CN115786371B - 番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用 - Google Patents
番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物免疫技术领域，具体涉及番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用。本发明在实施例中通过寻找番茄中参与青枯菌胞外多糖识别的基因，且对番茄抗青枯病有贡献的关键基因，筛选得到番茄基因SlLyk4。本发明还在番茄中进行基因敲除，验证了番茄基因SlLyk4在参与青枯菌胞外多糖识别的功能和参与青枯菌抗病性的作用。通过在感病品种根部超量表达番茄基因SlLyk4发现其对青枯菌更加抗病，即番茄基因SlLyk4可以提高番茄对青枯菌抗性，可以用于番茄抗青枯病育种工作中。
Description
技术领域
本发明属于植物免疫技术领域，具体涉及番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用。
背景技术
青枯病是由茄科雷尔氏菌(青枯菌)引起的一种毁灭性细菌病害。青枯菌通常从伤口或自然孔口侵入植物根部，首先在根部的细胞间隙定植，随后侵入木质部导管，在条件适宜的情况下，迅速大量增殖，造成维管束堵塞，导致植物迅速缺水萎蔫死亡。与寄主长期协同进化过程中，青枯菌表现出广泛的生态和寄主适应性，兼具遗传多样性和复杂性，使得该病的防治更加棘手。
长期以来科学家对于青枯病的防治展开了一系列的探索。传统的农业栽培管理措施可以降低青枯病在田间的发生和发展，但是也存在过程繁杂、见效慢的缺点。化学防治是见效最快的防治措施，但化学农药滥用带来的“3R”问题使人们意识到要走出农药带来的“舒适圈”，探索更加绿色高效的防治策略。基于此，大力发展安全性替代防控措施势在必行，其中创建抗病品种是防控青枯病的研究和实践主体方向，创建抗病品种也是最方便、经济、有效的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用，所述番茄基因SlLyk4参与青枯菌胞外多糖识别，在作物中进行表达或过表达可提高作物对青枯菌的抗病性。
本发明提供了番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用。
优选的，所述土传病害包括茄科雷尔氏菌引起的青枯病。
本发明还提供了过表达番茄基因SlLyk4在提高作物对土传病害抗性中的应用。
本发明还提供了过表达番茄基因SlLyk4在提高番茄对青枯病抗性中的应用。
本发明还提供了一种提高番茄对青枯病抗性的方法，包括以下步骤：在目标番茄的基因组中表达或过表达番茄基因SlLyk4。
优选的，所述番茄基因SlLyk4的基因登录号为101261978。
优选的，番茄基因SlLyk4的过表达载体的基础载体包括pCAMBIA2300。
优选的，所述过表达载体的构建方法，包括将番茄基因SlLyk4插入pCAMBIA2300的BamH1和Sma1酶切位点之间。
本发明还提供了番茄基因SlLyk4在培育抗番茄土传病害的新种质中的应用。
本发明还提供了上述方法在培育抗青枯病番茄新品种中的应用。
有益效果：本发明提供了番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用，实施例中通过寻找番茄中参与青枯菌胞外多糖(Extracellular Polysaccharide，EPS)识别的基因，且对番茄抗青枯病有贡献的关键基因，筛选得到番茄基因SlLyk4。本发明还在番茄中进行基因敲除，验证了番茄基因SlLyk4在参与青枯菌胞外多糖识别的功能和参与青枯菌抗病性的作用。通过在感病品种根部超量表达番茄基因SlLyk4发现其对青枯菌更加抗病，即番茄基因SlLyk4可以提高番茄对青枯菌抗性，可以用于番茄抗青枯病育种工作中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述番茄基因SlLyk4的筛选流程图；
图2为筛选参与青枯菌胞外多糖识别基因的结果图，其中A：SlLyk家族成员聚类分析图，B：SlLyks在青枯菌处理后的表达情况图，C：沉默SlLyk4后，胞外多糖触发的活性氧爆发变化情况图，D：对照和沉默植物扩增的基因亮度对比图；
图3为敲除载体的构建及基因敲除突变体的构建方法示意图，其中A：gDNA设计图谱，B：基因敲除突变体的测序验证图；
图4为敲除突变体生长表型测定结果图；
图5为敲除突变对胞外多糖的免疫响应检测结果图；
图6为敲除突变体对青枯菌的抗病表型的影响结果图；
图7为pCAMBIA2300的质粒图谱；
图8为毛根转化植物对青枯菌的抗病表型的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用。
