CN113186199A - 一种温敏雄性不育基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种温敏雄性育性基因及其应用。一种温敏雄性不育基因，该基因为FLK基因的突变体。所述的温敏雄性不育基因为FLK基因的第四个外显子缺失14个碱基，缺失碱基为TGATACGTGCACAT。通过图位克隆技术克隆拟南芥温敏不育突变体temp1，获得了温敏育性基因FLK的突变基因，通过转基因实验验证了此基因的功能，可用于培育温敏雄性不育系。

Description

一种温敏雄性不育基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种温敏雄性不育基因及其应用。

背景技术

植物通过不同品种间的杂交产生杂种。杂种在生长势、适应性、产量等方面具有优势,称为杂种优势。利用杂种优势可以提高农作物的产量、品质和抗性。一般育种利用杂种优势的途径主要是通过杂交育种，而杂交育种的方式主要有两系法和三系法。三系法育种需要不育系、保持系和恢复系，而两系法只需要不育系和恢复系。两系法中的不育系具有育性转换的特点，其雄性的不育或可育受控于外界的光周期和温度条件，不育系在不同光温条件下可以作为保持系。与三系法相比，两系法具有三大优越性：一是不育系一系两用，不需要保持系，简化了种子生产程序，减少了生产环节和不育系繁殖面积，降低了种子成本；二是配组自由，绝大多数常规品种都可成为恢复系，扩大了杂种优势利用的种质范围，大大提高了选到优良组合的概率；三是不育系的不育性遗传行为简单，较容易转育到其他性状优良的品种系中，有利于改良品质、抗性等性状，同时其不育性受细胞核控制，从而避免了细胞质不育对杂种优势的负效应，以及因细胞质单一化而导致某种毁灭性病虫害爆发的潜在威胁。目前，在水稻两系法中应用的不育系主要有光敏不育系和温敏不育系。光敏不育系的花粉育性主要受日照长度的控制，在长日照的条件下，花粉表现为不育，而在短日照条件下，花粉可育；温敏不育系的花粉育性主要受环境温度控制。当环境温度高于某一温度时，花粉表现为不育，而当环境温度低于某一温度时，表现为可育。

目前已发现的拟南芥温敏不育基因有PLANT U-BOX 4(PUB4), MYB33,MYB65和REVERSIBLE MALE STERILE1(RVMS)。温敏不育系突变体temp1是从拟南芥Col背景中发现的突变体，其温敏不育性受一对隐性基因所控制，其育性转换主要受温度控制，转换温度的起始点为29℃，即环境温度高于29℃时，其花粉表现为不育，而环境温度低于29℃时，表现为可育。突变体temp1所携带的温敏不育基因座为FLK，已定位于第三染色体。

已经报道的拟南芥FLK基因为开花相关调控基因。目前尚未有FLK基因在育种方面的相关研究和报道，以及该温敏不育基因被分离克隆的报道，该基因的突变体temp1温敏不育的分子基础尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种温敏雄性育性基因及其应用，通过图位克隆技术克隆拟南芥温敏不育突变体temp1，获得了温敏育性基因FLK的突变基因，通过转基因实验验证了此基因的功能，并提出了RNAi(RNA interference RNAi)的转基因技术，可使正常拟南芥中的基因功能丧失，培育温敏雄性不育系。

为实现上述目的，本发明首先提供一种温敏雄性不育基因，该基因为FLK基因的突变体。

进一步地，所述的温敏雄性不育基因为FLK基因的第四个外显子缺失14个碱基，缺失碱基为TGATACGTGCACAT。

进一步地，所述的温敏雄性不育基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

进一步地，本发明还提供一种包含所述温敏雄性不育基因的载体。

进一步地，本发明还提供一种包含所述温敏雄性不育基因或所述载体的重组微生物。

进一步地，本发明还提供所述温敏雄性不育基因在培育植物温敏不育系中的应用。

进一步地，本发明还提供所述的温敏雄性不育基因的遗传标记，包括单核苷酸多态、插入缺失多态、限制性内切酶长度多态或切割扩增片段多态。

进一步地，所述的遗传标记可用于鉴定突变体或杂交后代植株的基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）阐明了拟南芥突变体temp1的温敏不育的分子机理，获得了拟南芥突变体temp1的温敏不育基因；（2）本发明提供的温敏育性基因具有重要的应用价值，是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、InDel（插入缺失多态）、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)，用这些标记可鉴定拟南芥突变体或杂交后代植株的基因型。

