CN116179588B - 水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用，属于转基因植物和植物育种领域。该水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，通过在水稻中超表达所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A，以提高水稻抗稻曲病性能。本发明研究发现，OsRACK1A基因正向调控对稻曲病的抗性，超量表达OsRACK1A基因可以增强水稻对稻曲病的抗病性，且该基因提高稻曲病抗性的同时不影响水稻产量和农艺性状，为水稻的抗病育种提供新的思路。

Description

水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的 应用

技术领域

本发明涉及转基因植物和植物育种领域，特别是涉及一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用。

背景技术

水稻稻曲病是世界范围内水稻生产中的一种重要的水稻穗部真菌病害，在各个水稻栽培区域均有发生。稻曲病除了影响水稻产量，稻曲球中存在的多种稻曲毒素能够危害人畜健康。遗传抗性被认为是最有效、最经济、最环保的病害防控方式。所以，挖掘稻曲病菌抗病基因以及探索其抗病遗传机制对研究该病害的防治具有重要的指导意义。

但是，水稻抗稻曲病的基因目前报道较少。目前对于作物抗病性机理的理解主要依赖于作物抗性基因对感染叶片组织的病原体的遗传抗性分析。尽管水稻穗部病原体对农业危害严重，但抗性相关基因对水稻穗部免疫调控的生化和分子机制知之甚少。与水稻叶部组织免疫反应相比，水稻穗部对病原菌的防御机制研究有限。因此，本发明发掘一种能够调控水稻对稻曲病菌抗性的关键基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在水稻中过表达OsRACK1A基因，可显著增强水稻对稻曲病的抗病性，为水稻的抗病育种提供新的思路。

本发明从水稻中分离克隆一个编码支架蛋白OsRACK1A的基因，对该基因在水稻抗稻曲病改良中的应用进行了功能验证，研究发现，水稻中的OsRACK1A基因正向调控对稻曲病的抗性。超量表达OsRACK1A基因可以增强水稻对稻曲病的抗病性。反之，干涉OsRACK1A基因表达可以显著降低水稻对稻曲病的抗性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用，所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，所述水稻支架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，通过在水稻中超表达所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A或上调所述水稻支架蛋白的表达量，以提高水稻抗稻曲病性能。

本发明还提供一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A的重组载体，所述重组载体是通过扩增引物扩增上述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A后，将其连接插入过量表达载体中得到的。

进一步地，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。

本发明还提供一种重组菌，包括上述的重组载体。

本发明还提供一种如上述的重组表达载体或上述的重组菌在改善水稻对稻曲病抗性中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分别构建OsRACK1A过量表达载体和干涉OsRACK1A基因表达载体，获得阳性植株苗进行稻曲病处理，结果发现：OsRACK1A基因正向调控对稻曲病的抗性，超量表达OsRACK1A基因可以增强水稻对稻曲病的抗病性，而干涉OsRACK1A基因表达可以显著降低水稻对稻曲病的抗性。另外，对构建的OsRACK1A过表达转基因水稻的产量性状进行分析，发现OsRACK1A基因提高稻曲病抗性的同时不影响水稻产量和农艺性状，为水稻的抗病育种提供新的思路。

本发明不仅可以帮助扩展水稻对稻曲病的抗性新机制的认知，而且还可以利用生物技术创制抗性新种质，培育抗性新品种。本发明为稻曲病抗性基因的发掘、抗性种质的创制和抗性品种的培育提供重要理论指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明构建OsRACK1A基因过量表达的转基因水稻；A为OsRACK1A基因过量表达载体35S-OsRACK1A-OE的构建示意图；B为在水稻Q455背景中表达载体35S-OsRACK1A-OE获得转基因水稻中潮霉素筛选检测结果；C为35S-OsRACK1A-OE转基因水稻株系中OsRACK1A基因表达量结果；

