CN113278725A - 用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi‑PASA标记引物及检测方法，外引物P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，外引物Q的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，内引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，内引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，上述引物序列中小写字母碱基为引入的错配碱基。采用本发明的四个引物，结合一次PCR和电泳，便可以准确地检测出eIF4E1基因SNP突变位点回交转育过程中回交和自交后代的基因型，提高分子标记辅助轮回选择效率，加快育种进程。

Description

用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物及 检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物及检测方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

烟草是重要的经济作物，由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的烟草PVY病毒病是影响烟草生产的主要病害之一。实践证明，选育和种植抗病品种是控制该病害最经济有效的措施。抗病种质资源的发掘、研究和利用是烟草抗PVY育种的重要基础。已知烟草PVY的抗源分为两大类，一类是以VAM(TI1406)及其衍生种质TN86为代表的隐性基因位点(VAM和va)控制的抗性，另一类是以非洲烟草(Nicotiana africana)为代表的对PVY免疫的抗性。目前，受va位点控制的抗源被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va位点的育种利用效率，国内外研究者相继开发了与va位点相关的分子标记，如RAPD(Randomly AmplifiedPolymorphic DNA)和SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记。这些标记与va位点间的遗传距离较远，导致利用标记数据判断抗性表型误差较大，进而限制了这类分子标记在育种中的实际应用。

在抗性获得的研究中，Noguchis等认为va基因型烟草植株的抗性是由于对PVY感病的基因片段的缺失造成的。2014年，Julio等通过更加深入的研究，明确了va基因型烟草植株对PVY的抗性是由于真核翻译起始因子4E1(eukaryotic translation initiationfactor 4E1，elF4E1)基因的缺失造成的，即eIF4E1基因为烟草隐性抗PVY基因(感病基因)。2015年，刘勇等根据烟草eIF4E1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与eIF4E1野生型等位基因紧密连锁的显性标记，随后利用该标记进行分子标记辅助选择育成抗PVY新品种云烟301，但由于该标记不能作为eIF4E1等位基因缺失的共显性标记，降低了其在实际育种中的应用价值和意义。2018年，Dluge等利用RNA测序的方法比较了VAM基因型、va基因型和野生型三种烟草中的基因表达差异，发现在具有PVY抗性的VAM和va基因型烟草中，真核翻译起始因子eIF4E1基因所在的染色体区段发生大范围的缺失，由于建立eIF4E1等位基因缺失的共显性标记需要了解该基因缺失连接片段的序列特点，而eIF4E1基因及其侧翼序列的大范围缺失，造成研究者未能有效地克隆到该基因的缺失连接片段、获得序列信息，从而未能开发出等位基因缺失的共显性标记。

此前，本单位通过对烟草品种半坤村晒烟中的eIF4E1等位基因进行测序和序列比对鉴定到1个基因内特异性SNP位点，随后针对该突变位点开发出共显性分子标记并已向国家专利局提出名为“与烟草PVY抗性紧密连锁的分子标记,引物及应用”的发明专利申请，申请号为“202011147704”，该发明公开了一种烟草eIF4E1基因SNP突变位点特异性共显性分子标记，标记检测由2个单一PCR扩增反应组成。与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，扩增引物对为FW/RWm，扩增片段大小466bp；与突变型位点检测相关的标记命名为ASM-m，扩增引物对为Fm/RWm，扩增片段片段大小466bp。具体操作流程如下：

1)野生型位点PCR扩增反应

上游引物FW：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCcTG-3'；

下游引物RWm：5'-CAGGAGCTATTCAAAACCATAATTCAAC-3'；

PCR反应体系(20μl)：

PCR反应循环程序：

取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。

2)突变型位点PCR扩增反应

上游引物Fm：5'-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTC-3'

下游引物RWm：5'-CAGGAGCTATTCAAAACCATAATTCAAC-3'

