CN110205327A - 一种水稻温敏核不育基因tms3突变体及其分子标记与应用 - Google Patents
一种水稻温敏核不育基因tms3突变体及其分子标记与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种水稻温敏核不育基因tms3突变体及其分子标记与应用，本发明图位克隆了水稻温敏核不育基因tms3，并通过遗传转化验证了该基因的功能。本发明提供的温敏雄性育性基因tms3突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用Crispr技术诱导正常水稻品种中tms3基因功能丧失得到突变体植株，可以培育温敏雄性不育性系，证实了该基因具有重要的应用价值。本发明还提供了与tms3基因紧密连锁的分子标记，利用该分子标记可以检测tms3，实现在培育温敏雄性不育系和水稻两系不育系中的应用。
Description
技术领域
本发明属于作物分子生物学领域，具体地说，涉及一种水稻温敏核不育基因tms3突变体及其分子标记与应用。
背景技术
水稻为世界近一半人口提供了主要的食物来源。随着人口增加，耕地面积的减少，提高水稻产量仍是最为重要的育种目标。而两系法和三系法育成的杂交稻在中国和多个国家的广泛种植,为世界粮食安全提供了有力的保障(范优荣等2016)。与三系杂交稻相比,两系不育系配组自由、恢复系广、杂交制种过程简化,在杂交稻生产上占据了越来越重要的地位(斯华敏等2011)。另外，两系不育系的育性受细胞核基因控制，从而避免细胞质单一化对杂种优势的负效应以及某种毁灭性病虫害大规模爆发的风险(袁隆平，1987)。
光温敏雄性核不育基因是两系杂交稻育种与生产的关键。目前研究者已经定位克隆了几个重要的光温敏雄性不育基因，如pms1(Fan et al 2016)；pms3(Ding et al2012)；tms2(Chueasiri et al 2014)；tms5(Zhou et al 2014)；tms9-1(Qi et al 2014)。然而，这些基因并不能完全满足育种实践的要求，仍需要挖掘更多的光温敏雄性核不育基因。通过分离克隆光温敏雄性核不育基因以及加强其作用机理研究，有助于快速创造优良不育系，从而提高水稻产量。
发明内容
本发明目的是提供一种新的光温敏雄性核不育基因及其分子标记与应用。
本发明在水稻品种珍汕97(ZS97)中发现一株自然突变体，其育性受温度调控，具体表现为高于23℃不育，低于23℃可育，将该株系命名为MZ2。在本申请之前，MZ2所携带的温敏雄性核不育基因尚未分离克隆，其分子基础也不清楚，也未有报道应用于水稻不育系培育中。
本发明采用图位克隆的方法克隆了水稻温敏核不育基因tms3突变体，并通过遗传转化验证了该基因的功能。
具体而言，本发明提供了一种水稻温敏核不育基因tms3突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种水稻温敏核不育基因tms3突变体编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了含有本发明所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞、转化植物细胞或表达盒。
本发明发现突变植株MZ2花粉育性受到温度调控，具体表现为：在高温条件下，无花粉或花粉败育；而在低温条件下，花粉全部可育。本发明通过Crispr技术诱导tms3基因功能丧失突变植株，可以使正常水稻表现出高温花粉败育，低温花粉可育，可用于培育新的温敏雄性不育系。
基于此，本发明提供了所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体、其编码的蛋白、含有其的生物材料在植物育种、种质资源改良、制种、或培育转基因植物中的应用。
本发明提供了所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体、其编码的蛋白、含有其的生物材料在培育温敏雄性核不育水稻中的应用。
进一步地，本发明提供了水稻tms3基因(野生型)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明提供了水稻tms3基因(野生型)在调控水稻温敏核不育性状中的应用，所述水稻tms3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，本领域技术人员在该野生型水稻tms3基因的基础上，进行基因改造，有望获得水稻温敏核不育基因突变体。
本发明通过比对ZS97与MZ2的tms3基因编码区，发现MZ2中tms3基因编码区第75位核苷酸存在单碱基G缺失。根据这一单碱基缺失，本发明开发了可以用于辅助育种的分子标记。
本发明提供了水稻温敏核不育基因tms3的分子标记，其为SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第75位碱基G缺失。
本发明提供的上述分子标记可由以下引物扩增组合得到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别为：
上游引物1：TCCGTCGCCGTCACTCTCC(SEQ ID NO.4)
上游引物2：CCGTCGCCGTCACTCTCG(SEQ ID NO.5)
通用引物：CTGCTGCTGGGAGCGCGAGA(SEQ ID NO.6)。
本发明提供了上述分子标记在制备温敏雄性核不育的转基因水稻中的应用。
本发明提供了检测水稻温敏核不育基因tms3突变体的方法，通过下述引物组合扩增待检水稻基因组DNA，基于KASP反应体系平台检测PCR扩增产物：
所述引物组合的核苷酸序列为：
上游引物1：TCCGTCGCCGTCACTCTCC
上游引物2：CCGTCGCCGTCACTCTCG
通用引物：CTGCTGCTGGGAGCGCGAGA，
如果样品PCR产物只检测到上游引物2对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试样品不含tms3突变体；若只检测到上游引物1对应的荧光信号，则检测位点为SEQ IDNO.3所述序列的第75位碱基G缺失，即测试样品含有纯合突变tms3基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为G:-，则含有杂合的tms3基因。
