CN112094942A - 与烟草pvy抗性紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记，其与野生型位点检测相关的标记命名为ASM‑W，片段大小466bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM‑m，片段大小466bp，SEQ ID No.2所示。本发明还公开一种用于上述与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记的引物，引物序列如SEQ ID NO.3、4、5所示。本发明还公开了上述分子标记和引物在鉴别烟草eIF4E1基因位点的基因型中的应用。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有半坤村晒烟突变类型的种质材料或转育后代。

Description

与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记、引物及应用

技术领域

本发明涉及一种基因的自然突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种烟草真核生物翻译起始因子eIF4E1的突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒烟草种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的烟草材料，提高eIF4E1突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L.)是重要的经济作物之一，烟草马铃薯Y病毒病，又称烟草脉坏死病或烟草脉带病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起一种系统侵染性病害，常年造成烟叶产量和质量损失。选育和种植抗病品种是防治该病最经济有效的方法。研究显示，烟草PVY的抗源分为两大类，一类是以VAM(TI1406)及其衍生种质TN86为代表的隐性基因位点(VAM和va)控制的抗性，另一类是以非洲烟草(Nicotiana africana)为代表的对PVY免疫的抗性。目前，受va位点控制的抗源被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va位点的育种利用效率，国内外研究者相继开发了与va位点相关的分子标记，如RandomlyAmplified Polymorphic DNA(RAPD)和Sequence Characterized Amplified Region(SCAR)标记。这些标记与va位点间的遗传距离较远，导致利用标记数据判断抗性表型误差较大，进而限制了这类分子标记在育种中的实际应用。

在抗性获得的研究中，Noguchis等认为va基因型烟草植株的抗性是由于对PVY感病的基因片段的缺失造成的。2014年，Julio等采用新一代测序技术比较烟草抗感PVY近等基因系转录组，明确了烟草eIF4E1基因为烟草PVY隐性抗病基因，即感PVY基因，该基因属于真核细胞翻译起始因子(eukaryotic initiation factor，简称为eIF)的一种类型。2015年，刘勇等根据烟草eIF4E1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与eIF4E1等位基因紧密连锁的显性标记，该标记虽然能将部分抗病烤烟(或白肋烟)品种与感病品种区分开来，但是由于为显性标记不能有效区分eIF4E1等位基因纯合和杂合基因型，在回交转育eIF4E1抗病等位基因时，还是不能利用该标记进行连续回交辅助选择。同时，应用上述分子标记引物也可以从我们新鉴定出的来自中国多个省份的抗PVY晒烟地方品种中扩增出相应的特异条带，因此，使用这些分子标记引物不能有效地将这些新鉴定的抗PVY烟草品种与感病品种区分开来。更为重要的是，如果盲目的使用这些分子标记引物进行烟草抗PVY种质资源筛选，往往可能会遗漏一些好的抗病种质资源，因为这些种质资源的eIF4E1基因DNA序列可能只是发生了局部改变，而非全长序列的缺失。

2018年，Dluge等针对由隐性基因位点VAM和va控制的两份烟草PVY抗源材料的研究发现，两份抗源材料的染色体围绕eIF4E1基因及其侧翼序列发生大范围的缺失，其中VAM基因型材料缺失6.55Mbp，包含184个基因，va基因型材料缺失5.5Mbp，包含143个基因。上述DNA片段的大范围缺失不仅造成VAM和va基因位点的共显性标记难以开发，而且也会由于一些功能基因的缺失带来不利的农艺性状。早有研究报道，VAM基因型抗源材料的PVY抗性存在连锁累赘，如叶片短小、产量较低、缺乏叶面分泌物等。这些连锁累赘现象可能与eIF4E1基因上下游大量功能基因的缺失相关，因此即使针对这类抗源材料设计出共显性标记用于回交育种辅助选择或增加回交次数，也无法打破PVY抗性定向改良带来的连锁累赘。

发明内容

基于上述，本发明针对鉴定获得的一个eIF4E1基因SNP自然突变体提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，根据eIF4E1等位基因间的差异，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的共显性标记并用于标记辅助选择。

本发明的技术方案是：一种与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记，其与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小466bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小466bp，SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种用于上述与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记的引物，其引物序列如下：

正向引物FW：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTG-3'；

正向引物Fm：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTC-3'；

反向引物RWm：5'-CAGGAGCTATTCAAAACCATAATTCAAC-3'；

如SEQ ID NO.3、4、5所示；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FW和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物Fm和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-m。