附图说明

图1是实施例1拟南芥突变体temp1的染色体连锁定位图；

图2是实施例2拟南芥野生型的基因组和突变体temp1的FLK编码区的差异示意图；

图3和图4是实施例3将拟南芥野生型的FLK基因导入突变体temp1，获得的转基因植株在高温(29℃)下的花粉恢复可育的照片；其中图3为未导入FLK基因的突变体temp1在高温(29℃)下花粉的育性照片；图4为导入FLK基因的突变体temp1在高温(29℃)下花粉的育性照片；

图5为实施例4利用RNAi技术抑制转化型拟南芥的FLK表达后，在高温(29℃)条件下不育的照片；

图6为实施例4利用RNAi技术抑制转化型拟南芥的FLK表达后，在适温(22℃)下表现花粉可育的照片；

图7为采用本发明提供的温敏不育基因序列的分子标记在辅助选择育种中的应用实例。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明使用图位克隆的方法完成拟南芥temp1温敏不育基因的粗定位，将拟南芥temp1温敏不育基因定位于F9F8和MLD14之间，结合全基因组测序的结果，确定候选基因为AT3G04610，即FLK。经过与野生型Col-0的序列进行比对，拟南芥temp1的FLK基因的突变体在第四个外显子缺失14个碱基，碱基为TGATACGTGCACAT。构建FLK基因的互补载体，用PCR的方法，从野生型Col-0中扩增FLK基因的基因组全序列克隆到植物转化载体，将该载体用农杆菌介导的方法转化拟南芥temp1温敏不育系。T₀代时，被转化的温敏不育系在高温条件其花粉育性恢复正常。在T₁代中不同单株的花粉育性在高温条件下出现分离，即含有转基因的单株花粉育性正常，而不含转基因的单株花粉不育。同时，采用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的方法降低野生型Col-0中FLK基因的表达，在T₀代中植株中FLK基因的表达量下降，导致正常品种的花粉育性转变为高温(29℃)不育和适温(22℃)可育。在T₁代中不同单株的花粉育性在高温条件下出现分离，即含有转基因的单株，表现为雄性育性不育，而不含转基因的单株表现雄性育性正常。这些结果说明FLK基因的突变体的是温敏不育基因，其在模式植物拟南芥中的表达抑制或其功能缺失突变型表达异常的蛋白，能导致植物温敏雄性不育。具体实施过程如下详细阐述。

实施例1 突变体temp1的温敏不育基因精细定位（多态性分子标记的筛选和突变体temp1基因的连锁定位）

根据公开的拟南芥基因组序列数据库的资料，查找了多个分子标记进行图位克隆，如表1所示：

表1 与突变体temp1紧密连锁或共分离的多态性分子标记

表1的分子标记为单核苷酸多态性（SNP）标记。分子标记与目标基因的重组事件越多，表示两者的遗传距离越远，反之其遗传距离越近。利用这种遗传作图的方法和突变体temp1与野生型Ler杂交的1000多株植株构建了一个temp1基因的遗传连锁图，见图1。图1中最终将温敏不育基因定位于F9F8和MLD14之间。

实施例2 突变体temp1的克隆与序列分析

粗定位将突变体temp1的温敏不育基因定位于F9F8和MLD14之间，结合全基因组测序，预测候选基因为AT3G04610，即FLK，其基因序列如SEQ ID NO. 1 所示，具体为：

