CN111533807A

CN111533807A - AET1-RACK1A-eIF3h复合物在植物环境温度适应性中的应用

Info

Publication number: CN111533807A
Application number: CN201910059211.5A
Authority: CN
Inventors: 林鸿宣; 陈可; 郭韬; 厉新民; 单军祥; 叶汪薇
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2020-08-14

Abstract

本发明提供了AET1‑RACK1A‑eIF3h复合物在植物环境温度适应性中的应用，具体地，本发明提供了一种分离的复合物，所述复合物为AET1与RACK1A和eIF3h相结合所形成的三元复合物。此外，本发明的复合物可用于筛选提高植物抗逆性的药物或化合物。本发明还首次发现，下调或敲除AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种会降低复合物的含量，植物会呈现热敏感表型，而当上调AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种时，会促进复合物的形成，从而改良植物的性状。

Description

AET1-RACK1A-eIF3h复合物在植物环境温度适应性中的应用

技术领域

本发明属于农学领域，具体地说，本发明涉及基于AET1-RACK1A-eIF3h复合物在植物环境温度适应性中的应用。

背景技术

近些年来，随着第三次工业革命的发展及人口数量不断增长，人类活动加快全球气候变暖趋势，世界各地极端气候频发，对农业生产及粮食安全都产生较大影响。植物由于其固着生长的特性决定了其在漫长进化过程中产生许多适应环境改变的策略。这些策略涉及植物激素信号转导、植物生长发育过程调控、植物光合效率强度等一系列分子机理研究。许多过程在过去几十年生命科学的飞跃式发展过程中为农业生产、环境保护、医疗健康等方面做出了巨大的贡献。水稻作为世界上最重要的粮食作物养活了全球近一半的人口，对我国粮食安全起到了至关重要的作用。理解水稻是如何适应不断增加的高温环境，并且应用遗传工程的手段培育对环境温度变化适应性好的水稻优良品种有助于在我国水稻生产应用上提供新策略，对促进水稻产量持续、稳步提升具有深远意义。同时，对水稻环境温度适应性基因资源的挖掘及分子机理研究，也会为其他农作物的育种提供新的思路及借鉴。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在调控生长素下游响应基因的蛋白翻译重起始和翻译效率进而通过生长素信号影响植物生长发育过程中发挥重要作用的AET1-RACK1A-eIF3h复合物。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的复合物，所述复合物为AET1与RACK1A和eIF3h相结合所形成的三元复合物。

在另一优选例中，所述复合物的分子量≥80KD，较佳地，≥100KD。

在另一优选例中，所述复合物的分子量为100－150KD，较佳地，130－150KD。

在另一优选例中，所述复合物中，AET1与RACK1A和eIF3h的摩尔比为1-4:1:1，较佳地，1-2:1:1,更佳地，1:1:1。

在另一优选例中，所述AET1包括野生型的AET1和突变型的AET1。

在另一优选例中，所述AET1的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1或7所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:1或7所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述AET1活性的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1或7所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述AET1活性的多肽。

在另一优选例中，所述所述编码AET1蛋白的AET1基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1或7所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:2或8所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2或8所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:2或8所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述RACK1A的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述RACK1A活性的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述RACK1A活性的多肽。

在另一优选例中，所述编码RACK1A蛋白的RACK1A基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:4所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述eIF3h的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述eIF3h活性的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述eIF3h活性的多肽。

在另一优选例中，所述编码eIF3h的eIF3h基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:5所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:6所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:6所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明第二方面中，提供了一种本发明第一方面所述的复合物的用途，用于筛选提高植物的抗逆性的药物或化合物。

在另一优选例中，所述抗逆性选自下组：抗旱、抗盐、抗高温、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、十字花科植物、茄科植物、豆科植物、锦葵科植物、葫芦科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：水稻(Oryza sativa)、谷子(Setariaital ica)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa FPsc)、番茄(Solanum Lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、棉花(Gossypium raimondii)、黄瓜(Cucumis sativas)、或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。

在另一优选例中，当应用所述复合物筛选药物或化合物时，所述应用包括步骤：

(a)在测试组中，在待测物质存在下，培养植物细胞，并且设置无待测物质的对照组；

(b)检测测试组中所述复合物的含量H1并与对照组中的复合物含量H0进行比较，其中当H1显著高于H0，则表示所述测试物为提高植物的抗逆性的药物或化合物。

在另一优选例中，所述显著高于指H1/H0≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。

在本发明第三方面中，提供了一种改良植物的方法，包括步骤：调控植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述改良植物包括提高植物的抗逆性。

在另一优选例中，所述调控植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性包括提高植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，当所述提高植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性指植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量E1与所述植物中野生型AET1、RACK1A、eIF3h本底表达量E0之比≥2，较佳地，≥5，更佳地，≥10倍时，所述植物的性状改良包括植物抗高温、抗旱、抗盐能力增加。

在另一优选例中，所述提高植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性指植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的活性A1与所述植物中野生型AET1、RACK1A、eIF3h本底活性A0之比≥2，较佳地，≥5，更佳地，≥10倍。

在另一优选例中，当所述提高植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性指植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的活性E1与所述植物中野生型AET1、RACK1A、eIF3h本底活性E0之比≤1/2，较佳地≤1/5，更佳地≤1/10时，所述植物的性状改良包括植物抗高温、抗旱、抗盐能力减弱。

在本发明第四方面中，提供了一种筛选促进本发明第一方面所述复合物形成的药物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养植物细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中本发明第一方面所述复合物的形成情况；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中本发明第一方面所述复合物的形成情况；

(b)如果所述测试组中本发明第一方面所述复合物的形成数量Q1显著高于所述对照组中的本发明第一方面所述的复合物的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。

在另一优选例中，所述“显著高于”指Q1/Q2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。

在另一优选例中，所述植物细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述植物细来自选自下组的植物：禾本科植物、十字花科植物、茄科植物、豆科植物、锦葵科植物、葫芦科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述植物细胞来自选自下组的植物：水稻(Oryza sativa)、谷子(Setaria italica)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zeamays)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa FPsc)、番茄(SolanumLycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicagotruncatula)、棉花(Gossypium raimondii)、黄瓜(Cucumis sativas)、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了aet1突变体的表型特征；

其中，(A)野生型特青和aet1突变体在上海夏季与海南冬季种植的株型；(B)精细定位aet1基因及该位点的序列保守性分析；(C)特青、aet1以及互补植株AET1_pro:cAET1/aet1在上海大田的株型；(D)特青和aet1突变体实验室不同温度处理10天后的表型；(E)对特青和aet1突变体温度处理的统计比较；(F)特青和AET1^CRISPR植株上海大田的株型；(G)不同的光周期对特青和aet1突变体的表型；(H)实验室条件下盐处理特青和aet1突变体的表型；(I)实验室PEG处理模拟干旱胁迫条件下特青和aet1突变体的表型；(J)特青和aet1突变体上海大田茎部部分横切面图。

图2显示了AET1突变会影响体内与体外鸟苷转移酶酶活及体内总tRNA内稳态；

其中，(A)EMSA实验表明体外纯化的AET1及AET1^P382S能够结合pre-tRNA^His；(B)Thg1酶活实验表明AET1具有体外催化tRNA^His前体加G反应，而AET1^P382S则丧失酶活；(C-E)tRNA测序对特青、aet1突变体分别在常温和高温(HS)条件下tRNA^His(C)、tRNA^His前体加G反应(D)及tRNA^Met(E)所有等位基因比例统计；(F)tRNA测序对特青、aet1突变体分别在常温和高温(HS)条件下所有tRNA总量比例改变的统计。

图3显示了AET1与RACK1A、eIF3h互作形成复合体，同时表达量受热诱导上调；

其中，(A)酵母双杂交实验表明AET1与RACK1A，eIF3h分别互作，形成一个复合体；(B-C)AET1，RACK1A及eIF3h分别接YFP的N端及C端都能相互与对应基因互作产生荧光信号，而AET1cYFP与阴对照OsHAL3-nYFP则没有荧光信号；(D)AET1，RACK1A及eIF3h基因在野生型与aet1突变体在常温和高温条件下表达量比较，这三个基因都有受热诱导上调的趋势。

图4显示了AET1，RACK1A及eIF3h分别定位于内质网；

其中，(A)AET1-YFP，RACK1A-YFP，eIF3h-YFP在水稻原生质体中的亚细胞定位结果，发明人利用ER marker来表示内质网的位置；(B)核糖体蛋白S2的亚细胞定位结果，该蛋白是核糖体组成成分之一，共定位于内质网上。

图5显示了AET1直接与生长素响应基因mRNA结合，但是RACK1A，eIF3h不结合；

其中，(A-E)利用AET1多克隆抗体对野生型与aet1突变体高温处理样品进行RNA免疫共沉淀后利用qRT-PCR反应发现生长素下游响应基因有明显富集；(F)体外RNA-EMSA实验表明AET1及AET1^P382S都能结合用Cy5标记的特异性mRNA探针，影响凝胶迁移率，而RACK1A及eIF3h则无法与对应RNA探针结合改变RNA条带迁移率。

图6显示了RACK1A^CRISPR，eIF3h^CRISPR及OsARF23^CRISPR植株的表型特征；

其中，(A)转基因阴性对照特青及2个不同突变形式的RACK1A^CRISPR植株在上海大田的株型；(B)转基因阴性对照特青及2个不同突变形式的eIF3h^CRISPR植株在上海大田的株型；(C)阴性对照及RACK1A^CRISPR植株株高统计(A)；(D)阴性对照及eIF3h^CRISPR植株株高统计(B)；(E)对两种不同突变形式的RACK1A^CRISPR植株进行序列比对；(F)对两种不同突变形式的eIF3h^CRISPR植株进行序列比对；(G)实验室不同温度下处理ZH11及OsARF23^CRISPR植株表型；(H)ZH11及OsARF23^CRISPR植株在25℃处理下株高统计(G)；(I)ZH11及OsARF23^CRISPR植株在38℃处理下株高统计(G)；(J)对两种不同突变形式的OsARF23^CRISPR植株进行序列比对。

