CN104045697A

CN104045697A - 调控水稻开花时间和育性的基因OsRRMh及其应用

Info

Publication number: CN104045697A
Application number: CN201310084884.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡秀玲; 刘德瑞
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CN104045697B

Abstract

本发明首次揭示了OsRRMh多肽或其编码多核苷酸与水稻开花时间、结实率或穗型有关。所述多肽或编码多核苷酸可用于改善水稻的性状或制备转基因水稻。本发明的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸及使用方法对于水稻栽培具有广泛应用价值，为转基因技术改良水稻性状或者研究水稻的性状提供了很好的平台。

Description

调控水稻开花时间和育性的基因OsRRMh及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及利用OsRRMh基因及其蛋白控制水稻开花时间和育性的方法及其应用。

背景技术

Split ends(Spen)家族蛋白是一类由N端的RRM结构域和C端的1个SPOC结构域构成的分子量很大的蛋白[1,2]。Spen基因在神经发育研究中最先被克隆，spen果蝇突变体呈现多样的免疫缺陷表型[1,3]。Spen蛋白利用其RRM结构域结合到特定的RNA片段上，通过调节染色质的修饰等进而起到共激活子的作用，并调节其靶基因的表达水平。

在真核生物中，RNA结合蛋白(RBP)在转录后水平对基因的调控涉及可变剪接、多聚腺苷酰化、RNA稳定性及RNA输出等所有方面。它们通过调节特定转录本的表达对许多发育过程起着调控作用[4]。尽管对动物中RBP的功能鉴定有越来越多的报道，但对植物而言，对RBP编码基因的克隆和功能分析还非常少。

RiceRBP数据库为研究水稻中的RNA结合蛋白提供了便利条件。根据Morris等[5]2011年的报道，此数据库中至少包含有由221个基因编码的257个已经由实验验证过有功能的RNA结合蛋白。数据库中收录的大多数蛋白与RNA的结合能力都未得到证实，目前只能预测出它们可以结合RNA。我们预测其将大力推动对植物中的RNA结合蛋白的研究。

对拟南芥中的一个Spen家族蛋白FPA的最新研究[6]揭示，其与另一个RNA结合蛋白FCA在控制mRNA不同模式3’末端形成上是功能冗余的。FPA和FCA通过控制开花抑制因子FLC(Flowering Locus C)不同模式的3’多聚腺苷酰化的形成而调节开花时间。在拟南芥中对FPA、FCA和FLC的功能研究比较详细，但在水稻中Spen基因还未见研究。

水稻(Oryza sativa)是重要的禾谷类作物，特别是对于我国这样人口众多的国家尤其具有重要意义。因此，本领域急需了解水稻中Spen家族蛋白对于水稻开花、育性、结实等诸方面的作用，进而能够针对性地改造现有的水稻。

发明内容

本发明的目的在于揭示与水稻开花时间、结实率或穗型有关的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸；所述多肽或编码多核苷酸可用于改善水稻的性状或制备转基因水稻；因而本发明对于水稻栽培具有广泛应用价值，为转基因技术改良水稻性状或者研究水稻的性状提供了很好的平台。

在第一方面，本发明提供一种分离的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的用途，所述多肽或多核苷酸用于改善水稻的性状，所述水稻的性状包括水稻开花时间、结实率、穗型；或者，

所述多肽或多核苷酸用于制备转基因水稻。

在优选的实施方式中，所述改善水稻的性状包括延迟水稻开花时间、提高或降低水稻的结实率、增大或减小水稻的穗型；或者

所述转基因水稻的开花时间延迟、结实率提高或降低、穗型增大或减小。

在另一优选的实施方式中，所述改善水稻的性状包括提高水稻的结实率、增大水稻的穗型；或者

所述转基因水稻的结实率提高、穗型增大；

从而提高水稻的产量。

在另一优选的实施方式中，所述多肽或多核苷酸具有以下特征：

所述多肽是：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(ii)由SEQID NO:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由(i)衍生的多肽；或

所述多核苷酸是：(i)具有SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO:1所示序列互补的多核苷酸。

在第二方面，本发明提供一种改善水稻性状的方法，所述方法包括：促进或抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

在优选的实施方式中，所述改善水稻的性状包括延迟水稻开花时间、提高或降低水稻结实率、增大或减小水稻的穗型。

在优选的实施方式中，所述多肽是：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(ii)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由(i)衍生的多肽；或

在另一优选的实施方式中，所述方法包括：抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

在优选的实施方式中，通过RNAi、反义RNA、基因敲除、或基因失活等方法来抑制OsRRMh多肽的表达或活性。

在优选的实施方式中，通过外源性导入OsRRMh多肽的编码多核苷酸来促进OsRRMh多肽的表达或活性。

在另一优选的实施方式中，利用SEQ ID NO:57所示的dsRNA抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

在第三方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括步骤：

(a)促进或抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸的表达；和

(b)培养(a)所述的水稻细胞，将其再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括步骤：

(a)通过RNAi、反义RNA、基因敲除、或基因失活等方法抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸；和