PCR反应体系(20μl)：

PCR反应循环程序：

取5ul扩增产物在2％的琼脂胶上进行电泳检测。

利用该标记和引物可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代单株的基因型进行准确选择，但每个单株基因型的检测都需要进行2个单一PCR扩增，操作步骤较为复杂。

双向等位基因特异PCR(bi-directional PCR amplification of specificalleles,Bi-PASA)能够在一个PCR反应体系里同时检测两个不同长度的等位基因片段，是一种更为简捷的等位基因分型方法，其通过1次PCR反应即可检测已知突变位点的类型。最近几年，利用双向等位基因特异PCR在人类疾病、花生和大麦等生物检测上已经收到越来越多的研究者重视。但双向等位基因特异PCR要求在同一反应体系中同时对不同的基因类型进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，不同引物之间是否形成二聚体、退火温度差、引物的配比、反应温度等不同参数均具有较高的要求，因此，将检测不同基因类型的特异性引物混合，利用双向等位基因特异PCR在同一反应体系中进行检测，未必能够获得理想效果，只能退而求其次，利用不同基因类型的特异性引物单独检测各自对应的基因类型。

本发明在半坤村晒烟中检测到突变型eIF4E1等位基因的基础上，探索通过双向等位基因特异PCR在同一反应中完成两个eIF4E1等位基因分子标记的扩增，为烟草抗性育种分子标记相关研究提供一种更加省时、省力、经济有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物。

本发明的另一目的是提供一种含有所述标记引物的检测试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记方法，该方法基于Bi-PASA的四个引物的核苷酸序列，以及该引物在检测携带突变型eIF4E1等位基因的抗PVY烟草(CC型)、携带野生型eIF4E1等位基因的感PVY烟草(GG型)及同时含有突变型和野生型eIF4E1等位基因的杂合型烟草(GC型)的用法。

本发明的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物，所述引物序列如下：

外引物P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：

5’-CAAAATAAGCTGATTTCTCCAGCTTG-3’；

外引物Q的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：

5’-CGCTTCGTCCCAATTTACATTAG-3’；

内引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：

5’-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTG-3’；

内引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：

5’-CCATAGGATTATCAAACCAAAAAGTgG-3’；

上述引物序列中小写字母碱基为引入的错配碱基。

第二方面，本发明提供一种含有所述标记引物的检测试剂盒。

第三方面，本发明提供一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记方法，包括以下步骤：

步骤1，提取烟草品种基因组DNA；

步骤2，利用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的检测试剂盒扩增所述烟草品种基因组DNA，获得PCR扩增产物；

步骤3，将所述PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。

可选的，步骤2中PCR扩增反应体系如下：

可选的，步骤2中PCR扩增反应程序为：

PCR反应在C1000 TouchTMPCR仪中进行。

可选的，步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳50min检测，

如果扩增产物中存在337bp片段而不存在441bp片段，显示标记个体基因型为GG型，为纯合野生型个体；

如果扩增产物中存在441bp片段而不存在337bp片段，显示标记个体基因型为CC型，为纯合突变型个体；

如果扩增产物中同时存在337bp和441bp两个片段，显示标记个体基因型为GC型，为杂合突变型个体。

本发明的有益效果是：采用本发明的四个引物，结合一次PCR和电泳，便可以准确地检测出eIF4E1基因SNP突变位点回交转育过程中回交和自交后代的基因型，提高分子标记辅助轮回选择效率，加快育种进程。

本发明是在突变位点附近设计两个外引物和两个内引物，内引物的3’终末端为突变位点，同时在内引物3’末端引入错配碱基，当引物错配时，延伸效率降低，最后根据扩增片段的数量和大小检测突变是否发生。此方法将原来利用2对引物分管扩增抗感等位基因的2个单一的PCR扩增反应简化为四引物单管PCR扩增，操作简便、省时省力。