图2为本发明构建OsRACK1A基因下调表达的转基因水稻；A为OsRACK1A基因下调表达载体OsRACK1A-KD的构建示意图；B为在水稻Q455背景中表达载体OsRACK1A-KD获得转基因水稻进行G418的筛选检测结果；C为OsRACK1A-KD转基因水稻株系中OsRACK1A基因表达量结果；

图3为本发明构建的OsRACK1A过表达或基因干涉转基因水稻对稻曲病的抗性分析，A为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻接种稻曲病菌PJ52菌株后的发病表型；B为Q455与35S-OsRACK1A-OE感病水稻每穗病粒率统计结果；C为接种稻曲病菌后6天，Q455与35S-OsRACK1A-OE感病水稻穗部稻曲病菌的相对生长量结果；D-F依次为野生型Q455与OsRACK1A-KD基因干涉转基因水稻的发病表型、单穗病粒率统计、稻曲病菌的相对生长量结果；

图4为本发明构建的OsRACK1A过表达转基因水稻的产量性状分析结果，A为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻在成熟期的植株表型；B为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻的单株所有谷粒；C为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻的考种分析结果，包括单株分蘖数、千粒重、单株实粒数和单株产量指标。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1分离纯化OsRACK1A基因完整编码区段的DNA片段

1.1水稻幼穗总RNA的提取(Trizol法)

取约50mg水稻材料Q455幼穗放入1.5mL RNase free EP管中，用研钵棒磨成粉末后加入400μL Trizol(Invitrogen公司生产)充分混合，冰上放置5min。加入80μL三氯甲烷，上下颠倒混合，冰上放置5min，然后12000r/min 4℃离心10min，取上清液到新的1.5mL EP管。加入等体积的异丙醇到上清液中，上下颠倒混匀，-20℃冰箱放置15min。12000r/min 4℃离心10min，去上清液，用预冷的75％DEPC酒精洗涤管底沉淀物两次，用枪头彻底吸干残留液后将所有EP管在超净工作台放置10min，待所有残留酒精挥发完后加入60μL DEPC水溶解，冻存-80℃冰箱为后续实验做准备。

1.2PCR扩增及产物回收

为了得到OsRACK1A基因编码的完整DNA片段，本发明采用TOYOBO公司生产的cDNA逆转录试剂盒(具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书操作)将上述抽提出的水稻幼穗总RNA进行反转录，得到作为PCR扩增模板的cDNA。根据参考基因组设计扩增编码OsRACK1A的全长引物如下所示：

RACK1A-BamHI_F:5’-CAGGATCCATGGCCGGCGCGCAGGAGTC-3’(SEQ ID NO：1)；注：下划线的序列为BamHI识别位点。

RACK1A-SpeI_SR:5’-CCCACTAGTCTAGCCGGCGTAGCTGAAAC-3’(SEQ ID NO：2)；注：下划线的序列为SpelI识别位点。

利用Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme)进行PCR扩增(具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书操作)。扩增结束后，以1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用干净的手术刀在紫外灯下切出目的片段大小的琼脂糖凝胶。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Thermo)进行回收，得到分离纯化的OsRACK1A基因产物。

