CN112521472A - 一种与水稻育性及花器官数目相关的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与水稻育性及花器官数目相关的分子标记及其应用。本发明将籼稻品种93‑11经钴60辐射诱变后，筛选得到雄性核不育突变体，通过图位克隆的方法，将突变体定位在水稻12号染色体长臂包含MIL2基因在内碱基位16702239到17016311之间的314.070Kb的碱基缺失。该缺失突变体命名为mil2‑4390，缺失片段两端核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该突变体可以通过分子标记M1来鉴定。mil2‑4390突变体引起水稻隐性雄性核不育、雌性低育且导致水稻花器官数目发生变异，可用于制备隐性雄性核不育或花器官变异的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。

Description

一种与水稻育性及花器官数目相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个与水稻核雄性不育、雌性低育、花器官数目发育相关的基因突变体及其分子标记和应用。
背景技术
水稻不仅是单子叶植物基因组研究的模式植物，而且是重要的粮食作物。水稻是世界上三分之一人类的主食，其花不仅是繁殖器官，而且是形成子粒的基础。水稻花 的正常发育直接影响稻谷产量和稻米品质，因此水稻花发育的研究一直是水稻遗传育 种工作者关注的重点。研究水稻花发育不仅具有重要的理论意义，而且对水稻产量和 品质遗传育种具有重要的指导意义。
通过水稻分子遗传学的研究发现双子叶模式植物拟南芥、金鱼草等物种研究中获得的“ABCDE花器官调控模型”部分适用于解释水稻等单子叶植物花器官发育的分子 调控(Yoshida H and Nagato Y.Flower development in rice.2011,J Exp Bot.,62(14):4719- 4730；Lombardo F and Yoshida H.Interpreting lemma and palea homologies:apoint of view from rice floral mutants.Front Plant Sci,2015,61(6):1-6.)。目前已克隆多个与双子叶植物 拟南芥、金鱼草相应的ABCDE模型基因功能相似、产物同源的MADS-box基因(于新， 王建军，王才林.水稻花器官发育的分子机理.分子植物育种,2013,11(4):617-624.)，然而 水稻与拟南芥等植物进化上相差较远，花的形态结构差异较大，水稻花具有与双子叶 植物相似的雄蕊和雌蕊繁殖器官，但没有明显的双子叶植物所具有的花尊和花瓣结构， 围绕雄蕊和雌蕊繁殖花器官的是与双子叶植物和其他单子叶植物的花萼、花瓣明显不 同的外稃、内稃和浆片。
随着研究的深入及新的水稻花发育相关突变体基因的分离，越来越多的研究显示， 单子叶水稻与双子叶拟南芥菜花器官形态建成有较多的不同仍然有许多问题需要解决 (Hitoshi Y and Yasuo N.Flower development in rice.J Exp Bot,2011, 62(14):4719-4730；Lombardo F and Yoshida H.Interpreting lemna andpalea homologies:apointof view from rice floral mutants.Front Plant Sci,2015,61(6):1-6.)。首先，内、外稃是 否是花尊的同源物，这一点并没有充足的实验证据来支持；其次，内、外稃是同一种 器官或是不同的器官也还未获得充分的证据；第三，水稻颖片究竟是一朵退化的花还是一整朵花的有机组成部分，仍然不是很清楚。因而，对水稻的花发育过程的遗传调 控机制尚不能像拟南芥那样形成一个总体轮廓，要阐明水稻花发育的一些基本问题， 还有待一些新的基因克隆和研究。
雄性不育系是杂交水稻育制种技术的关键节点。雄性不育系是指雄配子发育异常而丧失生育能力，雌配子发育正常的植物株系。它只能作为母本接受父本的花粉，自 交不能结实。目前杂交水稻生产上应用的雄性不育系有核质互作型和光温敏型两种。 核质互作型雄性不育系的不育基因在细胞质中，细胞核中没有育性恢复基因。当细胞 核中有育性恢复基因的恢复系与其配组杂交时可以生产可育的子一代杂交种，当细胞 核中没有育性恢复基因而细胞质中也没有不育基因的保持系与其杂交时可以繁殖不育 系种子。由于需要不育系、保持系和恢复系三系配套，这种杂交水稻育制种技术常被 称为“三系法”。一些控制核质互作型不育及相应育性恢复的基因已经被克隆(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65：579-606)。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时影响水稻雌雄育性及花器官数目发育的突变体，与该突变体共分离的分子标记及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供一种隐性核不育类型的雄性不育突变位点及基于该突变所产生的雌性低育及花器官数目变异。
本发明所提供的的突变位点产生的不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以 通过转野生型基因恢复育性。该基因和该基因突变产生的不育系为研发水稻新型杂交 育制种技术提供了元件，为解决现有技术存在的问题奠定了基础，同时能为水稻花器 官发育ABCDE模型提供研究基础。
本发明的第一方面提供一个水稻MIL2基因缺失突变体，位于12号染色体长臂，包含基因MIL2在内的16702239碱基位到17016311碱基位共314.070Kb的碱基缺失，将该 缺失命名为突变体mil2-4390。进一步地，水稻MIL2基因缺失突变体mil2-4390缺失片段 两端侧翼核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的保护范围还包括，包含上述突变体mil2-4390的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞。
上述突变体mil2-4390的发现过程及特点：
(1)突变体mil2-4390表型分析