(b)培养(a)得到的水稻细胞，将其再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括步骤：

(a)利用SEQ ID NO:57所示的dsRNA抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸；和

(b)培养(a)得到的水稻细胞，将其再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括步骤：

(a)将OsRRMh多肽的编码多核苷酸导入水稻细胞；和

(b)培养(a)得到的水稻细胞，再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括步骤：

(a)提供OsRRMh多肽的编码多核苷酸的表达载体；

(b)将(a)的表达载体导入农杆菌；

(c)将水稻细胞或组织或器官与(b)的农杆菌接触，从而使OsRRMh多肽的编码多核苷酸转入水稻细胞、组织或器官；

(d)筛选转入OsRRMh多肽的编码多核苷酸的水稻细胞或组织或器官；和

(e)将步骤(d)的水稻细胞或组织或器官再生成水稻。

在第四方面，本发明提供OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂的用途，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂可用于延迟水稻开花时间、提高水稻的结实率、增大水稻的穗型。

在另一优选的实施方式中，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂是SEQ ID NO:57所示的dsRNA。

在第五方面，本发明提供一种OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂，所述拮抗剂抑制或下调OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达。

在优选的实施方式中，所述拮抗剂是dsRNA。

在优选的实施方式中，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO:57所示。

在第六方面，本发明提供一种筛选OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予水稻；

b)检测水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照水稻相比，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达上调，则所述待测物质是OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的促进剂；

如果与未给予待测物质的对照水稻相比，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达下调，则所述待测物质是OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂。

在第七方面，本发明提供OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的用途，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸用于制备预测水稻性状的试剂或试剂盒，所述水稻性状包括开花早晚、结实率或穗型。

在第八方面，本发明提供一种预测水稻性状的方法，所述水稻性状包括开花早晚、结实率或穗型，所述方法包括以下步骤：

(a)检测待测水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达；和

(b)将(a)检测到的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达值与标准品的相应检测值比较；

如果(a)的检测值显著高于标准品的检测值，则所测水稻有可能结实率降低、或穗型减小；

如果(a)的检测值显著低于标准品的检测值，则所测水稻有可能开花延迟、结实率提高、或穗型增大。

在优选的实施方式中，所述方法还包括：(c)根据预测结果选择有可能结实率提高、或穗型增大的水稻作为候选水稻以供进一步测定。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示OsRRMh基因的序列、结构示意及基因拷贝数检测结果。其中，A：OsRRMh基因(SEQ ID NO:1)及其编码蛋白(SEQ ID NO:2)的全长序列。内含子序列用小写字母表示。Southern blot标记探针片段用下划线标出；B：Southernblot分析OsRRMh基因在水稻基因组中的拷贝数；C：OsRRMh结构示意图。数字表示内含子在基因中的位置(翻译起始点ATG的A作为+1位)

图2显示OsRRMh在ZH11中的表达模式。其中，A：qRT-PCR检测OsRRMh在水稻各组织中的表达；B：用Western blot检测ZH11各组织部位中OsRRMh蛋白的表达水平。OsRRMh蛋白的分子量为97kD；阳性对照是在BL21(DE3)中表达的带His标签的OsRRMh蛋白。

图3显示了OsRRMh mRNA形成过程中存在可变剪切。其中，A：Northernblot方法检测到水稻不同组织中OsRRMh存在不同转录本；B：OsRRMh可变剪切产生的不同转录本的剪切模式；黑框显示为检测到的cDNA片段。剪切模式图右侧标注对应条带大小。模式图中用数字标注内含子的位置信息(翻译起始点ATG的A作为+1位)。

图4显示了OsRRMh下调表达植株的表型分析。其中，A：OsRRMh下调表达质粒pRiG-OsRRMh的构建图；B：OsRRMh下调表达植株的开花延迟表型；C：qRT-PCR分析转基因植株中OsRRMh的下调表达程度；pRiG，转化空质粒pRiG的转基因植株；1-3，T2代OsRRMh dsRNAi独立转基因植株；D：OsRRMh下调表达植株的穗型变化；E：对OsRRMh下调表达植株开花时间和每穗粒数的统计结果。*和**分别表示用t-test进行统计学分析显示为P<0.05或P<0.01的差异显著或极显著。下同此描述。

图5显示了OsRRMh下调表达转基因植株叶片组织中控制水稻开花时间基因的表达程度变化。其中，pRiG为转化空质粒pRiG的转基因植株；1-3，T2代OsRRMh dsRNAi独立转基因植株。

