CN106939312B

CN106939312B - 一种粒重相关基因及其应用

Info

Publication number: CN106939312B
Application number: CN201511025241.2A
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 司丽珍; 陈佳颖; 黄学辉; 罗江虹; 陆婷婷; 朱静洁; 上官颖颖
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN106939312A

Abstract

本发明涉及一种粒重相关基因及其应用。具体地，本发明首次揭示了一种水稻稻类相关基因GLW7或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺形状，所述农艺形状选自下组的一种或多种：(i)籽粒粒型性状；(ii)千粒重；(iii)灌浆量、和/或灌浆速率；(iv)穗长；(v)枝梗数；(vi)每穗粒数；(vii)谷物产量；(viii)垩白利率。

Description

一种粒重相关基因及其应用

技术领域

本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及一种粒重相关基因及其应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，世界上大约有50％以上的人口以水稻为主食；到2025年，人们对水稻的需求将会增加50％。中国是一个水稻生产和消费大国，水稻对保障我国粮食安全具有重要作用。亚洲栽培稻被分为两大亚种：粳稻和籼稻。经过长期的人工选择，亚洲栽培稻从普通野生稻驯化而来。研究表明，粳稻最早是由一小部分野生稻在中国南方驯化而来，而籼稻则是由驯化的粳稻与一些当地的野生稻进一步杂交，从而从中国扩散到东亚和南亚等地区。在这些过程中，许多农艺性状，如落粒性的降低，从匍匐生长到直立生长，种子壳色等都发生了变化。同时，在这么多年的进化过程中，许多栽培品种为了适应当地的气候环境或者增加产量，它们的遗传基础又进一步得到改良。

籼稻品种主要种植在热带和亚热带地区，大部分粳稻种植在温带地区，也有一些粳稻在热带和亚热带地区种植。根据粳稻的种植地区以及其它的农艺性状，又被分为热带粳稻和温带粳稻两种亚型。与籼稻相比，尽管粳稻的这两种亚型在遗传上具有比较近的遗传距离，但它们仍然在一些农艺性状上有很大的差异。典型的籼稻是长粒，温带粳稻的籽粒为短圆形；与温带粳稻相比，热带粳稻(又名爪哇稻)是大粒、大穗、每穗粒数增加、以及剑叶较宽。

传统研究的基因的功能大多针对单一性状或几个性状，通过构建重组自交系，替换系，DH群体等分离群体，利用QTLs作图的方法定位、克隆到目标基因，然后再研究这一特定基因的功能。由于分离群体仅涉及两个特定的材料，因此连锁分析只涉及同一座位的两个等位基因。由于全基因基因型分析的成本越来越低，全基因组关联分析(genome-wideassociation study，简称GWAS)的手段也越来越高效，且越来越被应用到复杂性状的遗传分析中。GWAS是利用不同基因座等位间的连锁不平衡关系，进行标记与性状的相关性分析，以达到鉴定特定目标性状基因(或染色体区段)的目的。GWAS可以利用自然群体在长期进化中所积累的重组信息，因此具有较高的解析率，可实现数量性状基因(位点)的精细定位；可对一个基因座上所有等位基因在自然群体中的变异进行考察；GWAS可以同时快速的定位多个性状的许多QTLs位点。这些都是传统的连锁分析不可能做到的。GWAS还可以让我们找到许多从前未曾发现的主效QTLs，这将为基因功能研究开辟一条高效、快捷的途径。

水稻千粒重性状是构成水稻产量的主要因素之一，同时水稻的千粒重也与粒型密切相关，这一性状不仅影响稻谷产量，而且影响稻米的品质，因此在水稻中开展千粒重及粒型的研究对增加水稻的产量及改善品质都具有重要作用。随着人们生活水平提高，对米质的要求不仅要口味适合，而且要外形美观，尤其是在国际市场上特别突出。水稻谷粒的长、宽、长/宽和千粒重直接决定着稻米的长、宽、长/宽和粒重，而这些性状恰好是组成稻米品质及饮食喜好的重要部分。

因此本领域迫切需要开展相关基因的定位和功能研究，以便用于提高作物的农艺性状。

发明内容

本发明的目的就是提供一种稻类粒重相关基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种物质的用途，所述的物质选自下组：粒重相关基因GLW7或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺形状，所述农艺形状选自下组的一种或多种：

(i)籽粒粒形性状；

(ii)千粒重；

(iii)灌浆量、和/或灌浆速率；

(iv)穗长；

(v)枝梗数；

(vi)每穗粒数；

(vii)谷物产量；

(viii)垩白利率。

在另一优选例中，所述的物质为粒重相关基因GLW7或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控农作物的农艺形状选自下组：

(i-1)增加粒长、增加粒厚、和/或增加粒体积；

(ii-1)增加千粒重；

(iii-1)提高灌浆量、和/或提高灌浆速率；

(iv-1)增加穗长；

(v-1)增加枝梗数；

(vi-1)增加每穗粒数；

(vii-1)增加谷物产量；

(viii-1)降低垩白利率和/或提高谷物品质。

在另一优选例中，所述的物质为粒重相关基因GLW7的抑制剂，并且所述调控农作物的农艺形状选自下组：

(i-2)降低粒长、降低粒厚、和/或降低粒体积；

(ii-2)降低千粒重；

(iii-2)减少灌浆量、和/或减少灌浆速率；

(iv-2)降低穗长；

(v-2)降低枝梗数；

(vi-2)降低每穗粒数；

(vii-2)降低谷物产量；

(viii-2)提高垩白利率。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。

在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi或其组合。

在另一优选例中，所述的农作物包括禾本科农作物。

在另一优选例中，所述的农作物选自下组：水稻、小麦、和大麦。

在另一优选例中，所述的水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。

在另一优选例中，所述籽粒粒形形状选自下组：粒长、粒厚、或其组合。

在另一优选例中，所述枝梗数包括一级枝梗数和二级枝梗数。

在另一优选例中，所述的粒重相关基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述粒重相关基因GLW7来自禾本科作物。

在另一优选例中，所述的粒重相关基因GLW7来自水稻或小麦。

在另一优选例中，所述粒重相关基因选自下组：水稻的GLW7基因(OsSPL13)、小麦的GLW7基因(AHW57562.1)和谷子的GLW7基因(XP_004957796.1)、或其组合。

