CN102329806A

CN102329806A - 控制水稻粒宽、粒重和产量的基因及其应用

Info

Publication number: CN102329806A
Application number: CN201110294864A
Authority: CN
Inventors: 傅向东; 王少奎; 吴昆�; 张桂权; 曾瑞珍
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN103906839B; IN2014DN03305A; CN103906839A; BR112014007614A2; WO2013044742A1; CN102329806B; US20140237685A1; US9688984B2

Abstract

本发明公开了一种控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8(SEQ IDNO：1-6)及其应用。GW8可以控制水稻谷粒的形状和大小。GW8通过影响细胞横向和纵向分裂速度来控制谷壳的大小和长宽比，并调节灌浆速率，进而影响水稻的产量。GW8可以作为鉴定水稻籽粒长宽比和籽粒大小品种的分子标记。GW8对基于提高水稻产量及改良稻米品质的育种有广泛的应用前景。

Description

控制水稻粒宽、粒重和产量的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。具体地，本发明涉及一种控制水稻粒宽、粒重和产量的基因及其应用。本发明还涉及由该基因编码的多肽和该基因的启动子序列。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上十分重要的粮食作物，也是我国第一大粮食作物，全球近一半的人口以稻米为主食(Tan et al，2000)，随着世界总人口的不断增加，为解决粮食不足的问题，产量的提高在水稻育种过程中将一直是至关重要的目标。而且，随着人们生活水平的提高和稻米市场开放，稻米作为商品进行交易，人们对稻谷外观和蒸煮食味等品质的要求也日益提高，尤其是在国际市场上特别突出，改良稻米品质的任务显得越来越迫切(Juliano et al，1993；毛孝强等，2003)。

水稻产量主要由有效穗数、穗粒数、千粒重三大要素决定，其中千粒重受籽粒大小影响。水稻谷粒形状是衡量稻米外观品质的重要指标之一，同时还影响稻米的商品品质和加工品质(糙米率、精米率、整精米率等)。我国的国家优质稻谷标准中还规定优质籼稻品种的长宽比不能低于2.8，谷粒形状已成为育种家选育优质米品种的一个重要指标(康海岐等，2001)。

目前对控制粒型的相关基因研究还比较少，已经克隆的与水稻粒型相关的QTLs有3个：GS3(Chuchuan Fan等，2006)、GW2(Song等，2007)及GW5(Shomura等，2008)。当GW2与GW5功能缺失时，会提高粒宽；GS3的功能缺失则会导致粒型变长。这3个基因对表型都起到一个负调控的作用。到目前为止，对水稻粒型起到正调控作用的相关基因还未见报道。

我们利用染色体单片段代换系材料回交得到的分离群体，采用图位克隆的方法首次克隆了控制水稻籽粒大小、粒宽和产量的基因GW8(grain width in chromosome 8)，并鉴定了一批携带GW8不同单倍型的单片段代换系材料。通过对这些单片段代换系材料的表型分析及遗传互补实验，证明了该基因的功能。我们还分离了该基因的启动子区域，并对GW8基因的组织特异性表达进行了研究。

我们的研究可为今后从分子水平阐明水稻粒型的遗传基础，为水稻的高产育种、及基于稻米品质改良的分子设计育种提供理论依据及材料支持。

发明内容

本发明涉及一种控制水稻粒宽、粒重和产量的基因及其应用。更具体地，本发明人利用水稻染色体单片段代换系材料回交得到的分离群体，采用图位克隆的方法首次克隆了控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8(grain width in chromosome 8)，并鉴定了一批携带GW8不同单倍型的单片段代换系材料。通过对这些单片段代换系材料的表型分析及遗传互补实验，证明了该基因的功能。我们还分离了该基因的启动子区域，并对GW8基因的组织特异性表达进行了研究。

