CN106676179A - 一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用 - Google Patents

一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记和应用，属于植物生物技术领域。本发明的分子标记包含两条正向引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、一条反向引物SEQ ID NO.3。利用该分子标记，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可完成对水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的基因分型。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高目标性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。

Description

一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用。
背景技术
雄性不育系的发掘和利用是提高作物产量和获取杂种优势的重要途径。目前，主要的杂交育种方法有“三系法”和“两系法”，二者在提高作物产量和保证国家粮食安全中发挥了非常重要的作用，但也都存在一些比较明显的弊端。
比如，三系法的利用中不仅需要选育质核互作的雄性不育系，受恢保关系的制约，同时还需要选育对应的保持系和恢复系才能进行繁种和制种，育种过程复杂、育种周期冗长、育种效率和种质资源利用率低下；以光温敏不育系为基础的两系法虽然打破了恢保关系的限制，但光温敏雄性不育材料的育性受到环境温度和光照变化的影响，易导致繁种和制种失败，造成两系杂交法难以大量推广应用。单隐性核雄性不育基因控制的不育系恰好克服了“三系法”和“两系法”的缺陷，其育性不受光温条件影响，兼具三系法的稳定性和两系法配组灵活性的优点，因而具有重要的潜在商业利用价值。
水稻材料1907是海南波莲水稻基因科技有限公司于2013年6月在湖南省农业科学院用钴60辐射籼稻材料9311后，经多世代筛选而获得的一个由单基因(cyp704b2)控制的无花粉型隐性核雄性不育、雌性可育的突变体材料。在该突变体中野生型CYP704B2基因编码区第794个碱基后的GGG被替换为T，造成了移码突变和翻译提前终止，导致野生型CYP704B2蛋白C端339个氨基酸被Tyr-Ala-Val-Thr所取代，最终产生不育表型(龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)：44-52)。
DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。对于基因组中核苷酸序列已知的小片段插入缺失类型的遗传差异一般可使用特异引物PCR标记进行检测，例如STS(sequnce-tagged site)标记，引物扩增受阻突变体系PCR标记，CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)标记，dCAPS(Derived CleavedAmplified Polymorphic Sequences)标记等(管峰，艾君涛，杨利国.一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术.生命的化学，2004，24(6)：514-516；王忠华，RedusMARC，贾育林.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立.中国水稻科学，2005，19(6)：483-488；水稻紫色果皮的延迟遗传及Pb基因功能标记开发.中国水稻科学，2014，28(6)：605-611；张亚东，周丽慧，郑佳，等。2016，一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，专利号：CN103882145B；丁丹，张亚东，郑佳.水稻粒长基因GS3和qGL3功能标记的设计及应用.江苏农业学报，2014，30(6)：1191-1197)。然而这些方法在实用性、检测效率或使用成本上各自存在不同程度的局限性，因而不利于大规模、批量化的育种实践运用。
鉴于隐性核雄性不育材料在育种中潜在的巨大商业价值及运用前景，针对基因中引起功能变异的碱基序列，设计与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记。
本发明的第二个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型的方法及其应用。
本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记同时鉴定水稻的基因型和水稻是否存在隐性核雄性不育基因cyp704b2的方法及其应用。
本发明提供的一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。
本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。
本发明提供了上述分子标记在水稻育种中的应用。
本发明提供了用于检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的特异性引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物M1907-F1：TGTCGGGTTTGGGGTTGAGATAGGG，SEQID NO.2所示的正向引物M1907-F2:GGGTTTGGGGTTGAGATCTAAGCT，和SEQ ID NO.3所示的反向引物M1907-R:AGCGTGACGATGATGTTGGCAGC。
本发明上述引物组合是针对野生型CYP704B2基因的编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变设计、筛选后获得。M1907-F1和M1907-F2的3’末端碱基分别为GGG和GCT，只能分别与野生型和突变型完全配对。此外，M1907-F1的5’端增加了不完全配对序列TGTC用以引入扩增片段长度多态性，M1907-F1和M1907-F2的3’端第四个碱基均引入C→A的突变用以扩大M1907-F1和M1907-F2对目标序列识别能力的差异。M1907-R为公共反向引物，可以分别与M1907-F1和M1907-F2配对扩增出96bp和90bp的PCR产物。
本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。
本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定特定水稻种质资源中是否存在隐性核雄性不育基因cyp704b2的方法。
本发明提供了前述特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。
进一步地，本发明提供了检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型及其是否存在于某一特定水稻种质资源中的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析。
若扩增产物只出现90bp条带，则表明待测样品具有纯合突变基因型cyp704b2；若只出现96bp条带，则表明待测样品为纯合野生基因型CYP704B2；若同时出现90bp和96bp条带，则表明待测样品为杂合基因型。
90bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，96bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。
进一步地，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench TopTM Taq master mix 4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃，4min；94℃、20s，63℃、20s，72℃、20s，共35个循环，接着72℃、5min，最后16℃，1min。
在本发明的实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。
含有本发明所述的特异性引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2选育中的应用。
本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于野生型CYP704B2基因编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变，设计并开发了一种扩增片段短，特异性强的三引物分子标记。利用该标记，只需通过简单的PCR即可完成对水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的基因分型，预测水稻是否不育。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。
附图说明