在另一优选例中，所述粒重相关基因GLW7的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述调控农艺性状功能的多肽。

在另一优选例中，所述粒重相关基因GLW7的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1或2所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1或2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:1或2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，当采用粒重相关基因GLW7或其编码蛋白或其促进剂时，还用于：

(a)增加籽粒颖壳细胞的大小；

(b)促进SRS5的功能。

本发明第二方面提供了一种改良作物农艺性状的方法，包括步骤：

提高所述作物中粒重相关蛋白GLW7的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

在另一优选例中，所述的改良作物的农艺性状选自下组：

(i-1)增加粒长、增加粒厚、和/或增加粒体积；

(ii-1)增加千粒重；

(iii-1)提高灌浆量、和/或提高灌浆速率；

(iv-1)增加穗长；

(v-1)增加枝梗数；

(vi-1)增加每穗粒数；

(vii-1)增加谷物产量；

(viii-1)降低垩白利率和/或提高谷物品质。

在另一优选例中，所述的“提高”包括步骤：将所述作物中粒重相关蛋白GLW7的5’-UTR区域中的(CACTTC)₂序列突变为(CACTTC)₁，从而提高粒重相关蛋白GLW7的表达量或活性。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：删去(CACTTC)₂序列中的TC、删去(CACTTC)₂中的CACTTC、在(CACTTC)₂序列中插入了GT。

在另一优选例中，所述的方法还包括：提高所述作物中GS3蛋白的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

本发明第三方面提供了一种促进SRS5功能的方法，包括步骤：在所述细胞或作物中上调粒重相关蛋白GLW7的表达，从而促进SRS5功能。

在另一优选例中，所述的SRS5来自水稻。

本发明第四方面提供了一种复合物，所述复合物为粒重相关蛋白GLW7结合于SRS5基因的启动子区域所形成的复合物。

在另一优选例中，所述的粒重相关蛋白GLW7结合于SRS5基因的选自下组的区段：-933bp±5bp的区段、-143bp±5bp的区段、或其组合。

在另一优选例中，粒重相关基因包括GLW7(OsSPL13)。

本发明第五方面提供了一种表达粒重相关基因GLW7的表达盒，所述的从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、GLW7的ORF序列、和终止子，

其中所述的5’UTR区仅含有一个CACTTC序列或不含有CACTTC序列。

在另一优选例中，所述的5’UTR区如SEQ ID NO.:1中第1980-2199位所示。

在另一优选例中，所述的GLW7的ORF序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列或其等同氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的表达盒如SEQ ID NO.:1中第1980-4829位所示。

本发明第六方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第五方面所述的所述的表达盒。

本发明第七方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第六方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第五方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为植物细胞。

在另一优选例中，所述的植物细胞为禾本科植物细胞。

在另一优选例中，所述的植物细胞为水稻细胞、小麦细胞。

本发明第八方面提供了本发明第五方面所述的表达盒的用途，用于改良作物的选自下组的农艺性状：

(i-1)增加粒长、增加粒厚、和/或增加粒体积；

(ii-1)增加千粒重；

(iii-1)提高灌浆量、和/或提高灌浆速率；

(iv-1)增加穗长；

(v-1)增加枝梗数；

(vi-1)增加每穗粒数；

(vii-1)增加谷物产量；

(viii-1)降低垩白利率和/或提高谷物品质。

本发明第九方面提供了一种粒重相关基因GLW7的启动子元件的用途，用于时空特异性表达外源蛋白，其中所述的时空特异性表达指在穗期及小花发育期特异性地表达于枝梗、外稃、和/或内稃组织。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了GWAS分析的GLW7的位点及附近11个基因的表达。

其中，1a为GWAS关联分析确定七号染色体位点GLW7，在染色体7：18.5-21.0Mb信号。在峰值附近260kb的基因预测。罗马字母I到XI代表11个预测基因(I,Os07g0502900；II,Os07g0503200；III,Os07g0503300；IV,Os07g0503500；V,Os07g0503600；VI,Os07g0503700；VII,Os07g0503900；VIII,Os07g0504601；IX,Os07g0505200；X,Os07g0506000；XI,Os07g0506366)。1b为在标识SNP rs19784266位点为基因型的粳稻群体的粒长。1c为以上11个基因在水稻中穗，叶及根中的表达。图中所示为11个大粒与小粒的品种的平均值。粉色代表小粒品种的平均值，蓝色代表大粒品种的平均值。所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝10)。P值采用t-检验获得。1d为GLW7(OsSPL13)在小粒品种和大粒品种中的RNA表达量，及所选材料的籽粒表型。1e为Western检测GLW7(OsSPL13)在小粒品种和大粒品种中的蛋白表达量及所选品种的籽粒图片。

图2显示了小粒基因型品种东京GLW7^SGH的cDNA序列，划线部分为保守的SBP结构域，黑框标记的序列为OsmiR156调控区，有星号的氨基酸为入核信号。SGH是小粒基因型(small-grain hyplotype)的缩写。

图3显示了大粒基因型品种GP7的GLW7^LGH的cDNA序列，划线部分为保守的SBP结构域，黑框标记的序列为OsmiR156调控区，有星号的氨基酸为入核信号。LGH是大粒基因型(Large-grain hyplotype)的缩写。

图4显示了GLW7位点在大粒和小粒中的序列分析及功能研究。

其中，a比较分析GLW7在大粒和小粒基因型的启动子区、5’UTR区、蛋白编码区、3’UTR区的序列差异。灰色方框代表蛋白编码区，内含子区用连接灰色方框的折线表示。白色方框代表5’UTR区和3’UTR区。小黑棒代表此碱基缺失；小红棒代表mir156调控区。GLW7^SGH和GLW7^LGH分别代表小粒基因型和大粒基因型。