1.3OsRACK1A的基因序列

将上述得到的回收产物送至测序公司测序，获得OsRACK1A基因的核苷酸序列为(SEQ ID NO：3)：

5’-ATGGCCGGCGCGCAGGAGTCTCTGGTGTTGGCCGGCGTGATGCACGGCCACAACGACGTGGTGACGGCCATCGCGACCCCCATCGACAACTCGCCGTTCATCGTCTCCTCCTCCCGCGACAAGTCGCTGCTGGTGTGGGACCTCACCAACCCCGTCCAGAACGTCGGCGAGGGCGCCGGCGCCTCCGAGTACGGCGTGCCCTTCCGCCGCCTCACCGGCCACTCCCACTTCGTCCAGGACGTCGTCCTCAGCTCCGACGGCCAGTTCGCGCTCTCTGGCTCCTGGGACGGCGAGCTCCGCCTCTGGGACCTCTCCACCGGGGTCACCACCCGCCGCTTCGTCGGCCACGACAAAGACGTCCTCTCCGTCGCCTTCTCCGTCGACAACCGCCAGATCGTCTCCGCCTCCCGCGACCGCACCATCAAGCTGTGGAACACCCTCGGCGAGTGCAAGTACACCATCGGCGGCGACCTCGGCGGCGGCGAGGGCCACAACGGGTGGGTCTCCTGCGTCCGCTTCTCCCCCAACACCTTCCAGCCAACCATCGTCTCTGGCTCCTGGGACCGCACCGTCAAGGTGTGGAACCTCACGAACTGCAAGCTGCGCTGCAACCTCGAGGGCCATGGCGGCTACGTCAACGCTGTCGCGGTCAGCCCCGACGGTTCTCTGTGCGCGTCCGGTGGCAAAGATGGCGTTACCCTGCTGTGGGACTTGGCTGAGGGCAAGAGGCTGTACTCGCTTGACGCGGGTTCCATCATTCACTCGCTCTGCTTCTCGCCCAACCGCTACTGGCTCTGCGCGGCGACCCAGGACTCTATCAAGATCTGGGATCTTGAGTCAAAGCACATTGTGCAGGACCTTAAGCCCGAGATCCCTGTCTCCAAGAACCAGATGCTCTACTGCACAAGCTTGAACTGGAGCGCAGATGGAAGCACCCTCTATGCTGGTTACACAGATGGAACCATCAGGATCTACAAGATCTCAGGTTTCAGCTACGCCGGCTAG-3’。

OsRACK1A基因编码蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO：4)：

N-MAGAQESLVLAGVMHGHNDVVTAIATPIDNSPFIVSSSRDKSLLVWDLTNPVQNVGEGAGASEYGVPFRRLTGHSHFVQDVVLSSDGQFALSGSWDGELRLWDLSTGVTTRRFVGHDKDVLSVAFSVDNRQIVSASRDRTIKLWNTLGECKYTIGGDLGGGEGHNGWVSCVRFSPNTFQPTIVSGSWDRTVKVWNLTNCKLRCNLEGHGGYVNAVAVSPDGSLCASGGKDGVTLLWDLAEGKRLYSLDAGSIIHSLCFSPNRYWLCAATQDSIKIWDLESKHIVQDLKPEIPVSKNQMLYCTSLNWSADGSTLYAGYTDGTIRIYKISGFSYAG-C

实施例2OsRACK1A过量表达双元表达载体的构建

用快切酶BamHI和SpelI(购自Thermo公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)双酶切实施例1获得的PCR产物，然后与经过BamHI和SpelI双酶切的载体pCAMBIA1300利用Ligation High连接酶(购自TOYOBO公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过热激化转的方法转入大肠杆菌DH5α(购自北京全式金生物技术有限公司)中，加600μL LB培养基复苏1小时，涂于含50μg/mL的卡那霉素的LB(胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉13g/L)培养基平板上，37℃温箱培养14-16h。挑取单克隆进行菌落PCR检测，将阳性菌落扩大培养并提取质粒，并将质粒送至测序公司测序，测序正确的过量达载体命名为35S-OsRACK1A-OE。