本发明的目的在于提供一种从水稻中分离克隆的一个可同时控制粒型和产量的重要功能基因及其应用。

本发明通过构建GW8的近等基因系，利用图位克隆的方法，将GW8基因精细定位到水稻第八号染色体长臂末端12.6Kb的物理范围内，该区段有且仅有一个预测的候选基因，该基因有3个外显子，共编码455个氨基酸。

在本发明的第一方面中，通过回交及分子标记辅助选择，构建了以华粳籼74为受体亲本，来自于8个供体材料，包括Katy、Basmati385、Basmati370、江西丝苗、联鉴33、Lemont、Amol3、紫恢100的染色体单片段代换系材料，依次命名为：W06-40-48-06-02-03-02-03-1、W09-38-60-07-07-03-04-0049-16、W11-15-08-09-04、W13-30-45-01-10-02-6、W14-09-06-09-12、W23-06-07-02-09-09、W02-15-01-08-14-05-01-32、W05-36-75-01-01-06，这些材料携带了不同单倍型的GW8。

本发明的第二方面涉及控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：1-6中的任何一个所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs：9、10、11中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9和10、11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO：9和10、11中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，GW8 cDNA序列及其变体、相关启动子的核苷酸序列由SEQ IDNOs：1-8所示，具体参见下表1。

表1：SEQ ID NOs：1-8的序列名称及其来源

SEQ ID NO：	名称	来源
			1	野生型GW8 cDNA序列	华粳籼74
2	gw8 cDNA序列(突变体1)	W09-38-60-07-07-03-04-0049-16
			3	gw8 cDNA序列(突变体2)	W02-15-01-08-14-05-01-32
4	野生型GW8 gDNA序列	华粳籼74
			5	gw8 gDNA序列(突变体1)	W09-38-60-07-07-03-04-0049-16
6	gw8 gDNA序列(突变体2)	W02-15-01-08-14-05-01-32
			7	野生型GW8启动子序列	华粳籼74
8	突变体gw8启动子序列	W09-38-60-07-07-03-04-0049-16

[0022] 本发明还涉及控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：7和8所示的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的核苷酸序列；

(4)(1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(5)与(1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述启动子序列的构建体，以及包含所述构建体的细胞，其中所述细胞为植物细胞，优选水稻细胞。

本发明的第三方面涉及分离的多肽(也称蛋白质)，其由本发明所述的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8编码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NOs：9、10、11中任何一个所示的氨基酸序列，

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9、10、11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，

(3)与SEQ ID NOs：9、10、11中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列，

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，

(5)由本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

其中，GW8蛋白序列及其变体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NOs：9-11所示，具体参见下表2。

表2：GW8蛋白序列及其变体蛋白的名称及其来源

SEQ ID NO：	名称	来源
			9	野生型GW8蛋白	华粳籼74
10	gw8蛋白(突变体1)	W09-38-60-07-07-03-04-0049-16
			11	gw8蛋白(突变体2)	W02-15-01-08-14-05-01-32

[0038] 本发明的第四方面涉及一种重组构建体，其含有本发明所述的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的多核苷酸序列。其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

本发明的第五方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明所述的重组构建体，或在其基因组中整合有本发明所述的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的多核苷酸序列。所述宿主细胞可以选自动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞，农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明的第六方面涉及本发明的多核苷酸(即，控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8)或多肽或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在改良作物植物性状(例如，提高作物产量)中的用途。本发明还涉及改良作物植物性状(例如，提高作物产量)的方法，该方法包括制备含有本发明的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的多核苷酸序列或本发明的构建体的作物植物，例如，所述方法可以包括从含有本发明的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的重组植物细胞再生转基因植物或者将含有本发明所述的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的植株与另一植株杂交。所述性状包括但不限于：粒宽、粒长、灌浆速率、产量等。其中所述植物优选是粒宽增加，千粒重增加的植物，其中所述植物优选是农作物，例如水稻。