图6显示了OsRRMh或其SPOC结构域过量表达植株的表型分析。其中，A：pHB-OsRRMh构建图；B：pHB-OsRRMh转基因植株表现为穗型变小和结实率降低；C：qRT-PCR分析转基因植株中OsRRMh的表达；1-3代表pHB-OsRRMh T₂代转基因纯合株；D：OsRRMh过量表达植株的每穗着粒数和结实率统计数据；E：pHB-OsRRMh SPOC转基因植株表现出结实率降低和小穗表型；F：qRT-PCR检测SPOC过量表达转基因植株中SPOC构域的表达水平；G：SPOC结构域过量表达的转基因植株的每穗着粒数和结实率统计数据；H和I分别为SPOC过量表达和对照转基因植株花粉在1%I₂-KI溶液中的染色结果；B和E的标尺为1cm，H和I的标尺为10μm；B和E中的红色箭头指示不育的小花穗，H中指示不育的花粉颗粒。

图7显示了在fpa(Ler)和Col-0中过量表达OsRRMh的表型分析。其中，A：在拟南芥fpa中过量表达OsRRMh产生的表型；B：半定量RT-PCR分析fpa+35s::OsRRMh中OsRRMh和FPA的表达水平；C：Col-0中过量表达OsRRMh造成晚开花；D：Col+35s::OsRRMh相比Col-0在莲座叶数和延迟开花天数上的差异；1-5代表独立转基因植株筛选到的T3代纯合植株；E：半定量RT-PCR检测自主开花控制途径部分基因的表达水平。

图8显示了水稻中的Spen-like蛋白组成元件及序列同源性。其中，A：由OsRRM、OsRRMh、Os01g0765300编码的水稻Spen-like蛋白的构成特征；B：用MEGA4[7]对水稻和拟南芥中的Spen-like蛋白作系统进化树分析；所用算法为Neighbor-Joining(NJ)，bootstrap重复为1000。系统进化树中所显示数字代表占bootstrap值的百分比(%)。标尺标注进化距离。C、D、E：水稻与拟南芥中的Spen-like蛋白之间分别进行RRM结构域和SPOC结构域的序列比对。

图9显示了对水培30天ZH11小苗在不同光照周期处理下OsRRMh的表达进行分析。其中，A：长日照条件下(14小时光照，10小时黑暗)OsRRMh的表达模式；B：在短日照条件下(10小时光照，14小时黑暗)OsRRMh的表达模式。白色、黑色标尺分别显示光照和黑暗时间。

图10显示了OsRRMh参与调控水稻开花时间的模式图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现OsRRMh下调表达造成转基因植株开花延迟、每穗粒数变多以及穗变大，而OsRRMh或其SPOC编码结构域的过量表达会造成转基因植株育性降低、穗型变小和结实率明显降低；因此，对OsRRMh进行调控就可能对水稻的各种性状，例如开花时间、穗型以及结实率等等进行调节，进而调控水稻及稻米的产量和质量。在此基础上完成了本发明。

本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离的OsRRMh多肽”是指OsRRMh蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsRRMh蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本文所用的术语“OsRRMh多肽”或“OsRRMh蛋白”具有相同的含义，表示氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽，而其编码多核苷酸表示SEQ ID NO:1所示的多核苷酸。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白该术语包括OsRRMh蛋白的变异形式，所述变异形式具有与OsRRMh蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与OsRRMh蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsRRMh蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsRRMh蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsRRMh蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有OsRRMh蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供OsRRMh蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OsRRMh蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“OsRRMh蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys

Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
			Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro;Ala	Ala
His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
			Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
			Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
			Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
			Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本领域技术人员明白，本发明的OsRRMh蛋白还包括OsRRMh蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsRRMh蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种OsRRMh蛋白的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，OsRRMh蛋白的生物活性片段是指OsRRMh蛋白的片段，但其仍然能保持全长OsRRMh蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长OsRRMh蛋白的50%的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsRRMh蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。

本发明还提供了编码本发明OsRRMh蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsRRMh蛋白的多聚核苷酸。

此外，应理解，虽然本发明的OsRRMh基因获自一种水稻，但是获自其它品种水稻的，与本发明的OsRRMh基因高度同源(如具有70%以上的序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。因此，本发明亦适用其它水稻；换言之，本文所述的“OsRRMh蛋白或其编码多核苷酸”还包括来自其品种水稻的OsRRMh蛋白或其编码多核苷酸。

本发明的OsRRMh蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OsRRMh蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的OsRRMh蛋白。一般来说有以下步骤：

1.用本发明的编码OsRRMh蛋白的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；

3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，OsRRMh蛋白多核苷酸序列可插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含OsRRMh蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶片颜色性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在优选的实施方式中，所述OsRRMh多肽是：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(ii)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由(i)衍生的多肽；或，所述OsRRMh多肽编码多核苷酸是：(i)具有SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO:1所示序列互补的多核苷酸。

鉴于本发明的内容，本领域技术人员知晓本发明的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸可用于改善水稻的性状，所述水稻的性状包括水稻开花时间、结实率、或穗型。在具体的实施方式中，所述改善水稻的性状包括延迟水稻开花时间、提高或降低水稻的结实率、增大或减小水稻的穗型。

