CN109486992B

CN109486992B - 烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用

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Publication number: CN109486992B
Application number: CN201811512012.7A
Authority: CN
Inventors: 林世锋; 王仁刚; 余婧; 任学良; 张洁; 余世洲
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN109486992A

Abstract

本发明公开了一种烟草eIF4E‑1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记，与野生型位点检测相关的标记命名为ASM‑W，片段大小763bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM‑m，片段大小572bp，如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了一种用于鉴别上述位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记的引物，引物序列如SEQ ID NO.3、4、5所示。利用该标记和引物可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有PVY抗性突变类型的种质材料或转育后代。

Description

烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用

技术领域

本发明涉及一种基因的大片段突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种烟草真核生物翻译起始因子eIF4E-1的突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒烟草种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的烟草材料，提高eIF4E-1突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的一种烟草系统性侵染病害。此病引起的损失因烟草侵染时期和病毒株系不同而异，早期感染的脉坏死株系，可导致绝产绝收，若近收获期感染或感染弱株系，则减产相对较轻，一般损失25-45％。PVY除引起产量损失外，更为严重的是病叶烤晒后色泽和烟味较差，品质显著降低。

选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表现为隐性基因(va)控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出与Va位点相关的分子标记(RAPD、SCAR)。烤烟种质RY5对PVY坏死株系(PVYN)的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点(Va)紧密连锁的RAPD标记O12V3695与SCAR标记PVY ME1。文献报道的RAPD标记和SCAR标记，与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM。与PVY抗性的连锁距离较远，将导致利用标记数据判断抗性表型误差较大。同时RAPD标记存在扩增产物的特异性不高，非目标条带干扰结果判断、PCR扩增需要循环数多达45个循环等不足。

已有研究表明eIF4E为Va基因位点的一个隐性抗PVY基因，即感PVY基因。2014年，国外学者采用新一代测序技术比较烟草抗感PVY近等基因系转录组，明确了烟草eIF4E-1基因(GenBank登录号KF155696)为烟草PVY隐性抗病基因。随后研究者针对已知材料鉴定发现，PVY抗病品种eIF4E-1基因及其侧翼序列发生大范围的缺失，由于分析eIF4E-1基因缺失连接片段的序列特点需要对其进行克隆和测序，而eIF4E-1基因及其侧翼序列的大范围缺失，造成克隆该基因的缺失连接片段极为困难，因此目前有关缺失连接片段的序列资料极为匮乏，迄今国内外研究者未有针对该基因设计出共显性分子标记用于烟草PVY抗性分子标记辅助选择育种。

2015年，云南省烟草农业科学研究院刘勇等根据烟草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与PVY抗性紧密连锁的显性分子标记(专利申请号：2014101504706)，其通过在烟草野生型eIF4E-1基因的第1个外显子内设计上游引物(CF2)，在内含子区域设计下游引物(GR11)，获得在供试抗病品种中无扩增条带，而在感病品种中有特异条带的引物对。该标记能将部分抗病烤烟(或白肋烟)品种与感病品种区分开来，但不能有效区分野生型eIF4E-1的纯合和杂合基因型，例如申请人通过序列分析和PCR验证，发现应用CF2/GR11引物在6份PVY抗病晒烟品种和8份PVY感病烤烟或晒烟品种中均能扩增出大约的特异性条带(如图1所示)，因此其不能有效地将这些烟草PVY抗感品种区分开来，在回交转育突变型eIF4E-1位点时，不能直接利用该分子标记进行辅助选择。

发明内容

为克服现有分子标记的不足，本发明针对获得的一个eIF4E-1位点的大片段缺失突变体提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，根据eIF4E-1基因缺失连接片段序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变型的共显性标记并用于标记辅助选择。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记进行辅助选择育种，对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。

本发明的技术方案是：一种烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记，与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小763bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小572bp，如SEQ ID No.2所示。