实施例3构建干涉OsRACK1A基因表达载体OsRACK1A-KD

为了干涉OsRACK1A基因表达，用两对引物(RNAiRACKIA_XhXa-1F/RNAiRACK1A_SpeI-1R和RNAiRACK1A_SalI-2F/RNAiRACK1A_BamHI-2R)扩增327bp的OsRACK1A特异序列，先后克隆到中间载体pUCCRNAi中，将构建好的中间载体质粒使用快切酶XbaI和SalI酶切后链接到已经使用相应快切酶酶切后的pCam23A载体中，然后同实施案例2中所述通过菌落PCR检测阳性克隆并扩繁提取质粒，得到OsRACK1A-KD构建体。该步骤使用到的引物序列信息为：RNAiRACKIA_XhXa-1F：5’-CATCTCGAGTCTAGACACCCTCTATGCTGGTTACAC-3’(SEQ ID NO：5)(下划线序列为XbaI酶切位点)；RNAiRACKIA_SpeI-1R：5’-CGACACTAGTAAAAAGAGAGAAGCACCATGG-3’(SEQ ID NO：6)(下划线序列为SpeI酶切位点)；RNAiRACKIA_SalI-2F：5’-CAAGTCGACCACCCTCTATGCTGGTTACAC-3’(SEQ ID NO：7)(下划线序列为SalI酶切位点)；RNAiRACKIA_BamHI-2R：5’-CACGGATCCAAAAAGAGAGAAGCACCATGG-3’(SEQ ID NO：8)(下划线序列为BamHI酶切位点)。

干涉OsRACK1A特异序列为(SEQ ID NO：9)：

5’-CACCCTCTATGCTGGTTACACAGATGGAACCATCAGGATCTACAAGATCTCAGGTTTCAGCTACGCCGGCTAGAGATGGGGAGTGTTGTTTTAGTTATCGCGTTCTGGTAAACGACTGTGGTATCACCCTAGTGTTCTTTTTGGCTGTTTGAAAGGCATTAATCTGCCTGAGTACTTCTGCTTAATTTACCCATCTATGTAGTAGCTCCAGTACTGAGCTCATGGATACTGTGGAATAGGGATCTGTTTTGCACCATGTTTTGTTTTGACTTCCTTTTCAATATATTGTCTGATGAACCATGCGATCCATGGTGCTTCTCTCTTTTT-3’。

实施例4转基因水稻的获得

4.1农杆菌的转化

将表达载体35S-OsRACK1A-OE(来自实施例2)，以及干涉表达载体OsRACK1A-KD(来自实施例3)通过液氮热激化转的方法转入农杆菌EHA105(购自北京全式金生物技术有限公司)，加600μL LB培养基复苏1小时，涂于含50μg/mL的卡那霉素和利福平抗生素的LB(胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉13g/L)培养基平板上，28℃培养箱培养48h。挑取单克隆进行菌落PCR检测，将阳性克隆储存于-80℃备用。

4.2各种培养基的配制

基本培养基：MS和N6粉末(Phytotechnology Lab公司生产)。

愈伤组织诱导培养基(1L)：N6(4g)，蔗糖(30g)，肌醇(0.1g)，酸水解酪蛋白(0.3g)，脯氨酸(0.5g)，谷氨酰胺(0.5g)，2,4-D(2mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8。

侵染培养基(1L)：酵母提取物(3g)，胰蛋白胨(5g)，高温高压灭菌后加入40mg AS，调pH＝5.5。

共培养培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，2,4-D(2mg)，D-Sorbitol(50g)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入40mg的AS。

筛选培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，2,4-D(2mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入400mg羧苄青霉素和50mg潮霉素(用于OsRACK1A过量表达水稻筛选)或50mg遗传霉素(G418)(用于OsRACK1A干涉表达水稻筛选)。

预分化培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，D-Sorbitol(50g)，6-BA(3mg)，NAA(0.5mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入200mg羧苄青霉素和25mg或25mgG418。

再分化培养基(1L)：MS(4.4g)，蔗糖(30g)，D-Sorbitol(50g)，6-BA(2mg)，NAA(0.05mg)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后加入200mg羧苄青霉素和25mg潮霉素或25mg G418。