本领域技术人员不难理解，水稻结实率提高或水稻的穗型增大对于水稻或稻米的生产会有着极其重大的经济意义。因此，在优选的实施方式中，所述改善水稻的性状包括提高水稻的结实率、或增大水稻的穗型。同时，如果得到性状变差的水稻，例如结实率降低或穗型减小，所得到的水稻也可以用作“模型”植物来研究，例如如何提高低产水稻的产量；例如，筛选能够提高或改善结实率低或穗型小的水稻的农用物质。

在揭示了OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的功能的基础上，本发明进一步提供了通过促进或抑制水稻中OsRRMh多肽的表达或活性来改善水稻性状的方法。在具体的实施方式中，所述改善水稻的性状包括延迟水稻开花时间、提高或降低水稻结实率、增大或减小水稻的穗型。在优选的实施方式中，所述方法抑制水稻中OsRRMh多肽的表达或活性。

鉴于现有技术的教导，本领域技术人员知晓如何促进或抑制水稻中OsRRMh多肽的表达或活性。在具体的实施方式中，可以通过，例如但不限于：RNAi、反义RNA、基因敲除、或基因失活等方法来抑制OsRRMh多肽的表达或活性。在优选的实施方式中，利用SEQ ID NO:57所示的dsRNA抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。在另一具体的实施方式中，本领域技术人员还可以通过外源性导入OsRRMh多肽的编码多核苷酸来促进OsRRMh多肽的表达或活性。

因此，OsRRMh多肽或其编码多核苷酸可进一步用于制备转基因水稻，所述转基因水稻的开花时间延迟、结实率提高或降低、穗型增大或减小。在优选的实施方式中，所述转基因水稻的结实率提高、穗型增大。本领域技术人员知晓如何利用OsRRMh多肽或其编码多核苷酸制备转基因水稻。

例如，所述制备转基因水稻的方法包括：(a)促进或抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸的表达；和，(b)培养(a)所述的水稻细胞，将其再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括：(a)通过RNAi、反义RNA、基因敲除、或基因失活等方法抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸；和，(b)培养(a)得到的水稻细胞，将其再生成水稻。

在优选的实施方式中，所述方法包括：(a)利用SEQ ID NO:57所示的dsRNA抑制水稻细胞中OsRRMh多肽的编码多核苷酸；和，(b)培养(a)得到的水稻细胞，将其再生成水稻。

在另一优选的实施方式中，所述方法包括：(a)将OsRRMh多肽的编码多核苷酸导入水稻细胞；和，(b)培养(a)得到的水稻细胞，再生成水稻。

在进一步的优选实施方式中，所述方法包括：

(a)提供OsRRMh多肽的编码多核苷酸的表达载体；

(b)将(a)的表达载体导入农杆菌；

(e)将步骤(d)的水稻细胞或组织或器官再生成水稻。

鉴于OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的作用或功能，本领域技术人员还可理解它们的促进剂或拮抗剂可用于延迟水稻开花时间、提高或降低水稻的结实率、增大或减小水稻的穗型。

在优选的实施方式中，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂可用于提高水稻的结实率、或增大水稻的穗型。在进一步优选的实施方式中，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂是SEQ ID NO:57所示的dsRNA。

鉴于本发明的结果，本发明还提供一种用于抑制或下调OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达的拮抗剂。在优选的实施方式中，所述拮抗剂是dsRNA。在另一优选的实施方式中，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO:57所示。

本发明还提供筛选OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括：a)将待测物质给予水稻；和，b)检测水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达情况；

本发明的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸还可用于制备预测水稻性状的试剂或试剂盒，所述水稻性状包括开花早晚、结实率或穗型。对某种水稻进行预测后，可以相应地采取后续步骤，以影响或改善水稻的生长或生产，例如给予水稻OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂以提高结实率或增大穗型；或者在对某种水稻品种作诱变，例如人工或自然诱变后，可根据OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性对水稻的结实率或穗型作出一定预测，进而根据预测结果筛选更可能有经济价值的候选植株作进一步测定。

因此，本发明还提供了预测水稻性状的方法，所述水稻性状包括开花早晚、结实率或穗型，所述方法包括：

(a)检测待测水稻，例如经诱变的水稻中OsRRMh多肽或其编码基因的活性或表达；和

(b)将(a)检测到的OsRRMh多肽或其编码基因的活性或表达值与标准品，例如未经诱变的原始水稻品种，的相应检测值比较；

本发明的优点主要体现在：

1.本发明首次发现OsRRMh蛋白或其编码多核苷酸具有调控水稻性状，例如水稻开花时间、结实率或穗型的功能；

2.利用本发明的OsRRMh蛋白或其编码多核苷酸可以研究水稻的性状或针对性地改造现有水稻；

3.使用本发明的OsRRMh蛋白或其编码多核苷酸可以通过转基因技术等手段培育出具有所需性状的各种新品种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料和方法