在将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变后，筛选得到一株雄性不育突变体，通过多代种植，表型观察与检测，进一步证实该突变可引起水稻隐性雄性核不育、雌性低育且 导致水稻花器官数目发生变异。通过图位克隆的方法，将突变位点定位在水稻12号染 色体长臂16702239碱基位到17016311碱基位共314.070Kb的碱基缺失，命名为突变体 mil2-4390。
突变体mil2-4390的突变区间包含了MIL2基因在内的49个ORF，如图4中的C所示，因此综合导致了目标性状。
(2)突变体mil2-4390遗传分析
对突变体mil2-4390进行光温环境测试，证明mil2-4390突变体的雄性育性稳定，不 受光温环境影响，是一个普通核雄性不育雌性低育突变体。
因突变体mil2-4390缺失49个ORF，不能预期同时缺失49个ORF的表型是否由一个基因控制。在长日高温条件下种植mil2-4390与明恢63的F2代分离群体，发现具育性与 雄性不育分离比符合3:1，因此mil2-4390的雄性不育性状受一对隐性单基因控制。
本发明的第二方面提供一种与突变体mil2-4390共分离的分子标记M1，所述分子标记由SEQ ID NO.2-4所示引物对扩增得到。
使用与突变体mil2-4390共分离的分子标记检测mil2-4390突变体雄性不育表型上 的特异性，表明该分子标记在多个品种中存在多态性。
本发明第三方面提供检测上述分子标记M1的引物对：
上游引物M1_F：GGGTCTTTTGCACGGTATTA(如SEQ ID NO.2所示)；
上游引物W1_F：CCCAACGAAATAAATAGG(如SEQ ID NO.3所示)；
下游引物R：TAAGAGCGTTTGTAGGAAGT(如SEQ ID NO.4所示)。
基于本领域技术人员的理解，上述分子标记或引物对在制备转基因植物、作物改良育种及制种、制备隐性雄性核不育的转基因水稻、及水稻育性检测中的应用，均属 于本发明的保护范围。
本发明的第四方面提供一种检测水稻育性的方法，利用SEQ ID NO.2-4所示引物对，扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增条带；
若只出现201bp的条带，则标志着该待检植物具有雄性不育、雌性低育且花器官变异表型；
若只出现115bp的条带，则标志着该待检植物为野生型正常表型；
若同时出现201bp和115bp的条带，说明待检测植物是mil2-4390杂合基因型。
本发明的第五方面提供一种水稻不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含有突变位点mil2-4390的水稻为母本，育性正常的水稻为父本进行杂交；
(2)以F1代为母本，与父本回交；
(3)使用SEQ ID No.2-4所示引物对检测后代植株mil2-4390基因型，选择 mil2-4390杂合基因型且与轮回亲本基因型相似度高的植株；
(4)步骤(3)得到的植株为母本与父本回交；
(5)重复步骤(3)与(4)，选出mil2-4390基因型杂合，遗传背景回复率高的植 株，收自交种；
(6)种植(5)中得到的自交种，重复步骤(3)与(4)，选出mil2-4390基因型 杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种，种植，后代中分离的mil2-4390纯合株 即含有纯合mil2-4390突变基因的隐性核不育系。
本发明的有益效果是：
(1)突变体mil2-4390来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对水稻分子育种十分有利；
(2)本发明的突变体mil2-4390包含12号染色体长臂的16702239碱基位到17016311 碱基位共314.070Kb的碱基缺失，不仅造成完全的雄性不育，雌性低育，而且造成了雌 雄花器官数目的变异，为进一步研究水稻花器官发育ABCDE模型提供了研究基础，证明了大片段缺失所携带的附加效应；
(3)因辐射诱变造成突变位点比野生型少约314.070Kb个碱基对，采用实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳就能开展分子检测，不需要特别的检测技术和方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中野生型93-11和突变体mil2-4390整株和穗型照片。
图2是本发明中野生型93-11和突变体mil2-4390花器官照片；
其中1-5为突变体4390花器官照片，6为野生型93-11花器官照片。
图3是本发明中野生型93-11与突变体mil2-4390的花粉I2-KI染色照片。
图4是本发明中突变位点mil2-4390的位置确定；
其中，A显示突变位点mil2-4390在染色体上的位置；B显示突变位点mil2-4390 的粗定位结果；C显示突变位点mil2-4390缺失片段图。
图5是本发明中雄性不育基因MIL2-4390的初步定位与检测；
其中M为D2000 DNA Ladder标记，其余泳道为引物检测模板野生型93-11和突 变位体mil2-4390的检测结果。
图6是本发明中共分离标记M1检测各品种基因型的结果；
其中A为M1检测mil2-4390和明恢63的F2群体的基因型；上带大小201bp， 下带大小115bp；泳道CK为阴性对照水；泳道1-11为11个mil2-4390和明恢63的 F2群体分离出来的单株；
B为不同品种和这些品种和mil2-4390的基因型多态性，其中泳道1～13分别为 M1标记检测亲本4390、ZH11、明恢63、野香B、R51084、青丰29B、青丰1B、博 II B、H28B、宜香B、特B、空育131、隆科638S。
图7是本发明杂交转育的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分 实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有 作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1水稻核雄性不育雌性低育突变体mil2-4390的表型和遗传分析
(1)mil2-4390突变体的筛选
2013年6月用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。2014年春，选种子量较 多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽 穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。 在其中4390号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为mil2-4390。野生型和突变体mil2-4390整株和穗型见图1；野生型93-11和突变体mil2-4390花器官见图 2。
