是指玉米开花期的穗位叶片叶宽在2-4厘米，叶宽显著低于正常玉米自交系。
如前所述，选育适宜高密度种植的窄叶品种是改善植株群体效应和提高玉米产量的一种重要途径。由于玉米窄叶性状可能由一个或多个基因调控，并且可能存在多态性和互作效应，这增加了确定与窄叶性状紧密连锁的InDel分子标记的难度，目前对玉米宽窄叶基因的研究还不多。
有鉴于此，本发明对控制玉米窄叶性状的基因进行了深入研究，本发明使用遗传学方法确定窄叶性状的遗传方式，以及通过关联分析、图位克隆等技术确定与窄叶性状紧密关联的基因位置。引物设计和优化也是开发与窄叶性状紧密连锁的InDel分子标记的重要技术难点之一。由于目标DNA序列的特点多变，设计特异性的引物可能具有挑战性。引物设计需要考虑目标DNA序列的长度、GC含量、特异性和引物间的位点覆盖。此外，引物的温度和扩增程序也需要优化，以确保可靠的扩增效果。存在多态性的窄叶性状还可能需要设计多组引物，以覆盖各个多态位点。
本发明最终将窄叶基因定位在玉米6号染色体ZZY53和ZZY78两个分子标记之间，物理距离为5.1Mb。在定位区间内测序发现，玉米窄叶突变体与野生型相比，存在2个位点的多态性和13个核苷酸的插入，该区域可以作为玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记，命名为InDel-NR53。
基于该InDel分子标记，本发明进一步设计了用于特异性扩增上述InDel分子标记的特异性引物，具体如下：
上游引物：5’-CTGGAGTAGCGCAGTAGAGTG-3’；
下游引物：5’-AGTTGTGCTTGCTGGTTCAT-3’。
将上述特异性引物进行blast分析，以现有的玉米基因组序列为基准，发现分子标记InDel-NR53定位于玉米6号染色体105125244-105125378bp处，所述物理位置参考B73RefGen_v5基因组版本。
利用本发明的分子标记InDel-NR53能够在早期准确的鉴定玉米的窄叶性状，有利于选育适宜高密度种植的窄叶品种，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1：玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记的获得
本发明中的nal1窄叶突变体是田间发现的自然突变体。以窄叶突变体nal1为父本，自交系B73、B104、W22为母本，构建BC1分离群体，对控制玉米窄叶的基因进行精细定位。将所构建的BC1分离群体种植于大田，在5叶期对分离群体进行表型鉴定，取窄叶叶片提取总DNA，利用合成玉米IBM图谱上已有的以及自主开发的SSR标记对窄叶突变体及亲本进行多态性筛选。根据已公布的玉米基因组进行引物加密，最终将窄叶基因定位在ZZY53和ZZY78两个分子标记之间，物理距离为5.1Mb。
1.窄叶突变体的获得
nal1突变体是在育种田发现的自然突变体，该突变体具有窄叶表型，穗三叶(叶片最宽处)叶宽显著低于野生型，且窄叶表型可以稳定遗传，初步确定其表型是由于基因突变导致的。
表1：nal1突变体表型分析
2.遗传分析
利用nal1突变体与正常自交系B73、B104、W22杂交，F1叶片发育正常，表明窄叶为隐性性状。与W22组配的BC1分离群体中，野生型株数与突变型株数的比例经卡方检验符合1:1(χ2＝0.92<χ2 0.05,1＝3.84),表明nal1突变性状受1对隐性核基因控制。
表2：nal1窄叶突变体遗传分析
3.窄叶基因的初定位
自交系W22与窄叶突变体构建的BC1分离群体种植于大田，在5叶期对分离群体进行表型鉴定，取具有窄叶表型的叶片提取总DNA，DNA的提取方法如下：
(1)取约0.1g叶片装入2.5mL离心管，液氮速冻后研磨成粉末；
(2)加入约700μl CTAB缓冲液，充分震荡混匀。
(3)放入60℃水浴锅中水浴30-40min，每隔10-15min震荡一次。
(4)取出离心管，加入Tris饱和酚350μl，氯仿350μl抽提，轻轻混匀后，8000rpm离心8min。
(5)取其上清液600μl于另一管中，加异丙醇500μl，轻轻混匀，至絮状DNA出现时静置。
(6)将离心管放入离心机，1200rpm离心6min，去上清液。用70％乙醇清洗2-3次。
(7)室温晾干后，溶于200μl 1×TE，轻轻混匀，-20℃保存。
利用合成玉米IBM图谱上已有的以及自主开发的SSR标记对窄叶突变体及亲本进行多态性筛选。采用混合群体分离分析法(BSA)对突变体进行基因定位。利用平均分布在玉米全基因组上的448对公共的SSR引物对W22与窄叶突变体进行多态性标记筛选，有175对引物存在亲本多态性差异。随机选取5株正常植株DNA及5株突变体植株DNA等量混合，构建正常DNA池和突变DNA池，对175对引物进行初步连锁性分析，最终筛选出6对可能与窄叶性状紧密连锁的标记。利用6对可能与目标基因连锁的分子标记对32个F2窄叶植株进行PCR扩增并用凝胶电泳验证，结果发现ZY1和ID6.6与目标性状紧密连锁。用346个窄叶突变植株对这2对引物进行PCR扩增和电泳验证，找出标记间发生重组交换的单株，根据交换单株的个数和物理位置，将窄叶基因初步定位于玉米6号染色体ZY1和ID6.6标记之间，遗传距离分别为6cM和21cM，物理距离为32Mb。
4.窄叶基因的精细定位
种植B73、B104、W22与窄叶突变体构建的BC1分离群体，对窄叶植株叶片提取DNA。在初定位的ZY1和ID6.6标记之间，开发了171对SSR分子标记，对B73、B104、W22与窄叶突变体进行亲本多态性差异检测，利用有差异的标记继续进行精细定位，最终将窄叶基因定位在玉米6号染色体ZZY53和ZZY78两个分子标记之间，物理距离为5.1Mb。