一种用于鉴别上述位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记的引物，引物序列如下：

正向引物FWm：5'-CCCATTTGACACCATAAGTTCATACG-3'；

反向引物RW：5'-AAACACTGTTTGCAGAATTTAAGCAAC-3'；

反向引物Rm：5'-GGAGTATGATCTAGACGAAGTATCTCTTGACTAC-3'；

如SEQ ID NO.3、4、5所示；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FWm和反向引物RW的组合用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物FWm和反向引物Rm的组合用于扩增分子标记ASM-m。

本发明还提供一种所述烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

本发明还提供一种所述引物在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。具体应用方式为：利用引物FWm、RW和Rm配置三引物多重PCR反应体系对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果仅扩增出一条572bp特异扩增条带，则为纯合突变型，如果仅扩增出一条763bp特异扩增条带，则为野生型，如果同时扩增出一条572bp特异扩增条带和一条763bp特异扩增条带，则为杂合突变型。

本发明的有益效果是：本发明利用全基因组重测序和染色体步移技术(Chromosome walking)发现抗PVY晒烟品种福泉柳叶烟基因组第14染色体上，从第107367742位碱基到第107394706位碱基共26965个碱基缺失，该缺失片段包含隐性抗PVY基因eIF4E-1的3′端，利用该突变位点开发位点特异性共显性ASM标记。利用该标记可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有PVY抗性突变类型的种质材料或转育后代。

附图说明

图1：引物CF2/GR11在抗感烟草品种间的多态性(琼脂糖凝胶电泳)，其中1-8为抗PVY品种，9-16为感PVY品种，M为DNA分子量标准DL5000。

图2：隐性抗病基因eIF4E-1基因组分段扩增示意图。图中黑色方框代表外显子，方框之间的连接线代表内含子。箭头所在位置为分段扩增基因组DNA过程中所用引物的结合位点。上下游引物间以实线连接代表该段序列在福泉柳叶烟和K326中均可扩出，上下游引物间以虚线连接代表该段序列只能在K326中扩出而在福泉柳叶烟中不能扩出。

图3：染色体步移和验证扩增产物电泳图(A：第三次巢式PCR扩增结果；B：克隆验证PCR扩增结果；1：以福泉柳叶烟基因组为模板的第三次巢式PCR扩增产物；2：以福泉柳叶烟基因组为模板的克隆验证PCR扩增产物)

图4：福泉柳叶烟eIF4E-1基因缺失断点测序结果。显示缺失介于Chr14:107367742和Chr14:107394706之间，该缺失区包含烟草eIF4E-1基因的3'端。缺失断点间见TTGAAAATT九个碱基的插入。

图5：二引物PCR体系在烟草材料中的扩增。M：DL2000 marker；1：福泉柳叶烟；2：K326/福泉柳叶烟；3：红花大金元/福泉柳叶烟；4：云烟87/福泉柳叶烟；5：K326；6：红花大金元；7：云烟87；A：FWm+RW引物扩增结果；B：FWm+Rm引物扩增结果。

图6：二引物PCR体系扩增产物序列分析。A：FWm+RW在K326和K326/福泉柳叶烟中扩增出的DNA片段序列，该序列与中国烟草基因组数据库(V4.0)中的eIF4E基因(Ntab0942120)的基因组序列相同，其中小写部分及其下游序列在福泉柳叶烟中发生大片段缺失，横线部分分别为引物FWm和RW位置；B：FWm+Rm在福泉柳叶烟和K326/福泉柳叶烟中扩增出的烟草基因组序列片段，阴影部分为福泉柳叶烟基因组缺失断点间插入的9个碱基，横线部分分别为引物FWm和Rm位置。

图7：三引物多重PCR反应体系在不同烟草材料中的扩增检测效果。M：DL2000marker；1：福泉柳叶烟；2：K326；3：红花大金元；4：云烟87；5：K326/福泉柳叶烟；6：红花大金元/福泉柳叶烟；7：云烟87/福泉柳叶烟。