本发明所述番茄基因SlLyk4的基因登录号优选为101261978。本发明所述番茄基因SlLyk4优选通过图1所示流程进行筛选，以寻找番茄中参与青枯菌胞外多糖识别的基因为突破口，寻找参与识别青枯菌胞外多糖，且对番茄抗青枯病有贡献的关键基因。本发明首先对番茄SlLyk型受体激酶家族进行系统分析，再结合番茄受青枯菌侵染前后的转录组数据(数据来自French Elizabeth等人2018年的研究)，分析SlLyks在青枯菌处理24h、48h后的表达情况，发现SlLyk4的表达量最高，且位于激酶结构域的保守氨基酸显示不具备激酶活性的第一分支中，因此以SlLyk4作为对象进行后续研究。本发明对所述基因SlLyk4进行沉默，发现胞外多糖触发的活性氧爆发显著降低，暗示其参与青枯菌胞外多糖的识别，通过在番茄中进行敲除验证了其参与青枯菌胞外多糖识别的功能和参与青枯菌抗病性的作用；通过在感病品种根部超量表达该基因发现其对青枯菌更加抗病，综上证实了番茄基因SlLyk4可以调控番茄对青枯菌抗性，可以用于番茄抗青枯病育种工作。
本发明所述土传病害优选包括茄科雷尔氏菌(青枯菌)引起的青枯病。
本发明还提供了过表达番茄基因SlLyk4在提高作物对土传病害抗性中的应用。
本发明在实施例中，通过对易感病的番茄品种进行番茄基因SlLyk4的过表达，使得其对于青枯菌抗性提高。
本发明还提供了过表达番茄基因SlLyk4在提高番茄对青枯病抗性中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了一种提高番茄对青枯病抗性的方法，包括以下步骤：在目标番茄的基因组中表达或过表达番茄基因SlLyk4。
本发明番茄基因SlLyk4的过表达载体的基础载体优选包括pCAMBIA2300，所述过表达载体的构建方法，优选包括将番茄基因SlLyk4插入pCAMBIA2300的BamH1和Sma1酶切位点之间。
本发明对所述表达或过表达的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规遗传转化方法即可。
本发明还提供了番茄基因SlLyk4在培育抗番茄土传病害的新种质中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述方法在培育抗青枯病番茄新品种中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的番茄基因SlLyk4在调控作物对土传病害抗性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中，如非特殊说明，所用的试剂盒材料均为本领域的常规市售产品，所用的实验方法也均为常规方法：
1.植物材料
番茄青枯病感病品种Money Maker(该品种已公开：Rhizosphere microbiomestructure alters to enable wilt resistance in tomato，Nature Biotechnology 36,1100–1109(2018))、番茄青枯病抗病品种H7996。
2.供试菌株
感受态转化：用于热激转化的大肠杆菌MC1061，用于电击转化的农杆菌GV3101、MSU440。
病原菌接种：茄科雷尔氏菌GMI1000、UW551。
3.各种酶、试剂和仪器
Taq、EasyPfu DNAPolymerase购于北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；限制性内切酶购于宝日医生物有限公司；SYBR购于莫纳生物科技有限公司；Trizol购于北京天根生化科技有限公司；柱式DNA回收试剂盒购于上海生工生物工程公司；其它常规试剂均选用国产分析纯或化学纯试剂；引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；测序由擎科测序公司完成。
PCR仪(EppendorfAG 22331Hamburg)、电泳仪(Tanon EPS 600)、全自动多功能酶标仪(Tecan SparkTM)、荧光显微镜(Leica DM2500)、荧光定量PCR仪(C1000 TouchTM)、化学发光仪(Tanon 5200)、分光光度计(DeNovix DS 11)、超净工作台(北京哈东联HDL)、凝胶成像系统(BIO-RAD ChemiDoc XRS+)、单反相机(尼康B700)。
4.试剂和培养基的配置
HA抗体(Roche，货号12013819001)：1×PBST+5％Milk+α-HA-HRP(2000X)
农杆菌悬浮液：MS Salt4.3 g，蔗糖20.0g，肌醇(20mg/mL)5mL，维生素B1(1mg/mL)400μL，调至pH＝5.8，ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌30min。
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌30min。固体培养基需另加12.0g琼脂。
CPG液体培养基：细菌蛋白胨NO.210.0g，酸水解酪蛋白1.0g，葡萄糖5.0g，ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌30min。固体培养基需另加15.0g琼脂。
