CN108866234B

CN108866234B - 烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108866234B
Application number: CN201810989309.6A
Authority: CN
Inventors: 林世锋; 王仁刚; 余婧; 任学良; 张洁; 余世洲
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN108866234A

Abstract

本发明公开了一种烟草eIF4E‑1突变位点特异性共显性分子标记，与野生型位点检测相关的标记命名为ASM‑W，片段大小543bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基插入突变位点检测相关的标记命名为ASM‑m，片段大小543bp，如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了一种用于鉴别上述突变位点特异性共显性分子标记的引物，引物序列如SEQ ID NO.3、4、5所示。利用该标记和引物可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有开阳小黑烟eIF4E‑1突变类型的种质材料或转育后代。

Description

烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种烟草真核生物翻译起始因子eIF4E-1的突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒烟草种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的烟草材料，提高eIF4E-1突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的一种烟草系统性侵染病害。此病引起的损失因烟草侵染时期和病毒株系不同而异，早期感染的脉坏死株系，可导致绝产绝收，若近收获期感染或感染弱株系，则减产相对较轻，一般损失25-45％。PVY除引起产量损失外，更为严重的是病叶烤晒后色泽和烟味较差，品质显著降低。

选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表现为隐性基因(va)控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出与Va位点相关的分子标记(RAPD、SCAR)。烤烟种质RY5对PVY坏死株系(PVYN)的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点(Va)紧密连锁的RAPD标记O12V3695与SCAR标记PVY ME1。文献报道的RAPD标记和SCAR标记，与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM。与PVY抗性的连锁距离较远，将导致利用标记数据判断抗性表型误差较大。同时RAPD标记存在扩增产物的特异性不高，非目标条带干扰结果判断、PCR扩增需要循环数多达45个循环等不足。

已有研究表明eIF4E为Va基因位点的一个隐性抗PVY基因，即感PVY基因。2014年，国外学者采用新一代测序技术比较烟草抗感PVY近等基因系转录组，明确了烟草eIF4E-1基因(GenBank登录号KF155696)为烟草PVY隐性抗病基因。2015年，云南省烟草农业科学研究院刘勇等根据烟草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与PVY抗性紧密连锁的显性分子标记(专利申请号：2014101504706)，其通过在烟草野生型eIF4E-1基因的第1个外显子内设计上游引物(CF2)，在内含子区域设计下游引物(GR11)，获得在供试抗病品种中无扩增条带，而在感病品种中有特异条带的引物对。该标记能将部分抗病烤烟(或白肋烟)品种与感病品种区分开来，但不能有效区分野生型eIF4E-1的纯合和杂合基因型，例如申请人通过序列分析和PCR验证，发现应用CF2/GR11引物在6份PVY抗病晒烟品种和8份PVY感病烤烟或晒烟品种中均能扩增出大约的特异性条带(如图1所示)，因此其不能有效地将这些烟草PVY抗感品种区分开来，在回交转育突变型eIF4E-1位点时，不能直接利用该分子标记进行辅助选择。

发明内容

为克服现有分子标记的不足，本发明针对获得的一个eIF4E-1位点的碱基插入突变体提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的共显性标记并用于标记辅助选择。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记进行辅助选择育种，对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。

本发明的技术方案是：一种烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记，其与烟草eIF4E-1野生型和碱基插入突变体鉴定直接相关，其中与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小543bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基插入突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小543bp，如SEQ ID No.2所示。

一种用于鉴别上述突变位点特异性共显性分子标记的引物，引物序列如下：

正向引物FW：5'-CACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTATG-3'；

正向引物Fm：5'-ACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTATG-3'；

反向引物RWm：5'-AAAATTTTTAAAACAAGATAGACATTTGTGTG-3'；

如SEQ ID NO.3、4、5所示；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FW和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物Fm和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-m。

本发明还提供一种所述的烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

本发明还提供一种所述的引物在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。具体应用方式为：利用(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合这两套引物，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果(Fm+RWm)组合扩增出543bp特异扩增条带，而(FW+RWm)组合扩不出则为纯合突变型；如果(FW+RWm)组合扩增出543bp特异扩增条带，而(Fm+RWm)组合扩不出则为野生型；如果(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合均能扩增出543bp特异扩增条带，则为杂合突变型。

本发明的有益效果是：本发明利用全基因组重测序技术结合PCR产物克隆验证发现开阳小黑烟隐性抗PVY基因eIF4E-1上的1个SNP位点，利用该SNP位点开发位点特异性共显性ASM标记。利用该标记可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有PVY抗性突变类型的种质材料或转育后代。