附图说明

图1：烟草eIF4E1基因SNP突变位点上下游区域DNA序列比较及引物设计策略分析示意图。碱基下方标注两个星号代表SNP突变位点，标注一个星号代表突变位点临近区域存在的特异性碱基；

图2烟草eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选电泳结果。M：DL 2000 DNAMarker；1-8：不同引物组合扩增产物，每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物；

图3烟草eIF4E1突变型等位基因特异性扩增引物筛选电泳结果(1)。M：DL 2000DNA Marker；1-12：不同引物组合扩增产物，每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物；

图4双向等位基因特异PCR引物组合筛选电泳结果(1)。M：DL 2000 DNA Marker；1-18：不同引物组合扩增产物；

图5双向等位基因特异PCR引物组合筛选电泳结果(2)。M：DL 2000 DNA Marker；1-18：不同引物组合扩增产物；

图6烟草eIF4E1突变型等位基因特异性扩增引物筛选电泳结果(2)。M：DL 2000DNA Marker；1-9：不同引物组合扩增产物，每一编号下面分为两条泳道，第一条泳道是以感PVY品种(K326)DNA为模板的PCR产物，第二条泳道是以抗PVY品种(半坤村晒烟)DNA为模板的PCR产物；

图7双向等位基因特异PCR引物组合筛选电泳结果(3)。M：DL 2000 DNA Marker；1-9：不同引物组合扩增产物；

图8双向等位基因特异性PCR扩增原理；

图9：Bi-PASA遗传标记引物对抗感材料基因组DNA扩增情况。M：DL2000 marker；1：半坤村晒烟；2：K326×半坤村晒烟；3：红花大金元×半坤村晒烟；4：云烟87×半坤村晒烟；5：K326；6：红花大金元；7：云烟87；(a)P/B引物扩增结果；(b)A/Q引物扩增结果；(c)A/Q/P/B引物扩增结果；

图10：Bi-PASA遗传标记在F₂群体和亲本中的扩增。P1：半坤村晒烟；P2：K326；1-22：F₂代单株。4、6、10、14和21单株为纯合突变型(CC)，扩增产物电泳带型与亲本1半坤村晒烟相同，为两条电泳条带；3、7、11、16、17和18单株为纯合野生型(GG)，扩增产物电泳带型与亲本2K326相同，为一条电泳条带；其余单株为杂合突变型(GC)，扩增产物电泳条带为三条带；

图11：F₂代群体单株PCR产物直接测序结果。A:GG型样本的测序结果；B:GC型样本的测序结果，SNP处显示重叠峰，从曲线颜色可以判断出是GC杂合型；C:CC型样本的测序结果。图中所示均为正义链的测序结果。

图12：Bi-PASA遗传标记在回交后代中对部分单株的检测结果。P1：半坤村晒烟；P2：K326；1-22：回交后代单株。2、3、6、9、10、12、13、15、18和20单株为纯合野生型(GG)，扩增产物电泳带型与亲本2K326相同；其余单株为杂合突变型(GC)，扩增产物电泳条带为三条带；

图13：利用Bi-PASA分子标记对不同烟草品种进行PCR扩增检测结果。M：DL2000marker；1-24：烟草种质资源(表4)；R：抗病品种资源；S：感病品种资源。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

1、烟草基因组DNA的提取

以抗PVY烟草品种半坤村晒烟和感病烟草品种K326杂交构建F₁、F₂及BC群体，采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒(Axygen)提取烟草样品基因组DNA。为了尽可能缩短和简化DNA提取步骤，在Axygen试剂盒常规提取步骤前利用Geno/Grinder2010 SPEX高通量动植物组织研磨机对烘干后样品进行前处理。这种方法利用研磨珠在高速振荡下产生的机械冲击力破坏样品细胞壁和细胞膜,使细胞内容物包括基因组成分释放出来,供下游提取纯化。