图8：共显性标记在亲本及F2群体部分单株中的检测结果。P1：亲本1即福泉柳叶烟；P2：是亲本2即K326；1-21是F2代中21个单株，其中3、4、8、10、14和16同亲本1，1、6、9、11、17、19和21同亲本2，其余单株为杂合型。

图9：共显性标记在亲本及回交后代部分单株中的检测结果。P1：亲本1即福泉柳叶烟；P2：是亲本2即K326；1-21是回交后代中21个单株，其中2、4、5、6、8、9、10、12、16、18和20同亲本2，其余单株为杂合型。

图10：转移单隐性基因的常规改良育种与分子标记辅助选择育种比较示意图。

具体实施方式

1、烟草eIF4E基因缺失突变的确认

基于前人对PVY抗病相关基因的研究，申请人通过基因组重测序技术，对高抗、高感PVY烟草品种全基因组进行测序并对eIF4E和eIF(iso)4E基因家族成员进行深入的序列比较。结果发现：与高感品种的保守性相比，高抗品种在eIF4E-1基因区域存在不同程度的碱基插入或缺失突变。

为进一步验证全基因组重测序所获得候选突变位点，根据eIF4E-1的基因组序列设计6对首尾交叠的特异PCR引物，

P1：5'-CTAAAATCTATAACTAAGTACATAGAAAACACACG-3')；

P2：5'-CGTCCCAATTTATGTAATGTTGTTTGACTTA-3'；

P3：5'-ATTGGGACGGAGGGACTATCTTG-3'；

P4：5'-CTAACTCAAAACGGACGACTTAAATAAAGATC-3'；

P5：5'-GACCAGTATTTCAATGTCATTCTTGGATCT-3'；

P6：5'-CTTAAAACAATGAAAGTCTGCTCCCAC-3'；

P7：5'-ATATCAACCACCCAAGCAAGTTAGTTGT-3'；

P8：5'-GGCCACACCCTTGTTATCTTGC-3'；

P9：5'-TGATGCCATTTAACAATAATGCGC-3'；

P10：5'-GCTGAATGATGCCAGAATCTCCT-3'；

P11：5'-CGTGGCACGAATTCCGATTACTG-3'；

如SEQ ID NO.6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16所示，其中6对引物分别为P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10、P9/P11。

如图2所示，分别以CTAB法制备感PVY烤烟品种K326和抗PVY晒烟品种福泉柳叶烟幼苗叶片中DNA为模版，分段扩增隐性抗病基因eIF4E-1的-38-947、939-2261、2203-2854、2802-3630、3587-4317、3587-4423bp片段。经过扩增产物克隆、测序、拼接和比对发现，K326中上述引物扩增产物的测序结果是目的基因的对应序列，福泉柳叶烟中引物P1/P2和P3/P4扩增产物的测序结果是目的基因对应序列，而P5/P6、P7/P8、P9/P10和P9/P11扩增产物的测序结果不是目的基因对应序列，确定福泉柳叶烟中eIF4E-1基因3'端发生大片段缺失，缺失断点位于eIF4E-1基因2261-2854bp之间。

2、烟草eIF4E基因3'端缺失连接片段的克隆及PCR验证

为了获得福泉柳叶烟eIF4E-1基因3'端缺失连接片段序列信息，实验使用TaKaRa公司的染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit)进行热不对称PCR扩增已知序列相邻的未知序列。根据分段扩增获得的福泉柳叶烟eIF4E-1基因5'端保留序列，在接近断点的位置设计三条引物，分别为：

SP1：5'-AGTTTGGTAAGAGTTGGACGGGTTAG-3'；

SP2：5'-GTGCATTTGTCTTCATATACCAAGCTG-3'；

SP3：5'-CTAGATTGATGAGACTAAACGTAGCTG-3'；

如SEQ ID NO.17、18、19所示。另一组引物为Genome Walking Kit中通用引物(命名为AP)。PCR扩增参照TaKaRa公司的染色体步移试剂盒说明进行。