1/2MS固体培养基：MS Salt 2.2g，MES 0.5g，加入0.8L ddH2O，用5M KOH调至pH＝5.8，蔗糖5.0g，ddH2O定容至1L，琼脂8.0g，121℃高压灭菌30min。
KCMS培养基(预培养、共培养培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，肌醇(20mg/mL)5mL，维生素B1(1mg/mL)1.3mL，2,4-D(1mg/mL)200μL，KH2PO4(100mg/mL)2mL，KT(1mg/mL)100μL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH2O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min。
2Z培养基(筛选培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH2O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入IAA(1mg/mL)100μL，玉米素(1mg/mL)2mL，卡那霉素(100mg/mL)1mL，头孢(300mg/mL)1.2mL。
0.2Z培养基(继代培养基)：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，蔗糖30.0g，调至pH＝5.8，ddH2O定容至1L，琼脂7.4g，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入玉米素(1mg/mL)200μL，卡那霉素(100mg/mL)1mL，头孢(300mg/mL)1.2mL。
生根培养基：大量元素(20X)50mL，微量元素(200X)5mL，铁盐(200X)5mL，有机物(200X)5mL，IBA(1mg/mL)2mL，蔗糖30.0g，琼脂7.4g，调至pH＝5.8，ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌30min，温度冷却至60℃时加入卡那霉素(100mg/mL)500μL，头孢(300mg/mL)1.2mL。
5.实验方法：
5.1植物RNA提取，根据Trizol试剂盒说明书进行。
5.2农杆菌介导的番茄基因沉默：
将VIGS载体电转至GV3101农杆菌感受态，28℃培养3h后涂至具有25μg/ml kana和25μg/ml gen抗性的LB平板，挑取单菌落至具有相同抗性的LB液体培养基中28℃，190rpm/min摇培12h，吸取200μl菌液至3ml具有25μg/ml kana、25μg/ml gen、10MmMES(吗啉乙磺酸)、20μMAS(乙酰丁香酮)的液体LB培养基中28℃，190rpm/min摇培8h，收集菌液，4000rpm/min离心，收集菌体，利用农杆菌悬浮液将菌体重悬并调整菌液的OD600为1.5。以1:1的比例混合TRV-RNA1和TRV-RNA2农杆菌并注射生长一周的H7996幼苗的子叶。接种约10天后可以看到沉默PDS基因的对照组叶片白化，该植物即可进行实验操作。
5.3EPS介导的番茄叶片活性氧爆发实验：
从生长3周的番茄植株上取12片打孔成0.28cm2的叶圆片，(每个叶圆片切成4条窄叶；将叶片放入96孔板，每个孔加100μL的ddH2O，过夜复苏；吸去ddH2O，加入100μL的反应混合液，包括50μmol/L的Luminol，10μg/mL的过氧化物酶，75μg/ml的flg22；将样品放入酶标仪中，立即开始测定，每隔1.5min测定一次，测20个周期；将每次处理后10个叶圆片产生的活性氧数值作为相对光单位。
5.4番茄遗传转化：
(1)播种：选取100颗左右饱满健康的Money marker和Hawaii种子倒入50mL离心管，用75％酒精洗5min，倒掉酒精，用灭菌水清洗种子3次，再用次氯酸钠溶液(84消毒液：蒸馏水＝1:1)清洗种子5min，此过程要在超净工作台中进行；倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌水清洗种子3次；将清洗过的种子放置在1/2MS培养基表面，在组培室中培养10d左右，长至两片子叶完全展开。
(2)制备外植体：在培养皿里放一片滤纸，用无菌ddH2O将滤纸润湿，将子叶展开的无菌苗取出后，将子叶叶尖、叶柄切除，切成1片外植体，放至KCMS培养基上(培养基上垫一层滤纸)，暗培养2d。
(3)准备菌液：从-80℃挑取含敲除载体的甘油菌在Kana+Gen抗性LB平板上划线活化，28℃倒置培养，浸染前一天晚上挑取单菌落于2mLKana+Gen抗性液体LB培养基中28℃、190r/min摇床培养12-16h，然后将200μL菌液加入10mLKana+Gen抗性LB培养基，28℃、190r/min摇床培养6-8h。