从水稻中分离克隆温敏雄性核不育基因tms3，对该基因进行功能验证并证实其在水稻育种中的应用。本发明提供的温敏雄性核不育基因tms3突变体可以使正常水稻表现出高温花粉败育，低温花粉可育，可用于培育新的温敏雄性不育系。利用该基因可以实现优良不育系的快速培育，加快两系法育种进程，进一步提高水稻产量。
附图说明
图1为ZS97与MZ2不同光温条件下花粉育性示意图。
图2为温敏雄性核不育基因tms3基因初定位结果图。
图3为温敏雄性核不育基因tms3基因精细定位结果图。
图4为tms3突变体基因型及其在高低温条件下结实率。
图5为本发明的分子标记标记K_tms3-75进行基因位点分型效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例中使用的水稻(Oryza sativa)品种ZS97为标准品种，水稻突变体MZ2来自华中农业大学。
实施例1水稻温敏雄性核不育基因tms3突变体的获得与表型分析1.tms3调控花粉育性受温度调控
本发明利用光照培养箱设置4个温度与光照组合，培养条件分别为：28℃+14h光照；28℃+10h光照；22℃+14h光照；22℃+10h光照。
对处于花粉母细胞形成期的ZS97与MZ2植株处理7天后，随后转移到正常管理的大田中种植。调查植株小穗花粉育性发现：ZS97在所有处理中花粉均正常可育，而MZ2只有在低温条件下表现为花粉正常可育，在高温条件下表现为无花粉表型(图1)。
通过对ZS97与MZ2进行不同光照时间与温度处理，证实MZ2突变体花粉育性主要受温度调控。
2.tms3精细定位
本发明利用MZ2与9311杂交、自交构建分离群体，种植于武汉华中农业大学水稻试验田。在高温条件下考察分离群体花粉育性，利用隐性极端池分析法，将tms3初步定位在MP03138与MP03114之间470.6-kb区域内(图2)。
随后将MZ2与ZS97背景的tms3替换为NIP片段的导入系杂交构建分离群体，进行精细定位。通过筛选3000株分离群体，将tms3精细定位到23.3-kb区域。通过PCR扩增与测序，得到MZ2与ZS97候选基因区域内基因序列。通过序列比对与水稻基因注释网站信息(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，发现候选基因区域内ZS97与MZ2仅在LOC_Os03g30790基因编码区第75位核苷酸存在变异，MZ2相比ZS97缺失1个G(鸟嘌呤)导致编码蛋白移码提前终止，见图3。
表1与tms3紧密连锁的多态性分子标记
3.遗传转化载体与tms3水稻突变体植株构建
利用Crispr技术构建tms3突变体的方式进一步确定该基因的功能。本发明中，花粉育性受一对隐性等位基因控制，武汉夏季高温条件下，ZS97以及MZ2与ZS97杂交种均正常可育，MZ2完全败育，因此，野生型tms3对tms3突变等位基因完全显性，可以通过诱导tms3纯合突变体培育不育系。
Crispr载体由华中农业大学赵云德教授提供，Crispr靶位点设计根据CRISPER2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE)。通过引物合成以及PCR扩增引入靶位点(靶位点序列为AACCTCAGCTCAAGGTACTC)，PCXUN空载体使用KpnI酶切线性化后与OsU3-F/R扩增PCR产物进行同源重组，连接产物转化DH5α大肠杆菌，复苏后菌液涂到Kana抗性的LA培养皿，37℃培养14h。挑取单克隆扩繁抽提质粒，使用OsU3-F测序，靶位点无突变即得到最终载体。把构建好的正确载体转入农杆菌EHA105，参照Hiei et al 1994将菌株导入中花11的愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织，分化、生根并最终转移到大田得到转基因植株。
经过对T1代转基因植株进行测序，得到3个不含cas9蛋白且tms3纯合突变的独立转基因植株，上述突变体均会导致tms3编码蛋白移码提前终止(图4的A图)。调查野生型中花11与3个突变体植株在高温与低温条件下结实率发现：野生型中花11在高温条件下结实率均正常，而高温下3个突变体结实率低于5％，低温下则与中花11均能够正常结实(图4的B和C图)。证实了tms3突变导致高温下水稻雄性不育表型。
实施例2tms3分子标记的获得
在tms3的23.3-kb的候选基因区域，本实施例对ZS97与MZ2进行比较测序，发现二者仅存在1个单碱基缺失差异：MZ2在SEQ ID NO.3所示的tms3基因的第75位缺失一个碱基G。申请人将这个单碱基变异开发成KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)标记用于基因选择。所开发的标记标记K_tms3-75的序列如下：
K_tms3-75S，TCCGTCGCCGTCACTCTCC(SEQ ID NO.4)
K_tms3-75F，CCGTCGCCGTCACTCTCG(SEQ ID NO.5)
通用引物序列为：CTGCTGCTGGGAGCGCGAGA(SEQ ID NO.6)。
两条特异性引物5’分别连接LGC公司的FAM或HEX接头序列。KASP反应体系参照KASP Master Mix试剂说明书，结果检测利用其配套的LGC SNP line基因分型平台。
如果样品PCR产物只检测到引物K_tms3-75F对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试样品不含突变型tms3；若只检测到引物K_tms3-75S对应荧光信号，则检测位点为碱基-，即测试样品含有纯合突变tms3；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为G:-，则含有杂合的tms3。