本发明还提供一种上述与烟草PVY抗性紧密连锁的共显性分子标记在鉴别烟草eIF4E1基因位点的基因型中的应用。

本发明还提供一种上述引物在鉴别烟草eIF4E1基因位点的基因型中的应用。具体应用方式为：利用(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合这两套引物，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无；

如果(Fm+RWm)组合扩增出466bp特异扩增条带，而(FW+RWm)组合扩不出则为纯合突变型；

如果(FW+RWm)组合扩增出466bp特异扩增条带，而(Fm+RWm)组合扩不出则为野生型；

如果(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合均能扩增出466bp特异扩增条带，则为杂合突变型。

为克服或者说为避开背景技术所指出问题的困扰，本发明从筛选新的抗病资源入手，获得了一批新的抗病种质资源，这些种质资源均是我国晾晒烟地方品种，是经过长期的自然繁衍、淘汰及人工驯化选择的结果，不涉及人工诱变或基因修饰。通过比较发现所有新鉴定的抗病种质无一例外均在eIF4E1基因位点发生了不同类型的突变，其中抗病种质半坤村晒烟的eIF4E1基因第一外显子区存在一个SNP突变，即第149位的G/C突变，本发明针对该突变位点，设计引物，开发了鉴定eIF4E1基因野生型和突变型的共显性标记并用于标记辅助选择。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记可以对半坤村晒烟作为PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有半坤村晒烟突变类型的种质材料或转育后代，对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。

附图说明

图1：半坤村晒烟中eIF4E1基因的等位性检测。(a)烟草eIF4E1基因位点显性分子标记检测结果；M：DL 2000DNA Marker；1：TN90；2：K326；3：半坤村晒烟；(b)抗PVY烟草品种开阳小黑烟eIF4E1等位基因共显性分子标记检测结果；M：DL 2000DNA Marker；1：开阳小黑烟；2：K326；3：半坤村晒烟；(c)抗PVY烟草品种福泉柳叶烟eIF4E1等位基因共显性分子标记检测结果；M：DL2000DNA Marker；1：福泉柳叶烟；2：K326；3：半坤村晒烟；(d)野生型eIF4E1基因3’端特异性检测引物扩增结果；M：DL 2000DNA Marker；1：TN90；2：K326；3：半坤村晒烟。

图2：半坤村晒烟中eIF4E1基因的PCR扩增(琼脂糖凝胶电泳)。(a)全长cDNA序列扩增；M：DL 2000DNA Marker；1：K326；2：半坤村晒烟；(b)全长DNA序列扩增；M：DL 10000DNAMarker；1：K326；2：半坤村晒烟。

图3：来自红花大金元(Hongda)、K326和半坤村晒烟(Bankun)的eIF4E1基因的cDNA序列(a)及推导的氨基酸序列(b)的多重比对。

图4：半坤村晒烟中eIF4E1基因的核苷酸序列分析。烟草eIF4E1基因的DNA序列包含5个外显子和4个内含子。黑色方框代表外显子，水平线代表内含子。下面截取的片段序列是包含eIF4E1基因突变位点在内的466bp的核苷酸序列(即本发明分子标记的核苷酸序列)，其中大写字母为外显子序列，小写字母为内含子序列，26bp处的英文字母“R”为突变位点(G/C等位基因突变)。

图5：烟草eIF4E1基因SNP位点上下游临近区域DNA序列比较及引物设计策略分析示意图。加下划线的部分为设计分子标记正向引物所特异性结合的位置，星号标注的是SNP位点。

图6：烟草eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选的PCR产物电泳结果。M：DL2000DNA Marker；1-8：不同正向引物与不同反向引物组合(见表2)扩增产物，每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物。

图7：烟草eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选的PCR产物电泳结果。M：DL2000DNA Marker；1-8：正向引物W-F3与不同反向引物组合(见表3)扩增产物，每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物。

图8：烟草eIF4E1突变型等位基因特异性扩增引物筛选的PCR产物电泳结果。M：DL2000DNA Marker；1-2：引物组合W-F3\R6和W-F4\R6扩增产物(CK)；3-8：不同正向引物(见表4)与反向引物R6组合扩增产物；每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物。