附图说明

图1：引物CF2/GR11在抗感烟草品种间的多态性(琼脂糖凝胶电泳)，其中1-8为抗PVY品种，9-16为感PVY品种，M为DNA分子量标准DL5000；

图2：两份烟草材料eIF4E-1基因的gDNA扩增(琼脂糖凝胶电泳)，其中1、2分别代表K326和开阳小黑烟两份烟草材料，M为DNA分子量标准DL15000；

图3：两份烟草材料eIF4E-1基因的cDNA扩增(琼脂糖凝胶电泳)，其中1、2分别代表K326和开阳小黑烟两份烟草材料，M为DNA分子量标准100bp Ladder；

图4：来自开阳小黑烟、K326和红大的eIF4E-1基因组序列比对(图中示有差异的部分)；

图5：开阳小黑烟、红花大金元和K326的eIF4E-1的cDNA序列比对图(图中示差异明显部分，前部省略号是开阳小黑烟两种剪接异构体的碱基插入部分，后部省略符号是开阳小黑烟剪接异构体-2的碱基缺失部分)；

图6：两种推导的氨基酸序列与来自K326和红花大金元的eIF4E-1氨基酸序列比较(图中可以看出开阳小黑烟的两种剪接异构体或从第83位氨基酸开始发生移码突变，提前终止，或中间出现大片段的缺失)；

图7两套AS-PCR引物对抗感材料基因组DNA扩增情况(A：FW/RWm物扩增结果；B：Fm/RWm引物扩增结果；1：含有突变型eIF4E-1基因位点的抗病烟草品种开阳小黑烟；2、3、4、5、6：含有野生型eIF4E-1基因位点的感病烟草品种K326、红花大金元、云烟87、镇远小花烟、公会晒烟)；

图8：两套AS-PCR引物在F2代分离群体中对部分单株的检测结果(A：FW/RWm引物对扩增结果；B：Fm/RWm引物对扩增结果)；

图9：两套AS-PCR引物在回交后代中对部分单株的检测结果(A：FW/RWm引物对扩增结果；B：Fm/RWm引物对扩增结果)；

图10：转移单隐性基因的常规改良育种与分子标记辅助选择育种比较示意图。

具体实施方式

1、烟草eIF4E基因位点差异分析和验证

基于前人对PVY抗病相关基因的研究，本研究通过基因组重测序技术，对高抗、高感PVY烟草品种全基因组进行测序并对eIF4E和eIF(iso)4E基因家族成员进行深入的序列比较。结果发现：与高感品种的保守性相比，高抗品种在eIF4E-1基因区域存在不同程度的碱基插入或缺失突变。

为进一步验证全基因组重测序所获得候选突变位点，根据eIF4E-1的基因组序列和eIF4E家族成员的序列设计烟草eIF4E-1的上下游引物，

上游引物4-S：CTAAAATCTATAACTAAGTACATAGAAAACACACG；

下游引物4-A：GGTACTTAAACTGTCAAGTGGCAGC，如SEQ ID NO.6、7所示；

以感PVY烤烟品种K326和抗PVY晒烟品种开阳小黑烟为材料，分别通过PCR和RT-PCR技术扩增烟草eIF4E-1的gDNA和cDNA全序列(图2、图3)。

将扩增得到的基因进行测序，与中国烟草基因组数据库中的红花大金元(含有野生型eIF4E-1基因的PVY感病材料)数据进行比对发现，晒烟品种开阳小黑烟的eIF4E-1基因区域存在一个保守的单碱基插入突变(图4)。进一步通过编码区预测和氨基酸序列推导发现，其中烤烟品种K326的eIF4E-1基因mRNA与红花大金元完全一致(图5)；而晒烟品种开阳小黑烟具有两种mRNA剪接异构体，并且由于单碱基T的插入，或引起移码突变，导致下游提前出现终止密码，而使蛋白截断，或出现可变剪切，而使蛋白序列中间出现大片段的缺失(图6)。

2、烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

2.1分子标记引物设计

以抗PVY烟草开阳小黑烟和感病烟草K326杂交构建F1、F2及BC群体，基于基因组重测序开发位点特异性共显性分子标记ASM-W和ASM-m，如SEQ ID NO.1、2所示，与PVY抗病表型共分离。

根据抗、感材料中分子标记ASM-W和ASM-m之间的差异设计引物，反向引物固定为RWm(如SEQ ID NO.5所示)，正向引物分别Fm(如SEQ ID NO.4所示)(在3′端第三位引入错配碱基A)和FW(如SEQ ID NO.3所示)(在3′端第二位引入错配碱基A)引物的核苷酸序列、退火温度及扩增片段长度见下表：