b为转化用的载体。I，GLW7^SGH包含从小粒基因型材料东京里克隆到的8kb的基因组序列；互补载体-CP，GLW7^LGH包含从大粒基因型材料GP7里克隆到的8kb的基因组序列；III，pGLW7^SGH::GLW7^LGH包含从小粒基因型材料东京克隆到的2.4kb启动子与从大粒材料GP7里克隆到的3.6kb的转录区段；IV，载体GLW7^SGH突变了5’UTR的-172位碱基(C>T)；V，载体GLW7SGH突变了5’UTR的-146——-135位碱基(从TCCGCCTTCCACTTCCACTTCCAC(SEQ ID NO.:4中第76-99位)>GCCTTCCACTTCCAC(SEQ ID NO.:4中第79-93位)；VI，在载体V的基础上又突变了-15位碱基(T>G)；VII，从小粒基因型材料东京克隆到的2.4kb启动子及蛋白翻译区与从大粒材料GP7里GLW7的3’UTR区融合；VIII，载体GLW7^SGH在2679bp位置插入了GT两碱基；IX：载体GLW7^SGH在2816bp位置删除了TC两碱基；X，载体GLW7^SGH在3066bp位置插入了GT两碱基。

c为东京以及以上载体(I到X)转化东京的粒型外观。

d为转基因植株(I到X)的粒长。所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝50)。

e为转基因植株(I到X)的粒厚。所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝20)。

f为转基因植株(I到X)的千粒重。所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝8)。

g为转基因植株的RNA含量检测。

h为转基因植株的蛋白含量western分析。

图5显示了GLW7小粒基因型材料东京和大粒基因型材料GP7的5’UTR区的比较。

图6显示了突变体和转基因植株的粒型及灌浆速率的分析。

其中，a.东京野生型(DJ)，GLW7::RNA干扰(RNAi-1和RNAi-2)，转大粒基因型的材料互补实验GLW7^LGH(CP-1和CP-2)。以上转化的都是东京。

b.GP579，以及转化大粒基因型品种GP579的GLW7::RNA干扰(三种下调表达的RNAi，即RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3)的粒型。

c.东京和glw7的突变体的粒型。

d.东京野生型，GLW7::RNA干扰(RNAi-1和RNAi-2)，转大粒基因型的材料互补实验GLW7^LGH(CP-1和CP-2)，以上材料的粒长、粒宽、粒厚以及千粒重的比较。

e.GP579，以及转化GP579的GLW7::RNA干扰(RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3)的转基因材料的粒长、粒厚以及千粒重的比较。

f.东京野生型、glw7突变体和互补材料CP-1的籽粒鲜重灌浆速度。

g.东京野生型、glw7突变体和互补材料CP-1的籽粒干重灌浆速度。

东京野生型、glw7突变体和互补材料CP-1的籽粒干物质积累的灌浆速度。所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝7)。P值采用t-检验获得。

h.RNAi植株与互补植株的RNA含量分析。

i.RNAi植株与互补植株的蛋白含量western分析。

图7显示了对东京野生型和不同转基因植株的农艺性状分析。

具体地，显示了穗长、一级枝梗、二级枝梗、每穗粒数及小区产量在东京野生型、RNAi干扰植株(RNAi-1)、载体I、载体II、和载体III中的比较。除了产量实验是三小区重复外，其它几个性状均取了60穗进行了测量。

图8显示了对东京野生型和不同转基因植株的GLW7的RNA表达和蛋白水平的变化与细胞大小、粒长以及粒重的变化相一致。

a.在东京野生型和突变体glw7中GLW7转录与蛋白水平的分析。R，根；L，叶片；LS，叶鞘；C，茎；P10-P80，幼穗，数字表示幼穗长度达到穗终长度的10％，20％，40％，80％和100％；0d-25d，数字指开花后的天数。

b.在东京野生型和突变体glw7中蛋白水平的分析。DJ,东京野生型。Actin蛋白作为蛋白上样量的对照。

c.电镜扫描种子颖壳。(完整种子Bar＝1mm；外稃Bar＝100um)，

d.横向比较细胞的总数目(n＝8)。

e.在颖壳的上部、中部和下部的细胞数目比较。

f.颖壳的上部、中部和下部的细胞密度的比较。

g.开花当天东京野生型、突变体glw7和互补材料CP-1的颖壳全图。(Bar＝5mm)

h.从g途中显示的虚线处对颖壳横切图片。

i.东京野生型、突变体glw7和互补材料CP-1的外稃和内稃横切后的颖壳长度。

j.外稃薄壁细胞的数目。

k.外稃薄壁细胞的平均长度。

l.外稃薄壁细胞的平均大小。

注：DJ，东京野生型；glw7，突变体；CP-1，互补材料(转GLW7^LGH的转基因株系)；III，转pGLW7^SGH：：GLW7^LGH的转基因株系。

图9显示了对东京野生型、突变体glw7以及互补CP-1的穗茎节的切片分析。

a与d.东京野生型纵切；b与e.突变体glw7的纵切；c与f.互补材料CP-1的纵切(bar＝100um)。

g.东京野生型横切；h.突变体glw7的横切；i.互补材料CP-1的横切。

图10显示了对东京野生型、突变体glw7以及互补CP-1的穗茎节的纵切切片的细胞长度与细胞面积的分析。

图11显示了原位杂交研究在穗和小花发育不同时期GLW7的表达模式，GLW7通过调控直接SRS5来调控粒型。

a.东京野生型一级枝梗期GLW7的表达；

b.东京野生型二级枝梗期GLW7的表达；

c.东京野生型二级枝梗期GLW7的表达；

d.东京野生型小花起始期GLW7的表达；

e.东京野生型小花1mm期GLW7的表达；

f.东京野生型小花1.6mm期GLW7的表达；

g.东京野生型小花2.2mm期GLW7的表达；

h.东京野生型小花3.1mm期GLW7的表达；

i.东京野生型小花4mm期GLW7的表达；

j.东京野生型小花5mm期GLW7的表达；

k.原位杂交GLW7的阴性对照；

l.SRS5基因结构图示，三角代表在启动子和第一个内含子区GATC盒，灰色方块代表SRS5的5’UTR和3’UTR，蓝色方块代表SRS5编码区。

m.染色体免疫沉淀(CHIP)分别在东京野生型和突变体glw7的穗中的结果；

n.分别在东京野生型和突变体glw7的穗中，CHIP后的样品进行定量PCR分析结果；数值是用GLW7的抗体比上HA的抗体的CHIP结果。

o.定量PCR分析东京野生型和突变体glw7中的SRS5在不同组织中的表达情况，R，根；L，叶；P10，P50，穗；0d，开花当天。

图12显示了OsmiR156对GLW7(OsSPL13)的调控及核定位情况。

a，OsSPL13中的OsmiR156结合位点及mOsSPL13的人为突变位点。

b，GUS融合载体构建。pDJ::GUS-OsSPL13和pDJ::GUS-mOsSPL13。

c，OsmiR156过表达植株及MIM156转基因植株中OsSPL13的RNA变化情况，所有的测量数据以平均数±SD表示(n＝3)。P值采用t-检验获得。

d，pDJ::GUS-OsSPL13和pDJ::GUS-mOsSPL13在叶中和穗中GUS基因的染色结果。

e，OsSPL13的GFP融合蛋白的核定位观察。

图13显示了GS3在东京野生型中的RNA干扰实验

a，两个独立转基因株系的粒型(bar＝5mm)