参照TaKaRa公司的染色体步移试剂盒方法，经过三轮巢式PCR反应，最终在福泉柳叶烟中扩增得到808bp的PCR产物，琼脂糖电泳图见3A。将该片段切胶回收，进行TA连接测序。测序结果表明克隆片段的5'端序列与eIF4E-1基因中355bp序列重叠，初步断定序列正确。然后根据测得的序列设计下游引物SP4(5'-CCCGAAGGTTTTCACCGACG-3')与SP1组成上下游引物组合，以福泉柳叶烟基因组为模版，进行PCR扩增，得到1051bp的目的条带(如图3B)，随后的TA克隆测序结果与预计一致，从而证明该克隆的序列正确。

使用DNAman6.0对福泉柳叶烟中染色体步移获取的序列结果与分段PCR扩增获取的序列结果进行拼接得拼接后的基因序列，将该基因序列与烟草基因组序列(基因组版本V4.0)进行比对，结果显示：拼接后的基因序列第1到2566位碱基与第14染色体第107365176到第107367741碱基完全匹配，而第2576到3019位碱基与第14染色体第107394707到第107395148碱基完全匹配，表明福泉柳叶烟在第14染色体上第107367742位碱基到第107394706位碱基，共26965个碱基发生了缺失，同时缺失断点之间还存在TTGAAAATT九个碱基的插入(见图4)。由于该缺失区包含了烟草eIF4E-1基因的3'端，造成该基因发生突变，故将福泉柳叶烟中该突变基因命名为eIF4E-1-MBM。

3、烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

3.1分子标记引物设计

以抗PVY烟草福泉柳叶烟和感病烟草K326杂交构建F1、F2及BC群体，基于基因组重测序开发位点特异性共显性分子标记ASM-W和ASM-m，与PVY抗病表型共分离。

根据抗感材料中分子标记ASM-W和ASM-m之间的差异设计引物，正向引物固定为FWm，反向引物分别为RW和Rm，引物的核苷酸序列、退火温度及扩增片段长度见下表：

引物名称	引物序列(5′-3′)	Tm值	片段大小
				FWm	CCCATTTGACACCATAAGTTCATACG	57.35℃
RW	AAACACTGTTTGCAGAATTTAAGCAAC	57.46℃	763bp
				Rm	GGAGTATGATCTAGACGAAGTATCTCTTGACTAC	61.33℃	572bp

3.2烟草DNA提取

采用CTAB法制备植物基因组DNA，具体方法如下：

1)取鲜嫩的烟草叶片0.2～0.5g，在液氮中研磨成粉状；

2)将粉末转入到1.5ml离心管中，并立即加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液(2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaC1)；

3)倒置几次混匀，65℃水浴2h以上；

4)室温下冷却5min，加入600μl 24:1(v/v)氯仿：异戊醇；

5)倒置几次混匀，之后于12000rpm下离心10min；

6)取上清，加入600μl的24:1氯仿:异戊醇；

7)倒置几次混匀，之后于12000rpm下离心10min；

8)取上清，加入1.5μl Rnase(10mg/ml)，在室温下放置30min；

9)加入等体积异丙醇(－20℃)，倒置大于15次，－20℃放置0.5h以上；

10)12000rpm离心10min；

11)沉淀吹干，溶于适量双蒸水中；

12)取2μl DNA有DNA样品在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，100V电压电泳30min检测DNA质量；取1μl样品用Nanodrop检测DNA浓度。