(2)mil2-4390突变体的表型分析
在临高县大田早造栽培条件下，用碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I2，w/w)对4390家系不同植株的花粉进行染色分析。可育植株的花粉粒绝大部分大而圆，并且被染成 蓝黑色如图3所示。而mil2-4390突变体的无花粉粒且不能被染色(如图3)。此外，可育植 株套袋自交后正常结实，而mil2-4390突变体套袋自交后不结实。而以水稻品种93-11和 明恢63为父本给mil2-4390突变体授粉则少量结实。这些结果表明该mil2-4390突变体在 长日高温条件下表现出雄性不育表型且雌性低育。将mil2-4390突变体的稻兜在2015年 冬季种植于海南省陵水县提蒙镇，安排稻蔸在1-2月抽穗(经查询当时平均温度为 17-24℃)。对抽穗后的花粉粒进行碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I2，w/w)染色，结 果表明花药未染色，说明mil2-4390突变体的雄性育性稳定，不受光温环境影响，是一 个普通核雄性不育雌性低育突变体。
随机从突变体中取30个样品进行花器官观察，见表1，只有6个样品雌雄花器官数目正常，而雌雄花数目同时变异的有10个样品，只发生雄花变异的有14个样品，没有 发现只发生雌花变异的突变体材料。说明该位点的变异有80％的可能会造成花器官数目 的变异，有20％的可能只影响花器官的育性。
表1 4390突变体花器官组织数目统计
Figure BDA0002818907630000061
Figure BDA0002818907630000071
(3)mil2-4390突变体的遗传分析
在长日高温条件下种植mil2-4390与明恢63的F2代，第1个分离群体570株，其中448 株育性正常，122株表现雄性不育，可育与半不育株与不育株分离比符合3:1(χ2＝0.89， P>0.05)。第2个分离群体340株，其中245株育性正常，95株表现雄性不育，可育与半不 育株与不育株分离比符合3:1(χ2＝1.17，P>0.05)。第3个分离群体370株，其中282株育性正常，88株表现雄性不育，可育与半不育株与不育株分离比符合3:1(χ2＝0.21，P>0.05)。上述结果表明mil2-4390的雄性不育性状受由一对隐性单基因控制。
实施例2叶片采样与DNA提取
采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1g叶片，放入2.0mL离 心管，加入800μL 1.5×CTAB提取缓冲液，5μL RNase A，震荡分散，65℃水浴0.5h， 其间轻摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚(1:1，v/v)，混匀，轻摇10min；10000rpm 离心20min；转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH值5.2)、0.6倍体积的异丙 醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；10000rpm离心10min；弃去上清，用体积百分含量 70％乙醇洗沉淀2次；风干，加入200μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop 2000 检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。
实施例3雄性不育基因MIL2-4390的初步定位与检测
使用极端性状混合池分析法(bulked segregant analysis)和隐性群体分析法(recessive-class analysis)对MIL2-4390基因进行定位。以明恢63为父本与mil2-4390突变体杂交构建了一个F2群体，分离出了305个不育株。利用301对均匀分布于12条染色体 上的SSR标记筛选93-11与明恢63之间具有多态性的标记，筛选得到64对具有多态性的SSR标记，多态性较低，表明明恢63与93-11在基因组序列上差异较小。分别构建所述 F2群体的可育株和不育株的混合基因池，利用所述64对多态性标记对所述可育基因池与 不育基因池进行分析。结果表明12号染色体上的SSR标记12.109和12.184与mil2-4390的 突变表型存在连锁关系。进一步利用上述连锁标记逐个分析明恢63和mil2-4390的F2群 体中的不育株的基因型，最终确定目标基因初步定位于SSR标记12.160与12.184之间， 由此将mli2-4390粗定位于12号染色体上(图4的A)，通过查找文献发现该区段有一个 已经克隆的水稻雄性不育基因MIL2，合成该基因连锁标记进行连锁分析检测，并合成 引物进行测序检测，引物检测结果见表2，得到缺失区域信息。引物MIL2-7F1/7R1及 MIL2-7F2/7R2在模板93-11和mil2-4390中均检测为阳性，4390JC-F1/R1在2个模板间检 测均为阴性，剩余引物在93-11对照均能扩增出阳性条带，而在模板mil2-4390无法扩增 出阳性条带，结果见图5。因此我们推断mil2-4390突变体在引物MIL2-8F1/8R1和引物 MIL2-7F1/7R1之间的发生了碱基缺失从而导致突变表型。
表2引物检测结果
Figure BDA0002818907630000081
Figure BDA0002818907630000091
实施例4PCR反应与产物回收
参考93-11基因组序列，在缺失片段最邻近的已知片段序列引物MIL2-8F1和MIL2-7F1之间设计一组热不对称PCR引物，扩增4390突变体DNA。
用于扩增缺失片段侧翼序列的引物对序列见表3：
表3扩增缺失片段侧翼序列的引物对序列
Figure BDA0002818907630000092
Tail-PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL dNTPs，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq DNA聚合酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积 补至10μL。
PCR反应分三步进行：