TCAGTAACCGTAGCCTGAGCTGTAATCCGTAGCGTATCCTCCAGGCGGGTTTGTTGGAGCCGCTGCGTAAACTGAGCCGTGTGTTGCGTATGGGTTATAGCCTTGCTGCTCTGGTGCTACAGTTTGAGGCTGTGCTGGTGCCGGCGCTCCAGCTTCAGCCATGAAGTTCTGAATAAGCTGCACGGCAGTTTGGACTTGTGAGCCAGTTCCGCTAACCTCAACAGTCATTTCACCAGGTACTCCCCTGGTCTCCTGAATAGTTACTGTTGCTCCACTAAGACGTCTAGTGTAGCTTATGTTTGAACCCGACGTCCCAATTACAGCATCAGCATAAGACAGTGGAATCTGCATTTGCTGCGTAACTTGCTGAGCGACCATTGGTGGGGCTGATGATACGTGCACATTCATAGGAGGCTCTCTACCATATGCAGATATACCTTGATGAGGCTGTTTCTCCATTGGAGGTTGACGCATCTCAGGAGGAGGATAGTAACTATCATGTCTAGGAGGTGGTTGCATATATGGAGGTGGGTTGTGACCATAGCCTCCTCCACCAACACTTGGGGCATGACCTTGAGGAGGACCCCATGACTGGTGTGGTGGTGGCATATGGTCCATTTGGCGAGTTGGCTTTTGCATCTGATTTTCAAAGAATGGGATGATGCTACGATCAACCAAGAACTTTCTGAGATGTGACGCAATCAGCTCCAAGGCTCTATGAACACTTGTTGGTTCCCCCACAACTTCAACAACCCTATCGTCTTGAAGAGCAAAAACAGGTAAATCCTCTGATCCAAGAACTCTGACTATACAAGCGGATGCTTCTTGAATAGCTTTAACTGTTCCTCCCTGTTTTCCAATCAAACTTCCAGCCTGAGATGCTGGGACTAGTAATCTTGTTGACACCTTTGAAGGCGGAGGGGCTTGAGAAGCTTCACCATCCAAACCATCAACTATCCGCATGTGGACTCTAAGAAGGCCATCCATAGAAGGTGGTAGAGATGATTCGGGCTCTTCTTTACCAGAAACCATAACAGCTCTTTCTGTTGTGCCTGGAGGACCATCGAGAATCTTTATTCGAGCCCTTGTCTCCTCAACTATTTTCTTAATGACATCACCTTTGCGACCAATGATGCTACCCACTTTCTGTGCAGGAACCAGCATACGGAATACCGTCTCTCCGGGCCATCCCGGCCACCTCTTCTCCTCACCTCCAACTGTCGCATCTTCTTCAGGCTCTGATTTCTGTAGAGACTCAAGATGCTCAGGAATTCCTTCCTCATCTTCTACTTTATCTTGCACTTCATCACCATTGTGATCTTGTACATCACCTTGCGCCTGATACTGAGCCTGATCATGAGCCTCGTCTTGTAACTGAAACTGCTCCTGATTTTGTGGCTGATATTGTAGGTCATCTTGCGAATGATCTTGGACATCTTCATTAGCCTGGTCCTGCAACTGGTATTGATGATACTCTAACTGATCATCAACCTCGTACTGCTGAGGTTCAAGAGTCTGATCTGGTACCTCGTACTGCTGTGGTTCAAGAGTCGGATCTGGTACCTCGTACTGCTGAGGTTCAAGAATCGGATCTTCAACCTCGTATGGTTGGTGAACAAGGGTCTCATCATGAACCTGGTACGGTAACCCATTATGCAACTCATCTGACCCTTGATCTGGTACCTGATCTCCATTGTGTGCAACGAAATTTTGCTGATCTTCAGCTTCAGCCAT。下划线表示缺失的14个碱基。