1.植物材料和生长环境

水稻ZH11(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua No.11)用作转基因受体材料。利用Liu等[8]报道的农杆菌介导法进行转基因操作。水稻的生长条件为：昼(28°C)/夜(22°C)，自然光照(383μmol/m²/s)，10h光照/14h黑暗(短日照)或14h光照/10h黑暗(长日照)。拟南芥突变体fpa是Ler(landsberg erecta)背景材料。拟南芥的种植条件为：温度21±1°C，光照强度100μE/m²/s，光照周期10h光照/14h黑暗。利用浸花法转化进行农杆菌介导的拟南芥转化[9]。

2.异位表达OsRRMh和其SPOC结构域

以cDNA克隆(J013002G20，KOME网站获取，网址http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)为模板，用引物ATGSa和TAABa完成对OsRRMh编码区全长的扩增。片段最终插入到pHB载体[10]的SalI-BamHI之间，其上游是双CaMV35S启动子。用引物SPOCBg和SPOCPm扩增OsRRMh SPOC结构域的291bp片段。片段最终插入到pCAMBIA1304[11]的CaMV35S启动子下游的BglII和PmlI之间。

3.下调表达OsRRMh

pRiG载体是以pCAMBIA1301为骨架，在其中插入特异的poly(A)片段。这一特定结构的引入使得其在转化植物体后会形成自身回折，而可以对插入片段对应基因的表达产生抑制作用(ZL03160092.1)。利用引物OshRiBN和OshRiS完成了对OsRRMh cDNA3’末端的427bp特异区段的扩增。片段最后构建入pRiG载体的CaMV35S启动子下游的BamHI和SacI之间。

4.Southern blot

用CTAB法提取ZH11的叶片DNA，分别用SmaI,PstI和EcoRI对各自20μgDNA进行完全酶切。酶切后的基因组DNA在0.7%琼脂糖凝胶中进行分离，最后转印到尼龙膜(GE Healthcare)上。用ECL Alkphos Direct labeling and a detectionkit(GE Healthcare)对杂交信号进行分析。杂交所用到的探针片段是用引物OshRis和OshRiBN扩增出的靠近OsRRMh3’端的659bp特异区段。

5.RNA提取、反转录和RT-PCR及qRT-PCR分析基因表达

用Trizol法(Invitrogen)对各组织RNA进行提取。按照操作说明，在ImProm-II^TM反转录酶(Promega)的作用下以1μg总RNA为样品进行cDNA第一链的合成。以合成的cDNA为模板，在设计的特定引物以及SYBRGreen(TAKARA)Real-time PCR反应体系下完成对特定片段的扩增。

6.Northern blot

对ZH11各组织分别提取总RNA，取20μg在1%甲醛胶中进行分离，最后转印到尼龙膜(GE Healthcare)上。最终是用Random Primer DNA Labeling Kit Ver2.0(TAKARA,Otsu,Japan)合成的P³²标记好的探针对杂交信号进行分析。探针片段为以OsRRMh cDNA为模板用RT-1和RT-2扩增出的靠近3’端的520bp片段。

7.蛋白质提取和Western blot

从水稻各组织中提取蛋白，取30μg用Bradford法[12]测定蛋白质浓度。在8%SDS-PAGE分离胶中对蛋白质条带进行分离并最终转印到PVDF膜(GEHealthcare)上。用ECL Plus Western Blotting and Detection kit(GE Healthcare)检测蛋白杂交信号。实验中所用到的抗体包括1:5000稀释的抗OsRRMh兔一抗(Immunogen,Wuhan,China)和1:5000稀释的HRP标记羊抗兔二抗(CW-Bio，Shanghai，China)。

8.OsRRMh的RACE分析

提取ZH11叶片中总RNA，用大约500ng反转录为cDNA第一链。利用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，完成了对叶片中存在的OsRRMh可变剪切产生转录本的3’末端鉴定。用于检测OsRRMh可变剪切模式的引物是E3F和E6R。

9.花粉分析

收集SPOC过量表达植株和对照植株的新鲜花粉，立即用1%I₂–KI溶液进行染色以观察花粉中淀粉的累积情况。之后在显微镜下观察花粉的染色情况并拍照。

10.在拟南芥fpa突变体中过量表达OsRRMh

利用GV3101(Agrobacterium tumefaciens)介导的浸花法[9]用“异位表达OsRRMh”中的35s::OsRRMh分别完成对Col-0和fpa的转化得到Col+35s::OsRRMh和fpa+35s::OsRRMh。T1代种子在含有25μg/L潮霉素的筛选培养基上筛选得到阳性株。T3代转基因纯合植株用于检测基因表达和分析开花时间的改变。

表1.引物汇总

实施例1.OsRRMh编码的Spen-like蛋白

分别从BAC克隆(OSJNBa0028C22；IRGSP网站获取，网址http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/)和cDNA克隆(J013002G20；KOME网站获取，网址http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中克隆了OsRRMh基因的基因组和cDNA全长并测序。OsRRMh基因位于水稻基因组的9号染色体，其编码区全长为2700bp。通过将OsRRMh基因组序列与其全长cDNA序列进行比对，推断出OsRRMh由6个外显子和5个内含子构成(图1A)。