b，GS3在两个独立转基因株系的RNA水平测量。

图14显示了GLW7和GS3对粒型调控的研究。

a，各种植株后代的10粒种子照片；

b，各种植株后代的千粒重分析(n＝8)；

c，各种植株后代的粒长分析；

d，各种植株后代的粒宽分析；

e，各种植株后代的粒厚分析。

图15显示了对GS3(a)和GLW7(b)在不同材料中的RNA表达分析。DJ，东京野生型；glw7为突变体；互补材料为CP-1；GS3-RNAi-1和GS3-RNAi-2为在东京中进行GS3干扰的独立转基因株系。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的稻类农艺性状位点的研究，首次揭示了一种水稻粒重相关基因GWL7或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺形状，所述农艺形状选自下组的一种或多种：(i)籽粒粒形性状；(ii)千粒重；(iii)灌浆量、和/或灌浆速率；(iv)穗长；(v)枝梗数；(vi)每穗粒数；(vii)谷物产量；(viii)垩白利率。该水稻粒重相关基因GWL7还能显著提高稻米品质。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明的GLW7基因”、“粒重相关基因GLW7”、或“本发明的OsSPL13”可以互换使用，都是指来源于农作物(如水稻、小麦)的GLW7基因及其变体。本发明的GLW7基因典型的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控农作物(如水稻)的农艺性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.:l或SEQ ID NO.:2中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:l或SEQ ID NO.:2的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:l或SEQ ID NO.:2中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:l或SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ IDNO.:1或SEQ ID NO.:2所示)具有一定同源性(保守性)的GLW7的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。

如本文所用，术语“本发明多肽”、“GLW7基因的编码蛋白”、可以互换使用，都是指来源于水稻的RGLW7的多肽及其变体。本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

本发明涉及一种调控农艺性状的GLW7多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。本发明的多肽能够有效调控农作物(如水稻)的农艺性状。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:3所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“调控农作物(如水稻)的农艺性状”。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有GLW7蛋白活性的GLW7蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GLW7蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:3差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了编码GLW7多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO.:1、SEQ ID NO.:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

应理解，虽然本发明的GLW7基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻GLW7基因高度同源(如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的GLW7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

上面方法的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

如本文所用，术语“长粒”、“大粒”可互换使用。

如本文所用，术语“短粒”、“小粒”可互换使用。

如本文所用，术语“GLW7^LGH”指大粒水稻的GLW7基因。

如本文所用，术语“GLW7^SGH指小粒水稻的GLW7基因。

如本文所用，术语“农作物”没有特别的限制，包括(但不限于)：水稻、小麦、大麦等。

本发明还提供了本发明粒重相关基因GLW7或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂的用途，用于调控农作物的农艺形状，所述农艺形状选自下组的一种或多种：

(i)籽粒粒形性状；

(ii)千粒重；

(iii)灌浆量、和/或灌浆速率；

(iv)穗长；

(v)枝梗数；

(vi)每穗粒数；

(vii)谷物产量；

(viii)垩白利率。

在一优选实施方式中，当采用粒重相关基因GLW7或其编码蛋白或其促进剂时，还用于：

(a)增加籽粒颖壳细胞的大小；

(b)促进SRS5的功能。

如本文所用，所述“促进剂”指一类物质，能够促进GLW7或其编码蛋白的表达，从而(i-1)增加粒长、增加粒厚、和/或增加粒体积；(ii-1)增加千粒重；(iii-1)提高灌浆量、和/或提高灌浆速率；(iv-1)增加穗长；(v-1)增加枝梗数；(vi-1)增加每穗粒数；(vii-1)增加谷物产量；和/或(viii-1)降低垩白利率和/或提高谷物品质。

如本文所用，所述“抑制剂”指一类物质，能够抑制GLW7或其编码蛋白的表达，从而(i-2)降低粒长、降低粒厚、和/或降低粒体积；(ii-2)降低千粒重；(iii-2)减少灌浆量、和/或减少灌浆速率；(iv-2)降低穗长；(v-2)降低枝梗数；(vi-2)降低每穗粒数；(vii-2)降低谷物产量；和/或(viii-2)提高垩白利率。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现粒重相关基因GLW7或其编码蛋白能够调控农作物的农艺形状、改善稻米品质。

(2)粒重相关基因GLW7或其编码蛋白在穗期及小花发育期特异性地表达于枝梗、外稃、和/或内稃组织。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和通用方法

1.1材料

筛选了多种粳稻材料，并进行播种。收获种子后测量水稻粒长，进行GWAS分析。种子的饱满度会影响粒长、粒宽，在种子完全成熟后，单株收种用于粒型考察。每个单株随机取100粒左右的种子，去芒后使用扫描仪进行粒型扫描。得到的扫描图像使用“种子大米外观品质检测软件”计算每个种子的长度和宽度，计算平均值。

1.2扫描电镜观察种子表面

1.2.1取样：取成熟后的种子水中超声10分钟，42℃干燥三天。

1.2.2上样：粘贴样品。将双面胶黏贴在铜台上，用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在胶上。

1.2.3镀膜：粘贴好样品后进行真空喷金镀膜。

1.2.4观察：样品制备好后，使用日本岛津JSM-6360LV型扫描电子显微镜进行观察。

1.3石蜡切片及原位杂交

用于组织学观察和原位杂交的材料用4％多聚甲醛固定，系列乙醇脱水，二甲苯透明并包埋在石蜡中。原位杂交的探针用罗氏公司的地高辛标记试剂盒进行标记。标记好的原位正义反义探针在8-um的石蜡切片上进行杂交20。