通过与野生型Col-0的FLK基因测序比对发现，突变体temp1的FLK基因在第四个外显子上缺失14个碱基，缺失碱基为TGATACGTGCACAT，见图2。

实施例3 遗传转化鉴定目的基因的功能

将从野生型Col-0扩增的FLK基因片段（包含启动子区、编码区及其下游区序列）克隆到载体PBI101中。将该表达载体导入常用的农杆菌中，通过浸花法转化temp1温敏不育系，获得T0代转基因植株。经分子检测，获得含有外源正常基因的转化植株，这些转化植株在高温条件下（29℃）花粉育性正常，见图3和图4。

收获T₀代种子，种植T₁代，在高温条件下（29℃）花粉育性出现分离，即含有FLK转基因的植株花粉可育，而不含FLK转基因的植株花粉败育。这些结果证明了FLK的突变体基因是温敏不育基因。

实施例4 用RNAi技术抑制FLK基因的表达产生温敏不育转化体

将扩增好的野生型FLK基因的cDNA片段连接到载体，将构建好的RNAi载体导入农杆菌，使用浸花法转化正常可育的野生型Col-0中，筛选得到含有转基因的T₀代植株。对温度敏感的花粉母细胞时期进行高温处理（29℃）和适温（22℃）处理。

结果见图5和图6，高温处理的植株产生败育花粉且花粉量很少，而经适温处理的植株可育花粉量达50%以上，适温处理的T₀代转化体能结实获得T₁植株。再次对T₁植株进行花粉母细胞发育时期的高温（29℃）处理。结果T₁植株的花粉育性出现分离，即含有RNAi转基因的单株花粉败育，而不含RNAi转基因的单株花粉可育。

由此提示，通过RNAi技术抑制正常FLK基因的表达，可以产生温敏不育转化体。

实施例5 温敏不育基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用

利用本发明提供的引物信息可以产生拟南芥温敏不育基因及其紧密连锁的分子标记,用于鉴定拟南芥temp1的基因型,可在分子标记辅助选择育种中应用。如图7所示，利用分子标记SM110和SM47可鉴定拟南芥正常可育株和温敏不育株的基因型,即某个品种用SM110与SM47引物组合可以扩增出特异的条带，该品种为温敏不育系，相反即某个品种用SM110与SM47引物组合不能扩增出特异的条带，该品种不是温敏不育系。扩增两个分子标记的引物、扩增产物分别如表2所示：