第一步使用特异引物对M4390-R1、随机引物AD2，模板DNA为mil2-4390基因组DNA，反应程序为：93℃预热2min，95℃变性1min，然后执行以下循环：94℃变性 30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，10个循环；接着94℃变性30s，20℃复性2min， 72℃延伸3min，再执行以下循环：94℃变性20s，58℃复性1min，72℃延伸3min， 25个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。
第二步使用特异引物对M4390-R2、随机引物AD2，模板DNA为反应1产物100倍稀 释液，反应程序为：执行以下循环94℃变性20s，65℃复性1min，72℃延伸3min，1 个循环，然后再执行以下循环：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃ 变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延 伸3min，13个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。
第三步使用特异引物对M4390-R3、随机引物AD2，模板DNA为反应2产物20倍稀 释液，反应程序为：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s， 68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延伸3min， 6-7个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm 电场下电泳30min；采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收反应2的PCR产物。
实施例5DNA序列分析
将回收所得的反应3的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序引物M4390-R3。使用DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接，拼接后序 列如SEQID NO.1所示。将SEQ ID NO.1序列与水稻基因组序列(基因组版本 ASM465v1)进行比对，结果显示：SEQ ID NO.1第1到125位碱基与第12染色体第 16702115到第16702239位碱基完全匹配，而第135到第396位碱基与第12染色体第 17016311到第17016573位碱基完全匹配，表明突变体在第12染色体上第16702239位碱 基到第17016311位碱基，共314070个碱基发生了缺失。该缺失区间包含了水稻MIL2基 因在内的49个ORF，故将该突变体基因命名为MIL2-4390(参见图4C，虚线部分表示缺 失的片段，箭头处表示缺失片段中包含着整个MIL2基因)。
实施例6突变位点分子标记M1的设计与共分离验证
根据实施例5中得到的突变位点两侧的序列设计3条基因特异引物：突变位点正向引物M1_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；野生型位点正向引物W1_F，其核苷酸 序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。其中M1_F 位于缺失片段上。如果用上述引物组合只扩增出201bp产物，则标志着该待检植物MIL2 基因型为突变型(如图6的A中泳道4-6所示)；如果只扩增出115bp产物，则标志着该待 检植物MIL2基因型为mil2-4390突变体(如图6的A中泳道1-3所示)；如果扩增产物为201 bp、115bp两条带型，则标志着该待检植物MIL2基因型为野生型和mil2-4390突变体的 杂合基因型(如图6的A中泳道7-11所示)。
实施例7分子标记M1在不同品种中的多态性
为了验证M1标记在指示mil2-4390突变体雄性不育表型上的特异性，我们分析 了在多个品种中标记的多态性。图6的B中泳道1-13分别为M1标记检测亲本4390、 ZH11、明恢63、野香B、R51084、青丰29B、青丰1B、博II B、H28B、宜香B、特B、空育131、隆科638S。由图6的B可知，ZH11、青丰29B、青丰1B、博II B、 H28B、宜香B、特B、空育131、隆科638S扩增出了与mil2-4390条带不一致的115bp 的条带，因此该标记具有多态性；明恢63、野香B、R51084扩增出了不同于2个亲 本的多态性条带，因此该M1标记检测具有多态性，可以使用该标记进行此物种的分 子标记辅助选择育种。
实施例8利用mil2-4390基因转育新的不育系
用mil2-4390突变体与育性正常的受体，如博IIB和野香B，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行mil2-4390基因和遗传背景选择，最终获得博IIB和野香B 背景下带有纯合mil2-4390突变基因的隐性核不育系。杂交转育的技术路线图如图7所示， 具体实施步骤如下：
1、以受体亲本，如博IIB和野香B为父本与母本mil2-4390杂交获得F1。
2、以F1为母本与受体亲本，如博IIB和野香B，回交获得BC1F1。
3、种植BC1F1，分别使用引物序列如SEQ ID No.2-4引物对检测mil2-4390基因型，选择mil2-4390杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现201bp和115bp条带。
4、使用一组基因型(例如200个)在mil2-4390突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、 SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相 似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。
5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如博IIB和野香B，回交获得BC2F1。
6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出mil2-4390基因型杂合，遗传背景回复率 高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。