图7显示了AET1-RACK1A-eIF3h复合体在核糖体上调控OsARF蛋白翻译效率；

其中，(A)分别对野生型与aet1突变体进行25℃处理14天及25℃7天加上35℃7天的样品进行核糖体蔗糖梯度实验，OD₂₅₄在蔗糖各层吸收值；(B-C)对野生型及aet1突变体进行不同温度条件下处理后核糖体蔗糖梯度离心后标识核糖体状态的第8-14层部分OsARFsqRT-PCR结果，包括OsARF19的mORF及OsARF19的uORF(B),OsARF23的mORF及OsARF23的uORF(C)；(D)野生型与aet1突变体在不同温度下对AET1，eIF3h，RACK1A，OsARF23及Actin蛋白含量的分析(左列)，野生型与aet1突变体、eIF3h^CRISPR及RACK1A^CRISPR上海大田样品AET1，eIF3h，RACK1A，OsARF23及Actin蛋白含量的分析(右列)。

图8显示了aet1突变体与RACK1A^CRISPR及eIF3h^CRISPR植株展现出OsARF基因翻译效率降低；

其中，(A-C)野生型、aet1突变体、RACK1A^CRISPR及eIF3h^CRISPR植株在上海大田样品蔗糖梯度离心各层OD₂₅₄值；(D-O)野生型、aet1突变体、RACK1A^CRISPR及eIF3h^CRISPR样品的OsARF19的uORF(D,E,F)、OsARF19的mORF(G,H,I)、OsARF23的uORF(J,K,L)、OsARF23的mORF(M,N,O)RNA含量在核糖体第8-14层分布情况。

图9显示了aet1是一个生长素不敏感突变体；

其中，(A)野生型和aet1突变体在25℃用不同浓度生长素处理14天表型图；(B)野生型和aet1突变体在25℃用不同浓度生长素处理14天根长统计图；(C)野生型和aet1突变体在25℃用不同浓度生长素合成抑制剂L-Kyn处理14天根长统计图；(D)对DR5-GUS转基因植株与野生型和aet1突变体分别杂交F2代不同温度处理下GUS染色结果；(E)对DR5-GUS转基因植株与野生型和aet1突变体分别杂交F2代上海大田茎部GUS染色图；(F)野生型和aet1突变体在不同温度条件下处理后内源生长素含量及相对诱导生长素比例。

图10显示了AET1通过影响细胞分裂来调控植物生长；

其中，(A)利用流式细胞仪对野生型和aet1突变体在不同温度条件下处理3天后植物根尖细胞细胞倍性进行分析；(B)野生型和aet1突变体在不同温度条件下处理3天后植物根尖细胞细胞周期比较；(C-D)11个不同的细胞周期相关marker基因在野生型与aet1突变体常温(C)与高温(D)条件下样品相对表达量比较。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现一种AET1与RACK1A和eIF3h相结合所形成的三元复合物，该复合物可用于筛选提高植物抗逆性(如抗高温、抗盐、抗逆等)的药物或化合物。此外，本发明还首次发现，下调或敲除AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种会降低复合物的含量，植物会呈现热敏感表型，而当上调AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种时，会促进复合物的形成，从而改良植物的性状(比如提高植物的抗逆性)。在此基础上，本发明人完成了本发明。

AET1蛋白和基因

AET1基因编码一个水稻tRNA^His鸟苷转移酶，在水稻中只有一个同源基因。其功能为对tRNA前体5’端进行一个鸟苷化反应。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述AET1的氨基酸序列如下,共519个氨基酸残基。

其中，野生型的AET1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示：

MANSEYEYVKREFELDSLLPPSNWIVVRIDGCHFHRFSKIHTFEKPNDERALRLMNACATSMLEKFPDIVFAYGVSDEYSFVFREETEFYQRRESKILSLCVSYFTSVYVMKWKDFFPNKELKEPPYFDGRVVCYPNLKTIRDYLAWRQVDCHINNQYNTCFWSLVKSGKTEKEAQQALKGTFSKDKNELLSQQFQINYDDEPAIFRKGSCVYRDKVETMVKTDRCGNPIKRTRLVITNANVDIIGPEFWENHPYILREEKCRYENVKKFDINHRLPPCNWTVVRIDICKFEQFSLIHSFDKPNDEAALRLMNASASLMMESFPDIVFGYGFSNEYSFVFQDKTELYQRQESLILSSCTSRFTLFYMMKWKDFFPNKDLVEPPHFEAELLCYPKQKILCDYLSSRQAECHTTNQYSTCFWMLVKSGKSENEAREILKGTLSKDKNELLFQQFHLNYNNEPAVFRKGSCTYRQKVEESADAEGRENTTRERWDVIVAHADMGTEFWRKHPYILRKLDLLG(SEQID NO.:7)。

编码野生型的AET1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示：

ATGGCCAACAGCGAGTACGAGTACGTGAAGAGGGAGTTCGAGCTCGACAGCCTCCTCCCGCCCTCTAATTGGATCGTTGTGCGCATCGACGGCTGCCACTTCCACCGATTCTCCAAGATACATACCTTTGAGAAACCAAATGATGAGCGTGCTTTAAGATTGATGAACGCCTGTGCCACTTCTATGCTCGAAAAGTTCCCAGACATAGTCTTCGCATATGGCGTCAGTGATGAGTACAGTTTTGTTTTTAGAGAGGAAACTGAATTCTATCAAAGACGAGAAAGTAAAATTCTATCTTTATGTGTTTCCTACTTCACTTCTGTGTACGTGATGAAGTGGAAAGATTTCTTTCCTAATAAGGAGTTGAAGGAGCCTCCATATTTTGATGGTCGAGTTGTATGCTATCCAAACTTGAAGACTATCCGTGATTACCTGGCCTGGAGACAAGTGGATTGTCATATAAACAATCAATATAACACCTGCTTCTGGTCGTTAGTGAAGTCTGGGAAAACTGAAAAAGAAGCTCAACAAGCATTGAAGGGGACATTTTCAAAGGACAAGAATGAGTTACTTTCACAACAGTTCCAAATCAATTATGATGATGAACCGGCTATATTCCGAAAAGGGTCTTGCGTTTACCGAGACAAGGTAGAAACAATGGTGAAGACTGATCGTTGTGGAAACCCCATAAAAAGGACACGCTTAGTTATTACAAATGCAAATGTCGATATCATAGGACCCGAGTTTTGGGAAAATCATCCATATATTCTTCGAGAAGAAAAATGTAGGTATGAGAATGTTAAGAAGTTTGACATCAACCATAGGCTTCCACCTTGTAATTGGACTGTCGTTCGCATCGACATTTGTAAATTTGAGCAATTCTCGTTGATCCATTCATTTGACAAGCCAAATGATGAGGCAGCTCTAAGGTTGATGAATGCTTCTGCTTCTTTGATGATGGAGTCATTCCCTGACATTGTCTTTGGCTATGGTTTTAGCAATGAGTACAGTTTTGTGTTCCAGGATAAGACTGAACTATACCAGCGTCAGGAAAGCTTAATCCTTTCATCATGTACCTCACGTTTCACCTTGTTTTACATGATGAAGTGGAAAGATTTTTTCCCCAACAAGGACTTAGTGGAGCCACCGCACTTTGAGGCAGAACTTCTATGTTACCCAAAACAAAAGATACTTTGTGATTATTTGTCATCGAGACAAGCAGAATGCCACACCACCAACCAATACAGCACATGCTTTTGGATGCTAGTGAAATCTGGCAAAAGTGAAAACGAAGCTCGTGAGATATTAAAGGGAACATTATCAAAGGACAAGAACGAGTTGCTTTTCCAGCAATTTCATTTGAATTACAACAATGAACCAGCTGTGTTTCGGAAGGGTTCATGTACTTACCGGCAAAAGGTGGAAGAATCTGCAGACGCAGAGGGTAGAGAAAATACCACAAGAGAACGGTGGGATGTGATTGTGGCACACGCAGACATGGGGACGGAATTTTGGAGAAAGCATCCTTATATTTTAAGAAAATTGGATTTACTAGGCTGA(SEQ ID NO.:8)

突变型的AET1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示(第382位脯氨酸突变为丝氨酸)：

MANSEYEYVKREFELDSLLPPSNWIVVRIDGCHFHRFSKIHTFEKPNDERALRLMNACATSMLEKFPDIVFAYGVSDEYSFVFREETEFYQRRESKILSLCVSYFTSVYVMKWKDFFPNKELKEPPYFDGRVVCYPNLKTIRDYLAWRQVDCHINNQYNTCFWSLVKSGKTEKEAQQALKGTFSKDKNELLSQQFQINYDDEPAIFRKGSCVYRDKVETMVKTDRCGNPIKRTRLVITNANVDIIGPEFWENHPYILREEKCRYENVKKFDINHRLPPCNWTVVRIDICKFEQFSLIHSFDKPNDEAALRLMNASASLMMESFPDIVFGYGFSNEYSFVFQDKTELYQRQESLILSSCTSRFTLFYMMKWKDFFPNKDLVESPHFEAELLCYPKQKILCDYLSSRQAECHTTNQYSTCFWMLVKSGKSENEAREILKGTLSKDKNELLFQQFHLNYNNEPAVFRKGSCTYRQKVEESADAEGRENTTRERWDVIVAHADMGTEFWRKHPYILRKLDLLG(SEQID NO.:1)