引物名称	引物序列(5′-3′)	Tm值	片段大小
				RWm	AAAATTTTTAAAACAAGATAGACATTTGTGTG	55.96℃
Fm	ACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTATG	55.96℃	543bp
				FW	CACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG	56.48℃	543bp

2.2烟草DNA提取

采用CTAB法制备植物基因组DNA，具体方法如下：

1)取鲜嫩的烟草叶片0.2～0.5g，在液氮中研磨成粉状；

2)将粉末转入到1.5ml离心管中，并立即加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液(2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaC1)；

3)倒置几次混匀，65℃水浴2h以上；

4)室温下冷却5min，加入600μl 24:1(v/v)氯仿:异戊醇；

5)倒置几次混匀，之后于12000rpm下离心10min；

6)取上清，加入600μl的24:1氯仿:异戊醇；

7)倒置几次混匀，之后于12000rpm下离心10min；

8)取上清，加入1.5μl Rnase(10mg/ml)，在室温下放置30min；

9)加入等体积异丙醇(－20℃)，倒置大于15次，－20℃放置0.5h以上；

10)12000rpm离心10min；

11)沉淀吹干，溶于适量双蒸水中；

12)取2μl DNA有DNA样品在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，100V电压电泳30min检测DNA质量；取1μl样品用Nanodrop检测DNA浓度。

2.3PCR扩增

1)PCR反应体系(20μl)：

2)PCR反应循环程序：

3)取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。

为开发针对开阳小黑烟的PVY隐性抗病基因的分子标记，根据等位基因引物设计原理针对上述烟草品种eIF4E-1突变位点设计引物，经过筛选，根据SNP位点设计的等位基因特异引物Fm和FW与其下游公共引物RWm组成的两对引物，可以分别在含有突变型eIF4E-1基因的抗病烟草品种开阳小黑烟和含有野生型eIF4E-1基因的K326、红花大金元、云烟87、镇远小花烟、公会晒烟等感病烟草品种中扩增出一条长约550bp的特异性条带(图7)。

2.4F2代群体PVY抗性鉴定

苗期采用病毒汁液摩擦接种法对开阳小黑烟和K326构建的500个单株的F2群体进行PVY抗性鉴定，接种20天后调查单株抗病情况，经鉴定群体内感病单株为371株，抗病单株为129株，符合3:1的分离比率，证明开阳小黑烟的PVY抗性受隐性单基因控制(以r基因表达)。

2.5利用分子标记鉴定F2代群体单株基因型

使用FW/RWm和Fm/RWm引物对F2代群体内不同单株的DNA进行PCR扩增，结果如图8所示，Fm/RWm引物对扩增r基因型，FW/RWm引物对扩增R基因型。F2群体中抗病材料(纯合突变型)只有一种基因型rr，扩增条带情况为Fm/RWm有特异性条带，FW/RWm无条带。感病材料有2种基因型：RR(野生型)，扩增条带情况为FW/RWm有特异条带，Fm/RWm无条带；Rr(杂合突变型)，扩增条带情况为FW/RWm和Fm/RWm均有特异条带。

2.6分子标记在烟草PVY抗性回交改良中的应用

对抗、感PVY的亲本配制的回交后代(如BC1F1、BC2F1、BCnF1)种子，采用常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用CTAB等方法提取基因组DNA，采用分子标记ASM-W(FW/RWm)和ASM-m(Fm/RWm)引物对，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序如前所述，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相并记录(图9)。

然后按照如下标准判断烟草BCnF1代单株是否携带PVY抗性基因(r基因)：Fm/RWm引物对有543bp特异扩增条带，初步判断该单株携带PVY抗性基因。结果表明，BCnF1代单株有2种基因型：RR，扩增条带情况为FW/RWm有特异条带，Fm/RWm无条带；Rr，扩增条带情况为FW/RWm和Fm/RWm均有特异条带。筛选出携带PVY抗性基因的单株(基因型为Rr)可与K326继续回交或供下一步育种利用，表明该分子标记可用于烟草PVY抗性回交改良。与常规回交改良育种(图9，以开阳小黑烟和K326为例)相比，分子标记辅助选择育种(图10，以开阳小黑烟和K326为例)可利用分子标记直接对BCnF1单株进行基因型鉴定，选择携带PVY抗性基因的单株，不需自交一代，改良进度可缩短一倍，且省去了自交后代单株PVY接种鉴定工作。利用分子标记鉴定抗性具有以下优点：可显著缩短育种进程；检测准确率达100％；减少人为接种病害对其它实验材料的污染；减少人为接种病害对温度条件的需求；同一个后代单株的DNA，可用于其它分子标记的检测，可用于其它性状的分子标记辅助选择。