(4)侵染：将活化的菌液倒入15mL离心管中，25℃、4000r/min离心20min，倒掉上清，加入4mL农杆菌悬浮液悬浮菌体(农杆菌悬浮液务必在超净台中打开)；测量菌液OD600值，将菌液稀释至OD600＝0.1～0.2；在培养皿中加入30mL悬浮菌液，将所有外植体转移至农杆菌悬浮液中，浸染3-4min，浸染过程中轻轻晃动培养皿；倒掉悬浮液，在干净的培养皿里放一片滤纸，将外植体转移到滤纸上，尽快将菌液吸干；在KCMS培养基上铺一层滤纸，将外植体放置在滤纸上，暗环境共培养2d。
(5)筛选：将外植体转移至2Z培养基上，每培养皿放90-100片，叶片正面朝上，放组培室中培养，每天至少观察两次，7d后外植体会长大，为保证生长空间足够，此时应将部分外植体转移至新的2Z培养基上，并去除褐化外植体，2Z培养基应12-15d更换一次。
(6)继代培养：将在2Z培养基上生长良好的外植体(愈伤组织膨大，并长出不定芽)转至0.2Z培养基中，继代培养15d左右；待不定芽生出叶片时，将外植体叶片部分切掉，只留愈伤组织和不定芽，放至新的0.2Z培养基中继续培养15d左右。
(7)生根培养：待不定芽生长至2-3cm时，从根基部切下，转移至生根培养基中诱导生根。
(8)移栽：待幼苗不定根生长良好时，取出转化苗，清洗根部培养基，移栽到营养土中，盖上盖子保湿1周左右，揭盖后正常管理，等待验证。
5.5番茄DNA提取，CTAB法进行提取。
5.6EPS诱导的番茄根部活性氧爆发检测
番茄种子消毒及培养过程同番茄遗传转化。将生长10d的番茄根部切成0.5cm的小段，每两根放置在盛有100μL ddH2O的96孔板中，过夜复苏。吸去ddH2O，加入包括50μΜ的Luminol，10μg/mL的过氧化物酶，75μg/mL的EPS反应混合液。将样品放入酶标仪中测定活性氧生成变化。
5.7EPS诱导的番茄根部早期免疫基因表达检测
将在1/2MS培养基上生长10d的番茄整株取出放在盛有1mLddH2O的6孔细胞培养板中，每3株为一组，过夜恢复，将ddH2O吸出重新加入1mLddH2O，用75μg/mL的EPS处理番茄根部0h、1h、3h，提取根部的RNA，反转录合成cDNA，稀释5倍后，作为模板扩增免疫基因，扩增体系如下：2×SYBR green 5μL，cDNA 1μL，primermix 1μL，ddH2O 3μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10sec；55℃退火10sec；72℃延伸10sec，65-95℃溶解曲线每上升0.5℃一个循环。
5.8EPS诱导的番茄根部胼胝质积累检测
在1/2MS培养基上生长10d的番茄根部剪下放在盛有1mLddH2O的6孔细胞培养板中，每3株为一组，过夜恢复，将ddH2O吸出重新加入1mL ddH2O，并用75μg/mL的EPS处理24h，随后将根转移到含有FAA溶液(10％甲醛，5％醋酸，50％乙醇)的12孔板中孵育12h，分别用70％乙醇和ddH2O洗涤叶片2次，利用0.01％苯胺蓝溶液(150mM KH2PO4，pH 9.5)，避光染色0.5-1h。将染色的根通过50％甘油固定在载玻片上，利用荧光显微镜观察胼胝体沉降结果。
5.9番茄浸根接种青枯菌及病情统计
在营养土块JiffyPots上培养野生型和突变体番茄，培养至3周左右等待接种。在含有50μg/mL spec的CPG平板上划线活化青枯菌GMI1000(用于Money marker品种接种)，在无抗性的CPG平板上划线活化青枯菌UW551(用于Hawaii 7996品种接种)。28℃培养2d后挑取单菌落在相应抗性的液体CPG培养基中，28℃，190rpm/min摇床培养12h，吸取1ml菌液至50mL液体CPG培养基，培养至OD600≈1，将菌液转移至50mL离心管，4000rpm/min离心15min收集菌体，用蒸馏水重悬，并将菌液调整至OD600＝0.1。将生长番茄的小土块放入青枯菌菌液中浸泡1h，之后将接种后的番茄转取出，移至28℃，RH 99％，12h光照/12h黑暗的恒温光照培养箱中培养，接种后密切关注并记录植物发病情况。每隔1d记录一次发病率和病情指数，根据植株叶片萎蔫程度分为5个发病等级：0级，无萎蔫症状；1级，1％-25％叶片萎蔫；2级，26％-50％叶片萎蔫；3级，51％-75％叶片萎蔫；4级，76％-100％叶片萎蔫。
其中N0，N1，N2，N3，N4表示发病等级分别为0，1，2，3，4的植株数。
菌落数统计：接种10d左右剪取番茄茎基部约0.2g的小段，用刀片纵向切3下，插入1mL ddH2O中静置1h，收集菌液，此菌液浓度记作10-2，利用ddH2O梯度稀释至10-4、10-5，取10μL浓度为10-4、10-5菌液于相应抗性的CPG平板上进行涂布，28℃培养2d后对单菌落进行计数。
5.10发根农杆菌介导的番茄毛根转化
从-80℃挑取含表达载体的甘油菌在Kana+Strep抗性LB平板上划线活化，28℃倒置培养2d。将番茄从1/2下胚轴处切去，蘸取表达目的蛋白地MSU440农杆菌菌体并将菌体涂抹在番茄下胚轴伤口处，将番茄放回1/2MS平板；6-7天后，番茄长出新的毛根，用手术刀切去毛根，将番茄放至加有25μg/ml的卡那霉素的1/2MS平板上进行筛选让其继续生根；待长出较为旺盛的根后，取适量根部样品进行western blot验证，留取阳性植物移栽至营养土块中培养.