生根培养基(1L)：MS(2.2g)，蔗糖(30g)，植物凝胶(4g)，调pH＝5.8，高温高压灭菌后倒入组培瓶。

4.3诱导愈伤组织

将种子去壳，称取24g左右的种子，用50mL 75％酒精处理2min，用无菌蒸馏水洗2遍；用2.5％次氯酸钠消毒20min，然后用无菌蒸馏水将种子表面的次氯酸钠尽量清洗掉，用无菌的滤纸尽量吸掉种子表面的液体；用镊子消毒过的种子均匀地摆到N6培养基上，然后放到30℃的培养箱进行暗培养，大约需要10d左右，将愈伤组织从种子上剥离下来进行下一步操作。

4.4农杆菌侵染水稻愈伤组织

从-80℃冰箱取出的带有重组质粒的农杆菌，在YM固体培养基(含Kan/Rif/Gm)上划线，28℃培养2d，然后挑取少量菌到3mL的YM液体培养基(含Kan/Rif/Gm)中，28℃，200rpm过夜培养；吸取1mL菌液于50mL侵染培养基中，8℃，200rpm培养，OD不超过0.1；将剥好的愈伤组织浸泡到侵染液中，28℃，140rpm，侵染30min；倒掉侵染液，将愈伤组织转移到无菌滤纸上，尽量将愈伤组织表面的侵染液吹干；然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，22℃暗培养3d。

4.5筛选与分化

将愈伤转移到筛选培养基上，30℃暗培养至少30d，中间需要更换一次培养基；然后将愈伤转移到预分化培养基上，30℃光照培养15d，之后愈伤转移到再分化培养基上，30℃光照培养至有绿色小芽冒出。

4.6生根

将分化出的小芽转移到生根培养基上，30℃光照培养，待苗子长到大约10cm左右时进行炼苗，然后移栽到土壤中。

实施例5OsRACK1A基因转基因水稻的鉴定

本发明鉴定转基因水稻材料鉴定方式采用真核抗生素初筛，然后通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测转基因材料中OsRACK1A表达量。

5.1筛选鉴定阳性转基因苗

潮霉素溶液配制：6-BA(1mg/L)，Hyg(30mg/L)，调pH至6.0，用于OsRACK1A过量表达材料筛选；遗传霉素溶液配制：6-BA(1mg/L)，G418(30mg/L)，调pH至6.0，用于OsRACK1A干涉表达材料筛选；选取2～3cm转基因苗的叶片，并取同时期的野生型叶片做对照，用马克笔做上标记，泡到潮霉素或遗传霉素溶液中，28℃光照培养2～3d，观察如果叶片变褐色则说明不具有潮霉素或遗传霉素抗性，即没有转入目标载体或者目标载体没有工作，反之，叶片依然嫩绿则表明有目的载体转入。

图1中A为OsRACK1A基因过量表达载体35S-OsRACK1A-OE的构建示意图，其中RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，HygR代表潮霉素筛选抗性基因，CaMV35S代表花椰菜花叶病毒的强启动子，NOS为终止子，BamHI和SpeI为限制性内切酶；图1中B为在水稻Q455背景中表达载体35S-OsRACK1A-OE获得转基因水稻中潮霉素筛选检测结果，蓝色“+”表示阳性对照水稻材料，蓝色“—”表示阴性对照材料，红色“+”表示35S-OsRACK1A-OE水稻转基因潮霉素筛选阳性植株，红色“—”35S-OsRACK1A-OE水稻转基因潮霉素筛选阴性植株。图2中A为OsRACK1A基因下调表达载体OsRACK1A-KD的构建示意图，上部分为OsRACK1A-KD干涉结构的构建，St-GA20oxiIN表示为马铃薯GA20氧化酶的第1内含子，XhoI-XbaI、SpeI、BamHI、SalI为限制性内切酶；下部分为OsRACK1A-KD表达载体的构建，将OsRACK1A-KD干涉结构插入Actin1启动子下游XhoI与SalI酶切位点之间，RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，NPTII代表G418筛选抗性基因，CaMV35S代表花椰菜花叶病毒的强启动子。图2中B为在水稻Q455背景中表达载体OsRACK1A-KD获得的转基因水稻进行G418筛选检测结果，蓝色“+”表示阳性对照水稻材料，蓝色“—”表示阴性对照材料，红色“+”表示OsRACK1A-KD水稻转基因G418筛选阳性植株，红色“—”表示OsRACK1A-KD水稻转基因G418筛选阴性植株。