7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出mil2-4390基因型杂合，遗传背景纯合率 最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的mil2-4390纯合株即mil2-4390基因的 不育系。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行 等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技 术方案的精神和范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种与水稻育性及花器官数目相关的分子标记及其应用
<130> KHP201117365.6
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggggggggg gggtcttttg cacggtatta aaagtttgag ggggtcaaat ggttttagag 60
ttaaaggtgt gatttagact aacggaaaag tttgagggtg ttaaatggac ttaaccctat 120
aaaatctatt atctattata tactaaaagt ccattaaact tcctacaaac gctcttaaac 180
cgccacatgt catccctaca aatgctccta agccgccaag tggtgctcta ataaattaga 240
gaaattctag gaaaaaaata aaatatctaa ccattgattt tcatttaatc tgggggaccc 300
atattttcta accattacat ctaactaaaa aataccaaat agatttatat ttagaaagca 360
ccacgttcta tatcgatcca tccgtacgtg tacgtg 396
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtcttttg cacggtatta 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaacgaaa taaatagg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taagagcgtt tgtaggaagt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaggtggtg caaggataca a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcacatg gaaatgcgat aa 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggttttatc gcatttcc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcttttgttc cattcgtg 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcatccacc agaaggtagg c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggtatttc gagaatttta t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attacgacta ctttgcgata c 21
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caatttcaac caaacttcc 19
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 13
tcatgcctag ctcttctatc ttc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccatcactta attccctcca ccc 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggctaacct ggtatttgaa ca 22
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<212> DNA
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<400> 16
tgactgaagt gattgagagg g 21
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcatggctga aatctgaact g 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
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<400> 18
ttccaagcaa tatcaatggg tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccgtggtcta gcagttctcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttctcacgg ttttgaacac t 21
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcataaagc ccatttagac cc 22
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagttacct cttggtaagc c 21
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtagggtgac tggcgatagg t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gctgaatctt gggttgctga 20
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcagcaaccc aagattc 17