编码突变型的AET1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

ATGGCCAACAGCGAGTACGAGTACGTGAAGAGGGAGTTCGAGCTCGACAGCCTCCTCCCGCCCTCTAATTGGATCGTTGTGCGCATCGACGGCTGCCACTTCCACCGATTCTCCAAGATACATACCTTTGAGAAACCAAATGATGAGCGTGCTTTAAGATTGATGAACGCCTGTGCCACTTCTATGCTCGAAAAGTTCCCAGACATAGTCTTCGCATATGGCGTCAGTGATGAGTACAGTTTTGTTTTTAGAGAGGAAACTGAATTCTATCAAAGACGAGAAAGTAAAATTCTATCTTTATGTGTTTCCTACTTCACTTCTGTGTACGTGATGAAGTGGAAAGATTTCTTTCCTAATAAGGAGTTGAAGGAGCCTCCATATTTTGATGGTCGAGTTGTATGCTATCCAAACTTGAAGACTATCCGTGATTACCTGGCCTGGAGACAAGTGGATTGTCATATAAACAATCAATATAACACCTGCTTCTGGTCGTTAGTGAAGTCTGGGAAAACTGAAAAAGAAGCTCAACAAGCATTGAAGGGGACATTTTCAAAGGACAAGAATGAGTTACTTTCACAACAGTTCCAAATCAATTATGATGATGAACCGGCTATATTCCGAAAAGGGTCTTGCGTTTACCGAGACAAGGTAGAAACAATGGTGAAGACTGATCGTTGTGGAAACCCCATAAAAAGGACACGCTTAGTTATTACAAATGCAAATGTCGATATCATAGGACCCGAGTTTTGGGAAAATCATCCATATATTCTTCGAGAAGAAAAATGTAGGTATGAGAATGTTAAGAAGTTTGACATCAACCATAGGCTTCCACCTTGTAATTGGACTGTCGTTCGCATCGACATTTGTAAATTTGAGCAATTCTCGTTGATCCATTCATTTGACAAGCCAAATGATGAGGCAGCTCTAAGGTTGATGAATGCTTCTGCTTCTTTGATGATGGAGTCATTCCCTGACATTGTCTTTGGCTATGGTTTTAGCAATGAGTACAGTTTTGTGTTCCAGGATAAGACTGAACTATACCAGCGTCAGGAAAGCTTAATCCTTTCATCATGTACCTCACGTTTCACCTTGTTTTACATGATGAAGTGGAAAGATTTTTTCCCCAACAAGGACTTAGTGGAGTCACCGCACTTTGAGGCAGAACTTCTATGTTACCCAAAACAAAAGATACTTTGTGATTATTTGTCATCGAGACAAGCAGAATGCCACACCACCAACCAATACAGCACATGCTTTTGGATGCTAGTGAAATCTGGCAAAAGTGAAAACGAAGCTCGTGAGATATTAAAGGGAACATTATCAAAGGACAAGAACGAGTTGCTTTTCCAGCAATTTCATTTGAATTACAACAATGAACCAGCTGTGTTTCGGAAGGGTTCATGTACTTACCGGCAAAAGGTGGAAGAATCTGCAGACGCAGAGGGTAGAGAAAATACCACAAGAGAACGGTGGGATGTGATTGTGGCACACGCAGACATGGGGACGGAATTTTGGAGAAAGCATCCTTATATTTTAAGAAAATTGGATTTACTAGGCTGA(SEQ ID NO.:2)

此外，所述术语“AET1的衍生蛋白”还包括具有结合RACK1A和eIF3h功能的、SEQ IDNO：1或7所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明作用AET1的衍生蛋白还包括其活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与RACK1A和eIF3h结合功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)AET1蛋白或其衍生蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO.:1或7所示的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

发明还提供AET1蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:1或7所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码AET1多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO.:2或8所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。在本发明中，一种优选的编码蛋白AET1的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2或8所示。

代表性的其他物种的AET1同源基因包括(但并不限于)：水稻的AET1基因(OsAET1)、玉米的AET1同源基因(Zm00001d038829和水稻相似性80.1％)、高梁的AET1同源基因(SORBI_3009G211200和水稻相似性80.9％)、小麦的AET1同源基因(A基因组TraesCS3A02G163200和水稻相似性83.9％；B基因组TraesCS3B02G194300和水稻相似性84.1％；D基因组TraesCS3D02G169700和水稻相似性83.3％)、小米的AET1同源基因(SETIT_021773mg和水稻相似性82.1％)、苜蓿的AET1同源基因(MTR_7g115250和水稻相似性90.2％)、拟南芥的AET1同源基因(AT2G31580.1和水稻相似性64.6％)、大白菜的AET1同源基因(Bra022856和水稻相似性56.7％)、山羊草的AET1同源基因(F775_12036和水稻相似性83.3％)。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

应理解，虽然本发明的AET1基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻AET1基因高度同源(如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

RACK1A蛋白和基因

RACK1A基因编码一个WD40重复序列的蛋白，其位于细胞质和核糖体40S小亚基上，行使蛋白翻译的中央调控器作用。另外，还可以在植物抗病信号传导过程发挥重要作用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述RACK1A的氨基酸序列如下,共334个氨基酸残基：

MAGAQESLVLAGVMHGHNDVVTAIATPIDNSPFIVSSSRDKSLLVWDLTNPVQNVGEGAGASEYGVPFRRLTGHSHFVQDVVLSSDGQFALSGSWDGELRLWDLSTGVTTRRFVGHDKDVLSVAFSVDNRQIVSASRDRTIKLWNTLGECKYTIGGDLGGGEGHNGWVSCVRFSPNTFQPTIVSGSWDRTVKVWNLTNCKLRCNLEGHGGYVNAVAVSPDGSLCASGGKDGVTLLWDLAEGKRLYSLDAGSIIHSLCFSPNRYWLCAATQDSIKIWDLESKHIVQDLKPEIPVSKNQMLYCTSLNWSADGSTLYAGYTDGTIRIYKISGFSYAG(SEQ ID NO.:3)。

在一优选实施方式中，所述RACK1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

eIF3h蛋白和基因

eIF3h基因编码翻译起始因子3复合体的H小亚基，在蛋白质上游开放阅读框介导的蛋白质重翻译过程发挥重要作用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述eIF3h基因的氨基酸序列如下,共347个氨基酸残基：

MANPAAAAGPSGGARSFLQAVSTVTEEAPSPLRVVQMEGLAVLKIIKHCEEFAPALVTGQLLGLDVGSVLEVTNCFPFPMREDDEEADADGANYQLEMMRCLREVNVDNNTVGWYQSCLLGSFQTVELIETFMNYQENIRRCVCIVYDPSRSNQGVLALKALKLTDSFMDLYRNNGLTGEKLREKKLSWVDIFEEIPIKVSNSALVSAFMTELEPESPVSQCDFDRLKLSTAPFMERNLEFLIGCMDDLSSEQNKFQYYYRNVSRQQSQQQAWLQKRRQENMARKAAGEEPLPEEDPSNPIFKPIPEPSRLEGYLVTNQISSYCNHINGVAGQNFNRLYLMKALQED(SEQ ID NO.:5)。

在一优选实施方式中，所述eIF3h基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

表达载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5'到3'方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

在本发明中，编码蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如水稻细胞)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

复合物

在本发明中，提供了一种复合物，所述复合物为AET1与RACK1A和eIF3h相结合所形成的三元复合物。

本发明的复合物的分子量≥80kD，较佳地，≥100kD，更佳地，如100kD－150kD，更佳地，130kD－150kD。

本发明的复合物可用于筛选提高植物的抗逆性的药物或化合物。

改良植物的方法

本发明提供了一种改良植物的方法，包括步骤：

调控植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性。

在一优选实施方式中，通过提高植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性，从而改良植物性状(比如提高植物抗逆性)。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，AET1-RACK1A-EIF3H复合体在调控生长素下游响应基因的蛋白翻译效率进而通过生长素信号影响植物生长发育过程中发挥重要作用。

(2)本发明首次发现，下调或敲除AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种会降低复合物的含量，植物会呈现热敏感表型，而当上调AET1与RACK1A和eIF3h的任意一种或多种时，可显著改良植物的性状(比如提高植物的抗逆性)。

(3)本发明首次发现，促进植物中AET1-RACK1A-EIF3H复合体的形成，可显著改良植物性状(比如提高植物抗逆性)。

(4)本发明首次发现，AET1-RACK1A-EIF3H复合体可用于筛选提高植物抗逆性(如抗高温、抗盐、抗逆等)的药物或化合物。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，本发明的实施例中的材料和试剂均为市售产品。

实验方法

1.实验材料和定位克隆

利用籼稻品种特青进行EMS诱变，然后筛选获得生长发育不良的温度敏感突变体aet1(图1A)，再将其与特青回交纯化背景。通过将aet1突变体与粳稻品种嘉花1号杂交产生F₁代，自交得到F₂分离群体用于后续定位。首先通过观察F2代分离情况，发现aet1突变体表型由一个隐性突变基因控制。通过BSA混池法将AET1基因初定位到水稻五号染色体长臂端，分子标记RM3870到RM480之间。然后利用7024株F₂水稻将其精细定位在分子标记35B-C2和RM3809之间。这段基因候选区约23.3kb(图1B)。通过比对网上日本晴参考序列发现该区域含有3个候选基因Os05g0535400，Os05g0535500，Os05g0535600。通过设计引物扩增这三个基因全长基因组序列，比较野生型及突变体序列的差异，发现候选基因Os05g0535500编码区的第1144位碱基由C突变成T，进而导致第382位脯氨酸突变为丝氨酸。而其他候选基因均为发现序列差异。因此，猜测候选基因Os05g0535500可能就是AET1。

RM3870的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGAGTAGATGTAAAGCCAAAGGATGC-3’(SEQ ID NO.:9)

3’端引物序列为：

5’-CATGTCTGAGTATGACGGAGTATTGC-3’(SEQ ID NO.:10)

RM480的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-TGGTACTCACCATGCAAGTAGAACG-3’(SEQ ID NO.:11)

3’端引物序列为：

5’-ATGCTCAAGCATTCTGCAGTTGG-3’(SEQ ID NO.:12)

35B-C2的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGCCTACACTGATCGTC-3’(SEQ ID NO.:13)

3’端引物序列为：

5’-GGAGGAATCGAACCAGAGAAGC-3’(SEQ ID NO.:14)

RM3809的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAATATCTATCGGCCTCTCCAAGC-3’(SEQ ID NO.:15)

3’端引物序列为：

5’-GGAGGAATCGAACCAGAGAAGC-3’(SEQ ID NO.:16)

AET1-SNP的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGTTTCATCTTAGACAAATATTTTTATA-3’(SEQ ID NO.:17)

3’端引物序列为：

5’-CGGAAATAATACAAGAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.:18)

2.转基因互补验证、过表达及互补验证、RNA干扰和CRISPR/Cas9基因编辑

为了进一步确认Os05g0535500就是造成aet1突变体的表型的基因，将来源于野生型特青的Os05g0535500启动子2.5kb、全长cds、500bp 3’UTR构建到pCOMBIA1300互补载体上，通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻种子诱导愈伤组织转化方法进行遗传转化，筛选转基因阳性株系。另外，通过构建了将野生型来源的AET1基因全长cds在CaMV35S启动子及玉米泛素启动子驱动下过表达AET1基因的载体。发明人也设计并构建了人工小分子干扰RNA载体抑制AET1表达的载体。根据课题实验需要，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对目的基因(AET1、RACK1A、eIF3h、OsARF23)分别设计基因敲除载体，用于目的基因的敲除。以上遗传性实验都是通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻种子诱导愈伤转化法进行遗传转化，通过遗传筛选转基因阳性株系，获得稳定T₂代转基因植株并考察表型。

pCOMBIA1300互补载体构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AACAGCTATGACATGATTACGAATTCAAAATC-3’(SEQ ID NO.:19)

3’端引物序列为：

5’-TTAAGAAAATTGGATTTACTAGGCTGATCTAG-3’(SEQ ID NO.:20)

pCOMBIA1301过表达载体构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATCAGCCTAGTAAATCCAATTTTCTTAA-3’(SEQ ID NO.:21)