在本发明的第七方面中，本发明提供所述GW8编码基因的用途，其用于控制作物籽粒的粒重(更优选地，通过增加粒宽和粒重而提高作物的产量)；用于控制作物籽粒的粒型(更优选地，通过控制粒宽改变长宽比而改良作物的品质)；调控但不仅限于细胞分裂速度；作为鉴定作物大粒品种和优质品种的分子标记。

本发明的第八方面涉及一种改良作物的方法。该方法包括：从本发明的重组植物宿主细胞再生转基因植物，或是适量调节GW8基因的表达水平，或是适量改变GW8蛋白生物学活性，或者将含有本发明的粒宽基因的植株与另一植株杂交；其中所述植物优选是籽粒长宽比改变，粒宽增加，千粒重增加的植物，其中所述植物优选是农作物，例如水稻。

以下是对本发明中所用的一些术语的定义。除非另外指明，本发明所用的术语具有本领域普通技术人员已知的意思。

“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。

“嵌合基因”是重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。

“编码序列”是转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。

在本发明上下文中，“对应于”意指当不同GW8基因或蛋白质的核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时，“对应于”一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对，但不必是在相对于特定GW8各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。同样，当特定GW8的编码或氨基酸序列与参照GW8的编码或氨基酸序列比对时，“对应于”参照GW8序列一些计数位置的该特定GW8序列中核酸或氨基酸是与参照GW8序列的这些位置比对，但不必是在该特定GW8蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。

这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列非天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。

“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。

“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核酸序列，包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。

“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。

“同源重组”是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。

当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的多肽时，该核酸序列与参照核酸序列是“同类编码”。

“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境如，例如重组宿主细胞或转基因植物中。

“天然基因”指在未转化细胞的基因组中存在的基因。

术语“天然存在”用于描述可以在自然界中发现的客体，其与人工产生的客体不同。例如，可以从自然来源分离，并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是“天然存在”的。

“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。

“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。

“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。

“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。

“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。

这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。

“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶11的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。

“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。

“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。

“改组的”核酸是通过改组方法，如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人工的和可选地循环的方式(物理地或实际上)重组两个或多个核酸(或字符串)产生改组核酸。一般地，在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸；可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。在一些(但不是所有)改组实施方式中，期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地，可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上下文，改组可以指重组和筛选的全部过程，或可替代地，可以仅指全部过程的重组部分。

在两个核酸或蛋白质序列比对中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60％，优选80％，更优选90％，甚至更优选95％和最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。

为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。

例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mo1.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过目测(通常参见，Ausubel等，下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。

适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对(HSPs)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值(Altschul等，1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列，用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于零)和N(错配残基的罚分值；总是小于零)计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11，期望值(E)10，截断值100，M＝5，N＝-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长值(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵为缺省值(参见，Henikoff & Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。

除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，那么认为检测核酸序列与参照序列相似。

两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。

在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分第2章″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(T_m)约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。

T_m是(在限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于T_m。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有lmg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15MNaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2x SSC漂洗15分钟(参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1x SSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6x SSC漂洗15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度，通常约0.01到1.0Na离子浓度(或其它盐)，通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。

下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，2X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1％SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mMEDTA中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗。

两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此，蛋白质通常与第二蛋白质基本相同，例如，其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。

“合成的”指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，称更密切地类似双子叶和/或单子叶植物基因G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。

“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。

“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。

本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。

附图简述

图1显示近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8的株型比较。(a)，粒型和种子大小比较；(b)，水稻株型比较；(c)，株高和有效穗数比较。

图2显示近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8的穗部表型比较。(a)，粒宽；(b)，粒长；(c)，千粒重；(d)，穗长；(e)，一级枝梗数目比较；(f)，二级枝梗数目比较；(g)，每穗穗粒数比较。

图3显示RT-PCR比较GW8基因在近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8的表达水平比较。R指根；C指茎杆；LB指叶片；LS指叶鞘；LC指叶垫；P1-P8指幼穗长度分别为1厘米，2厘米，3厘米，7厘米，9厘米，13厘米，16厘米和23厘米。