图9：PCR扩增产物的特异性检测。M：DL2000 marker；1：半坤村晒烟；2：K326/半坤村晒烟；3：红花大金元/半坤村晒烟；4：云烟87/半坤村晒烟；5：K326；6：红花大金元；7：云烟87；(a)：FWm/RW引物组合物扩增结果；(b)：FWm/Rm引物组合物扩增结果。

图10：两套AS-PCR引物在F2代分离群体中对部分单株的检测结果。(a)：FW/RWm引物组合物扩增结果；(b)：Fm/RWm引物组合物扩增结果。

图11：两套AS-PCR引物在回交后代中对部分单株的检测结果。(a)：FW/RWm引物组合物扩增结果；(b)：Fm/RWm引物组合物扩增结果。

图12：转移单隐性基因的常规改良育种与分子标记辅助选择育种比较示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

1、半坤村晒烟中PVY抗性基因的等位性检测

本申请发明人前期通过对国内外数百份烟草种质资源的收集和抗病性鉴定，发现晒烟品种半坤村晒烟在苗期PVY接种鉴定中表现为高抗(HR)，这一鉴定结果与先前的报道一致。

已知白肋烟品种TN90对PVY的抗性是由隐性基因位点(va)控制的，具体而言是由烟草PVY感病基因eIF4E1缺失造成的(Sierro et al.，2014；Dluge et al.，2018)。为检测半坤村晒烟与TN90对PVY抗性间的等位性关系，利用半坤村晒烟与TN90及感病品种K326配制抗抗及抗感杂交组合，通过人工摩擦接种法进行鉴定。结果显示，半坤村晒烟与TN90配制抗抗组合的F1代均表现为抗病，而半坤村晒烟与K326配制抗感组合的F1代均表现为感病。上述结果表明，半坤村晒烟与TN90的PVY抗病基因间具有等位性，即推断半坤村晒烟的PVY抗性同样是由感病基因eIF4E1缺失造成的。

近年来有关烟草eIF4E1基因突变的报道日益增多，已发现烟草抗PVY材料的eIF4E1基因可发生数种不同形式的突变，包括最为常见的基因全序列缺失突变，及单碱基插入和大片段缺失突变等。本申请发明人首先利用已开发的三个不同突变类型的分子标记及用于扩增野生型eIF4E1基因3’端的特异性引物组合物对半坤村晒烟DNA进行PCR扩增试验(表1)。结果显示，半坤村晒烟中eIF4E1基因未发生已报道类型的基因突变，3’端也未发生大片段缺失(图1)。这些结果表明，半坤村晒烟具有不同类型的eIF4E1等位基因。

表1半坤村晒烟中eIF4E1基因等位性检测的PCR扩增引物信息

2、半坤村晒烟中eIF4E1新等位基因的鉴定

为最终确定半坤村晒烟中eIF4E1基因是否发生突变，发明人进一步利用烟草eIF4E1基因全序列扩增引物(eIF4E1_F：TGGCCAAACAGGCTATTAAGG；eIF4E1_R：GGCATTAATTCAAAACCAAACGAG)，以半坤村晒烟及感PVY烤烟品种K326为材料，进行RT-PCR扩增获得烟草eIF4E1基因的全长cDNA序列(图2a、图3)。然后将获得cDNA序列与中国烟草基因组数据库中的红花大金元(含有野生型eIF4E1基因的PVY感病材料)数据进行比对发现，半坤村晒烟的eIF4E1基因编码区(CDS)第149位碱基处存在一个等位基因突变，即由G突变为C(图3a)，从而导致相应编码的蛋白质第50位氨基酸残基由色氨酸(W)突变为丝氨酸(S)(图3b)。随后的全长DNA序列扩增测序显示，烟草eIF4E1.S基因包含5个外显子和4个内含子，半坤村晒烟eIF4E1基因的G→C突变位于第1外显子上(图2b、图4)。为了将半坤村晒烟中发现的eIF4E1基因突变类型与之前已报道的突变类型区分开来，发明人将半坤村晒烟中发现的eIF4E1新等位基因命名为eIF4E1.B。