3’端引物序列为：

5’-TTAAGAAAATTGGATTTACTAGGCTGATCTAGAGTCGACCTGCAGGCATG-3’(SEQ ID NO.:22)

AET1人工小分子干扰RNA载体构建的5’端寡核苷酸引物1序列为：

5’-AGTTCGGTAAACGCAAGACGCTTCAGGAAGTTCAGTTTGA-3’(SEQ ID NO.:23)

AET1人工小分子干扰RNA载体构建的5’端寡核苷酸引物2序列为：

5’-TGAAGCGTCTTGCGTTTACCGAACTGCTGCTGCTACAGCC-3’(SEQ ID NO.:24)

AET1人工小分子干扰RNA载体构建的5’端寡核苷酸引物3序列为：

5’-CTAAGCGACTTCCGTTTACCGAATTCCTGCTGCTAGGCTG-3’(SEQ ID NO.:25)

AET1人工小分子干扰RNA载体构建的5’端寡核苷酸引物4序列为：

5’-AATTCGGTAAACGGAAGTCGCTTAGAGAGGCAAAAGTGAA-3’(SEQ ID NO.:26)

CRISPR/Cas9敲除AET1载体构建的U3片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGCAAGGAGCCTCCATATTTTGA-3’(SEQ ID NO.:27)

CRISPR/Cas9敲除AET1载体构建的U3片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACTCAAAATATGGAGGCTCCT-3’(SEQ ID NO.:28)

CRISPR/Cas9敲除AET1载体构建的U6a片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCCGCGAGTACGAGTACGTGAAG-3’(SEQ ID NO.:29)

CRISPR/Cas9敲除AET1载体构建的U6a片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACCTTCACGTACTCGTACTCG-3’(SEQ ID NO.:30)

CRISPR/Cas9敲除RACK1A载体构建的U3片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGCACCAACCATGGCCGGCGCGC-3’(SEQ ID NO.:31)

CRISPR/Cas9敲除RACK1A载体构建的U3片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACGCGCGCCGGCCATGGTTGG-3’(SEQ ID NO.:32)

CRISPR/Cas9敲除RACK1A载体构建的U6a片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCCGTGTTGGCCGGCGTGATGCA-3’(SEQ ID NO.:33)

CRISPR/Cas9敲除RACK1A载体构建的U6a片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACTGCATCACGCCGGCCAACA-3’(SEQ ID NO.:34)

CRISPR/Cas9敲除eIF3h载体构建的U3片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGCAGGCCGTGTCGACCGTCACCG-3’(SEQ ID NO.:35)

CRISPR/Cas9敲除eIF3h载体构建的U3片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACTATAGCGATCGTAAGGG-3’(SEQ ID NO.:36)

CRISPR/Cas9敲除eIF3h载体构建的U6a片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCCGAGCACCACCCGAGCAGCCA-3’(SEQ ID NO.:37)

CRISPR/Cas9敲除eIF3h载体构建的U6a片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACTGGCTGCTCGGGTGGTGCT-3’(SEQ ID NO.:38)

CRISPR/Cas9敲除OsARF23载体构建的U3片段5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GGCACCCTTACGATCGCTATA-3’(SEQ ID NO.:39)

CRISPR/Cas9敲除OsARF23载体构建的U3片段3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AAACTATAGCGATCGTAAGGG-3’(SEQ ID NO.:40)

3.EMSA,酶活检测及tRNA测序

AET1编码一个tRNA^His的鸟苷转移酶，具有在5’tRNA前体前加一个鸟苷能力。猜测aet1突变体背景下AET1^P382S失去了结合tRNA^His前体的能力或者失去催化酶活反应的能力。因此，在体外用pCOLD原核表达载体转化大肠杆菌，分别纯化了AET1-HIS和AET1^P382S-HIS融合蛋白，纯化好的tRNA^His与重组蛋白进行EMSA凝胶迁移实验，发现两个重组蛋白都可以和tRNA^His前体结合。利用同位素标记的tRNA^His前体与重组蛋白孵育，利用RNase A及CIAP酶解后用玻璃板，磷屏结合后观察结果。和猜测一致，AET1^P382S的确失去了催化鸟苷转移的活性。但其仍可以结合tRNA^His前体。tRNA测序把tRNA从总RNA分离出来，选取大小100bp左右的成熟tRNA条带纯化后测序，测序结果也说明aet1突变体相较野生型鸟苷转移tRNA^His含量降低，高温下aet1突变体降至野生型十分之一左右(图2)。

RNA-EMSA与tRNA-EMSA方法类似，但是探针需要公司体外合成20bp左右带Cy5化学发光基团的RNA链与对应蛋白及冷探针结合，之后用TBE-PAGE及非变性胶电泳，用拍胶仪拍照。

AET-HIS和AET^P382S-HIS蛋白表达载体pCOLD构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCCGGGTACCATGGCCAACAGCGAGTACGA-3’(SEQ ID NO.:41)

AET-HIS和AET^P382S-HIS蛋白表达载体pCOLD构建的3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCCGGTCGACGCCTAGTAAATCCAATTTTC-3’(SEQ ID NO.:42)

tDNA-His全长序列合成：

5’-TAATACGACTCACTATAGACACCGACGACCCTAAGCTCGGGTCCAGAGATGCCGGTGTTGCATCTTAAGAGTGGTGATTTGATGTCGGTG-3’(SEQ ID NO.:43)

4.蛋白互作检测

为了寻找调控AET1及与AET1潜在的互作蛋白，利用酵母双杂交技术进行体外的蛋白筛库及互作验证。利用实验室已有的两个酵母质粒库，筛选到了RACK1A及eIF3h与AET1互作。将这三个基因都构建到pGBKT7及pGADT7载体上，然后分别共转酵母Y2HGOLD感受态菌株。让其在二缺、三缺及四缺的SD培养基上生长3天后根据菌斑的大小及颜色判断这三个基因是否两两互作。基于酵母双杂交的结果，发现AET1,RACK1A及eIF3h三者两两互作，形成一个复合体(图3)。为了进一步确认该结果的可靠性，又利用双分子荧光互补BiFC技术进一步在烟草体内进行验证。分别将这三个基因的编码区构建在YFP的N端及C端，然后对应分成6组，分别转化根癌农杆菌GV3101两两共转化烟草，暗下培养48小时后利用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。激光共聚焦结果显示，AET1,RACK1A及eIF3h两两之间确实能发生互作(图3)。又利用原生质体判断发生互作的具体亚细胞场所。将这三个基因的编码区连接在PA7-YFP载体上，瞬时转化水稻原生质体。利用共定位Marker基因带mCherry荧光，发现这三个蛋白都能和ER共定位Marker定位一致(图4)。另外核糖体S2蛋白也能和ER Marker共定位。这些结果表明，这三个蛋白在核糖体上形成复合体。

酵母双杂交载体pGBKT7-AET1构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCCAACAGCGAGTACGAG-3’(SEQ ID NO.:44)

3’端引物序列为：

5’-TGCGGCCGCTGCAGGTCGTCAGCCTAGTAAATCCAATTT-3’(SEQ ID NO.:45)

酵母双杂交载体pGADT7-AET1构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCCAACAGCGAGTACGAG-3’(SEQ ID NO.:46)

3’端引物序列为：

5’-TGCAGCTCGAGCTCGATGGATTCAGCCTAGTAAATCCAATTT-3’(SEQ ID NO.:47)

酵母双杂交载体pGBKT7-eIF3h构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCGAATCCGGCAGCAGCAGCAGG-3’(SEQ ID NO.:48)

3’端引物序列为：

5’-TGCGGCCGCTGCAGGTCGCTAGTCCTCCTGCAAGGCCTTCATTA-3’(SEQ ID NO.:49)

酵母双杂交载体pGADT7-eIF3h构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCGAATCCGGCAGCAGCAGCAGG-3’(SEQ ID NO.:50)

3’端引物序列为：

5’-TGCAGCTCGAGCTCGATGGATCTAGTCCTCCTGCAAGGCCTTCATTA-3’(SEQ ID NO.:51)

酵母双杂交载体pGBKT7-RACK1A构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCCGGCGCGCAGGAGTCTC-3’(SEQ ID NO.:52)

3’端引物序列为：

5’-TGCGGCCGCTGCAGGTCGCTAGCCGGCGTAGCTGAAACCT-3’(SEQ ID NO.:53)酵母双杂交载体pGADT7-RACK1A构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCCGGCGCGCAGGAGTCTC-3’(SEQ ID NO.:54)

3’端引物序列为：

5’-TGCAGCTCGAGCTCGATGGATCTAGCCGGCGTAGCTGAAACCT-3’(SEQ ID NO.:55)

BiFC载体载体cYFP-AET1构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGACTCTAGGAGCTCGGTACCCGGGATGGCCAACAGCGAGTACGAGT-3’(SEQ ID NO.:56)

3’端引物序列为：

5’-GAACATCGTATGGGTACATACTAGTGCCTAGTAAATCCAATTTTCTTAA-3’(SEQ ID NO.:57)

BiFC载体载体nYFP-AET1构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GATTTCTGAGGAGGATCTTCCCGGGGCCAACAGCGAGTACGAGTACGTG-3’(SEQ ID NO.:58)

3’端引物序列为：

5’-AAGCAGGGCATGCCTGCAGGTCGACTCAGCCTAGTAAATCCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO.:59)

BiFC载体载体cYFP-eIF3h构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGACTCTAGGAGCTCGGTACCCGGGATGGCGAATCCGGCAGCAGCAGCA-3’(SEQ ID NO.:60)

3’端引物序列为：

5’-GAACATCGTATGGGTACATACTAGTGTCCTCCTGCAAGGCCTTCATTAA-3’(SEQ ID NO.:61)

BiFC载体载体nYFP-eIF3h构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GATTTCTGAGGAGGATCTTCCCGGGGCGAATCCGGCAGCAGCAGCAGGG-3’(SEQ ID NO.:62)

3’端引物序列为：

5’-AAGCAGGGCATGCCTGCAGGTCGACCTAGTCCTCCTGCAAGGCCTTCAT-3’(SEQ ID NO.:63)

BiFC载体载体cYFP-RACK1A构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGACTCTAGGAGCTCGGTACCCGGGATGGCCGGCGCGCAGGAGTCTCTGG-3’(SEQ ID NO.:64)

3’端引物序列为：

5’-GAACATCGTATGGGTACATACTAGTGTCCTCCTGCAAGGCCTTCATTAA-3’(SEQ ID NO.:65)