图1是本发明分子标记的引物设计示意图。包括一条公共的反向引物M1907-R，两条正向引物M1907-F1和M1907-F2。其中，M1907-R可以分别与CYP704B2(野生型)和cyp704b2(突变型)基因序列完全匹配；M1907-F1只能与CYP704B2基因序列完全匹配，M1907-F2只能与cyp704b2基因序列完全匹配。M1907-F1的5'端第一个碱基引入G→T的突变，3'端第四个碱基引入C→A的突变；M1907-F2的3'端第四个碱基引入C→A的突变。GGG突变位点用方框标出，引入的碱基突变用下划线标出。
图2是用本发明分子标记检测12个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图。泳道1-12分别为1907、五丰B、华占、中香黄占、R51084、青丰1号B、南H197、福丰恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B。PCR产物大小标记在胶图右侧。
图3是用本发明分子标记检测F1和F2群体PAGE胶电泳图。泳道1-18为1907纯合株/1907杂合株杂交F1群体不同单株，19-30为1907/9311杂交F2分离群体不同单株，31为1907，32为9311。PCR产物大小标记在胶图右侧。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1水稻隐性核不育基因cyp704b2的引物设计及扩增片段分析
1、引物设计
参考野生型CYP704B2和突变型cyp704b2基因序列的差异设计了能够鉴别隐性核雄性不育表型和正常育性表型的三引物组合：
M1907-F1:TGTCGGGTTTGGGGTTGAGATAGGG(SEQ ID NO.1)，M1907-F2:GGGTTTGGGGTTGAGATCTAAGCT(SEQ ID NO.2)，和M1907-R:AGCGTGACGATGATGTTGGCAGC(SEQID NO.3)(见图1)。
2、扩增片段分析
用上述引物组合对水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2进行扩增，不育材料只能扩出一条90bp的条带，可育材料能扩出一条96bp条带，或者同时扩出一条96bp和一条90bp条带。90bp和96bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
实施例2用本发明分子标记鉴定水稻品种/品系的cyp704b2基因型
1、实验材料
1907、五丰B、华占、中香黄占、R51084、青丰1号B、南H197、福丰恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B
2、水稻基因组DNA的提取
采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：在苗期取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH2O溶解DNA。
3、PCR扩增及检测
利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(M1907-F1，M1907-F2，M1907-R)对本实施例所述12个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTopTM Taq master mix 4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，20s，63℃，20s，72℃，20s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。
扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。电泳完成后用0.1％AgNO3染色，观片灯上观察拍照。
4、结果与分析
用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增这12个品种/品系，发现只有1907扩增出了一条90bp的带，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条96bp的带(见图2)。这一结果表明自然条件下不存在与隐性核雄性不育系1907存在相同变异的水稻种质，同时也印证了本发明分子标记在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型时的准确性和可靠性。
实施例3用本发明分子标记进行辅助选择育种
1、实验材料
1907纯合株/1907杂合株杂交F1代18个单株，1907/9311杂交F2代分离群体12个单株。
2、水稻基因组DNA的提取
参见实施例2。
3、PCR扩增及检测
参加实施例2。
4、结果与分析
用本发明实施例1的分子标记(特异性引物组合M1907-F1、M1907-F2和M1907-R通过PCR扩增得到)在苗期检测本实施例中30个单株的cyp704b2基因型，结果见图3。1907纯合株/1907杂合株杂交F1代18个单株中有6个单株只扩增出了90bp条带，有12个单株同时扩增出了90bp和96bp条带；1907/9311杂交F2代分离群体12个单株有2个只扩增出了90bp条带，1个只扩增出了96bp条带，9个同时扩增出了90bp和96bp条带。收种后对所述全部单株的育性进行鉴定，发现只扩出90bp条带的单株均为雄性不育，而剩余能扩增出96bp条带的单株雄性育性均正常。说明本发明分子标记能有效跟踪隐性核不育基因cyp704b2，并能准确预测水稻雄性育性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用
<130> KHP171110231.7TQ
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtcgggttt ggggttgaga taggg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggtttgggg ttgagatcta agct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcgtgacga tgatgttggc agc 23
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<212> DNA
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gggtttgggg ttgagatcta agctgtcacc tgatctcccg gagaacagct ttgcccaggc 60
attcgacgct gccaacatca tcgtcacgct 90
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<212> DNA
<213> 水稻
<400> 5
tgtcgggttt ggggttgaga tagggacgct gtcacctgat ctcccggaga acagctttgc 60
ccaggcattc gacgctgcca acatcatcgt cacgct 96

Claims (10)

1.一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。
2.权利要求1所述的分子标记在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记在水稻育种中的应用。
4.用于检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
5.权利要求4所述的特异性引物组合在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。
6.权利要求4所述的特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。
7.检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1-3所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物进行PAGE胶电泳，根据电泳条带确定cyp704b2的基因型。
8.一种检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1-3所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小推测水稻是否含有隐性核雄性不育基因cyp704b2。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTopTM Taq master mix 4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃，4min；94℃、20s，63℃、20s，72℃、20s，共35个循环；接着72℃、5min，最后16℃，1min。
10.含有权利要求4所述的特异性引物组合的试剂盒。
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