3、半坤村晒烟eIF4E1基因内特异SNP共显性分子标记的建立及其应用

3.1烟草基因组DNA的提取

以抗PVY烟草品种半坤村晒烟和感病烟草品种K326杂交构建F1、F2及BC群体，采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒(Axygen)提取烟草样品基因组DNA。为了尽可能缩短和简化DNA提取步骤，在Axygen试剂盒常规提取步骤前利用Geno/Grinder2010 SPEX高通量动植物组织研磨机对烘干后样品进行前处理。这种方法利用研磨珠在高速振荡下产生的机械冲击力破坏样品细胞壁和细胞膜,使细胞内容物包括基因组成分释放出来,供下游提取纯化。具体为：剪取约100mg烟草叶片置于2ml离心管中，于55℃干燥箱中干燥24h，利用研磨机振荡研磨成细粉状后，一次性加入520μl新鲜配制的裂解缓冲液(350μl PBS、0.9μl RNaseA、150μl Buffer C-L、20μl Proteinase K)裂解细胞，其余步骤按照说明书进行。

3.2野生型等位基因分子标记引物组合物的筛选

为设计烟草eIF4E1基因分子标记特异性PCR扩增引物，发明人首先在中国烟草基因组数据库中对烟草eIF4E1基因进行核苷酸序列同源性分析。分析结果显示，烟草eIF4E1在数据库对应的基因编号为Ntab0942120，同时存在2个一致性较高的同源基因，基因编号分别为Ntab0285450和Ntab0285460(图5)。从图5中可以看出，三者在eIF4E1等位基因SNP位点上下游临近区域的核苷酸序列一致性较高，其中SNP位点上游临近20bp的核苷酸序列相对下游临近20bp的核苷酸序列一致性要小一些，因此发明人确定在SNP位点处设计分子标记正向引物，以便尽可能将eIF4E1基因(Ntab0942120)与之同源基因(Ntab0285450和Ntab0285460)区分开来。

针对半坤村晒烟eIF4E1基因的SNP位点设计4条野生型等位基因特异性正向引物(在3′端第二位或第三位引入不同的错配碱基)，同时在其下游设计2条反向引物与4条正向引物组合进行野生型等位基因分子标记引物组合物筛选(表2)。PCR退火温度设置为58℃，延伸时间设置为30sec，循环数设置为28。

表2 eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选信息(1)

引物名称	引物序列(5′-3′)	产物长度(bp)
			W-F1	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTcG
W-F2	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTgG
			W-F3	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTG
W-F4	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTG
			R1	CATCTAAAATGAGTGATACATTTGTGTCAC	250
R2	CGCTTCGTCCCAATTTACATTAG	313

引物组合	W-F1	W-F2	W-F3	W-F4
					R1	1	2	3	4
R2	5	6	7	8

通过预实验电泳结果(图6)可以看出野生型等位基因特异性正向引物W-F3、W-F4与下游反向引物R2组成的引物组合物扩增效果相对较好，但还是未达到本实验预期扩增效果。因此，本实验重新设计7条反向引物(表3)与正向引物W-F3或W-F4组成引物对进行扩增。PCR退火温度设置为58℃，延伸时间设置为35sec，循环数设置为28。从图7电泳结果可以看出野生型等位基因特异性正向引物W-F3与新设计的反向引物R5、R6、R7、R8、R9组成的引物对扩增效果相对较好。

表3 eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选信息(2)

引物组合	R2	R3	R4	R5	R6	R7	R8	R9
									W-F3	1	2	3	4	5	6	7	8

3.3突变型等位基因分子标记引物组合筛选

针对eIF4E1突变型等位基因SNP位点设计6条突变型等位基因特异性正向引物(在3′端第二位或第三位引入不同的错配碱基)(表4)，与反向引物R6组合进行突变型等位基因分子标记引物组合物筛选。PCR退火温度设置为58℃，延伸时间设置为30 sec，循环数设置为28。从图8电泳结果可以看出设计的6条突变型等位基因特异性正向引物与反向引物R6组成的各个引物组合物扩增效果均表现出较好的效果。

表4 eIF4E1突变型等位基因特异性扩增引物筛选信息

引物名称	引物序列(5′-3′)
		m-F1	ACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTcC
m-F2	CAAACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTaC
		m-F3	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCTgC
m-F4	ACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTC
		m-F5	AACCTAAGCATCCATTAGAGAATTCaTC
m-F6	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTC

引物组合	W-F3	W-F4	m-F1	m-F2	m-F3	m-F4	m-F5	m-F6
									R6	1	2	3	4	5	6	7	8

3.4共显性分子标记体系的确立

本申请发明人将检测烟草野生型eIF4E1等位基因的分子标记命名为ASM-W，所需的PCR扩增引物组合物为FW/RWm，即预实验筛选到的引物组合物W-F3/R6；将检测半坤村晒烟突变型eIF4E1等位基因的分子标记命名为ASM-m，所需的PCR扩增引物组合物为Fm/RWm，即预实验筛选到的引物组合物m-F6/R6。引物的核苷酸序列和扩增产物长度如表5所示。

表5半坤村晒烟eIF4E1基因共显性分子标记扩增引物信息

引物名称	引物序列(5′-3′)	产物长度(bp)
			FW(W-F3)	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTG
Fm(m-F6)	CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTC
			RWm(R6)	CAGGAGCTATTCAAAACCATAATTCAAC	466

FW、Fm、RWm的引物序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。

共显性分子标记检测中PCR反应体系和条件如下所示：

1)PCR反应体系(20μl)：

2)PCR反应循环程序：

3)取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。

3.5PCR扩增产物的特异性检测

以不同类型烟草材料DNA为模板，分别利用引物组合物FWm/RW和FWm/Rm进行PCR扩增，结果见图9。FWm+RW在半坤村晒烟中没有扩增产物，在杂交组合子代(F1)K326/半坤村晒烟、红花大金元/半坤村晒烟、云烟87/半坤村晒烟，以及K326、红花大金元、云烟87中扩增出一条约466bp的片段(图9a)，记作ASM-W。FWm+Rm在半坤村晒烟、杂交组合子代K326/半坤村晒烟、红花大金元/半坤村晒烟、云烟87/半坤村晒烟中扩增出一条约466bp的片段，记作ASM-m，在K326、红花大金元、云烟87中没有扩增产物(图9b)。该结果与设计的扩增产物大小一致。

为了进一步验证PCR扩增产物是否为目标基因序列，对引物组合物FW/RWm和Fm/RWm在K326、半坤村晒烟和K326/半坤村晒烟中扩增出的片段进行测序。测序结果显示，FW/RWm在K326和K326/半坤村晒烟中扩增出的DNA片段和Fm/RWm在半坤村晒烟和K326/半坤村晒烟中扩增出的DNA片段均是烟草eIF4E1基因的特异序列。上述结果表明，引物组合物FW/RWm和Fm/RWm的扩增结果与实验设计一致，均能在对应的实验材料中扩增出目标片段。

3.6 F2代群体PVY抗性鉴定

苗期采用病毒汁液摩擦接种法对半坤村晒烟和K326构建的500个单株的F2群体进行PVY抗性鉴定，接种20天后调查单株抗病情况，经鉴定群体内感病单株为378株，抗病单株为122株，复合3:1的分离比率，证明半坤村晒烟的PVY抗性受隐性单基因控制(以r基因表达)。

3.7利用分子标记鉴定F2代群体单株基因型

使用FW/RWm和Fm/RWm引物对F2代群体内不同单株的DNA进行PCR扩增，结果如图10所示，Fm/RWm引物对扩增r基因型，FW/RWm引物对扩增R基因型。F2群体中抗病材料只有一种基因型rr，扩增条带情况为Fm/RWm有特异性条带，FW/RWm无条带。感病材料有2种基因型：RR，扩增条带情况为FW/RWm有特异条带，Fm/RWm无条带；Rr，扩增条带情况为FW/RWm和Fm/RWm均有特异条带。

3.8分子标记在烟草PVY抗性回交改良中的应用

对抗、感PVY的亲本配制的回交后代(如BC1F1、BC2F1、BCnF1)种子，采用常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用DNA制备试剂盒等方法提取基因组DNA，采用分子标记ASM-W(FW/RWm)和ASM-m(Fm/RWm)引物组合物，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序如前所述，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相并记录(图11)。

然后按照如下标准判断烟草BCnF1代单株是否携带PVY抗性基因(r基因)：Fm/RWm引物组合物有466bp特异扩增条带，初步判断该单株携带PVY抗性基因。结果表明，BCnF1代单株有2种基因型：RR，扩增条带情况为FW/RWm有特异条带，Fm/RWm无条带；Rr，扩增条带情况为FW/RWm和Fm/RWm均有特异条带。筛选出携带PVY抗性基因的单株(基因型为Rr)可与K326继续回交或供下一步育种利用，表明该分子标记可用于烟草PVY抗性回交改良。需要明确指出的是，应用上述分子标记辅助选择定向改良烟草PVY抗性的实际育种过程中，针对回交子代的基因型鉴定只需应用Fm/RWm引物组合物进行一次PCR扩增即可，只有针对自交后代隐性纯合子的筛选才需要应用FW/RWm和Fm/RWm两组引物组合物进行两次PCR扩增。