5.2荧光实时定量PCR(qRT-PCR)鉴定OsRACK1A的表达量

提取RACK1A转基因水稻的总RNA，并反转成cDNA，方法参照实施案例1。反转完成后，将获得的cDNA稀释5倍，以用于OsRACK1A表达量的特异性定量引物对OsRACK1A-2RT_F/OsRACK1A-2RT_R，并且用水稻的看家基因OsUbi(LOC_Os03g13170)作为内参，按照荧光定量检测试剂盒SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus，按照下表配制反应体系：

表1

RT-PCR反应条件：95℃，3min；95℃，15s；60℃，20s；40cycles，最后72℃，20s。以水稻基因OsUbi作为内参基因，三次生物学重复，表达量按2^-△△Ct法计算。

该步骤使用到的引物序列信息为：OsRACK1A-2RT_F：5’-AAGCCCGAGATCCCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：10)；OsRACK1A-2RT_R：5’-GCCGGCGTAGCTGAAACCTG-3’(SEQ ID NO：11)；OsUbi_F：5’-GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC-3’(SEQ ID NO：12)；OsUbi_R：5’-AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC-3’(SEQ ID NO：13)。

图1中C为检测通过潮霉素初步筛选后获得的35S-OsRACK1A-OE转基因水稻株系(OE2、3、4、5、6、7和OE8转基因株系)中OsRACK1A基因表达量。

图2中C为检测通过G418初步筛选后获得的OsRACK1A-KD转基因水稻株系中OsRACK1A基因表达量。

实施例6鉴定OsRACK1A转基因水稻对稻曲病的抗性

6.1水稻材料培养

本发明涉及的野生型水稻栽培材料以及遗传转化苗种植于水稻栽培大棚中，遗传转化苗分别选择实施例5中筛选鉴定的超量表达OsRACK1A的阳性转基因苗OE2、OE3、OE7和OsRACK1A-KD转基因水稻株系(KD1、KD2和KD3)。

6.2稻曲病菌培养

稻曲病菌的培养以及产孢：将稻曲病菌菌株从-80℃冰箱菌库拿出用PSA(马铃薯300g切片煮沸10min后纱布过滤，在收集到的液体中加入20g蔗糖和14g琼脂粉，然后用蒸馏水定容到1L；121℃，15min灭菌待用)活化，待新的菌丝在PSA培养基中长出来后切取4-5块边长为0.5cm左右的菌丝块放入含有200mL的PS(马铃薯蔗糖液体培养基：马铃薯300g切片煮沸10min后纱布过滤，在收集到的液体中加入20g蔗糖，然后用蒸馏水定容到1L；121℃，15min灭菌待用。)液体培养基的500mL锥形瓶中，140r/min，28℃恒温摇床中培养产孢。

6.3稻曲病菌接种与发病统计

针对稻曲病菌接种方法，目前主要是采用注射孢子和菌丝混合液到未破口水稻穗子的方法。

(1)将上述方法中得到的摇培稻曲菌液体收集，调整接种菌样分生孢子与菌丝浓度：通过纱布过滤的方法将摇床中培养了7天的稻曲病菌的分生孢子和菌丝分开；然后使用新配制的PSB培养基来调整分生孢子液浓度到1.0×10⁶个/mL；紧接着将纱布上的菌丝称取2g与200mL调整过的孢子液混合后用破壁机打碎混合液，其目的主要是打散菌丝方便注射，最后装罐备用。

(2)接种水稻穗部：从田间挑选出距离破口还有5到7天的水稻穗子，并且用订书机将防水羊皮纸钉在其剑叶处做好标记，以此方便接种；做好标记后，使用带合适针头的注射器将菌液从穗子中上部注射进入穗子中，待菌液快从穗子顶部溢出后停止注射。