采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒提取烟草品种基因组DNA，具体方法如下：

1)取100mg烟草的幼嫩叶片置于2ml离心管中，于55℃开盖烘干24h，利用Geno/Grinder2010 SPEX高通量动植物组织研磨机振荡研磨成细粉状后，一次性加入350μl PBS、0.9μl RNase A、150μl Buffer C-L、20μl Proteinase K，立刻漩涡振荡1min混合均匀，56℃水浴30min；

2)加入350μl Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12000rpm离心10min；

3)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤1.2的离心后上清液移至制备管中，12000rpm离心1min；

4)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12000rpm离心1min；

5)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12000rpm离心1min，以同样的方法，用700μl Buffer W2再洗涤一次。

6)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000rpm离心1min；

7)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100μl Eluent或去离子水，室温静置10min，12000rpm离心1min洗脱DNA。

2、检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物的筛选

在中国烟草基因组数据库利用blastn程序对烟草eIF4E1基因组序列进行同源性检索，结果显示烟草eIF4E1基因在数据库中对应的基因编号为Ntab0942120，同时具有2个一致性较高的同源基因，基因编号分别为Ntab0285450和Ntab0285460，特别是针对野生型eIF4E1等位基因(eIF4E1.S)而言，在SNP突变位点处这种较高的一致性更加明显(图1)。为了尽量提高eIF4E1野生型等位基因Bi-PASA标记引物在SNP突变位点处的特异性，发明人确定在SNP突变位点处设计eIF4E1野生型等位基因的正向引物(表1)，并在该引物3'端倒数第2位或第3位人为引入1个错配碱基，以提高PCR延伸反应的特异性。然后，通过比对在其下游500bp以内的基因组序列中寻找eIF4E1特异性碱基序列作为引物3'端设计反向引物(表1)，与正向引物组成不同引物组合进行PCR扩增效果检测。通过电泳结果可以看出，不同引物组合扩增效果明显不同，W-F3/R2和W-F4/R2引物组合物扩增效果较好(图2)。上述引物组合PCR退火温度均设为58℃，延伸时间均设为30sec，循环次数均设为30次。

表1烟草eIF4E1野生型等位基因特异性扩增引物筛选信息

对应于野生型等位基因，发明人在突变位点处设计突变型等位基因反向特异引物(表2)，并在该引物3'端倒数第2位或第3位人为引入1个错配碱基，以提高PCR延伸反应的特异性。然后，将其上游500bp以内的基因组序列在中国烟草基因组数据库中进行BLAST比对分析，寻找eIF4E1特异性碱基序列设计反向特异引物(表2)，与正向引物组成不同引物组合进行PCR扩增效果检测。从图3电泳结果可以看出，不同引物组合扩增效果存在一定差异。上述引物组合PCR退火温度均设为58℃，延伸时间均设为30sec，循环次数均设为30次。

表2烟草eIF4E1突变型等位基因特异性扩增引物筛选信息

为筛选到烟草eIF4E1基因SNP突变位点的双向等位基因特异PCR(Bi-PASA)的最佳引物组合，将之前所有筛选到的烟草eIF4E1野生型和突变型等位基因特异性扩增引物组合进行多重PCR引物组合扩增(图4、5)。从图4、5可以看出，引物组合Wm-F1/m-R1/W-F4/Wm-R2或Wm-F2/m-R1/W-F4/Wm-R2扩增效果较好。

为扩大双向等位基因特异PCR中野生型与突变型等位基因扩增片段长度差距，以便凝胶电泳条带易于分开，同时获得双向等位基因特异PCR扩增效果更佳的引物组合，发明人在Wm-F2上游设计9条正向引物与m-R1进行引物组合扩增，结果显示9个引物组合扩增效果良好(图6)。将上述9个引物组合分别与W-F4/Wm-R2组合进行双向等位基因特异PCR扩增(图7)。从图7可以看出，引物对组合Wm-F5/m-R1/W-F4/Wm-R2扩增效果最好，特异性条带最清晰、明亮，扩增产物含量最高。上述引物组合双向等位基因特异PCR退火温度均设为58℃，延伸时间均设为30sec，循环次数均设为30次。