5.11利用农杆菌介导的番茄遗传转化
将SlLyk4在感病品种的番茄中进行超量表达，获得稳定的转基因植物，技术方案如下：
将SlLyk4超量表达载体电击转化至GV3101感受态中，28℃培养3h后涂至具有kana和gen抗性的LB平板上，挑取单菌落至具有kana和gen抗性的LB液体培养基中，28℃，190rpm/min摇培12h，将菌液与50％的甘油1：1混合，保存在-80℃备用。
将消毒后的番茄种子(Money marker)种植于1/2MS培养基上，待子叶展开后将无菌苗取出，将子叶切成1～2片外植体，放至KCMS培养基上暗培养1d；将活化的菌液稀释至OD600＝0.1～0.2浸染外植体3～4min，将外植体放回KCMS培养基上，暗培养2d。将外植体转移至2Z筛选培养基上，约12～15d更换一次2Z培养基；将在2Z培养基上生长良好并长出不定芽的外植体转至0.2Z继代培养基中，继代培养15d左右；待不定芽生出叶片时，将外植体叶片部分切掉，只留愈伤组织和不定芽，放至新的0.2Z培养基中继续培养15d左右；待不定芽生长至2～3cm时，从根基部切下，转移至生根培养基中；待幼苗不定根生长良好时，将其移栽到营养土中，盖盖保湿1周，在培养室中炼苗2～3周。打取T1代植物两个叶圆片进行Westernblot验证，留下检测到SlLyk4表达的阳性植物收取种子。将T1代植物的种子种下获得T2代植物，打取T2代植物两个叶圆片进行Westernblot验证，留下检测到SlLyk4表达的阳性植物收取种子。将T2代植物的种子种下获得T3代植物，打取T3代植物两个叶圆片进行Westernblot验证，若后代均检测到蛋白表达，则说明其对应的T3代植物为超量表达SlLyk4得纯和植物。之后可利用该纯和植物的种子进行青枯菌接种，检测抗性变化。
实施例1
筛选参与青枯菌胞外多糖识别基因
首先对番茄SlLyk型受体激酶家族进行分析预测，从系统进化树来看SlLyk家族成员分为两个分支，其中SlLyk4/SlLyk2/SlLyk6/SlLyk7/SlLyk8/SlLyk9位于第一个分支，并且激酶结构域的保守氨基酸显示它们没有激酶活性，其余的成员在第二个分支上，保守位点显示它们具有激酶活性(图2中A)。
收集数据库中番茄受青枯菌侵染前后的转录组数据(数据来自French Elizabeth等人2018年的研究)，分析SlLyks在青枯菌处理24h、48h后的表达情况，发现SlLyk4的表达量最高，大多数基因的诱导表达情况不明显(图2中B)。
选取第一个分支中番茄SlLyk受体激酶进行研究。利用Oligo7软件设计该分支SlLyks基因的VIGS引物，并在FP引物核RP引物上添加EcoR1、Kpn1酶切位点，进行引物合成。
VIGS引物：
SlLyk2_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.1)：5′-CCGGAATTCATCTGTTACAATGCGGGAC-3′；
SlLyk2_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.2)：5′-CGGGGTACCAGCTCCTTGTGATCTTCG-3′；
SlLyk4_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.3)：5′-GAATTCATGCAATGGCGTTAACCGTA-3′；
SlLyk4_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.4)：5′-GGTACCCCAGCAACTTGGGAACTCA-3′；
SlLyk6_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.5)：5′-GAATTCCTTACAGTGTTCGCACCAG-3′；
SlLyk6_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.6)：5′-GGTACCCCAAGAAACCACAAAGCCT-3′；
SlLyk7_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.7)：5′-GAATTCACTCATTTGGTTACATGGGG-3′；
SlLyk7_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.8)：5′-GGTACCATATGTCTGTGCTCATCTCC-3′；
SlLyk9_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.9)：5′-CCGGAATTCCTTGTTAATGATCAACCCCT-3′；
SlLyk9_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.10)：5′-CGGGGTACCATTGCTAACCCTATAACAGT-3′；
SlLyk10_VIGS_EcoRI_FP(SEQ ID NO.11)：5′-CCGGAATTCCCCCACACATTCTGATCTCG-3′；