(3)遮阳和保湿：接种后当天或第二天上午给接种材料搭上黑色遮阳网，以此防止阳光过强导致不发病；接种前7天每天中午需要喷洒一定量水来到达保湿效果利于发病。

(4)取样和接种统计：接种后前期取样做相关实验：接种后6-7天取样各3穗水稻颖花材料，提取总RNA并反转成cDNA，具体步骤参照实施例1，以水稻内参基因OsUbi的表达作为对照，通过实施荧光定量PCR检测稻曲病菌内参基因UvTublin(UV8b_05680)的含量，来分析各材料被稻曲病菌侵染后的菌相对生物量。待接种25天后截取整个穗部来进行拍照表型并统计单穗稻曲球数。该步骤使用到的引物序列信息为：OsUbi定量引物见实施例5；内参基因UvTublin定量引物如下：

Uv_Tub2α-F：5’-GGCGTTTACAATGGCACTTC-3’(SEQ ID NO：14)；

Uv_Tub2α-R：5’-CGGAACAGTTGACCAAAAGG-3’(SEQ ID NO：15)。

实验结果见图3，A为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻接种稻曲病菌PJ52菌株4周后的发病表型，水稻穗部黑色球状体表示稻曲球；B为Q455与35S-OsRACK1A-OE感病水稻每穗病粒率统计结果；C为接种稻曲病菌后6天，Q455与35S-OsRACK1A-OE感病水稻穗部稻曲病菌的相对生长量结果；D-F依次为野生型Q455与OsRACK1A-KD基因干涉转基因水稻的发病表型、单穗病粒率统计、稻曲病菌的相对生长量结果。

根据图3可以得知，水稻中的OsRACK1A基因正向调控对稻曲病菌的抗性，超量表达OsRACK1A基因可以增强水稻对稻曲病的抗病性，而干涉OsRACK1A基因表达可以显著降低水稻对稻曲病的抗性。

实施例7OsRACK1A过表达转基因水稻考种

本发明从四川省和海南省水稻栽培基地对OsRACK1A过表达转基因水稻进行考种。水稻理论测产是指在水稻成熟以后快要收割前，按一定规则，选取一定面积的区块计量有效穗数，选择一定数量有代表性的稻穗进行取样并计量实粒数和结实率，测得干谷粒的千粒重。因收割损耗等原因，水稻的理论产量与实际产量不一定完全重合，一般地，实际产量为理论产量的80％～100％。根据栽培方式及田块形状大小等不同因素，理论测产取样的方式也不同，取样时应遵循代表性和适量性原则。本发明主要通过考察不同材料的株高、单株分蘖数、单株实粒数、以及单株产量来验证OsRACK1A过表达转基因水稻产量与野生型Q455的差异。实验结果见图4，A为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻在成熟期的植株表型；B为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻的单株所有谷粒；C为野生型Q455与35S-OsRACK1A-OE过表达转基因水稻分别在四川与海南考种分析结果，包括单株分蘖数、千粒重、单株实粒数和单株产量指标。

由图4结果可知，本发明提供的超量表达OsRACK1A基因的转基因水稻，不仅能够增强稻曲病抗性，且不影响水稻产量和农艺性状，为培育抗性新品种提供基因资源。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A在水稻抗稻曲病改良中的应用，其特征在于，通过在水稻中超表达所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A或上调所述水稻支架蛋白的表达量，以提高水稻抗稻曲病性能；

所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种重组表达载体或重组菌在改善水稻对稻曲病抗性中的应用，其特征在于，所述重组表达载体是通过扩增引物扩增权利要求1中所述水稻支架蛋白编码基因OsRACK1A后，将其连接插入过量表达载体中得到；

所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；

所述重组菌包括所述的重组表达载体。