图4显示近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8的谷壳横切面比较。

图5显示近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8灌浆速率测定的比较结果，左图显示近等基因系种子在灌浆过程中鲜重的动态变化；右图显示近等基因系种子在灌浆过程中干重的动态变化。

图6显示遗传互补验证GW8功能的结果。转基因NIL-gw8植株中适当上调GW8基因表达可以增加粒宽和改变长宽比，上图显示过量表达GW8基因导致种子大小的改变；下图显示过量表达GW8基因导致米粒大小的改变。

图7显示转基因NIL-GW8植株中适当下调GW8基因表达可以改变粒宽和提高长宽比。HJX74是指华粳籼74亲本(NIL-GW8)，XT2-9和XT6-16是指两个独立的携带RNAi-GW8载体的转基因水稻植株，上图显示下调GW8基因表达能增大种子大小和改变长宽比；下图显示下调GW8基因表达能增大米粒的大小和改变粒型。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明确定了一个可以改变水稻粒宽、长宽比和千粒重的基因，该基因位于水稻第八号染色体长臂末端，该基因表达量降低或是功能缺失可导致籽粒宽度变窄，千粒重下降。本发明人将该控制水稻粒宽和粒重的基因命名为GW8。

植物转化

在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的控制粒宽和粒重的蛋白。可将本发明的控制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，将所述控制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应粒宽蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35％，优选多于约45％，更优选多于50％，最优选多于约60 ％GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列，但可以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已被证明是不同的(Murray等，Nucl.Acids Res.17：477-498(1989))。此外，可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP 0385962(Monsanto)，EP 0359472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法，用本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变，如上述那些改变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，下列实施例仅用于进一步说明本发明，而不用来限制本发明的精神和范围。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

实施例1：GW8近等基因系的构建

本发明人以我国南方高产水稻品种华粳籼74(来源：华南农业大学农学系育成的高产优质稻种，广东省2000年审定品种)为轮回亲本，籽粒细长的Basmati385(来源：来自巴基斯坦/印度的细长粒型优质水稻品种)为供体亲本进行连续多代的回交，至BC₅F₂根据粒宽变窄的表型选择单株，初步定位后继续用华粳籼74回交。除了对目标区段进行选择外，还对目标性状以外的区段进行背景扫描，最终获得与华粳籼74遗传背景十分接近的近等基因系NIL-gw8材料用于后续的研究。近等基因系NIL-gw8和NIL-GW8表型详见图1。根据近等基因系表型比较分析发现，GW8基因对植株的高度、分蘖数、抽穗期和每穗穗粒数等农艺性状影响不大。

研究所用的分子标记是以PCR为基础的标记，包括SSR标记和自行设计PSM标记(GW8基因定位和克隆所用的引物及其序列详见表3)。SSR标记均来自McCouch等(2001，2002)发表的微卫星标记连锁图；PSM标记是用SSR分析工具(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)分析克隆序列筛选出微卫星重复性好的SSR目标序列，再用Primer5分析软件对这些目标序列进行引物设计。从这些引物中选择了83对在染色体上均匀分布，且在亲本间多态性好的标记用于遗传背景筛选。最终选择到这83对分子标记中除了目标片段所在区域与供体亲本一致，其余均与轮回亲本基因型一致的单株。该单株继续回交两次，自交纯合后用于后续实验。

PCR程序按照Panaud等(1996)的方法稍加修改进行，具体为每管20μl扩增反应体系，包括：0.15μM SSR引物、200μM dNTP、1×PCR反应缓冲液(50mM KCL，10mM Tris-HCL PH8.3，1.5mM MgCL2，0.01％明胶)、50-100ng模板DNA，1UTaq酶；反应程序为：94℃DNA变性5分钟、循环(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)35次、72℃再延伸5分钟。扩增出的PCR产物用6％聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳，电压调至300V，室温下电泳约3小时。电泳完毕后，银染记录带型或凝胶成像。