BiFC载体载体nYFP-RACK1A构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GATTTCTGAGGAGGATCTTCCCGGGGCCGGCGCGCAGGAGTCTCTGGTGT-3’(SEQ ID NO.:66)

3’端引物序列为：

5’-AAGCAGGGCATGCCTGCAGGTCGACCTAGCCGGCGTAGCTGAAACCTGAG-3’(SEQ ID NO.:67)

原生质体瞬时转化PA7-AET1-YFP构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-TTACGAACGATACTCGAGGTCGACATGGCCAACAGCGAGTACGAGT-3’(SEQ ID NO.:68)

3’端引物序列为：

5’-CACCATACTAGTGGATCCCCCGGGGCCTAGTAAATCCAATTTTCTT-3’(SEQ ID NO.:69)

原生质体瞬时转化PA7-RACK1A-YFP构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-TTACGAACGATACTCGAGGTCGACATGGCCGGCGCGCAGGAGTCTC-3’(SEQ ID NO.:70)

3’端引物序列为：

5’-CACCATACTAGTGGATCCCCCGGGGCCGGCGTAGCTGAAACCTGAG-3’(SEQ ID NO.:71)

原生质体瞬时转化PA7-eIF3h-YFP构建的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-TTACGAACGATACTCGAGGTCGACATGGCGAATCCGGCAGCAGCAG-3’(SEQ ID NO.:72)

3’端引物序列为：

5’-CACCATACTAGTGGATCCCCCGGGGTCCTCCTGCAAGGCCTTCATT-3’(SEQ ID NO.:73)

5.RNA免疫共沉淀

将野生型与aet1突变体样品经实验室条件高温处理后使用RNA免疫共沉淀试剂盒对样品处理，将AET1抗体与带有磁性的小珠交联后与样品孵育，孵育后纯化磁性小珠，并用蛋白酶K降解抗体及杂质蛋白，纯化RNA后可以进行建库测序或者反转录验证目标RNA富集含量。

6.细胞学检测

aet1突变体和野生型特青相比，在海南冬季种植没有明显差异，在上海夏季种植有明显的生长发育障碍表型。利用半薄切片及X-射线显微镜研究该突变发生的细胞学基础。选取上海大田明显生长差异的叶片及切小的茎段固定在FAA，用于石蜡包埋半薄切片观察叶片及茎部横切统计横切面薄壁细胞的大小及数目，据此发现相比起野生型特青，aet1突变体表现出细胞数量减少，细胞异常增殖行为。又对野生型与aet1突变体在不同温度处理后根尖细胞进行细胞核提取，并用DAPI染色，再用流式细胞仪分析每个样品的细胞倍性，以此判断特青及aet1突变体样品细胞分裂速率的差异。

7.核糖体蔗糖梯度实验

为了更精确了解AET1-RACK1A-eIF3h复合体是如何调控蛋白质翻译，特别是翻译重起始过程。将特青与aet1突变体在不同温度处理下取样，进行核糖体萃取后加入含有20％-60％蔗糖溶液，用高速离心机分离不同核糖体组分，再进行RNA纯化后进行qRT-PCR。发明人比较OsARF23,OsARF19的uORF及mORF在不同样品中的Ct值，发现在核糖体含量偏高的层数中，正在翻译的OsARF19的mORF及OsARF23的mORF在aet1突变体明显减少；而正在翻译的OsARF19及OsARF23的uORF部分在aet1突变体有所上升，表明aet1突变体可能一方面由于上调OsARF基因的uORF翻译量及下调OsARF基因的mORF翻译量共同造成OsARF蛋白的翻译效率降低(图7、8)。蛋白Western检测也展示出相同的结果。

8.非生物胁迫处理及激素处理

对于温度处理，先把各个样品浸种，催芽，待正常温度25摄氏度生长7天后，对应进行温度处理，而对于盐、旱处理则需要将小苗正常条件下生长14天后进行7天处理(盐处理条件：NaCl 125mM)(干旱处理条件：PEG 4000 20％)。处理后恢复7天，观察表型。生长素及L-Kyn处理则利用1/2MS固体培养基，灭菌后将其对应浓度加入培养基，凝固后待用。种子样品需去壳后消毒，播在固体培养基上，过2周后观察表型，进行相关株高等统计。

实施例1通过对水稻籼稻品种特青(TQ)进行EMS诱变，获得了一个对环境温度非常敏感的突变体aet1，并克隆了控制其表型的AET1基因。

aet1突变体在上海与海南有着非常明显生长差异；上海夏季(气温高)种植时表现出株高变矮、育性降低、叶片卷曲等多种植株生长素缺陷表型；在海南冬季(气温低)种植时则表现出与野生型生长没有明显差异。由此可见，aet1突变体是一个研究水稻对不同地区环境温度适应性的好材料(图1A)。利用aet1突变体和粳稻品种嘉花1号进行杂交，得到的F₁代种子自交一代得到F₂分离群体，利用BSA法及图位克隆等方法成功定位并克隆了候选基因AET1(图1B)。通过序列比对发现来自aet1突变体背景的AET1等位基因第1144位核苷酸C突变为T，从而导致编码蛋白的第382位脯氨酸突变为丝氨酸。构建全长转基因互补材料及过表达质粒分别利用农杆菌转化aet1突变体愈伤组织，得到的T₂代转基因植株在上海生长能完全恢复aet1突变体在上海生长劣势的表型，表明该候选基因的突变导致了aet1突变体在上海夏季高温下生长受限的表型(图1C)。通过不同温度条件处理TQ及aet1突变体发现aet1突变体受热敏感(图1D和1E)。另外，在野生型TQ背景下敲除AET1可以使水稻在上海夏季生长明显受到抑制(图1F)。对aet1突变体进行多种非生物胁迫处理，发现aet1突变体对不同光周期不敏感(图1G)，其他非生物胁迫处理(NaCl,PEG模拟干旱)确认其相较于野生型，敏感性增加(图1H和1I)。组织学观察发现，TQ及aet1突变体在叶片横切面上有着明显的组织学差异(图1J)。因此，AET1基因是一个对水稻环境适应性非常重要的遗传改良位点。

实施例2 AET1具有tRNA^His鸟苷转移酶活性，并且对tRNA内稳态及蛋白质翻译起着重要作用。

通过体外纯化正常及突变形式的AET1蛋白，进行tRNA凝胶迁移实验(图2A)及酶活实验(图2B)，结果表明两种形式蛋白都能结合tRNA^His前体，但是只有正常形式能够发挥酶活功能。对不同温度下野生型及突变体进行tRNA测序后发现，tRNA^His在野生型及突变体有显著变化，突变体tRNA^His含量在常温及高温均高于野生型(图2C)，而鸟苷化反应却显著低于野生型(图2D)，同时，影响蛋白翻译起始的tRNA^Met含量在高温条件下突变体显著少于野生型(图2E)。对所有20种tRNA含量分析发现野生型在常温及高温下tRNA内稳态保持一定水平，各tRNA含量保持稳定；而突变体tRNA内稳态在常温已经剧烈变化，高温加剧这种变化。这些数据表明AET1对tRNA^His前体的鸟苷化反应对于蛋白质翻译及tRNA内稳态有着重要作用(图2F)。

实施例3 AET1与RACK1A及eIF3h形成复合体，共同调控水稻蛋白翻译重起始过程。

通过酵母双杂交筛库及互作验证发现AET1与RACK1A及eIF3h蛋白均能发生相互作用(图3A)。进一步通过荧光双分子互补实验等方法发现AET1、RACK1A、eIF3h中的任意两种蛋白均可发生相互作用(图3B，3C)。通过热处理野生型及aet1突变体的qRT-PCR试验结果表明无论在野生型还是突变体，这三个基因都受热诱导上调(图3D)。利用水稻原生质体对三个基因进行瞬时转化发现三个蛋白本身也都定位于ER上(图4A)，同时与一个核糖体蛋白S2也能很好的共定位(图4B)。上述结果表明三者互作部位发生在ER上，并且很可能位于核糖体上，并据此推测，这三个基因在水稻也可能发挥类似的功能。

实施例4 AET1与AET1^P382S可以体内体外与OsARF mRNAs结合，而RACK1A及eIF3h无法与OsARF mRNAs结合。

发明人制备了AET1蛋白的多克隆抗体，并且验证了多克隆抗体的质量。在实验室利用高温处理野生型与突变体并利用RNA免疫共沉淀方法及RNA测序得到能够与AET1互作的RNA序列。通过RNA-seq及qRT-PCR验证，发现AET1可以富集生长素响应基因OsARF mRNAs，包括uORF及mORF区域，而遍在表达的OsActin RNA则没有特异性富集(图5A-5E)。在体外纯化AET1、AET1^P382S、RACK1A及eIF3h蛋白，设计含有Cy5的RNA探针，发现在体外AET1，AET1^P382S都可以结合OsARF mRNAs,而RACK1A及eIF3h则不结合(图5F)。由此推测RACK1A通过招募eIF3h及AET1形成复合体，而结合是通过AET1介导的对mRNA的结合与识别，而eIF3h通过调控蛋白翻译重起始发挥功能。

实施例5 RACK1A及eIF3h敲除植株表现出生长迟缓等表型，而OsARF23敲除植株也表现出热敏感表型。

发明人通过CRISPR/Cas9技术在特青分别敲除了RACK1A及eIF3h，在上海大田种植发现这两个基因的敲除突变体表现出明显的生长迟缓，与aet1突变体在上海的表型类似，统计株高有显著性差异，测序结果表明这两个突变体都有明显的序列编辑(图6A-图6F)。与此同时发明人也构建了OsARF23敲除植株，通过实验室条件热处理发现高温处理条件下OsARF23敲除植株相比野生型有明显热敏感表型(图6G-图6I)。以上结果表明，从遗传角度阐述了AET1-RACK1A-eIF3h通过形成复合体，对含有uORF结构的基因，例如OsARF23等进行蛋白翻译过程的调控。