1.4实时定量PCR

新鲜植物组织或者-80℃冻存的组织用Trizol Reagent提取。总RNA样品中的DNA经过DNA酶消化后，用Invitrogen的SuperScript^TM II Reverse Transcriptase进行反转录为cDNA第一链，进一步为实时定量PCR的模版。定量PCR采用Takara公司的

Premix ExTaqTM试剂盒，在Applied Biosystems 7500real time PCR仪上进行。根据基因序列设计特异基因引物，选择水稻基因eEF-1α(GenBank accession no.AK061464)作为内参。

1.5GLW7的亚细胞定位

1.5.1GLW7-GFP融合蛋白构建

为了观察GLW7的细胞亚定位，我们构建了GLW7-GFP融合蛋白。经测序验证正确后，基因枪电击转化洋葱表皮细胞。

1.5.2基因枪电击转化洋葱表皮细胞

1.5.2.1洋葱表皮的准备：取新鲜有活力的洋葱，剥除最外面一层，取里面的一层

1.5.2.2在50μl无水乙醇中加入3mg金粉，震荡1分钟，10000rpm离心10min，弃上清；

1.5.2.3加入50μl无菌水，震荡1min，10000rpm离心10s，弃上清。

1.5.2.4重复步骤2一次

1.5.2.5依次加入5μl空载PA7质粒或者构建好的质粒(1μg/μl)，50μl的2.5MCaCl2，20μl的0.1M亚精胺，每加完一种试剂，震荡2-3s，

1.5.2.6震荡5-10min，冰上静置10min，10000rpm离心10-20s，弃上清

1.5.2.7加入250μl无水乙醇，震荡重悬，10000rpm离心10-20s，弃上清

1.5.2.8重悬沉淀于60μl无水乙醇中

1.5.2.9粒子轰击：把洋葱切成2cm左右的小片，取一片平铺于湿润的MS培养基上。每次取10μl包被质粒的金粉重悬液，点于微粒载膜中央，晾干后，使用Biolistic PDS-1000/He基因枪进行粒子轰击。

1.5.2.10定位观察：轰击后的洋葱放在25度黑暗的环境下培养24小时后，撕下内表皮，使用共聚焦显微镜(Zeiss,LSM510Meta,Germany)观察GFP荧光信号的位置。

1.6GLW7的染色体免疫沉淀

选东京和glw7突变体的幼穗用1％的甲醛固定，液氮磨碎，通过梯度离心分离细胞核，超声打断成0.2到1K的DNA片段，然后与GLW7的抗体孵育，HA抗体作为阴性对照。抗体拉下来的DNA用于测序或者qPCR分析。

实施例1鉴定粒重相关基因GLW7(OsSPL13)

筛选了多份粳稻材料，并测量了粒长和千粒重，用基因组关联的方法分析鉴定出七号染色体一个新的位点，此位点跟粒长和粒重有关，这个位点在粳稻群体中对粒长的贡献率为32％，粒重的贡献率为25％。我们根据水稻LD的情况，选择了260kb的位点进行了基因分析，共有11个预测基因(表1，图1a)，之后分析了这11个基因在水稻中穗，叶及根中的表达情况。

分析表明，在长粒基因型中的材料中(rs19784266C)粒长的平均值显著高于含小粒的基因型材料(rs19784266T)(图1b)。在穗中，Os07g0505200的表达在长粒中是短粒的两倍(P-value＝3.98×10-7)，其它11个基因没有检测出大的差异(图1c，1d)。在根中，和叶中也有一些基因在长粒和短粒的材料中存在差异,由于这些基因的表达量均很低，且在穗中它们的表达没有差异，因此认为它们不是此位点的候选基因。

由于以前有实验报道粒型的发育主要取决于水稻小花外俘和内俘的发育，而决定粒型的基因应该在水稻的颖壳发育中有较高的表达。根据本发明的数据，Os07g0505200基因在水稻的大粒品种中表达显著高于小粒品种，且主要在颖壳发育中表达，因此推测Os07g0505200很可能就是GLW7基因，GLW7的基因组序列如SEQ ID No.:1所示。

小粒GLW7基因和大粒GLW7基因的cDNA分别如图2，图3所示。小粒GLW7基因的cNDA序列如SEQ ID No.:4所示，小粒GLW7基因的氨基酸序列如SEQ ID No.:5所示。大粒GLW7基因的cDNA序列如SEQ ID No.:2所示，大粒GLW7基因的氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示。

随后，制备了GLW7的抗体，用此检测了GLW7在大粒和小粒中的蛋白水平。Actin蛋白作为上样量的对照。Western杂交证明GLW7在大粒中有较高的蛋白，在小粒品种中的蛋白量相对很低(图1e)。

本发明还发现，GLW7编码一个Squamosa启动子结合蛋白OsSPL13，属于SBP-Likegenes(SPLs)家族。此类家族基因广泛存在于植物中，从藻类到高等植物中它们都起很重要的作用。

实施例2基因5’UTR区的变异是GLW7(OsSPL13)在粳稻群体中控制粒型变化的主要位点

对大粒、小粒品种进行测序，测序包含2.4kb的启动子区及转录区。序列分析表明，该基因在群体中的变异可被分为两类：小粒基因型材料(GLW7^SGH)和大粒基因型材料(GLW7^LGH)。基因序列分析表明有29个主要的多态性差异在这两类基因型中，其中16个位点是跟小粒基因型和大粒基因型紧密连锁的：6个SNPs位点在启动子区；三个多态位点在5’UTR(c.-172C>T,-146--135“CACTTCCACTTC”>“CACTTC”,-15C>T)；一个同义突变在第一个外显子区；2个SNPs在内含子区；三个插入缺失多态在3’UTR区。这些变异与大粒品种和小粒品种紧密相关。在大粒品种和小粒品种的基因型比较中，没有发现与粒型紧密相关的氨基酸变异(图4a)。