将OsRRMh的基因序列在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)中的Oryza sativa(japonica cultivar-group)基因组数据库进行了序列检索，结果提示OsRRMh基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在。同时用Southern blot分析后发现，对分别用SmaI、PstI、EcoRI完全酶切的水稻基因组DNA杂交后都显示唯一条带。由此，提示OsRRMh在水稻基因组中是一个单拷贝基因(图1B)。

OsRRMh编码全长为900aa的蛋白质(图1A)。OsRRMh蛋白由N端的三个RRM结构域和靠近C端的一个SPOC结构域构成(图1C)。另外，OsRRMh与OsRRM间有很高的序列相似度(图8B-E)。

将OsRRMh的cDNA以及其编码的蛋白质全长序列信息提交到GenBankDatabase，检索号为HE995412。

实施例2.OsRRMh是组成型表达的基因

为检测OsRRMh的组织表达特性，首先用qRT-PCR方法检测了OsRRMh在ZH11的根，茎，叶片(30DAS,播种后天数(Days After Sowing))，小花和7DPA未成熟种子中的表达。结果显示，以UBQ10的表达为参照，OsRRMh在叶片和未成熟种子中相对表达最高，而在根和茎中表达非常低(图2A)。

接着对它在水稻各组织中的蛋白表达进行检测。对提取的ZH11根、茎、叶、小花和未成熟种子等各组织的蛋白用抗OsRRMh的兔多克隆抗体进行了Western blot分析，显示在以上的所有组织中都有OsRRMh蛋白的表达(图2B)。

由此得出结论：OsRRMh是一个组成型表达基因。

实施例3.OsRRMh pre-mRNA在水稻不同组织中存在不同的剪切模式

为从RNA水平分析OsRRMh的表达模式，用Northern blot的方法对ZH11的茎、叶、小穗和开花后7天未成熟种子等组织部位中OsRRMh的转录本进行了检测。基因特异性探针片段为用引物RT-1和RT-2扩增出的OsRRMh基因的cDNA片段。对提取的各种组织20μg总RNA在1%的丙烯酰胺凝胶中进行分离。结果显示，在各组织中可以检测到分子量从1.2kb到2.5kb不等的条带，同时在各组织间存在不同的条带分布(图3A)。

为检测Northern blot中显示的多条特异条带是否由OsRRMh的可变剪切产生，利用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，Mountain View,USA)对OsRRMh转录本的3’末端进行了分析。用PrimeScript^TM反转录酶将提取的200ng ZH11叶片总RNA反转为第一链cDNA。当用OsRRMh特异引物E3F和E6R对cDNA进行PCR扩增时发现至少可以检测到三种可变剪切产生的不同转录本(图3B)。1型转录本是以正常剪切方式所形成的完全型，而2和3型转录本则是在外显子内部产生了新的非常规剪切模式(图3B)。这一结果也印证了OsRRMh成熟转录本形成过程中确实存在可变剪切现象。

通过可变剪切产生的不同转录本可能在控制发育方面行使着不同的功能。与拟南芥中的FCA调节自身转录本的形成类似[13,14]，OsRRMh可能通过其固有且特异的机制进行自身调控以产生不同的转录本。但另外一种可能是，可变剪切形成的不同转录本会被NMD机制清除掉而并不会行使重要功能[15,16]。

实施例4.OsRRMh下调表达造成转基因植株开花延迟

为分析OsRRMh基因的功能，构建了OsRRMh dsRNAi植株(图4A)。24棵独立转基因植株中有7株呈现明显的晚开花表型表现(图4B，表2)，对其中的3个株系进行检测发现，OsRRMh表现为明显地下调表达(图4C)。本实施例中，OsRRMhRNAi构建的序列为：attccctcctgctatgcaagctcctgctgccgcacaagctcctgttgctgcacaagcttctgctgacgaggcagaacggaacaggaagtatcaggcgactcttcagttggctcagcgcctgttgggtcagctacaacagaagcctggaaatcaaccttaaggctatcctggaaatcaaccttcaggctaagttacttattcaggtacgttttatgtgctgctctgcaattgttctttccgtgccatttacaacttctctgctatgaaattaggtatcaagtgaaatatccaaacagattcaggcattcagctaatcgtaggtgtagtatatgcacttcttaaaagttaaaaccagaaactctgctaacaagttttgtaggctttatttctgctagggcatagtccaatttaggcgaaca(SEQ ID NO:57)；序列为cDNA序列中从ATG算起的2544-2962区段。