实施例6野生型与aet1突变体、RACK1A及eIF3h敲除植株的核糖体状态没有明显变化，OsARF基因翻译效率在这些突变体及敲除植株发生明显下调。

发明人利用核糖体梯度离心分离实验室条件下野生型与aet1突变体核糖体组分，结果发现野生型与aet1突变体无论在常温还是高温条件下蛋白质翻译状态变化不大(图7A)。通过对核糖体分布的第8到第14层每一层纯化RNA后进行qRT-PCR后发现OsARF mRNAs在突变体分布减少，热激条件下OsARF mRNAs的mORF含量在突变体发生明显下调(图7B-7C)。该结果说明aet1突变体对OsARF23、OsARF19的翻译过程有明显抑制(图7)。而对于上海大田条件下的野生型及三个基因突变体做蔗糖梯度离心后发现，这三个互作蛋白任一组分失去功能对核糖体翻译状态改变不大(图8A-8C)，而qRT-PCR结果同样揭示三个基因的突变体中OsARF mRNAs的含量在核糖体梯度离心分离的不同层里明显少于其在野生型的含量(图8D-8O)。以上结果证实了AET1-RACK1A-eIF3h复合体通过影响以OsARF23，19为例的基因翻译重起始过程可能参与生长素信号途径。

实施例7 aet1突变体是一个生长素不敏感突变体，表明AET1参与生长素信号传导过程，调控植物生长发育。

发明人通过生长素处理及生长素合成基因TAA1抑制剂L-Kyn处理后发现，相较于野生型，生长素处理对于aet1突变体表现不敏感表型(图9A-B)，而生长素抑制剂L-Kyn处理表现出超敏感表型(图9C)。利用DR5-GUS转基因植株与野生型特青及aet1突变体杂交，得到的F₂代植株在不同温度处理下发现aet1突变体GUS信号明显减弱(图9D-9E)，表明在突变体中生长素信号下游响应的确出现问题。测定不同温度处理下野生型与aet1突变体的样品检测内源生长素含量，发现突变体内源生长素含量明显低于野生型(图9F)。此外，利用流式细胞仪检测野生型与突变体在不同温度下细胞周期比例，发现aet1突变体细胞分裂速率减慢(图10A-10B)。对野生型与aet1突变体的细胞周期基因及生长素信号相关基因qRT-PCR结果发现，aet1突变体在高温处理条件下这些基因发生明显下调(图10C-10D)，该实验结果也验证这个结论。以上数据表明，生长素信号传导过程在aet1突变体中的确出现障碍，与前面的研究结果一致。

讨论

本发明通过对水稻籼稻品种特青(Teqing)进行EMS诱变，获得了一个在夏季上海明显生长发育不良、在冬季海南生长正常的、对环境温度敏感的突变体，命名为aet1(adaptaion to envioronmental temperature 1)。据此，利用aet1突变体及粳稻品种嘉花1号的F₂分离群体结合图位克隆的方法成功定位及克隆了控制aet1表型的AET1基因。通过测序，发现aet1突变体中AET1基因的第1144位的核苷酸C突变成T，进而导致蛋白编码区第382位脯氨酸突变成丝氨酸。通过构建转基因遗传互补实验，确认了AET1^P382S突变导致了aet1的表型。AET1编码一个tRNA^His鸟苷转移酶。通过体外tRNA凝胶迁移实验及体外酶活实验首次证实水稻AET1蛋白具体tRNA^His前体的结合活性，同时具有对tRNA^His前体5’端进行鸟苷加工的活性。而发生突变的AET1^P382S蛋白基本失去了体外鸟苷转移酶活性。还对不同温度下生长条件的野生型及突变体进行tRNA测序，发现体内tRNA^His鸟苷化程度在突变体显著下降，确认突变体tRNA^His鸟苷化程度减弱导致突变体tRNA谱发生剧烈变化，进而导致蛋白翻译效率下降。通过酵母双杂交的方法筛选到了两个与AET1互作的蛋白，分别是真核翻译起始因子3的h亚基(eIF3h)及核糖体脚手架蛋白(RACK1A)。通过酵母双杂交及双分子荧光互补等技术在体内与体外证明这三个蛋白可以相互作用形成复合体共同调控蛋白翻译起始及含有uORF结构的蛋白翻译重起始过程。通过RNA免疫共沉淀及体外RNA凝胶迁移实验发现这个复合体是通过AET1结合mRNA并且调控蛋白翻译重起始过程。此外，通过在野生型背景下分别敲除eIF3h及RACK1A都可以发现在夏季上海大田条件下它们的基因敲除植株发生明显的株高变矮，生长发育减缓，植株育性减弱等表型，与aet1突变体表型类似。通过核糖体图谱等方法发现部分含有uORF结构的生长素响应基因如OsARF19及OsARF23的翻译在AET1、eIF3h及RACK1A这三个基因突变体都表现出翻译减弱趋势。而通过对野生型及aet1突变体进行生长素处理、生长素信号DR5染色、内源生长素测定等方法确定aet1是一个生长素不敏感突变体，而生长素下游响应基因OsARF23的敲除植株相较野生型也表现出温度敏感的表型。

这些结果表明，AET1-RACK1A-eIF3h复合体在调控生长素下游响应基因的蛋白翻译重起始和翻译效率进而通过生长素信号影响植物生长发育过程中发挥重要作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> AET1-RACK1A-eIF3h复合物在植物环境温度适应性中的应用

<130> P2018-1730

<160> 73

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Asn Ser Glu Tyr Glu Tyr Val Lys Arg Glu Phe Glu Leu Asp

1 5 10 15

Ser Leu Leu Pro Pro Ser Asn Trp Ile Val Val Arg Ile Asp Gly Cys

20 25 30

His Phe His Arg Phe Ser Lys Ile His Thr Phe Glu Lys Pro Asn Asp

35 40 45

Glu Arg Ala Leu Arg Leu Met Asn Ala Cys Ala Thr Ser Met Leu Glu

50 55 60

Lys Phe Pro Asp Ile Val Phe Ala Tyr Gly Val Ser Asp Glu Tyr Ser

65 70 75 80

Phe Val Phe Arg Glu Glu Thr Glu Phe Tyr Gln Arg Arg Glu Ser Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Leu Cys Val Ser Tyr Phe Thr Ser Val Tyr Val Met Lys

100 105 110

Trp Lys Asp Phe Phe Pro Asn Lys Glu Leu Lys Glu Pro Pro Tyr Phe

115 120 125

Asp Gly Arg Val Val Cys Tyr Pro Asn Leu Lys Thr Ile Arg Asp Tyr

130 135 140

Leu Ala Trp Arg Gln Val Asp Cys His Ile Asn Asn Gln Tyr Asn Thr

145 150 155 160

Cys Phe Trp Ser Leu Val Lys Ser Gly Lys Thr Glu Lys Glu Ala Gln

165 170 175

Gln Ala Leu Lys Gly Thr Phe Ser Lys Asp Lys Asn Glu Leu Leu Ser

180 185 190

Gln Gln Phe Gln Ile Asn Tyr Asp Asp Glu Pro Ala Ile Phe Arg Lys

195 200 205

Gly Ser Cys Val Tyr Arg Asp Lys Val Glu Thr Met Val Lys Thr Asp

210 215 220

Arg Cys Gly Asn Pro Ile Lys Arg Thr Arg Leu Val Ile Thr Asn Ala

225 230 235 240

Asn Val Asp Ile Ile Gly Pro Glu Phe Trp Glu Asn His Pro Tyr Ile

245 250 255

Leu Arg Glu Glu Lys Cys Arg Tyr Glu Asn Val Lys Lys Phe Asp Ile

260 265 270

Asn His Arg Leu Pro Pro Cys Asn Trp Thr Val Val Arg Ile Asp Ile

275 280 285

Cys Lys Phe Glu Gln Phe Ser Leu Ile His Ser Phe Asp Lys Pro Asn

290 295 300

Asp Glu Ala Ala Leu Arg Leu Met Asn Ala Ser Ala Ser Leu Met Met

305 310 315 320

Glu Ser Phe Pro Asp Ile Val Phe Gly Tyr Gly Phe Ser Asn Glu Tyr

325 330 335

Ser Phe Val Phe Gln Asp Lys Thr Glu Leu Tyr Gln Arg Gln Glu Ser

340 345 350

Leu Ile Leu Ser Ser Cys Thr Ser Arg Phe Thr Leu Phe Tyr Met Met

355 360 365

Lys Trp Lys Asp Phe Phe Pro Asn Lys Asp Leu Val Glu Ser Pro His

370 375 380

Phe Glu Ala Glu Leu Leu Cys Tyr Pro Lys Gln Lys Ile Leu Cys Asp

385 390 395 400

Tyr Leu Ser Ser Arg Gln Ala Glu Cys His Thr Thr Asn Gln Tyr Ser

405 410 415

Thr Cys Phe Trp Met Leu Val Lys Ser Gly Lys Ser Glu Asn Glu Ala

420 425 430

Arg Glu Ile Leu Lys Gly Thr Leu Ser Lys Asp Lys Asn Glu Leu Leu

435 440 445

Phe Gln Gln Phe His Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Pro Ala Val Phe Arg

450 455 460

Lys Gly Ser Cys Thr Tyr Arg Gln Lys Val Glu Glu Ser Ala Asp Ala

465 470 475 480

Glu Gly Arg Glu Asn Thr Thr Arg Glu Arg Trp Asp Val Ile Val Ala

485 490 495

His Ala Asp Met Gly Thr Glu Phe Trp Arg Lys His Pro Tyr Ile Leu

500 505 510

Arg Lys Leu Asp Leu Leu Gly

515

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggccaaca gcgagtacga gtacgtgaag agggagttcg agctcgacag cctcctcccg 60

ccctctaatt ggatcgttgt gcgcatcgac ggctgccact tccaccgatt ctccaagata 120

catacctttg agaaaccaaa tgatgagcgt gctttaagat tgatgaacgc ctgtgccact 180

tctatgctcg aaaagttccc agacatagtc ttcgcatatg gcgtcagtga tgagtacagt 240

tttgttttta gagaggaaac tgaattctat caaagacgag aaagtaaaat tctatcttta 300

tgtgtttcct acttcacttc tgtgtacgtg atgaagtgga aagatttctt tcctaataag 360

gagttgaagg agcctccata ttttgatggt cgagttgtat gctatccaaa cttgaagact 420

atccgtgatt acctggcctg gagacaagtg gattgtcata taaacaatca atataacacc 480

tgcttctggt cgttagtgaa gtctgggaaa actgaaaaag aagctcaaca agcattgaag 540

gggacatttt caaaggacaa gaatgagtta ctttcacaac agttccaaat caattatgat 600

gatgaaccgg ctatattccg aaaagggtct tgcgtttacc gagacaaggt agaaacaatg 660

gtgaagactg atcgttgtgg aaaccccata aaaaggacac gcttagttat tacaaatgca 720

aatgtcgata tcataggacc cgagttttgg gaaaatcatc catatattct tcgagaagaa 780

aaatgtaggt atgagaatgt taagaagttt gacatcaacc ataggcttcc accttgtaat 840

tggactgtcg ttcgcatcga catttgtaaa tttgagcaat tctcgttgat ccattcattt 900

gacaagccaa atgatgaggc agctctaagg ttgatgaatg cttctgcttc tttgatgatg 960

gagtcattcc ctgacattgt ctttggctat ggttttagca atgagtacag ttttgtgttc 1020

caggataaga ctgaactata ccagcgtcag gaaagcttaa tcctttcatc atgtacctca 1080

cgtttcacct tgttttacat gatgaagtgg aaagattttt tccccaacaa ggacttagtg 1140

gagtcaccgc actttgaggc agaacttcta tgttacccaa aacaaaagat actttgtgat 1200

tatttgtcat cgagacaagc agaatgccac accaccaacc aatacagcac atgcttttgg 1260

atgctagtga aatctggcaa aagtgaaaac gaagctcgtg agatattaaa gggaacatta 1320

tcaaaggaca agaacgagtt gcttttccag caatttcatt tgaattacaa caatgaacca 1380

gctgtgtttc ggaagggttc atgtacttac cggcaaaagg tggaagaatc tgcagacgca 1440

gagggtagag aaaataccac aagagaacgg tgggatgtga ttgtggcaca cgcagacatg 1500

gggacggaat tttggagaaa gcatccttat attttaagaa aattggattt actaggctga 1560

<210> 3

<211> 334

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Ala Gly Ala Gln Glu Ser Leu Val Leu Ala Gly Val Met His Gly