表3：GW8基因定位和克隆所用的引物及其序列

引物名称	引物序列
		PSM709F	TCACTGATTCCCTTTTACGTTT
PSM709R	GCTCAGTTGCTTCTTCATTAGA
		PSM710F	GCCAGCCAAGAAAAGCGACA
PSM710R	TCTTGAGATCCCACTCCATG
		PSM711F	ATGACCGTCTGCTTCCTCTAA
PSM711R	AACATCGACAGGGAGAAGTGC
		PSM712F	TTCAGATTGGGTATGCTCAT
PSM712R	CATTCAGACTTTCAGAGGCA
		PSM733F	GCCATAGTTATCGTCGTTT
PSM733R	GGAGTATTTGTTTGTTTCG
		PSM734F	GAGACGATGTGACTGAAAAG
PSM734R	ATGAATCTGAACAAAGGTATG
		PSM736F	AAAGGCGAGTCGTGGTAAAGA
PSM736R	GATGGAGATGGTGAGTGGGTG
		PSM695F	CATCGCTTCCAATGCCCTCC
PSM695R	CCCTCTTCTCCGTTCTGACG
		PSM699F	CTCAGATGGAACTGAAGGC
PSM699R	CAACTGGCTAATATGGTGCT
		RM447F	CCCTTGTGCTGTCTCCTCTC
RM447R	ACGGGCTTCTTCTCCTTCTC
		RM502F	GCGATCGATGGCTACGAC
RM502R	ACAACCCAACAAGAAGGACG

[0104]

RM80F	TTGAAGGCGCTGAAGGAG
		RM80R	CATCAACCTCGTCTTCACCG
RM281F	ACCAAGCATCCAGTGACCAG
		RM281R	GTTCTTCATACAGTCCACATG
RM5493F	GACAAAACACAAAGCAGGAC
		RM5493R	TAACAAACCAACCAACCAAG
RM3754F	TCGTAGGTGGGGCTAACAAG
		RM3754R	CACCCTCTTCTTCCTCCGAC
OSR7F	AACTCATTTGTCACACGCACA
		OSR7R	AAGCCTTTCCTCGTAACACG

实施例2：GW8近等基因系的穗部性状比较研究

本发明人于2010年1月在海南省陵水县实验基地试验田播种NIL-GW8和NIL-gw8(近等基因系NIL-GW8和NIL-gw8的构建详见实施例1的介绍，连续回交7代获得近等基因系)，待植株成熟后，分别统计一次枝梗数(primary branches，pb)，二次枝梗数目(secondary branches，sb)，穗长(panicle length，PL)和每穗粒数(number of grains on each panicle)等性状，具体见图2。

具体的统计方法：在水稻成熟后，分别在田间取30株主分蘖上的穗，分别统计每穗上的穗粒数(number of grain per panicle)，一次枝梗数目(number of primary branches)，二次枝梗数目(number of secondary branches)，穗长(panicle length)，直接计数并记录。

粒型、粒重的测量。谷粒自然干燥后，浮水冲去秕粒，37℃恒温干燥后，在室温条件下存放3个月及以上，保证谷粒的充分干燥和各株系间含水量的相对一致。从每个株系中随机选取形态正常的种子，以游标卡尺测量其粒宽、粒长，作为粒形的考查指标。谷粒千粒重根据随机选取的100粒饱满谷粒进行估算，于电子天平上进行称量其总重，取20次的平均值即为粒重。试验结果允许差：千粒重20g以下的不超过0.4g，千粒重20.1～50g的不超过0.7g，千粒重50.1g以上的不超过1.0g。