3、烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA分子标记的确定

为了将半坤村晒烟中eIF4E1突变型等位基因与野生型等位基因区分开来，发明人针对该突变型等位基因SNP突变位点建立了一个Bi-PASA分子标记。根据双向等位基因特异性PCR扩增原理(图8)，对半坤村晒烟中eIF4E1突变型等位基因的SNP突变位点设计1套特异引物，包括2个内引物(A和B)和2个外引物(P和Q)。在引物设计过程中，为提高延伸反应的特异性，在内引物的3'端倒数第2位或第3位人为引入1个错配碱基(表3)。

表3 Bi-PASA分子标记引物序列

^a序列中大写字母碱基为互补序列，小写字母碱基为引入的错配碱基。

采用TAKARA公司的Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)试剂盒(TaKaRa Code:RR901A)进行多重PCR扩增及检测，反应体系如下：

1)PCR反应体系(20μl)：

2)PCR反应循环程序：

PCR反应在C1000 Touch^TMPCR仪中进行。将扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳50min检测，如果扩增产物中存在337bp片段而不存在441bp片段，显示标记个体基因型为GG型，为纯合野生型个体；如果扩增产物中存在441bp片段而不存在337bp片段，显示标记个体基因型为CC型，为纯合突变型个体；如果扩增产物中同时存在337bp和441bp两个片段，显示标记个体基因型为GC型，为杂合突变型个体(图9)。需要指出的是，尽管在该体系中外侧引物PQ组合扩增效率较低，发生不平衡扩增，但是PQ引物组合电泳条带(726bp)有无和强弱不影响个体基因型的判断。

4、F₂代群体PVY抗性鉴定

苗期采用病毒汁液摩擦接种法对半坤村晒烟和K326构建的500个单株的F₂群体进行PVY抗性鉴定，接种20天后调查单株抗病情况，经鉴定群体内感病单株为378株，抗病单株为122株，复合3:1的分离比率，证明半坤村晒烟的PVY抗性受隐性单基因控制(以C基因表达)。

5、利用Bi-PASA分子标记鉴定F₂代群体单株基因型

采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒提取F₂代单株基因组DNA(方法同上)，使用Bi-PASA遗传标记引物对F₂代群体内不同单株的DNA进行PCR扩增(方法同上)，结果如图10所示，P1为亲本1半坤村晒烟，P2为亲本2K326，1-22为F₂代单株。4、6、10、14和21单株的基因型与亲本1半坤村晒烟相同，即纯合突变型(CC)，抗性鉴定结果显示这些单株具有PVY抗病性。3、7、11、16、17和18单株的基因型与亲本2K326相同，即纯合野生型(GG)，抗性鉴定结果显示这些单株具有PVY感病性。其余单株为杂合突变型(GC)，抗性鉴定结果显示这些单株同样具有PVY感病性。由此可见，利用Bi-PASA遗传标记区分eIF4E1基因纯合野生型、纯合突变型和杂合突变型的准确率为100％。

6、F2单株的基因型测序验证

为了验证Bi-PASA分型结果的准确性，本试验采用外侧引物P和Q对22个Bi-PASA分型单株进行PCR扩增(方法同上)，然后将扩增产物送至上海生工测序。利用Chromas2.3查看测序结果，如图11中A、B、C图分别是SNP位点Bi-PASA分型结果为GG、GC、CC型样本的测序结果。测序结果表明，Bi-PASA分型结果与测序结果的一致性达到100％，说明Bi-PASA方法是准确的、可靠的。