利用标记K_tms3-75对7份不育系与5份正常水稻tms3基因进行检测。结果如表2，只有MZ2中含有tms3基因突变体，其余水稻品种在标记测试位点都为G。另外，本实施例在ZS97与MZ2构建的分离群体中选取8个tms3纯合突变植株，8个tms3野生型植株，8个杂合单株，测试K_tms3-75对突变位点分型效果(图5)，同样证明本发明所提供的分子标记K_tms3-75及其引物组检测结果准确，特异性好。
表2标记K_tms3-75测试基因分型数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种水稻温敏核不育基因tms3突变体及其分子标记与应用
<130> KHP191112867.6
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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tcgccgtcac tctcctctcg cgctcccagc agcagacccc gcggggccgc cagccgcccc 120
cgcccggcgc cgaccccgtc gccttcgccg tcgtcgcctt cgtcgccatc tgcttcgtgc 180
tgatttcatt ttcggcaccg tcaagcattc tacatcaagt ccctgaagga catgttgggg 240
tgtactggag aggaggtgct cttttggaaa caatcactcc accaggtttt catgtgaagc 300
tgccttggat aacccaattt gagccaatac aggttactct tcaaacagac caggtcagaa 360
atattccttg tggaacaaaa ggtggagtca tgatcagctt tgataagatc gaggttgtca 420
accgcctcca taaagagttt gtgcacgaaa ccttactcaa ttatggtgtg cattatgaca 480
agacatggat ctatgacaaa attcatcatg agataaacca gttctgtagt gcccacagtt 540
tgcagcaagt ttacatcgac ttgtttgatc agattgatga aacgatgaaa gaagctattc 600
aaagagactg tacacgctat gctcctggta ttgagataat cagtgttcgt gttacaaagc 660
cgaacatacc tgatagcatt aggagaaatt ttgaacttat ggaggaggag cgtacaaagg 720
cattgattgc cattgagaag caaaaggtag cagagaagga agcagaaacg cagaagaaaa 780
ttgcactatc tgaagcagag aagaatgcac aggtgagcaa gatcctcatg gagcagaagc 840
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Pro Arg Gly Ala Ala Ser Arg Pro Arg Pro Ala Pro Thr Pro Ser Pro
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<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaaacatga cctttgtact 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agcgtgagag ccaaatgaat 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgcctaaatg gtaggccaag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaccatgcac acgtaggaga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agtcaaaatc ctcccggtct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaagcagccg atcgatgtat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atcagcatca caaacagacc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaaagttaaa ttaggttgcc 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cacaggacaa agagcaaagc gatat 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggcattgcca tgaagtgatc tctct 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacaggacaa agagcaaagc gataa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tttacgtgaa cttttctacc ttgtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccatacggc gtgatttgat tttcc 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aacgtctaga taactcattg gttgaaacca c 31