3.3 PCR扩增

1)PCR反应体系(20μl)：

2)PCR反应循环程序：

3)取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。

3.4二引物PCR体系对烟草抗感PVY材料扩增的特异性

以不同类型烟草材料DNA为模板，分别利用引物FWm+RW和FWm+Rm进行PCR扩增，结果见图5。FWm+RW在福泉柳叶烟中没有扩增产物，在杂交组合子代(F1)K326/福泉柳叶烟、红花大金元/福泉柳叶烟、云烟87/福泉柳叶烟，以及K326、红花大金元、云烟87中扩增出一条约763bp的片段(图5A)，记作ASM-W。FWm+Rm在福泉柳叶烟、杂交组合子代K326/福泉柳叶烟、红花大金元/福泉柳叶烟、云烟87/福泉柳叶烟中扩增出一条约572bp的片段，记作ASM-m，在K326、红花大金元、云烟87中没有扩增产物(图5B)。该结果与设计的扩增产物大小一致。

3.5二引物体系扩增产物的序列分析

为了进一步验证二引物体系扩增产物是否为目标基因序列，对引物FWm+RW和FWm+Rm在K326、福泉柳叶烟和K326/福泉柳叶烟中扩增出的片段进行测序(图6)。FWm+RW在K326和K326/福泉柳叶烟中扩增出的DNA片段序列完全一致(图6A，SEQ ID No.1，ASM-W)。对该序列进行BLAST分析，结果表明该序列与引物设计时所用的中国烟草基因组数据库(V4.0)中的eIF4E基因(Ntab0942120)的基因组序列相同，其中小写部分及其下游序列在福泉柳叶烟中发生缺失。FWm+Rm在福泉柳叶烟和K326/福泉柳叶烟中扩增出的DNA片段序列也完全一致(图6B，SEQ ID No.2，ASM-m)。BLAST分析表明，该片段分成两段定位在烟草第14染色体组(中国烟草基因组数据库V4.0)上，其中大写部分为缺失断点左侧eIF4E基因(Ntab0942120)保留序列，小写部分为缺失断点右侧连接序列。测序结果表明，引物FWm+RW和FWm+Rm的扩增结果与设计一致，均扩增出目标片段。

3.6三引物多重PCR扩增体系的建立

在二引物扩增的基础上，按照原有DNA模板浓度、dNTP、DNA聚合酶用量，而引物FWm、RW、Rm按1:1:1用量配置三引物PCR扩增体系。利用抗PVY烟草品种福泉柳叶烟，感PVY烟草品种K326、红花大金元、云烟87及其杂交子代K326/福泉柳叶烟、红花大金元/福泉柳叶烟和云烟87/福泉柳叶烟基因组DNA为模板，进行三引物PCR扩增。由图7看出，三引物多重PCR反应体系可以准确区分抗病品种、感病品种及其杂交子代，在抗病品种福泉柳叶烟中扩增出一条574bp的片段，在感病品种K326、红花大金元、云烟87中分别扩增出一条759bp片段，在杂合体K326/福泉柳叶烟、红花大金元/福泉柳叶烟和云烟87/福泉柳叶烟同时扩增出两条片段，片段大小分别与抗病品种和感病品种中的片段大小一致。

3.7 F2代群体PVY抗性鉴定

苗期采用病毒汁液摩擦接种法对福泉柳叶烟和K326构建的500个单株的F2群体进行PVY抗性鉴定，接种20天后调查单株抗病情况，经鉴定群体内感病单株为378株，抗病单株为122株，复合3:1的分离比率，证明福泉柳叶烟的PVY抗性受隐性单基因控制(以r基因表达)。

3.8利用分子标记鉴定F2代群体单株基因型

使用三引物多重PCR反应体系对F2代群体内不同单株的DNA进行PCR扩增，检测结果如图8所示，P1是亲本1，即福泉柳叶烟，P2是亲本2，即K326，1-21是21个F2代单株。从图中可以看出3、4、8、10、14和16同亲本1，是突变型(rr)，具有纯合的ASM-m标记，抗性鉴定显示为抗PVY材料；1、6、9、11、17、19和21同亲本2，是野生型(RR)，具有纯合的ASM-W标记，抗性鉴定显示为感PVY材料；其余单株为杂合型(Rr)，抗性鉴定同样显示为感PVY材料。由此可见采用三引物多重PCR扩增体系，对鉴定eIF4E-1位点的野生型、碱基缺失突变型及杂合型的准确率达100％。