7、分子标记在烟草PVY抗性回交改良中的应用

对抗、感PVY的亲本配制的回交后代(如BC1F1、BC2F1、BCnF1)种子，采用常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用DNA制备试剂盒等方法提取基因组DNA，采用Bi-PASA遗传标记引物组合物，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序如前所述，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相并记录(图12)。

然后按照如下标准判断烟草BCnF1代单株是否携带PVY抗性基因(C基因)：电泳结果出现441bp特异扩增条带，初步判断该单株携带PVY抗性基因。结果表明，BCnF1代单株有2种基因型：GG，电泳结果出现337bp特异扩增条带，不存在441bp特异扩增条带；GC，电泳结果同时出现337bp和441bp特异扩增条带。筛选出携带PVY抗性基因的单株(基因型为GC)可与受体亲本继续回交或供下一步育种利用。需要指出的是上述实验中电泳结果是否出现726bp的扩增条带不影响每个单株的基因型判断。

8、Bi-PASA分子标记在烟草种质资源中的有效性检测

为了检验所建立的Bi-PASA分子标记在其他烟草种质资源中的有效性，使用Bi-PASA分子标记对除K236、云烟87和红花大金元以外的24份已知PVY抗性的品种资源进行检测，其中包括烤烟、晒烟、白肋烟和雪茄烟资源类型(表4)。如图13所示，在所检测的17个PVY感病品种中均扩增出一个337bp片段。除半坤村晒烟外，在其他PVY抗病品种中均未显示出任何扩增片段，这是因为在这些PVY抗病品种中eiF4E1基因发生了完全缺失，在此情况下，本发明所开发的分子标记将作为显性分子标记将半坤村晒烟与其他抗病品种区分开来。和预期一样，在半坤村晒烟中产生了一个441bp片段。

表4 24份已知PVY抗性烟草种质资源信息表

^*R：抗病；S：感病。

<110>贵州省烟草科学研究院

<120>用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物及检测方法

<160>4

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CAAAATAAGC TGATTTCTCC AGCTTG 26

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CGCTTCGTCC CAATTTACAT TAG 23

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCgTG 26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CCATAGGATT ATCAAACCAA AAAGTgG 27

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物及检测方法

<160> 4

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>1

CAAAATAAGC TGATTTCTCC AGCTTG 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>2

CGCTTCGTCC CAATTTACAT TAG 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>3

CCTAAGCATC CATTAGAGAA TTCgTG 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>4

CCATAGGATT ATCAAACCAA AAAGTgG 27

Claims (6)

1.一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：

外引物P的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：

5’-CAAAATAAGCTGATTTCTCCAGCTTG-3’；

外引物Q的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：

5’-CGCTTCGTCCCAATTTACATTAG-3’；

内引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：

5’-CCTAAGCATCCATTAGAGAATTCgTG-3’；

内引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：

5’-CCATAGGATTATCAAACCAAAAAGTgG-3’；

上述引物序列中小写字母碱基为引入的错配碱基。

2.含有权利要求1所述标记引物的检测试剂盒。

3.一种用于检测烟草eIF4E1基因SNP突变位点的Bi-PASA标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取烟草品种基因组DNA；

步骤2，利用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的检测试剂盒扩增所述烟草品种基因组DNA，获得PCR扩增产物；

步骤3，将所述PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。

4.根据权利要求3所述的Bi-PASA标记方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增反应体系如下：

5.根据权利要求3所述的Bi-PASA标记方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增反应程序为：

PCR反应在C1000 Touch^TMPCR仪中进行。

6.根据权利要求3所述的Bi-PASA标记方法，其特征在于，步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳50min检测，

如果扩增产物中存在337bp片段而不存在441bp片段，显示标记个体基因型为GG型，为纯合野生型个体；

如果扩增产物中存在441bp片段而不存在337bp片段，显示标记个体基因型为CC型，为纯合突变型个体；

如果扩增产物中同时存在337bp和441bp两个片段，显示标记个体基因型为GC型，为杂合突变型个体。

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