为了研究哪些变化是造成粒型改变的主要的变异，发明人首先构建了3个载体(I到III，图4b)：I，GLW7^SGH包含从小粒基因型材料东京里克隆到的8kb的基因组序列；互补载体CP，GLW7^LGH包含从大粒基因型材料GP7里克隆到的8kb的基因组序列；载体III，pGLW7^SGH::GLW7^LGH包含从小粒基因型材料东京克隆到的2.4kb启动子与从大粒材料GP7里克隆到的3.6kb的GLW7的转录区段。并把这些载体分别转化小粒基因型品种东京野生型，考察了T3代的粒型变化。与东京相比，转载体-I的植株粒长和粒厚分别增加2.5％和1.7％；转互补载体-CP的植株粒长和粒厚分别增加6.4％和3.7％；而转载体-III的植株粒长和粒厚分别增加5.5％和2.8％；这一系列的变化最终导致千粒重在载体-I的转化株中增加3％，在互补载体-CP中增加10％，在载体-III增加9％。这些转基因植株的粒宽没有改变(图4c,4d,4e,4f)。由于没有检测到与大粒材料和小粒材料相关的GLW7基因的氨基酸的差异，所以推测造成粒型改变的区域是GLW7的5’UTR区或者3’UTR区。

接下来发明人在载体-I的基础上构建了载体IV到X(图4b)。IV，载体-I突变了5’UTR的-172位碱基(C>T)；V，载体-I突变了5’UTR的-146--135位碱基(从TCCGCCTTCCACTTCCACTTCCAC>GCCTTCCACTTCCAC)；VI，在载体-V的基础上又突变了-15位碱基(T>G)；VII，从小粒基因型材料东京克隆到2.4kb启动子及蛋白翻译区与从大粒材料GP7里GLW7的3’UTR区融合；VIII，载体-I在2679bp位置插入了GT两碱基；IX：载体-I在2816bp位置删除了TC两碱基；X，载体-I在3066bp位置插入了GT两碱基。接下来也把这些载体转化到东京中，考察T3代的表型。

结果显示，载体IV的转基因植株的粒长、粒宽、及粒厚与载体-I的相似，但是载体V(5’UTR的-146—-135)的粒长增加了6％，粒厚增加了3％，千粒重增加了9.7％。载体VI与载体V都显著增加粒长、粒厚及千粒重，且增加幅度与转大粒的互补载体-CP相似。其它几个载体(VII，VIII，IX，X)的转基因植株粒型也增加，但幅度较小，与转小粒基因型的载体-I相似(图4c，4d，4e，4f)。与此相对应的是对这些转基因植株的GLW7的RNA水平与蛋白水平的分析表明，互补载体-CP、载体-III、载体-V、载体-VI中，RNA含量与蛋白含量均显著高于其它的转化载体及东京野生型(图4g，4h)。

因此，本发明得出GLW7造成粒型改变的主要位点在5’UTR区-146——-135bp的(CCATTC)₂的不同造成的。两个重复(CCATTC)₂造成GLW7的表达量降低，粒型变小；一个重复的(CCATTC)的基因型可以增加GLW7的表达量，使粒型变大，粒重增加(图5)。

实施例3转基因及突变体进一步验证GLW7(OsSPL13)的功能及它对灌浆速率的分析

发明人构建了GLW7的RNAi干扰载体，并转化了小粒基因型品种东京与大粒基因型品种GP579。

在东京RNAi干扰后的转基因植株田间试验的结果显示，与东京野生型相比，千粒重在RNAi-1降低8％，在RNAi-2减低10％。RNAi-1和RNAi-2的序列相同，如SEQ ID NO.:6所示。

粒型测量结果表明，RNAi干扰后的转基因植株的粒长、粒厚也有显著降低，粒宽没有显著变化(图6a，6d)。

对大粒基因型品种GP579的GLW7::RNAi干扰转化植株的T1代的粒型检测表明，三个独立的转基因株系的粒长与千粒重均有显著降低(图6b，6e)。转pTCK303空载的植株粒型没有显著改变。

同时也得到在东京材料中glw7的突变体，研究表明，与野生型的东京相比，glw7突变体的千粒重、粒长、粒厚均有显著降低(图6c)。与此相一致的是，互补实验即把大粒的基因型GLW7^LGH转小粒基因型东京材料中，粒长、粒厚与千粒重与东京相比，均有显著增加(图6a，6d)。

随后对东京野生型、突变体glw7、互补材料CP-1的籽粒的灌浆情况进行了分析，与对照相比，在开花后三天，突变体glw7和互补株系CP-1籽粒的干重与鲜重均没明显差异。在开花后8天，鲜重和干重在这三种材料中已经出现明显差异，这些差异随着灌浆时间的增加而越来越大，在开花后25天达到最大值，这时候，突变体glw7的干重和鲜重分别比东京野生型降低24.7％和25.4％；而互补转基因植株CP-1与东京野生型相比，干重和鲜重分别增加了10％和11％。

这些结果表明，OsSPL13在灌浆过程中的物质积累方面起重要作用(图6f，6g)。在互补植株中RNA含量和蛋白含量显著增加，与此相对应的是在RNA干扰植株中蛋白含量显著降低(图6h，6i)。

实施例4GLW7(OsSPL13)能够增加水稻的产量，提高稻米品质。

除了对粒长及千粒重有正向效应之外，GLW7还在穗的发育过程中起重要作用。与未转基因的东京野生型相比，互补植株CP-1的穗长和一级枝梗均有显著增加(图7)。载体I(GLW7^SGH)的转基因植株与野生型相比，二级枝梗增加了14％，而每穗粒数增加了12.7％；CP-1(GLW7^LGH)的转基因植株与野生型相比，二级枝梗增加了55.9％，而每穗粒数增加了28.8％；对于载体III，其枝梗数与每穗粒数的增加程度与载体II相似。与此结果相一致的是，当通过RNA干扰降低GLW7的表达时，穗长、一级枝梗、二级枝梗以及每穗粒数均有显著降低。

结果表明，与东京野生型相比，载体I，II，III在产量分别增加了7％、23％和19％，而RNA干扰植株降低了60％(图7)。

随后又测量了稻米的品质。与野生型的东京相比，互补转基因植株的蛋白含量、直连淀粉含量、胶稠度、糊化温度都没有显著差异，而垩白利率却显著降低，结果表明，GLW7在增加千粒重与产量的同时还提高了稻米的品质(表1)。

表1

实施例5GLW7(OsSPL13)主要调控细胞的大小来调控籽粒形状

发明人分析了东京野生型和突变体glw7中的RNA转录和蛋白表达情况。

结果表明，GLW7的转录和蛋白水平都是在穗发育时期很高，在茎中也有少量的表达；在根和叶片中检测不到GLW7的蛋白(图8a)。没有蛋白在突变体glw7中检测到(图8a，8b)。