3.9分子标记在烟草PVY抗性回交改良中的应用

对抗、感PVY亲本配制的回交后代(如BC1F1、BC2F1、BCnF1)种子，采用常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用CTAB等方法提取基因组DNA，采用三引物多重PCR反应体系进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序如前所述，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相并记录(图9)。

然后按照如下标准判断烟草BCnF1代单株是否携带PVY抗性基因(r基因)：能够扩增出572bp的ASM-m标记带，初步判断该单株携带PVY抗性基因。结果表明，BCnF1代单株有2种基因型：RR，扩增条带情况为具有ASM-m标记带，不具有ASM-W标记带；Rr，扩增条带情况为同时具有ASM-m和ASM-W标记带。筛选出携带PVY抗性基因的单株(基因型为Rr)可与K326继续回交或供下一步育种利用，表明该分子标记可用于烟草PVY抗性回交改良。与常规回交改良育种(图10，以福泉柳叶烟和K326为例)相比，分子标记辅助选择育种(图10，以福泉柳叶烟和K326为例)可利用分子标记直接对BCnF1单株进行基因型鉴定，选择携带PVY抗性基因的单株，不需自交一代，改良进度可缩短一倍，且省去了自交后代单株PVY接种鉴定工作。利用分子标记鉴定抗性具有以下优点：可显著缩短育种进程；检测准确率达100％；减少人为接种病害对其它实验材料的污染；减少认为接种病害对温度条件的需求；同一个后代单株的DNA，可用于其它分子标记的检测，可用于其它性状的分子标记辅助选择。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用