与常规回交改良育种(图12a，以半坤村晒烟和K326为例)相比，分子标记辅助选择育种(图12b，以半坤村晒烟和K326为例)可利用分子标记直接对BCnF1单株进行基因型鉴定，选择携带PVY抗性基因的单株，不需自交一代，改良进度可缩短一倍，且省去了自交后代单株PVY接种鉴定工作。利用分子标记鉴定抗性具有以下优点：可显著缩短育种进程；检测准确率达100％；减少人为接种病害对其它实验材料的污染；减少人为接种病害对温度条件的需求；同一个后代单株的DNA，可用于其它分子标记的检测，可用于其它性状的分子标记辅助选择。

核苷酸序列表：

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记、引物及应用

<160> 5

<210> 1

<211> DNA

<212> 466

<213> 烟草

<400> 1

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCTTGGACT TTTTGGTTTG ATAATCCTAT GGCTAAATCT 60

AGACAAGCTG CTTGGGGCAG TTCCCTTCGC GAACTTTACA CTTTTTCCAC TGTCGAAGAT 120

TTTTTGGGGg taagttattt catattccct cggttccaat ttaggttaca gtctttcctt 180

tttagtcaac ttttagtctc cttaaatgat atatttctat atttagtaat aatttaatat 240

ttatagtgac acaaatgtat cactcatttt agatgaattt tttttttctt aaactccgta 300

ccaaatcaaa cactactaat gtaaattggg acgaagcgag tattatattt cgtgttaagc 360

tgttgtgttc tttggttgta aataaatcat ggggttttat tttactgttc aagaattttg 420

tgggtgctgt aggattttgt tgaattatgg ttttgaatag ctcctg 466

<210> 2

<211> DNA

<212> 466

<213> 烟草

<400> 2

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCTTCGACT TTTTGGTTTG ATAATCCTAT GGCTAAATCT 60

AGACAAGCTG CTTGGGGCAG TTCCCTTCGC GAACTTTACA CTTTTTCCAC TGTCGAAGAT 120

TTTTTGGGGg taagttattt catattccct cggttccaat ttaggttaca gtctttcctt 180

tttagtcaac ttttagtctc cttaaatgat atatttctat atttagtaat aatttaatat 240

ttatagtgac acaaatgtat cactcatttt agatgaattt tttttttctt aaactccgta 300

ccaaatcaaa cactactaat gtaaattggg acgaagcgag tattatattt cgtgttaagc 360

tgttgtgttc tttggttgta aataaatcat ggggttttat tttactgttc aagaattttg 420

tgggtgctgt aggattttgt tgaattatgg ttttgaatag ctcctg 460

<210>3

<211> DNA

<212> 26

<213>人工序列

<400>3

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCcTG 26

<210>4

<211> DNA

<212> 26

<213>人工序列

<400>4

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCgTC 26

<210>5

<211> DNA

<212> 28

<213>人工序列

<400>5

CAGGAGCTAT TCAAAACC ATAATTCAAC 28

Claims (5)

1.一种与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小466bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小466bp，SEQ ID No.2所示。

2.一种用于鉴别权利要求1中所述与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记的引物，其特征在于：引物序列如下：

正向引物FW：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTG-3'；

正向引物Fm：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTC-3'；

反向引物RWm：5'-CAGGAGCTATTCAAAACCATAATTCAAC-3'；

如SEQ ID NO.3、4、5所示；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FW和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-W；

正向引物Fm和反向引物RWm的组合用于扩增分子标记ASM-m。

3.权利要求1所述的与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

4.权利要求3所述的引物在鉴别烟草eIF4E-1基因位点的基因型中的应用。

5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，具体应用方式为：利用(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合这两套引物，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无；

如果(Fm+RWm)组合扩增出466bp特异扩增条带，而(FW+RWm)组合扩不出则为纯合突变型；

如果(FW+RWm)组合扩增出466bp特异扩增条带，而(Fm+RWm)组合扩不出则为野生型；

如果(FW+RWm)组合和(Fm+RWm)组合均能扩增出466bp特异扩增条带，则为杂合突变型。

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