1 5 10 15

His Asn Asp Val Val Thr Ala Ile Ala Thr Pro Ile Asp Asn Ser Pro

20 25 30

Phe Ile Val Ser Ser Ser Arg Asp Lys Ser Leu Leu Val Trp Asp Leu

35 40 45

Thr Asn Pro Val Gln Asn Val Gly Glu Gly Ala Gly Ala Ser Glu Tyr

50 55 60

Gly Val Pro Phe Arg Arg Leu Thr Gly His Ser His Phe Val Gln Asp

65 70 75 80

Val Val Leu Ser Ser Asp Gly Gln Phe Ala Leu Ser Gly Ser Trp Asp

85 90 95

Gly Glu Leu Arg Leu Trp Asp Leu Ser Thr Gly Val Thr Thr Arg Arg

100 105 110

Phe Val Gly His Asp Lys Asp Val Leu Ser Val Ala Phe Ser Val Asp

115 120 125

Asn Arg Gln Ile Val Ser Ala Ser Arg Asp Arg Thr Ile Lys Leu Trp

130 135 140

Asn Thr Leu Gly Glu Cys Lys Tyr Thr Ile Gly Gly Asp Leu Gly Gly

145 150 155 160

Gly Glu Gly His Asn Gly Trp Val Ser Cys Val Arg Phe Ser Pro Asn

165 170 175

Thr Phe Gln Pro Thr Ile Val Ser Gly Ser Trp Asp Arg Thr Val Lys

180 185 190

Val Trp Asn Leu Thr Asn Cys Lys Leu Arg Cys Asn Leu Glu Gly His

195 200 205

Gly Gly Tyr Val Asn Ala Val Ala Val Ser Pro Asp Gly Ser Leu Cys

210 215 220

Ala Ser Gly Gly Lys Asp Gly Val Thr Leu Leu Trp Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Gly Lys Arg Leu Tyr Ser Leu Asp Ala Gly Ser Ile Ile His Ser Leu

245 250 255

Cys Phe Ser Pro Asn Arg Tyr Trp Leu Cys Ala Ala Thr Gln Asp Ser

260 265 270

Ile Lys Ile Trp Asp Leu Glu Ser Lys His Ile Val Gln Asp Leu Lys

275 280 285

Pro Glu Ile Pro Val Ser Lys Asn Gln Met Leu Tyr Cys Thr Ser Leu

290 295 300

Asn Trp Ser Ala Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Gly Tyr Thr Asp Gly

305 310 315 320

Thr Ile Arg Ile Tyr Lys Ile Ser Gly Phe Ser Tyr Ala Gly

325 330

<210> 4

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

atggccggcg cgcaggagtc tctggtgttg gccggcgtga tgcacggcca caacgacgtg 60

gtgacggcca tcgcgacccc catcgacaac tcgccgttca tcgtctcctc ctcccgcgac 120

aagtcgctgc tggtgtggga cctcaccaac cccgtccaga acgtcggcga gggcgccggc 180

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gtcgtcctca gctccgacgg ccagttcgcg ctctctggct cctgggacgg cgagctccgc 300

ctctgggacc tctccaccgg ggtcaccacc cgccgcttcg tcggccacga caaagacgtc 360

ctctccgtcg ccttctccgt cgacaaccgc cagatcgtct ccgcctcccg cgaccgcacc 420

atcaagctgt ggaacaccct cggcgagtgc aagtacacca tcggcggcga cctcggcggc 480

ggcgagggcc acaacgggtg ggtctcctgc gtccgcttct cccccaacac cttccagcca 540

accatcgtct ctggctcctg ggaccgcacc gtcaaggtgt ggaacctcac gaactgcaag 600

ctgcgctgca acctcgaggg ccatggcggc tacgtcaacg ctgtcgcggt cagccccgac 660

ggttctctgt gcgcgtccgg tggcaaagat ggcgttaccc tgctgtggga cttggctgag 720

ggcaagaggc tgtactcgct tgacgcgggt tccatcattc actcgctctg cttctcgccc 780

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aagcacattg tgcaggacct taagcccgag atccctgtct ccaagaacca gatgctctac 900

tgcacaagct tgaactggag cgcagatgga agcaccctct atgctggtta cacagatgga 960

accatcagga tctacaagat ctcaggtttc agctacgccg gctag 1005

<210> 5

<211> 347

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

Met Ala Asn Pro Ala Ala Ala Ala Gly Pro Ser Gly Gly Ala Arg Ser

1 5 10 15

Phe Leu Gln Ala Val Ser Thr Val Thr Glu Glu Ala Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Arg Val Val Gln Met Glu Gly Leu Ala Val Leu Lys Ile Ile Lys His

35 40 45

Cys Glu Glu Phe Ala Pro Ala Leu Val Thr Gly Gln Leu Leu Gly Leu

50 55 60

Asp Val Gly Ser Val Leu Glu Val Thr Asn Cys Phe Pro Phe Pro Met

65 70 75 80

Arg Glu Asp Asp Glu Glu Ala Asp Ala Asp Gly Ala Asn Tyr Gln Leu

85 90 95

Glu Met Met Arg Cys Leu Arg Glu Val Asn Val Asp Asn Asn Thr Val

100 105 110

Gly Trp Tyr Gln Ser Cys Leu Leu Gly Ser Phe Gln Thr Val Glu Leu

115 120 125

Ile Glu Thr Phe Met Asn Tyr Gln Glu Asn Ile Arg Arg Cys Val Cys

130 135 140

Ile Val Tyr Asp Pro Ser Arg Ser Asn Gln Gly Val Leu Ala Leu Lys

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Thr Asp Ser Phe Met Asp Leu Tyr Arg Asn Asn Gly

165 170 175

Leu Thr Gly Glu Lys Leu Arg Glu Lys Lys Leu Ser Trp Val Asp Ile

180 185 190

Phe Glu Glu Ile Pro Ile Lys Val Ser Asn Ser Ala Leu Val Ser Ala

195 200 205

Phe Met Thr Glu Leu Glu Pro Glu Ser Pro Val Ser Gln Cys Asp Phe

210 215 220

Asp Arg Leu Lys Leu Ser Thr Ala Pro Phe Met Glu Arg Asn Leu Glu

225 230 235 240

Phe Leu Ile Gly Cys Met Asp Asp Leu Ser Ser Glu Gln Asn Lys Phe

245 250 255

Gln Tyr Tyr Tyr Arg Asn Val Ser Arg Gln Gln Ser Gln Gln Gln Ala

260 265 270

Trp Leu Gln Lys Arg Arg Gln Glu Asn Met Ala Arg Lys Ala Ala Gly

275 280 285

Glu Glu Pro Leu Pro Glu Glu Asp Pro Ser Asn Pro Ile Phe Lys Pro

290 295 300

Ile Pro Glu Pro Ser Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Val Thr Asn Gln Ile

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Cys Asn His Ile Asn Gly Val Ala Gly Gln Asn Phe Asn

325 330 335

Arg Leu Tyr Leu Met Lys Ala Leu Gln Glu Asp

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

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gtgtcgaccg tcaccgagga ggcgccgtcg ccgctccgcg tcgtgcagat ggagggcctg 120

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tgcttgaggg aggttaatgt tgacaataac actgttggat ggtatcaatc ttgcttgctt 360

ggatcttttc agactgtgga actgattgaa acgtttatga actatcagga gaatatccgg 420

agatgtgtgt gcatcgttta tgacccatct aggtcaaatc agggggttct agctctcaag 480

gccttgaaac tcacagattc attcatggat ctttaccgta acaatggttt aactggagag 540

aagttaagag agaagaaatt gtcatgggtt gatatttttg aggagatacc gattaaagtt 600

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aatatggcaa gaaaagctgc tggagaggag ccattgccag aagaagaccc atccaatccc 900

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tccagttact gcaaccatat taatggggtt gctggtcaga atttcaacag gctctactta 1020

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

Met Ala Asn Ser Glu Tyr Glu Tyr Val Lys Arg Glu Phe Glu Leu Asp

1 5 10 15

Ser Leu Leu Pro Pro Ser Asn Trp Ile Val Val Arg Ile Asp Gly Cys

20 25 30

His Phe His Arg Phe Ser Lys Ile His Thr Phe Glu Lys Pro Asn Asp

35 40 45

Glu Arg Ala Leu Arg Leu Met Asn Ala Cys Ala Thr Ser Met Leu Glu

50 55 60

Lys Phe Pro Asp Ile Val Phe Ala Tyr Gly Val Ser Asp Glu Tyr Ser

65 70 75 80

Phe Val Phe Arg Glu Glu Thr Glu Phe Tyr Gln Arg Arg Glu Ser Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Leu Cys Val Ser Tyr Phe Thr Ser Val Tyr Val Met Lys