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acagcagcca tgagtaaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtagagggag ttgaggttg 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgaattgctt ggttgttc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgtccaccca aacattccac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gttctgcgac gcctgctcct 20
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggcatctgg acctttt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgacagccac aacaacac 18
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgccttagc aaaccta 17
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttcaatgg ctcctgta 18
<210> 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tctccccttt ctcctacg 18
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagctcaacc ggatttg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccaacgaaa taaatagg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagaaaaga agggaagg 18
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtattctac gcacaagtcc 20
<210> 40
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tttgacgccg ttgacct 17
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgttttcat cctgctaag 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaagacgga gaaagtgta 19
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taggaaattc acgtacttac cacag 25
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tataacggat ggtcagatt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatttattag agtgcgacat 20
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agtgnagaan caaagg 16

Claims (10)

1.水稻MIL2基因缺失突变体mil2-4390，其特征在于，位于水稻12号染色体长臂的16702239碱基位到17016311碱基位共314.070Kb的碱基缺失，且所述缺失包含整个MIL2基因。
2.根据权利要求1所述水稻MIL2基因缺失突变体mil2-4390，其缺失片段两端侧翼核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.包含权利要求1所述水稻MIL2基因缺失突变体mil2-4390的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体或宿主细胞；所述宿主细胞为不能繁殖为植物的细胞。
4.与权利要求1所述水稻MIL2基因缺失突变体mil2-4390共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记由SEQ ID NO.2-4所示引物对扩增得到。
5.检测权利要求4所述分子标记的引物对，其特征在于，包括：
上游引物M1_F：GGGTCTTTTGCACGGTATTA；
上游引物W1_F：CCCAACGAAATAAATAGG；
下游引物R：TAAGAGCGTTTGTAGGAAGT6。
6.权利要求4所述分子标记或权利要求5所述引物对在制备转基因植物、作物改良育种、制种中的应用。
7.权利要求4所述分子标记或权利要求5所述引物对在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。
8.权利要求4所述分子标记或权利要求5所述引物对在水稻育性检测中的应用。
9.一种检测水稻育性的方法，其特征在于，利用权利要求5所述引物对，扩增待测植物基因组DNA，并检测扩增引物；
若只出现201bp的条带，则标志着该待检植物含有突变体mil2-4390，具有雄性不育、雌性低育且花器官变异表型；
若只出现115bp的条带，则标志着该待检植物为野生型正常表型；
若同时出现201bp和115bp的条带，说明被检测植物是mil2-4390杂合基因型。
10.一种水稻不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含有突变体mil2-4390的水稻为母本，育性正常的水稻为父本进行杂交；
(2)以F1代为母本，与父本回交；
(3)使用SEQ ID No.2-4所示引物对检测后代植株mil2-4390基因型，选择mil2-4390杂合基因型且与轮回亲本基因型相似度高的植株；
(4)步骤(3)得到的植株为母本与父本回交；
(5)重复步骤(3)与(4)，选出mil2-4390基因型杂合，遗传背景回复率高的植株，收自交种；
(6)种植(5)中得到的自交种，重复步骤(3)与(4)，选出mil2-4390基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种，种植，后代中分离的mil2-4390纯合株即含有纯合mil2-4390突变基因的隐性核不育系。
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