<160> 19

<210> 1

<211> 763

<212> DNA

<213>烟草

<400> 1

CCCATTTGAC ACCATAAGTT CATACGTGTG ACGTCTCTAC GTGCATTTGT CTTCATATAC 60

CAAGCTGATT ATTCATTTAA AAAGATAAAG ATATCTGCTT TTCTATTCCT TAATTAGGCT 120

AAGATTACAC TAATCTCCCC TCTAGATTGA TGAGACTAAA CGTAGCTGCA GACCAGTATT 180

TCAATGTCAT TCTTGGATCT TTATTTAAGT CGTCCGTTTT GAGTTAGGTG GTGATGATTT 240

GAAATTTGTG TCTGCCTTAG ATGCATGTTG TGTTGCTCGG ATGGGGGCGC GGGTATCCCA 300

TAATGGTGCA GATCTAAAGG TCGGATTTGT CATCACATAA ATTTTAGGAT TCGAGGATAT 360

GAATTCAACT ACGGTTACGG GTGCTGGGAT ACAACCAATA AATGTATGTT ACTACATATA 420

TAAGTATATA TTTCGATTAA TTAAAGTTAT CAAACTAAAT CTAATAATTT TTTCTTATAA 480

AATATAAACA CGTAATccgg tgtggattcc acacccatgt cgtgttgata cgggtgcggc 540

aaagattttg aagagtccgc gcaacttagg atgcatgcac cttgtttggt gagttcttta 600

tcagtctaat ttctcaaggc acttgagtta ttgtgcaact tggactatgt catgcctatt 660

ttgatattct gcatcttgga ttagatgttt tcaaatgcta ttatcctgtt agcttttgat 720

gaaatccttg aaccatgttg cttaaattct gcaaacagtg ttt 763

<210> 2

<211> 572

<212> DNA

<213>烟草

<400>2

CCCATTTGAC ACCATAAGTT CATACGTGTG ACGTCTCTAC GTGCATTTGT CTTCATATAC 60

CAAGCTGATT ATTCATTTAA AAAGATAAAG ATATCTGCTT TTCTATTCCT TAATTAGGCT 120

AAGATTACAC TAATCTCCCC TCTAGATTGA TGAGACTAAA CGTAGCTGCA GACCAGTATT 180

TCAATGTCAT TCTTGGATCT TTATTTAAGT CGTCCGTTTT GAGTTAGGTG GTGATGATTT 240

GAAATTTGTG TCTGCCTTAG ATGCATGTTG TGTTGCTCGG ATGGGGGCGC GGGTATCCCA 300

TAATGGTGCA GATCTAAAGG TCGGATTTGT CATCACATAA ATTTTAGGAT TCGAGGATAT 360

GAATTCAACT ACGGTTACGG GTGCTGGGAT ACAACCAATA AATGTATGTT ACTACATATA 420

TAAGTATATA TTTCGATTAA TTAAAGTTAT CAAACTAAAT CTAATAATTT TTTCTTATAA 480

AATATAAACA CGTAATttga aaattggaaa tgaccccgac acagcagtaa atgcagatgt 540

Agtcaagaga tacttcgtct agatcatact cc 572

10>3

<211>26

<212> DNA

<213>人工序列

<400>3

CCCATTTGAC ACCATAAGTT CATACG 26

<210>4

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>4

AAACACTGTT TGCAGAATTT AAGCAAC 27

<210>5

<211>34

<212> DNA

<213>人工序列

<400>5

GGAGTATGAT CTAGACGAAG TATCTCTTGA CTAC 34

<210>6

<211>35

<212> DNA

<213>人工序列

<400>6

CTAAAATCTA TAACTAAGTA CATAGAAAAC ACACG 35

<210>7

<211>31

<212> DNA

<213>人工序列

<400>7

CGTCCCAATT TATGTAATGT TGTTTGACTT A 31

<210>8

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<400>8

ATTGGGACGG AGGGACTATC TTG 23

<210>9

<211>32

<212> DNA

<213>人工序列

<400>9

CTAACTCAAA ACGGACGACT TAAATAAAGA TC 32

<210>10

<211>30

<212> DNA

<213>人工序列

<400>10

GACCAGTATT TCAATGTCAT TCTTGGATCT 30

<210>11

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>11

CTTAAAACAA TGAAAGTCTG CTCCCAC 27

<210>12

<211>28

<212> DNA

<213>人工序列

<400>12

ATATCAACCA CCCAAGCAAG TTAGTTGT 28

<210>13

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400>13

GGCCACACCC TTGTTATCTT GC 22

<210>14

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<400>14

TGATGCCATT TAACAATAAT GCGC 24

<210>15

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<400>15

GCTGAATGAT GCCAGAATCT CCT 23

<210>16

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<400>16

CGTGGCACGA ATTCCGATTA CTG 23

<210>17

<211>26

<212> DNA

<213>人工序列

<400>17

AGTTTGGTAA GAGTTGGACG GGTTAG 26

<210>18

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>18

GTGCATTTGT CTTCATATAC CAAGCTG 27

<210>19

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>7

CTAGATTGAT GAGACTAAAC GTAGCTG 27

Claims

1.一种烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小763bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小572bp，如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于鉴别权利要求1中位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记的引物，其特征在于：引物序列如下：

正向引物FWm：5'-CCCATTTGACACCATAAGTTCATACG-3'；

反向引物RW：5'-AAACACTGTTTGCAGAATTTAAGCAAC-3'；

反向引物Rm：5'-GGAGTATGATCTAGACGAAGTATCTCTTGACTAC-3'；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FWm和反向引物RW的组合用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物FWm和反向引物Rm的组合用于扩增分子标记ASM-m。

3.权利要求2所述的引物在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用引物FWm、RW和Rm配置三引物多重PCR反应体系对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果仅扩增出一条572bp特异扩增条带，则为纯合突变型，如果仅扩增出一条763bp特异扩增条带，则为野生型，如果同时扩增出一条572bp特异扩增条带和一条763bp特异扩增条带，则为杂合突变型。