SlLyk10_VIGS_KpnI_RP(SEQ ID NO.12)：5′-CGGGGTACCCATTGTGGCCTTGTACACT-3′。
以H7996的cDNA为模板进行扩增，PCR体系：1μl cDNA，1μl上游引物，1μl下游引物，47μl金牌Mix，PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸50min；共35个循环；72℃末次延伸5min；12℃保存10min，利用EcoR1和Kpn1限制性内切酶对PCR产物进行酶切，回收获得目的片段，同时用EcoR1和Kpn1酶切YL156载体并回收获得载体，利用T4DNA连接酶将载体和片段在16℃连接10h，之后将连接产物转化至MC1061感受态，涂至具有50μg/ml Kana抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落在具有50μg/ml Kana抗性的LB液体培养基中37℃，190rpm/min摇培8h，提取质粒，利用EcoR1和Kpn1进行双酶切验证，切下正确片段的即VIGS基因沉默载体构建成功。
选取沉默10d的番茄的第3轮叶片，用打孔器打下叶圆片放置于盛有100μl ddH2O的96孔板中过夜复苏，吸去ddH2O，加入包括50μΜ的Luminol，10μg/ml的过氧化物酶，75μg/ml的EPS的反应混合液中，放入酶标仪中进行测定，结果发现沉默SlLyk4后，胞外多糖触发的活性氧爆发显著降低，暗示其参与青枯菌胞外多糖的识别(图2中C)。
同时各打取4个第三轮的基因沉默植物的番茄叶片，进行RNA提取，利用1μg RNA进行逆转录合成cDNA，按照试剂盒操作流程去除基因组DNA并合成cDNA，合成的cDNA稀释5倍用作模板。利用同VIGS引物设计同样的方法设计并合成这些SlLyks基因的RT-PCR引物。
RT-PCR引物如下：
SlLyk2_RT_FP(SEQ ID NO.13)：5′-TGAGTGTGAGAACTACGAGCG-3′；
SlLyk2_RT_RP(SEQ ID NO.14)：5′-AGGCAGTGGCTACATCTAAAC-3′；
SlLyk4_RT_FP(SEQ ID NO.15)：5′-AGAAGTCACTAAGTTGGGCAC-3′；
SlLyk4_RT_RP(SEQ ID NO.16)：5′-AAGCAAGTTCCACAGGGTAC-3′；
SlLyk6_RT_FP(SEQ ID NO.17)：5′-ATAGCAAATTTCCGAGGAGG-3′；
SlLyk6_RT_RP(SEQ ID NO.18)：5′-TGTGGATGTAGCCTGGTTTG-3′；
SlLyk7_RT_FP(SEQ ID NO.19)：5′-CTGTAAGCATCATCAACTATCC-3′；
SlLyk7_RT_RP(SEQ ID NO.20)：5′-GCACATAATCTCACCAATCG-3′；
SlLyk9_RT_FP(SEQ ID NO.21)：5′-ATGAAGTGGAATGCTCGTG-3′；
SlLyk9_RT_RP(SEQ ID NO.22)：5′-ATACAATCCCATCGGTTAGG-3′；
SlLyk10_RT_FP(SEQ ID NO.23)：5′-TCATCATCTTCTGCTGCCTC-3′；
SlLyk10_RT_RP(SEQ ID NO.24)：5′-CCAAGGCAGCCAAGTTTAG-3′。
PCR扩增体系：1μl菌液，0.1μl上游引物(10μM)，0.1μl下游引物(10μM)，1μl 10×Taq缓冲液，0.1μl Taq，1μl MgCl2(25mM)，0.2μl dNTPs(10mM)，6.5μl超纯水，PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40min；共25-28个循环；72℃末次延伸5min；12℃保存10min，RT-PCR引物与VIGS引物扩增的片段几乎没有重叠，利用番茄的SlACTIN引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，发现SlACTIN基因扩增亮度一致，说明合成的cDNA浓度较为均一，再扩增对照GFP植物和SlLyks基因沉默植物中对应的基因，进行琼脂糖(BioFroxx品牌)凝胶电泳，比较对照和沉默植物扩增的基因亮度，经过对比，发现所有基因沉默植物的对于SlLyks基因均得到有效沉默(图2中D)，也证明图2中C中的结果比较可信。
实施例2
目标基因的敲除
A敲除载体的构建