同时对OsRRMh dsRNAi植株中Ehd1(Early heading date 1)[17]的下游基因RFT1(Rice Flowering Locus T 1)和Hd3a(Heading-date 3a)的表达水平进行了检测，二者表现为表达水平的一致下调(图5)。有报道提到，水稻开花控制基因Hd1和Ehd1共同起作用对水稻的穗型发育进行调控[18]。而RFL等的突变也会造成水稻穗型的变化[19]。对OsRRMh下调表达转基因植株的穗型进行观察后，发现其呈现为穗变大特征，主要表现为一级枝梗数目的增多(图4D)。对OsRRMh下调表达转基因植株的穗型指标之一的每穗粒数以及转基因植株的开花时间进行了统计后发现，所选取的3个独立转基因株系全部体现为极显著的每穗粒数变多(图4D-E)以及开花时间延后特征(图4B，E)。OsRRMh下调表达转基因植株所呈现的表型暗示OsRRMh可能参与调控水稻的开花时间。随后对OsRRMh下调表达转基因植株叶片中参与调控水稻开花时间基因，包括Hd1、Hd3a等22个基因的表达进行qRT-PCR分析，发现，其中只有RFT1、Hd3a以及OsMADS14的表达水平严重减弱。其中，OsMADS14位于Ehd1的下游起作用[20]，而RFT1和Hd3a是水稻中的成花素，与拟南芥的FT同源[21]。下表2显示了7个OsRRMh表达下调的转基因株系开花时间和穗型统计数据。

表2.

实施例5.OsRRMh或其SPOC编码结构域的过量表达造成转基因植株育性降低

构建在玉米Ubi启动子控制下的OsRRMh过表达质粒(图6A)并转化ZH11。共获得20株转基因植株，相比转化pHB[10]的对照植株(图6B)，在7株植株中检测到OsRRMh基因高表达。选取了其中3个植株繁殖，在它们的T2代植株中依然检测到OsRRMh mRNA高表达(图6C)，同时表现为穗型变小和结实率明显降低(图6B,D)，但是在开花时间上和对照质粒植株没有明显可见的差异。

有报道称，将rFCA(拟南芥开花控制基因FCA在水稻中的同源基因)的两个RRM结构域分别导入水稻造成了包括开花时间延迟、细胞和种子变大等表型[11]。由于OsRRMh和rFCA的RRM结构域间的保守性很高(42%的相似性,27%的一致性)，所以我们构建了35s启动子启动过量表达OsRRMh各自三个RRM结构域以及同时过量表达3个RRM结构域的转基因植株。但是转基因植株并没有表现出明显表型，尤其是在种子大小方面(数据未显示)。这也许是由OsRRMh与rFCA各自的RRM在结合特异RNA片段上的不同所致，尽管二者的RRM结构域本身在结构上相当高的相似性。

Ariyoshi等[3]认为，SPOC结构域在抑制转录和信号传递中起作用。由此构建了SPOC结构域过量表达的转基因植株。在获得的14棵独立转基因植株中，观察到有8株表现为穗型变小和结实率降低(图6E)。选取了其中3株进行SPOC结构域表达的qRT-PCR分析，结果显示，相比转化pHB对照植株均表现为高表达(图6F)。对SPOC结构域过量表达转基因植株的每穗着粒数和结实率进行了统计，显示每穗着粒数和结实率均降低(图6G)。同时利用I₂-KI染色方法对结实率降低的转基因植株中的花粉进行染色，结果表明结实率降低是由雄性不育造成(图6H-I)。SPOC结构域过量表达的转基因植株所体现出的另一表型是小穗(图6E)。

实施例6.在拟南芥fpa中过量表达OsRRMh不能恢复其晚开花表型

OsRRMh在拟南芥中的同源基因是FPA，二者在蛋白质序列上的相似性为44%，一致性为32%。为检测OsRRMh是否具有FPA相似的功能，在拟南芥fpa中进行了OsRRMh的遗传互补实验以分析其能否恢复fpa晚开花表型[22]。结果显示，转化了35s::OsRRMh的突变体相比fpa并没有表现出表型恢复(图7A)，同时在转基因植株中检测到OsRRMh的表达(图7B)。通过统计Col+35s::OsRRMh植株抽薹前的莲座叶数和延迟开花天数(图7D)，发现Col+35s::OsRRMh植株相比Col-0表现为晚花表型(图7C)。进一步的分析表明，在Col+35s::OsRRMh中开花控制基因如FT(Flowering Locus T)和AP1(APETALA1)的表达均表现为下调(图7E)，所以造成了晚开花表型。以上结果提示，尽管OsRRMh是FPA的同源基因，但是二者在植物体的作用机制却不同。推测可能是由于二者分别来源于单子叶和双子叶植物，所以OsRRMh与FPA在行使功能方面会不尽相同。

讨论

发明人分析了水稻中Spen-like基因OsRRMh的表达特征，并对其基本功能进行了初步探索。利用结构域搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)我们发现在水稻基因组中共有3个Spen-like基因(图8A)，与OsRRMh最同源的Spen-like基因是拟南芥中的FPA(图8B)。Spen-like基因编码的蛋白质拥有相同的元件构成特征(图8A，C-E)。由于RBP是通过其RRM结构域与特定RNA片段结合而行使功能，所以不同的RRM序列预示着其所结合RNA片段的不同(图8C-D)。结合SPOC结构域的不同(图8A，E)及它对发育的调节作用，我们还很难预测这些Spen-like基因的功能。