水稻种子的颖壳分为内稃和外稃，颖壳的大小是影响粒型的一个重要因素。颖壳的表皮是由硅质化细胞组成，具有表皮毛，在种子表面规则排布，起到保护种子的作用。影响粒型的基因通常通过影响颖壳的大小来进一步影响种子。GLW7^LGH促进粒长和粒厚，但对粒宽没有影响。我们取东京野生型，突变体glw7，互补植株CP-1及pGLW7^SGH：：GLW7^LGH的成熟种子，用扫描电镜，考察外稃硅质化细胞的数目和大小。

结果表明，在这几种材料中，发现细胞的数目没有变化(图8c，8d)，因此推测种子的变化不是由于细胞数目变化来造成的，而是通过改变细胞大小来影响的。

接下来，把外稃分为如图8c所示的上、中、下三部分，分别考察细胞大小及数目。

结果显示，与野生型相比，单位毫米内的细胞数目在glw7中明显增加；与此结果一致的是，互补植株CP-1在上、中、下三个区域单位毫米的细胞数目分别减低21％、9％、10％(图8e)。细胞密度(即每平方毫米的细胞数)在突变体glw7的上、中、下三个区域分别增加47％、20％、12％；而在互补材料CP-1和pGLW^7SGH：：GLW7^LGH中均有显著降低(图8f)。

由于GLW7对粒宽没有影响，但对种子的粒厚有显著影响，因此我们取开花当天的颖壳，石蜡固定后进行了纵切。

结果显示，外稃和内稃的总长度在CP-1中是显著大于东京野生型，而glw7的外稃和内稃的总长度显著小于东京野生型(图8g，8h，8i)。细胞数目和细胞长度在互补材料CP-1中有显著增加，在glw7中有显著降低(图8j，8k)；同时在CP-1中的细胞也显著大于东京野生型(图8l)。

上述结果显示，GLW7通过调控细胞分裂与细胞伸长来调控籽粒的厚度。对穗茎节的切片也显示了互补材料CP-1中的细胞变大，而突变体glw7中的细胞显著变小(图9和图10)。

上述结果表明，GLW7调控种子长度主要通过调控细胞大小的机制来实现的。

实施例6GLW7(OsSPL13)基因在穗及小花发育时期的时空表达模式

用原位杂交研究了GLW7基因在穗及颖壳发育不同时期的时空表达模式。结果如图11所示，GLW7在一级枝梗、二级枝梗的原基起始位置都可以检测到表达(图11a，11b，11c)；在花原基起始的位置有很强的表达(图11d)。当小花发育到1mm时，GLW7在外稃和内稃的中部有很强的表达(图11e)，这一表达随着花的发育逐渐降低(图11f)，当小花发育到2.2mm时，在颖壳中仅仅能检测到非常弱的表达(图11g)。当小花发育到4-5mm时，GLW7在内稃和外稃的两端出现很强烈的表达，并且越往中间表达越弱(图11h，11i，11j)。用GLW7的同义链做的阴性对照检测不到GLW7的表达(图11k)。

实施例7GLW7(OsSPL13)受OsmiR156的调控及核定位情况

发明人构建了两个GUS融合载体，即把OsSPL13的OsmiR156靶序列突变，使OsmiR156不能结合OsSPL13的cDNA区。这两个载体用的都是来自东京的OsSPL13自身的启动子(图12a，12b)。构建好的载体pDJ::GUS-OsSPL13和pDJ::GUS-mOsSPL13用来转化水稻。

对转基因水稻的GUS染色结果显示，GUS-OsSPL13的植株的叶片中几乎检测不到GUS基因的表达，而突变了OsmiR156靶位点的GUS-mOsSPL13转基因植株中，GUS基因在叶片中有很强的表达。二者在穗中都可以检测到很强的GUS活性(图12d)。

为了进一步证明OsSPL13受OsmiR156的调控，发明人转化了过表达的OsmiR156和模拟OsmiR156的(MIM156)，对于OsSPL13基因的表达情况进行了定量分析。当在水稻中过表达OsmiR156时，OsSPL13的表达与对照相比降低了4倍，而在MIM156转基因植株中，OsSPL13的表达显著增加(图12c)。

由于OsSPL13属于转录因子家族，因此构建了GFP-OsSPL13融合蛋白，并在洋葱表皮进行了瞬时表达，共聚焦显微镜观察发现与单独表达GFP细胞相比，GFP-OsSPL13仅在细胞核中表达(图12e)。

实施例8GLW7(OsSPL13)可以促进SRS5的功能

用OsSPL13的抗体做了染色体免疫沉淀(CHIP)，材料为东京野生型和突变体glw7的穗。从兔子中得到的HA抗体作为阴性对照。

通过染色体免疫沉淀以及接下来的测序分析，发现小圆粒基因SRS5(Small andRound Seed 5)是OsSPL13的直接结合基因。分析SRS5的启动子区，在转录起始位点上游，有四个GTAC结构基元分别在-1873bp、-1208bp、-933bp和-143bp(图11l)。区域V在第一个内含子中，含有两个GTAC结合序列，被用来作为阴性对照。

CHIP结果显示，对于这两个抗体，几乎没有信号可以在区段I和V中检测到；经过GLW7的CHIP，区段II、III和IV在东京野生型的样品中可以有很强的信号，但突变体glw7中检测不到(图11m)。最重要的是，区段III(-933bp)和区段IV(-143bp)在东京野生型中的染色体免疫沉淀后得到的量分别是glw7的10倍和37倍。HA抗体在东京野生型和glw7中都没有检测到信号(图11n)。进一步的实验表明，SRS5在突变体glw7穗中的RNA表达量显著低于东京野生型的穗中的量(图11o)。

随后我们又对东京野生型和突变体glw7的穗做了转录组分析(RNA-seq)。总共有1915个基因被检测到存在显著差异(P<0.01)，与东京野生型相比，在突变体glw7中有25.4％(486个基因)上调，74.6％(1429个基因)下调。基因本体(GO)分析，这些基因主要富集在调控细胞组成、细胞结构及微分子代谢途径。