最终在玉米6号染色体105125244-105125378bp处筛选得到一个与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记，命名为分子标记InDel-NR53，所述物理位置参考B73 RefGen_v5基因组版本。突变体中对应的该分子标记InDel-NR53的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：基于玉米窄叶基因的InDel分子标记的开发应用
基于实施例1筛选的分子标记InDel-NR53，设计用于扩增分子标记的引物对，所设计的引物对序列如下：
上游引物：5’-CTGGAGTAGCGCAGTAGAGTG-3’；(SEQ ID NO.2)
下游引物：5’-AGTTGTGCTTGCTGGTTCAT-3’。(SEQ ID NO.3)
分子标记InDel-NR53对W22和nal1突变体扩增产物序列的比对结果如图1所示。
利用分子标记InDel-NR53及设计的引物对，可以对玉米材料的叶宽性状进行检测，具体如下：
以待测玉米的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行PCR扩增，根据扩增产物的大小进行判断。
若待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为126bp，该待测玉米样品含有正常叶宽的等位基因；待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为139bp，则该待测玉米样品含有玉米窄叶的等位基因。
其中，10μl PCR扩增的反应体系如下：
(1)0.5μl浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
(2)0.5μl浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
(3)1μl浓度为100ng/μl的DNA模板；
(4)5μl 2×Taq Master Mix；
(5)3μL ddH2O。
PCR扩增的程序如下：
(1)94℃预变性10min；
(2)94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；
(3)72℃延伸10min；
(4)10℃保存。
通过上述扩增即可获得窄叶突变体及分离群体中窄叶材料扩增片段，在8％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(如图2所示)，若扩增出一条大小为139bp的条带，叶片表型为窄叶；若扩增出一条大小为126bp的条带，叶片表型为正常叶宽；若扩增出两条大小分别为139bp和126bp的条带，则表明玉米为杂合基因型。
利用InDel-NR53对F2分离群体进行基因分型，经过方差分析(图3)，结果表明杂合基因型单株和纯合W22基因型单株的穗位叶宽均显著宽于纯合nal1基因型植株，说明利用InDel-NR53对该群体进行基因分型是准确可行的，可简便、快速、高通量地应用于育种实践，这将大大加速玉米窄叶基因分子育种的进程。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.与玉米窄叶紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记为分子标记InDel-NR53；所述分子标记InDel-NR53的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的InDel分子标记在如下(1)或(2)中的应用：
(1)早期筛选或鉴定玉米种质资源的叶宽性状；
(2)玉米分子标记辅助育种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述玉米分子标记辅助育种具体为玉米窄叶耐密种质创新及杂交种选育。
4.用于扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
5.含有权利要求4所述引物对的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：DNA模板、TaqMaster Mix和ddH2O。
7.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在如下(1)或(2)中的应用：
(1)早期筛选或鉴定玉米种质资源的叶宽性状；
(2)玉米分子标记辅助育种。
8.一种检测玉米窄叶性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测玉米的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID NO.1的纯合玉米的叶宽低于所得PCR产物序列为SEQID NO.4的纯合玉米的叶宽。
9.一种鉴定与窄叶性状相关的玉米基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测玉米的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若扩增出一条大小为139bp的条带，表明玉米为叶片表型为窄叶的纯合基因型；若扩增出一条大小为126bp的条带，表明玉米为叶片表型为正常叶宽的纯合基因型；若扩增出大小分别为139bp和126bp的条带，则表明玉米为杂合基因型。
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