100 105 110

Trp Lys Asp Phe Phe Pro Asn Lys Glu Leu Lys Glu Pro Pro Tyr Phe

115 120 125

Asp Gly Arg Val Val Cys Tyr Pro Asn Leu Lys Thr Ile Arg Asp Tyr

130 135 140

Leu Ala Trp Arg Gln Val Asp Cys His Ile Asn Asn Gln Tyr Asn Thr

145 150 155 160

Cys Phe Trp Ser Leu Val Lys Ser Gly Lys Thr Glu Lys Glu Ala Gln

165 170 175

Gln Ala Leu Lys Gly Thr Phe Ser Lys Asp Lys Asn Glu Leu Leu Ser

180 185 190

Gln Gln Phe Gln Ile Asn Tyr Asp Asp Glu Pro Ala Ile Phe Arg Lys

195 200 205

Gly Ser Cys Val Tyr Arg Asp Lys Val Glu Thr Met Val Lys Thr Asp

210 215 220

Arg Cys Gly Asn Pro Ile Lys Arg Thr Arg Leu Val Ile Thr Asn Ala

225 230 235 240

Asn Val Asp Ile Ile Gly Pro Glu Phe Trp Glu Asn His Pro Tyr Ile

245 250 255

Leu Arg Glu Glu Lys Cys Arg Tyr Glu Asn Val Lys Lys Phe Asp Ile

260 265 270

Asn His Arg Leu Pro Pro Cys Asn Trp Thr Val Val Arg Ile Asp Ile

275 280 285

Cys Lys Phe Glu Gln Phe Ser Leu Ile His Ser Phe Asp Lys Pro Asn

290 295 300

Asp Glu Ala Ala Leu Arg Leu Met Asn Ala Ser Ala Ser Leu Met Met

305 310 315 320

Glu Ser Phe Pro Asp Ile Val Phe Gly Tyr Gly Phe Ser Asn Glu Tyr

325 330 335

Ser Phe Val Phe Gln Asp Lys Thr Glu Leu Tyr Gln Arg Gln Glu Ser

340 345 350

Leu Ile Leu Ser Ser Cys Thr Ser Arg Phe Thr Leu Phe Tyr Met Met

355 360 365

Lys Trp Lys Asp Phe Phe Pro Asn Lys Asp Leu Val Glu Pro Pro His

370 375 380

Phe Glu Ala Glu Leu Leu Cys Tyr Pro Lys Gln Lys Ile Leu Cys Asp

385 390 395 400

Tyr Leu Ser Ser Arg Gln Ala Glu Cys His Thr Thr Asn Gln Tyr Ser

405 410 415

Thr Cys Phe Trp Met Leu Val Lys Ser Gly Lys Ser Glu Asn Glu Ala

420 425 430

Arg Glu Ile Leu Lys Gly Thr Leu Ser Lys Asp Lys Asn Glu Leu Leu

435 440 445

Phe Gln Gln Phe His Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Pro Ala Val Phe Arg

450 455 460

Lys Gly Ser Cys Thr Tyr Arg Gln Lys Val Glu Glu Ser Ala Asp Ala

465 470 475 480

Glu Gly Arg Glu Asn Thr Thr Arg Glu Arg Trp Asp Val Ile Val Ala

485 490 495

His Ala Asp Met Gly Thr Glu Phe Trp Arg Lys His Pro Tyr Ile Leu

500 505 510

Arg Lys Leu Asp Leu Leu Gly

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

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catacctttg agaaaccaaa tgatgagcgt gctttaagat tgatgaacgc ctgtgccact 180

tctatgctcg aaaagttccc agacatagtc ttcgcatatg gcgtcagtga tgagtacagt 240

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gatgaaccgg ctatattccg aaaagggtct tgcgtttacc gagacaaggt agaaacaatg 660

gtgaagactg atcgttgtgg aaaccccata aaaaggacac gcttagttat tacaaatgca 720

aatgtcgata tcataggacc cgagttttgg gaaaatcatc catatattct tcgagaagaa 780

aaatgtaggt atgagaatgt taagaagttt gacatcaacc ataggcttcc accttgtaat 840

tggactgtcg ttcgcatcga catttgtaaa tttgagcaat tctcgttgat ccattcattt 900

gacaagccaa atgatgaggc agctctaagg ttgatgaatg cttctgcttc tttgatgatg 960

gagtcattcc ctgacattgt ctttggctat ggttttagca atgagtacag ttttgtgttc 1020

caggataaga ctgaactata ccagcgtcag gaaagcttaa tcctttcatc atgtacctca 1080

cgtttcacct tgttttacat gatgaagtgg aaagattttt tccccaacaa ggacttagtg 1140

gagccaccgc actttgaggc agaacttcta tgttacccaa aacaaaagat actttgtgat 1200

tatttgtcat cgagacaagc agaatgccac accaccaacc aatacagcac atgcttttgg 1260

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tcaaaggaca agaacgagtt gcttttccag caatttcatt tgaattacaa caatgaacca 1380

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

atgctcaagc attctgcagt tgg 23

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

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<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

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<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

ggaggaatcg aaccagagaa gc 22

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

ggtttcatct tagacaaata tttttata 28

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

cggaaataat acaagaagtc ag 22

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

aacagctatg acatgattac gaattcaaaa tc 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

ttaagaaaat tggatttact aggctgatct ag 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

catgcctgca ggtcgactct agatcagcct agtaaatcca attttcttaa 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

ttaagaaaat tggatttact aggctgatct agagtcgacc tgcaggcatg 50

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

agttcggtaa acgcaagacg cttcaggaag ttcagtttga 40

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

tgaagcgtct tgcgtttacc gaactgctgc tgctacagcc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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ctaagcgact tccgtttacc gaattcctgc tgctaggctg 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

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<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

aaaccttcac gtactcgtac tcg 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

ggcaccaacc atggccggcg cgc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

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<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala

20

<210> 34

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly

1 5 10 15

Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala

20

<210> 35

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Gly Ala Cys

1 5 10 15

Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly

20

<210> 36

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

Ala Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly

20

<210> 37

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Ala

1 5 10 15

Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala

20

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly

1 5 10 15

Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr

20

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<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Cys Gly

1 5 10 15

Cys Thr Ala Thr Ala

20

<210> 40

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

Ala Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly

20

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

Gly Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys

1 5 10 15

Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala

20 25 30

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Gly

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Thr Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

Thr Ala Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr

1 5 10 15

Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly

35 40 45

Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys

50 55 60

Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr

65 70 75 80

Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Gly Thr Gly

85 90

<210> 44

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly

20 25 30

Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Gly

35 40

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

tgcggccgct gcaggtcgtc agcctagtaa atccaattt 39

<210> 46

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

atggccatgg aggccagtga attcatggcc aacagcgagt acgag 45

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

tgcagctcga gctcgatgga ttcagcctag taaatccaat tt 42

<210> 48

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

atggccatgg aggccgaatt catggcgaat ccggcagcag cagcagg 47

<210> 49

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 49

tgcggccgct gcaggtcgct agtcctcctg caaggccttc atta 44

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 50

atggccatgg aggccagtga attcatggcg aatccggcag cagcagcagg 50

<210> 51

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 51

tgcagctcga gctcgatgga tctagtcctc ctgcaaggcc ttcatta 47

<210> 52

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 52

atggccatgg aggccgaatt catggccggc gcgcaggagt ctc 43

<210> 53

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 53

tgcggccgct gcaggtcgct agccggcgta gctgaaacct 40

<210> 54

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 54

atggccatgg aggccagtga attcatggcc ggcgcgcagg agtctc 46

<210> 55

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 55

tgcagctcga gctcgatgga tctagccggc gtagctgaaa cct 43

<210> 56

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 56

cgactctagg agctcggtac ccgggatggc caacagcgag tacgagt 47

<210> 57

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 57

gaacatcgta tgggtacata ctagtgccta gtaaatccaa ttttcttaa 49

<210> 58

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 58

gatttctgag gaggatcttc ccggggccaa cagcgagtac gagtacgtg 49

<210> 59

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 59

aagcagggca tgcctgcagg tcgactcagc ctagtaaatc caattttct 49

<210> 60

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 60

cgactctagg agctcggtac ccgggatggc gaatccggca gcagcagca 49

<210> 61

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 61

gaacatcgta tgggtacata ctagtgtcct cctgcaaggc cttcattaa 49

<210> 62

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 62

gatttctgag gaggatcttc ccggggcgaa tccggcagca gcagcaggg 49

<210> 63

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 63

aagcagggca tgcctgcagg tcgacctagt cctcctgcaa ggccttcat 49

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 64

cgactctagg agctcggtac ccgggatggc cggcgcgcag gagtctctgg 50

<210> 65

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 65

gaacatcgta tgggtacata ctagtgtcct cctgcaaggc cttcattaa 49

<210> 66

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 66

gatttctgag gaggatcttc ccggggccgg cgcgcaggag tctctggtgt 50

<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 67

aagcagggca tgcctgcagg tcgacctagc cggcgtagct gaaacctgag 50

<210> 68

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 68

ttacgaacga tactcgaggt cgacatggcc aacagcgagt acgagt 46

<210> 69

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 69

caccatacta gtggatcccc cggggcctag taaatccaat tttctt 46

<210> 70

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 70

ttacgaacga tactcgaggt cgacatggcc ggcgcgcagg agtctc 46

<210> 71

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 71

caccatacta gtggatcccc cggggccggc gtagctgaaa cctgag 46

<210> 72

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 72

ttacgaacga tactcgaggt cgacatggcg aatccggcag cagcag 46

<210> 73

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 73

caccatacta gtggatcccc cggggtcctc ctgcaaggcc ttcatt 46

Claims

1.一种分离的复合物，其特征在于，所述复合物为AET1与RACK1A和eIF3h相结合所形成的三元复合物。

2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物的分子量≥80KD，较佳地，≥100KD。

3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物中，AET1与RACK1A和eIF3h的摩尔比为1-4:1:1，较佳地，1-2:1:1,更佳地，1:1:1。

4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述AET1包括野生型的AET1和突变型的AET1。

5.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述AET1的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1或7所示氨基酸序列的多肽；

6.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述RACK1A的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽；

7.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述eIF3h的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的多肽；

8.一种权利要求1所述的复合物的用途，其特征在于，用于筛选提高植物的抗逆性的药物或化合物。

9.一种改良植物的方法，其特征在于，包括步骤：调控植物中AET1、RACK1A、eIF3h中的一种或多种蛋白的表达量和/或活性。

10.一种筛选促进权利要求1所述复合物形成的药物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养植物细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中权利要求1所述复合物的形成情况；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中权利要求1所述复合物的形成情况；

(b)如果所述测试组中权利要求1所述复合物的形成数量Q1显著高于所述对照组中的权利要求1所述的复合物的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。