利用SMART、InterPro在线网站预测SlLyk4的保守结构域，利用CRISPR-P、CRISPR-PLANT、CHOPCHOP等在线网站，设计靶向SlLyk4的第二个LyM结构域的gDNA(SEQ ID NO.25：AACTTGCCAAGCTATCAACG)(图3中A)，连接进入PTX基因编辑载体(Ye J,Wang X,Hu T,ZhangF,Wang B,Li C,Yang T,Li H,Lu Y,GiovannoniJJ et al.2017.An InDel in thepromoter of Al-ACTIVATED MALATETRANSPORTER9 selected during tomatodomestication determines fruitmalate contents and aluminum tolerance.PlantCell 29:2249–2268)，利用T4 DNA连接酶连接载体和片段，热击转化至MC1061感受态中，37℃培养1h后将菌液涂至具有50μg/mLKana抗性的LB平板上，37℃培养8h，挑取单菌落进行菌液PCR验证，PCR扩增体系：1μl菌液，0.1μl上游引物，0.1μl下游引物，1μl 10×Taq缓冲液，0.1μl Taq，1μl MgCl2，0.2μl dNTPs，6.5μl超纯水，PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min；28个循环；72℃末次延伸5min；12℃保存10min。选取一个菌液PCR验证正确的菌进行测序，选取测序结果与预测序列可以正确比对的单克隆进行质粒提取，获得的质粒即为构建成功的CRISPR敲除载体。
菌液PCR引物：
PTX_FP(SEQ ID NO.26)：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′；
PTX_RP(SEQ ID NO.27):5′-GCAGGCATGCAAGCTTATTGG-3′。
将CRISPR敲除载体电击转化至GV3101感受态中，28℃培养3h后涂至具有25μg/mLKana和25μg/mLGen的LB平板上，挑取单菌落至具有相同抗性的LB液体培养基中，28℃摇培12h，将菌液与50％的甘油1：1混合，保存在-80℃备用。
B.番茄遗传转化获得目的基因敲除突变体
将消毒后的番茄种子(Hawaii 7996和Money marker)种植于1/2MS培养基上，按照番茄遗传转化流程获得T1代转基因植物，打取T1代植物两个叶圆片置于1.5ml离心管并用液氮速冻，用CTAB法提取番茄的基因组DNA，利用SlLyk4的VIGS引物进行PCR扩增，获得含有靶点的目的片段，进行测序验证，结果发现H1和M8植物在靶点处出现双峰，表明其可能存在编辑(图3中B)。收取H1和M8植物T1代的种子，再在土中种植，提取植物的DNA，进行同样的PCR扩增和测序，获得测序单峰，切靶点处存在编辑的植物即为筛选得到纯合的Sllyk4基因编辑突变体。
C.敲除突变体生长表型测定
在育苗杯中种植Hawaii 7996、Money marker以及Sllyk4突变体H1、M8，在生长4周时进行拍照记录(图4中A)，并测定株高，株高测量区段为出土部分至叶片最高处(将叶片向上拉伸的最高点)，发现突变体和野生型的植株高度和生长表型没有差异(图4中B)。在1/2MS培养基上种植野生型和突变体植物，11d后测量番茄幼苗的根长并拍照，发现二者也不存在差异(图4中C和D)。这些结果说明在番茄中敲除了SlLyk4后不影响其生长表型。
实施例3
敲除突变对胞外多糖的免疫响应检测
检测野生型和突变体番茄根部在胞外多糖处理后的活性氧产生情况，结果显示与野生型番茄根部相比，Sllyk4突变体番茄根部几乎没有活性氧的生成(图5中A)。用胞外多糖处理番茄幼苗根部，提取野生型和突变体番茄根部的RNA，反转录合成cDNA，稀释5倍后，扩增PR1、ERF2a、ERF2b、WRKY3等免疫基因，PCR反应体系：5μL 2×MonAmpTM qPCRMix，1μLcDNA，1μL引物混合物，3μL超纯水，PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸10s，65℃-95℃溶解曲线每上升0.5℃一个循环，发现与野生型相比，Sllyk4突变体中的这些免疫基因的诱导显著下降甚至没有诱导(图5中B和C)。用胞外多糖处理番茄幼苗根部24h，用荧光显微镜观察根部胼胝质积累的差异，发现与野生型植物相比，Sllyk4突变体番茄根部胼胝质的积累显著降低(图5中D)。
qPCR引物：
SlACTIN_qPCR_FP(SEQ ID NO.28)：5′-GTATGTTGCTATTCAGGCTGTG-3′；
SlACTIN_qPCR_RP(SEQ ID NO.29)：GCAAAGCATAACCCTCGTAAAT-3′；
5′-SlPR1_qPCR_FP(SEQ ID NO.30)：5′-ACTCAAGAGCTGGTAATTGCAAC-3′；
SlPR1_qPCR_RP(SEQ ID NO.31)：5′-TTTCGATACCCACAATTGCACGG-3′；
SlERF2a_qPCR_FP(SEQ ID NO.32)：5′-ATGCACAATTACTTCGCGATG-3′；
SlERF2a_qPCR_RP(SEQ ID NO.33)：5′-TTCACTAGGTGGTCCAGTACTA-3′；
SlERF2b_qPCR_FP(SEQ ID NO.34)：5′-CGACGATACAGAGGAGTTAGAC-3′；
SlERF2b_qPCR_RP(SEQ ID NO.35)：5′-AAAAGTACCTAACCAAACACGC-3′；