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gagctcgtcg ccggcggata 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctgttttcc cgatcaaaaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctgtcaac gtatgtgcta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcaggtagt ttgttcatca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
accaacttct gacaatgcac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcatgttac tgcagaattt at 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ttttgatgaa attcggtctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccctcatcat agttccaaca 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttagcgtatt atcggagcag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccctcaat caatgttctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggagtttgg ctgatttaga acg 23
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgataggac tgctttgctc tgc 23
<210> 54
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<212> DNA
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atcggcaagc aatgtcatca agc 23
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<212> DNA
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gtgcatgtgc aagacacgtt cc 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
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ggacgccacc ttcctcttct gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggtcataaa cgccattaga ccaagc 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtaaatgcc tgagtgccta ccc 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agctaaaccg ctagggcctt cc 22
Claims (10)
1.一种水稻温敏核不育基因tms3突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种水稻温敏核不育基因tms3突变体编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。
3.含有权利要求1所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞、转化植物细胞或表达盒。
4.权利要求1所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体、权利要求2所述的蛋白、权利要求3所述的生物材料在植物育种、种质资源改良、制种或培育转基因植物中的应用。
5.权利要求1所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体、权利要求2所述的蛋白、权利要求3所述的生物材料在培育温敏雄性核不育水稻中的应用。
6.水稻tms3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
7.权利要求6所述的水稻tms3基因在调控水稻温敏核不育性状中的应用。
8.水稻温敏核不育基因tms3的分子标记，其特征在于，其为SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第75位碱基G缺失；其可由以下引物扩增组合得到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别为：
上游引物1：TCCGTCGCCGTCACTCTCC
上游引物2：CCGTCGCCGTCACTCTCG
通用引物：CTGCTGCTGGGAGCGCGAGA。
9.权利要求8所述的分子标记在制备温敏雄性核不育的转基因水稻中的应用。
10.检测权利要求1所述的水稻温敏核不育基因tms3突变体的方法，其特征在于，通过下述引物组合扩增待检水稻基因组DNA，基于KASP反应体系平台检测PCR扩增产物：
所述引物组合的核苷酸序列为：
上游引物1：TCCGTCGCCGTCACTCTCC
上游引物2：CCGTCGCCGTCACTCTCG
通用引物：CTGCTGCTGGGAGCGCGAGA，
如果样品PCR产物只检测到上游引物2对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试样品不含tms3突变体；若只检测到上游引物1对应的荧光信号，则检测位点为SEQ ID NO.3所述序列的第75位碱基G缺失，即测试样品含有纯合突变tms3基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为G:-，则含有杂合的tms3基因。
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