综上，上述结果表明，GLW7通过调控SRS5的表达来调控颖壳细胞的大小，从而影响粒型。

实施例9大粒基因GLW7^LGH等位基因从粳稻渗透到热带粳稻

发明人对栽培稻和野生稻的序列做了进化树方面的研究，研究表明，GLW7在不同生态型中的有分化。所有的GLW7^SGH小粒基因型都是热带粳稻，被聚类到一起；所有的GLW7^LGH大粒基因型，包含大部分热带粳稻、小部分温带粳稻和籼稻群体。在它们之中，有一部分热带粳稻被聚类成一个小的群体。

DNA序列分析表明，所有的籼稻品种均含有GLW7^LGH大粒基因型，这与本发明的GWAS结果相符合，即GLW7是粳稻群体造成粒型变化的一关键基因，但在籼稻群体中，GLW7对粒型的变异没有影响。

为了进一步估算GLW7在粳稻、温带粳稻、籼稻中的遗传分化情况，比较了七号染色体在这籼稻、温带粳稻、热带粳稻中的Fst(F分析)水平。与整个七号染色体相比，Fst值在温带粳稻和热带粳稻中在GLW7位点很高，但籼稻和热带粳稻相比GLW7位点相对较低，这表明，热带粳稻中大粒基因型GLW7^LGH这一位点在遗传上与籼稻距离更近，与温带粳稻较远。考虑到热带粳稻和籼稻均种植在热带地区，且它们在这些地区会彼此混合种植，可以推测，人们为了增加热带粳稻的粒型和产量，经过人工选择从而使籼稻的大粒基因型GLW7^LGH渗透到热带粳稻中。

实施例10GLW7与GS3对粒长的调控为独立进行

在东京野生型中做了GS3的RNA干扰实验。与预期相同，在2个独立的RNAi转基因株系中，粒长明显增加(图13a，13b)。随后做了两个杂交实验(GS3-RNAi-2与互补植株CP-1杂交；GS3-RNAi-2与突变体tgw7杂交)产生了后代群体。

对后代材料的表型分析表明，尽管glw7/GS3-RNAi仍然比东京野生型的籽粒要小，但粒长和粒重均比突变体glw7有显著增加。与此相对的是，CP-1/GS3-RNAi的粒长是所有组合中最长的，同时千粒重也是最重的。粒厚的变化不明显(图14a到14e)。

RNA表达的分析表明，GLW7在GS3-RNAi的转基因株系中没有变化，同时GS3的RNA表达量在tgw7与CP-1中也没有改变(图15a，15b)。

结果表明，尽管GLW7和GS3都对粒长与千粒重有调控，由于GS3主要通过增加细胞数目来增加粒长，而GLW7主要通过增加细胞的大小来增加粒长，所以二者是通过相互独立的途径来完成的。其中，GS3也是一种控制籼稻粒长的基因，序列如SEQ ID No.:7所示。

讨论

GLW7基因通过控制粒长、粒厚的发育，从而影响千粒重；同时其还对穗长、一级枝梗、二级枝梗以及每穗粒数均有影响，最终影响产量。

群体分析表明，当籼稻的大粒基因型GLW7^LGH通过基因渗透进入热带粳稻中时，从而引起了粳稻的籽粒变大、变厚、千粒重增加，同时使稻穗变长、枝梗数与每穗粒数均有显著增加。GLW7的RNA表达量、蛋白含量以及表达模式对这些表型的出现非常重要。GLW7^LGH的表达量的上调以及蛋白含量的增加导致粒型的变大，对其功能研究表明，GLW7是通过调控SRS5及一些expansins(细胞壁松弛蛋白)基因来增加细胞的伸长，从而增加籽粒的粒长、粒厚和千粒重。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种物质的用途，所述的物质选自下组：粒重相关基因GLW7或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，其特征在于，用于调控农作物的农艺形状，所述农艺形状选自下组的一种或多种：

(i) 籽粒粒形性状；

(ii) 千粒重；

(iii) 灌浆量、和/或灌浆速率；

(iv) 穗长；

(v) 枝梗数；

(vi) 每穗粒数；

(vii) 谷物产量；

(viii) 垩白利率，其中，所述的粒重相关基因GLW7来自水稻，所述农作物为水稻，所述粒重相关基因GLW7的核苷酸序列为编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述粒重相关基因GLW7的核苷酸序列为如SEQ ID NO.:1或2所示的多核苷酸。

3.一种改良作物农艺性状的方法，其特征在于，包括步骤：

提高所述作物中粒重相关蛋白GLW7的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状，其中，所述的粒重相关蛋白GLW7来自水稻，所述作物为水稻，所述粒重相关蛋白GLW7为SEQ IDNO.:3所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的“提高”包括步骤：将所述作物中粒重相关蛋白GLW7的5’-UTR区域中的(CACTTC)₂序列突变为(CACTTC)₁，从而提高粒重相关蛋白GLW7的表达量或活性。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：提高所述作物中GS3蛋白的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

6.一种促进SRS5功能的方法，其特征在于，包括步骤：在作物中上调粒重相关蛋白GLW7的表达，从而促进SRS5功能，其中，所述的粒重相关蛋白GLW7来自水稻，所述作物为水稻，所述粒重相关蛋白GLW7为SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽。

7.一种复合物，其特征在于，所述复合物为粒重相关蛋白GLW7结合于SRS5基因的启动子区域所形成的复合物，其中所述的粒重相关蛋白GLW7来自水稻，所述粒重相关蛋白GLW7为SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽。

8.一种表达粒重相关基因GLW7的表达盒，其特征在于，从5’至3’依次具有下述元件：GLW7的 5’UTR区、GLW7的ORF序列、和终止子，

其中所述的GLW7的5’UTR区仅含有一个CACTTC序列，所述的粒重相关基因GLW7来自水稻，所述粒重相关基因GLW7的核苷酸序列为编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸。

9.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求8所述的表达盒。

10.一种如权利要求8所述的表达盒的用途，其特征在于，用于改良作物的选自下组的农艺性状：

(i-1) 增加粒长、增加粒厚、和/或增加粒体积；

(ii-1) 增加千粒重；

(iii-1) 提高灌浆量、和/或提高灌浆速率；

(iv-1) 增加穗长；

(v-1) 增加枝梗数；

(vi-1) 增加每穗粒数；

(vii-1) 增加谷物产量；

(viii-1) 降低垩白利率和/或提高谷物品质，所述作物为水稻。