SlWRKY3_qPCR_FP(SEQ ID NO.36)：5′-GGACAGTAATGAATAGCTCGGA-3′
SlWRKY3_qPCR_RP(SEQ ID NO.37)：5′-TTGGATTCAGCTACTGTGACAT-3′。
实施例4
敲除突变体对青枯菌的抗病表型
采用浸根接种的方法，利用GMI1000菌株接种Money marker和Sllyk4突变体M8，利用UW551菌株接种Hwaii 7996和Sllyk4突变体H1，接种结果发现Sllyk4突变体植物与野生型相比对青枯菌的抗性有所下降(图6中A和E)，发病率和病情指数都比野生型更高(图6中B和C，图6中F和G)，发病情况更严重。接种10d左右剪取番茄茎基部约0.2g的小段，用刀片纵向切3下，插入1mL ddH2O中静置1h，收集菌液，梯度稀释后取10μL浓度为10-4、10-5菌液于相应抗性的CPG平板上进行涂布，28℃培养1-2d后对单菌落进行计数。计数结果显示突变体茎基部含有更多的青枯菌(图6中D和H)，这些结果说明SlLyk4敲除后使得番茄对青枯菌更加地感病，进一步说明SlLyk4在番茄对青枯菌的抗性中发挥重要作用。
实施例5
毛根转化植物对青枯菌的抗病表型
设计SlLyk4基因全长扩增引物，以FP(SlLyk4_FL_BamH1_FP：5′-CGGGATCCATGAATTATTCTCATCTCATCTTTG-3′)和RP(SlLyk4_FL_BamH1_RP：5′-TCCCCCGGGGGGCAATCTATGTGGTGAC-3′)为引物，以Money marker番茄的cDNA为模板，PCR体系：1μl cDNA，1μl上游引物，1μl下游引物，47μl金牌Mix，PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸2min；共35个循环；72℃末次延伸10min；12℃保存10min，扩增获得SlLyk4基因全长，利用BamH1、Sma1限制性内切酶酶切PCR扩增得到的SlLyk4，同时用同样的两种酶酶切双元表达载体pCAMBIA2300，再利用T4 DNA连接酶将载体和片段在16℃连接10h，之后将连接产物热击转化至MC1061感受态，涂至具有Kana抗性的LB平板上(图8)，经过双酶切验证和测序验证获得正确连接的表达载体。
FP(SlLyk4_FL_BamH1_FP，SEQ ID NO.38)：5′-CGGGATCCATGAATTATTCTCATCTCATCTTTG-3′；
RP(SlLyk4_FL_BamH1_RP，SEQ ID NO.39)：5′-TCCCCCGGGGGGCAATCTATGTGGTGAC-3′。
将正确连接的表达载体电转至发根农杆菌感受态MSU440中。在1/2MS培养基上种植Money marker番茄，待子叶展开后将无菌苗取出后，将番茄从1/2下胚轴处切去，蘸取表达SlLyk4蛋白的MSU440农杆菌菌体并将菌体涂抹在番茄下胚轴伤口处，按照番茄毛根转化的实验操作继续筛选培养，待长出较为旺盛的根后，取适量根部样品进行Western blot验证，发现SlLyk4的表达率很高(图8中A)，将成功表达目标蛋白的植物移栽至营养土块JiffyPots中，待番茄生长2周后采用浸根接种的方法接种青枯菌。结果发现毛根转化的番茄对青枯病的抗性有明显提升(图8中B)，在青枯菌接种后发病率和病情指数较对照植株均显著降低(图8中C)，茎基部青枯菌计数也说明超表达SlLyk4后限制了青枯菌在体内的增殖(图8中D)。这些结果说明SlLyk4的超量表达可以增强番茄对青枯菌的抗性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.番茄基因SlLyk4在调控番茄对土传病害抗性中的应用，其特征在于，所述土传病害为茄科雷尔氏菌引起的青枯病，所述番茄基因SlLyk4的基因登录号为101261978。
2.过表达番茄基因SlLyk4在提高番茄对青枯病抗性中的应用，所述番茄基因SlLyk4的基因登录号为101261978。
3.一种提高番茄对青枯病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：在目标番茄的基因组中过表达番茄基因SlLyk4，所述番茄基因SlLyk4的基因登录号为101261978。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，番茄基因SlLyk4的过表达载体的基础载体包括pCAMBIA2300。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述过表达载体的构建方法包括：将番茄基因SlLyk4插入pCAMBIA2300的BamH1和Sma1酶切位点之间。
6.权利要求3～5任一项所述方法在培育抗青枯病番茄新品种中的应用。
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| CN115786371A (zh) | 2023-03-14 |
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