核苷酸系列表：

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

<160> 7

<210> 1

<211> 543

<212> DNA

<213>烟草

<400> 1

CACTTTTTCC ACTGTCGAAG ATTTTTGGGG GTAAGTTATT TCATATTCCC TCGGTTCCAA 60

TTTAGGTTAC AGTCTTTCCT TTTTAGTCAA CTTTTAGTCT CCTTAAATGA TATATTTCTA 120

TATTTAGTAA TAATTTAATA TTTATAGTGA CACAAATGTA TCACTCATTT TAGATGAATT 180

TTTTTTTTCT TAAACTCCGT ACCAAATCAA ACACTACTAA TGTAAATTGG GACGAAGCGA 240

GTATTATATT TCGTGTTAAG CTGTTGTGTT CTTTGGTTGT AAATAAATCA TGGGGTTTTA 300

TTTTACTGTT CAAGAATTTT GTGGGTGCTG TAGGATTTTG TTGAATTATG GTTTTGAATA 360

GCTCCTGAAT ATCTTGCCTT CATATAGGGA AAATTGGGTA AAATCTTCAA TTTTATGTGA 420

CACTAATTCT GTTAAAAAAA ACACCTTTAT ATATTTCGAA ATAATTTAAC TTTAAACTTC 480

TCATTGTACT GTTAATGTGA TGATTTGTAG TCACACAAAT GTCTATCTTG TTTTAAAAAT 540

TTT 543

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213>烟草

<400>2

ACTTTTTCCA CTGTCGAAGA TTTTTTGGGG GTAAGTTATT TCATATTCCC TCGGTTCCAA 60

TTTAGGTTAC AGTCTTTCCT TTTTAGTCAA CTTTTAGTCT CCTTAAATGA TATATTTCTA 120

TATTTAGTAA TAATTTAATA TTTATAGTGA CACAAATGTA TCACTCATTT TAGATGAATT 180

TTTTTTTTCT TAAACTCCGT ACCAAATCAA ACACTACTAA TGTAAATTGG GACGAAGCGA 240

GTATTATATT TCGTGTTAAG CTGTTGTGTT CTTTGGTTGT AAATAAATCA TGGGGTTTTA 300

TTTTACTGTT CAAGAATTTT GTGGGTGCTG TAGGATTTTG TTGAATTATG GTTTTGAATA 360

GCTCCTGAAT ATCTTGCCTT CATATAGGGA AAATTGGGTA AAATCTTCAA TTTTATGTGA 420

CACTAATTCT GTTAAAAAAA ACACCTTTAT ATATTTCGAA ATAATTTAAC TTTAAACTTC 480

TCATTGTACT GTTAATGTGA TGATTTGTAG TCACACAAAT GTCTATCTTG TTTTAAAAAT 540

TTT 543

<210>3

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>3

CACTTTTTCC ACTGTCGAAG ATTTATG 27

<210>4

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>4

ACTTTTTCCA CTGTCGAAGA TTTTATG 27

<210>5

<211>32

<212> DNA

<213>人工序列

<400>5

AAAATTTTTA AAACAAGATA GACATTTGTG TG 32

<210>6

<211>35

<212> DNA

<213>人工序列

<400>6

CTAAAATCTA TAACTAAGTA CATAGAAAAC ACACG 35

<210>7

<211>35

<212> DNA

<213>人工序列

<400>7

GGTACTTAAA CTGTCAAGTG GCAGC 25

Claims

1.一种烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小543bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基插入突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小543bp，如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于鉴别权利要求1中突变位点特异性共显性分子标记的引物组合，其特征在于：该引物组合包括以下两种组合：

正向引物FW和反向引物RWm的组合，用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物Fm和反向引物RWm的组合，用于扩增分子标记ASM-m；

其中，正向引物FW的序列如下：

5'-CACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTATG-3'；

正向引物Fm的序列如下：

5'-ACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTATG-3'；

反向引物RWm的序列如下：

5'-AAAATTTTTAAAACAAGATAGACATTTGTGTG-3'。

3.权利要求2所述的引物组合在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用引物FW和RWm的组合以及引物Fm和RWm的组合，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果引物Fm和RWm的组合扩增出543bp特异扩增条带，而引物FW和RWm的组合扩不出则为纯合突变型；如果引物FW和RWm的组合扩增出543bp特异扩增条带，而引物Fm和RWm的组合扩不出则为野生型；如果引物FW和RWm的组合以及引物Fm和RWm的组合均能扩增出543bp特异扩增条带，则为杂合突变型。