OsRRMh是水稻基因组中的一个单拷贝基因(图1C)，其在根、茎、叶、小花和未成熟种子中都有表达(图2、3A)。OsRRMh的可变剪切在所有组织中都能检测到，而且在不同组织中表现出的所占比例的不同(图3A)。OsRRMh可能通过可变剪切产生的不同转录本来编码不同长度的蛋白质，进而行使不同的功能。由于在不同组织间存在这一表达模式的区别，所以OsRRMh多功能的行使可能依赖于可变剪切机制。OsRRMh的表达水平并不受光照时间的调控，即使是在光-暗转变的时间点上也没有出现跳跃式的变化(图9)，这与FPA所呈现出的依赖光周期的表达模式不同[19]。

结合OsRRMh的表达不受光周期节律调控这一表达特征，基本排除了OsRRMh位于OsGI和(或)Ehd1下游的可能性，其最可能独立于这些“主流干道”而自成体系并直接作用于诸如Hd3a、RFT1以及OsMADS14上，可能会影响以上3个基因的剪切效率或者其mRNA的稳定性。这些还有待于通过蛋白质与RNA结合实验等进行证实。

OsRRMh dsRNAi转基因植株表现为晚开花(图4B，E)及穗型变大表型(图4D，E)。这可能是因为OsRRMh的下调表达干扰了开花时间控制因子，如RFT1和Hd3a等的表达(图5)，进而影响了正常的开花时间。而开花时间的延后促进了穗的发育。这同时提示我们，OsRRMh可能是控制水稻从营养生长向生殖生长转变的关键影响因子。

OsRRMh的SPOC结构域或OsRRMh全长cDNA过量表达都造成了穗型变小以及结实率的显著降低(图6E-F，图6B-D)。尽管FPA是OsRRMh在拟南芥中的同源基因，但在fpa突变体中表达OsRRMh并不能恢复其晚开花表型(图7A)。这提示OsRRMh和FPA的功能或者作用方式不同。

由于SPOC结构域可能参与蛋白质间的相互结合[23-25]，所以我们可以在寻找Spen-like蛋白结合蛋白的基础上为明确其功能提供依据。这也将有助于我们对OsRRMh的SPOC结构域过量表达造成的结实率降低以及小穗表型的出现提供解释。

对Spen-like蛋白的结构推测和功能分析将成为对其研究的另一热点。伴随Spen蛋白和相关蛋白结构的成功解析，我们将能够鉴定出这些蛋白特异结合的RNA片段，从而可以精确分析其功能。根据PDB(Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/pdb/)[26]统计的数据显示，从2005年至今，在真核生物尤其是动物体内有超过100例的蛋白质-RNA复合体完成了结晶。伴随蛋白质结晶技术的飞速发展，Spen-like蛋白有可能在近期完成晶体解析。

C端包含SPOC结构域的蛋白根据其分子量大小可以分为两类：大蛋白和小蛋白。这其中大蛋白Spen的功能刚好与小蛋白NITO相反[27]。这给我们以启示，我们可以根据已知一类蛋白的功能去推测另一类蛋白的可能功能。

开花时间控制对于植物正常完成生长周期是极为重要的。研究人员在拟南芥中通过分子遗传操作分离出了很多控制这一发育转变过程的基因。RNA编辑在调节这其中的一些RNA结合蛋白，如FCA、FPA、FLK和mRNA3’处理因子FY等的功能方面起重要作用。对基因表达的转录后水平调控在开花时间控制上影响极大[28]。尽管在水稻中没有鉴定出有自主促进开花途径的存在，但转录后水平调控无疑在水稻中同样会行使很重要的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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Claims

1.一种分离的OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的用途，其中，所述多肽或多核苷酸用于改善水稻的性状，所述水稻的性状包括水稻开花时间、结实率、穗型；或者，

所述多肽或多核苷酸用于制备转基因水稻。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述改善水稻的性状包括提高水稻的结实率、增大水稻的穗型；或者

所述转基因水稻的结实率提高、穗型增大；

从而提高水稻的产量。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述多肽或多核苷酸具有以下特征：

所述多肽是：(i)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或(ii)由SEQID NO：2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由(i)衍生的多肽；或

所述多核苷酸是：(i)具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO：1所示序列互补的多核苷酸。

4.一种改善水稻性状的方法，所述方法包括：促进或抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用SEQ ID NO：57所示的dsRNA抑制水稻中OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的表达或活性。

7.一种制备转基因水稻的方法，其中，所述方法包括步骤：

(b)培养(a)所述的水稻细胞，将其再生成水稻。

8.OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂的用途，其特征在于，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂可用于延迟水稻开花时间、提高水稻的结实率、增大水稻的穗型。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂是SEQ ID NO：57所示的dsRNA。

10.一种OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂抑制或下调OsRRMh多肽或其编码多核苷酸的活性或表达。