表2 温敏不育基因的分子标记及其引物

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种温敏雄性不育基因及其应用

<141> 2021-04-19

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1720

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana ）

<400> 1

tcagtaaccg tagcctgagc tgtaatccgt agcgtatcct ccaggcgggt ttgttggagc 60

cgctgcgtaa actgagccgt gtgttgcgta tgggttatag ccttgctgct ctggtgctac 120

agtttgaggc tgtgctggtg ccggcgctcc agcttcagcc atgaagttct gaataagctg 180

cacggcagtt tggacttgtg agccagttcc gctaacctca acagtcattt caccaggtac 240

tcccctggtc tcctgaatag ttactgttgc tccactaaga cgtctagtgt agcttatgtt 300

tgaacccgac gtcccaatta cagcatcagc ataagacagt ggaatctgca tttgctgcgt 360

aacttgctga gcgaccattg gtggggctga tcataggagg ctctctacca tatgcagata 420

taccttgatg aggctgtttc tccattggag gttgacgcat ctcaggagga ggatagtaac 480

tatcatgtct aggaggtggt tgcatatatg gaggtgggtt gtgaccatag cctcctccac 540

caacacttgg ggcatgacct tgaggaggac cccatgactg gtgtggtggt ggcatatggt 600

ccatttggcg agttggcttt tgcatctgat tttcaaagaa tgggatgatg ctacgatcaa 660

ccaagaactt tctgagatgt gacgcaatca gctccaaggc tctatgaaca cttgttggtt 720

cccccacaac ttcaacaacc ctatcgtctt gaagagcaaa aacaggtaaa tcctctgatc 780

caagaactct gactatacaa gcggatgctt cttgaatagc tttaactgtt cctccctgtt 840

ttccaatcaa acttccagcc tgagatgctg ggactagtaa tcttgttgac acctttgaag 900

gcggaggggc ttgagaagct tcaccatcca aaccatcaac tatccgcatg tggactctaa 960

gaaggccatc catagaaggt ggtagagatg attcgggctc ttctttacca gaaaccataa 1020

cagctctttc tgttgtgcct ggaggaccat cgagaatctt tattcgagcc cttgtctcct 1080

caactatttt cttaatgaca tcacctttgc gaccaatgat gctacccact ttctgtgcag 1140

gaaccagcat acggaatacc gtctctccgg gccatcccgg ccacctcttc tcctcacctc 1200

caactgtcgc atcttcttca ggctctgatt tctgtagaga ctcaagatgc tcaggaattc 1260

cttcctcatc ttctacttta tcttgcactt catcaccatt gtgatcttgt acatcacctt 1320

gcgcctgata ctgagcctga tcatgagcct cgtcttgtaa ctgaaactgc tcctgatttt 1380

gtggctgata ttgtaggtca tcttgcgaat gatcttggac atcttcatta gcctggtcct 1440

gcaactggta ttgatgatac tctaactgat catcaacctc gtactgctga ggttcaagag 1500

tctgatctgg tacctcgtac tgctgtggtt caagagtcgg atctggtacc tcgtactgct 1560

gaggttcaag aatcggatct tcaacctcgt atggttggtg aacaagggtc tcatcatgaa 1620

cctggtacgg taacccatta tgcaactcat ctgacccttg atctggtacc tgatctccat 1680

tgtgtgcaac gaaattttgc tgatcttcag cttcagccat 1720

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtttaatcg tcggtgcgca agtt 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagctccggt tcatggatag attg 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagttaatga tttgtacaaa gtc 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagagctca gatcaaagct catc 24

<210> 6

<211> 61

<212> DNA

<213> SM110（Arabidopsis thaliana ）

<400> 6

tttaatcgtc ggtgcgcaag ttcgtgactc aattcttcaa tctatccatg aaccggagct 60

c 61

<210> 7

<211> 269

<212> DNA

<213> SM47（Arabidopsis thaliana ）

<400> 7

gttaatgatt tgtacaaagt cttgtgtatg acggtaagaa ctctacgtgg accacattat 60

tttagatggg aagatcctat gtgggaggag cctatgacag aggagcatca agttttcacg 120

ctaggaccca aacaaaaatg gagaatgctc gaatgtaagt atctacatcg tcatcattct 180

ggatctcaag ggatatgtag agatggggtg atgtattatt tagcttcttt caacgataaa 240

cgatctctga tgagctttga tctgagctc 269

Claims (9)

1.一种温敏雄性不育基因，其特征在于：该基因为FLK基因的突变体。

2.根据权利要求1所述的温敏雄性不育基因，其特征在于：该基因为FLK基因的第四个外显子缺失14个碱基，缺失碱基为TGATACGTGCACAT。

3.根据权利要求1或2 所述的温敏雄性不育基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。

4.一种包含如权利要求1-3任一项所述的温敏雄性不育基因的载体。

5.一种包含如权利要求1-3任一项所述的所述温敏雄性不育基因的重组微生物。

6.一种包含如权利要求4所述的载体的重组微生物。

7.一种包含如权利要求1-3任一项所述的温敏雄性不育基因在培育植物温敏不育系中的应用。

8.如权利要求1或2所述的温敏雄性不育基因的遗传标记，其特征在于：包括单核苷酸多态、插入缺失多态、限制性内切酶长度多态或切割扩增片段多态。

9.如权利要求8所述的遗传标记在植物育种中的应用，其特征在于：用于鉴定突变体或杂交后代植株的基因型。

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