差异显著性检测的方法：1.建立虚无假设，即先认为两者没有差异；2.通过统计运算，确定假设成立的概率P。3.根据P的大小，判断假设是否成立。我们的实验中的标准P＜0.05。统计表明NIL-GW8 与NIL-gw8在穗长、一次枝梗数、二次枝梗数目和每穗穗粒数(图2，d、e、f和g)没有差异，二者的粒宽和粒长差异均达到极显著差异，千粒重NIL-GW8较NIL-gw8高12％左右，差异也极显著(图2，a、b和c)。因而NIL-GW8有比NIL-gw8有更高产量，表明含有GW8的宽粒水稻品种要比含有gw8的窄粒水稻品种有增加产量的潜能。

实施例3：水稻粒宽、粒重基因GW8的获得

本发明利用华粳籼74(粒宽介于2.65-2.75mm)与窄粒的Basmati385(粒宽介于2.15-2.25mm)构建了染色体单片段代换系材料，用此单片段代换系材料发展定位群体，利用图位克隆技术克隆了GW8基因，其基因的基因组DNA序列(GW8 gDNA)如SEQ ID NO：4所示。该基因含有2个内含子，cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，在华粳籼74中编码一条含有454个氨基酸的蛋白，如SEQ ID NO：9所示。

序列比较分析表明，构建的一对近等基因系材料在编码区存在5处核苷酸序列差异(四个是碱基置换突变：T36C，T236C，A818C和T1089G。另一个是3bp插入突变，具体是在329位置上插入GCG)，其中3处涉及到编码氨基酸的变异(C36T，L236P和3bp插入突变)。该序列差异还存在于华粳籼74与本发明中测序的另一宽粒的单片段代换系材料W06-40-48-06-02-03-02-03-1之间，由此推断这几处氨基酸变异不是造成粒宽改变的主要原因。

通过单片段代换系材料中GW8表达量的分析比较，我们发现GW8在华粳籼74及W06-40-48-06-02-03-02-03-1幼穗中的表达量显著高于W09-38-60-07-07-03-04-0049-16幼穗中的表达量。正是表达量的降低，导致了W09-38-60-07-07-03-04-0049-16粒型变窄。

实施例4：水稻粒宽、粒重和产量基因GW8的变异形式

本发明人以同样表现为窄粒的单片段代换系材料W02-15-01-08-14-05-01-32为研究对象，从W02-15-01-08-14-05-01-32中获得另一条GW8的变异基因，该基因的第3外显子上一个CT(ORF的第1007位与1008位之间)插入导致翻译移码，并提前终止，其基因序列如SEQ ID NO：6所示。导致其编码的蛋白缺失部分氨基酸序列，仅编码417个氨基酸，如SEQ ID NO：11所示。

本发明人以来自于江西丝苗的单片段代换系材料W13-30-45-01-10-02-6为研究对象，该材料表现为宽粒。测序发现该材料与受体亲本华粳籼74中的GW8相比存在多处核苷酸差异，该材料第3外显子(1007位与1008位之间)相对于华粳籼74不存在CT插入，其余的变异位点均相同于W02-15-01-08-14-05-01-32和华粳籼74之间的差异。

qRT-PCR分析，W02-15-01-08-14-05-01-32的表达量相对于华粳籼74没有明显的下调或上调，二者GW8表达量水平一致。以上证明，GW8蛋白的功能缺失导致W02-15-01-08-14-05-01-32粒型变窄。

实施例5：GW8的分子标记辅助选择育种实验

本发明人在GW8内部设计PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)，用Taq酶进行PCR扩增宽粒材料与窄粒材料(如华粳籼74与W02-15-01-08-14-05-01-32置换系)的DNA，经过6％聚丙烯凝胶电泳可检测到CT插入造成的差异，宽粒品种得到的条带稍大，这可以作为特异性鉴定宽粒-窄粒材料的分子标记。在大粒品种与小粒品种的杂交后代群体中，可用该标记快速筛选出携带宽粒基因的后代材料。

实施例6：GW8水稻转基因实验

利用近等基因系NIL-GW8(由实施例1构建)幼穗为材料，反转录扩增获得GW8基因全长cDNA。根据GW8基因的cDNA序列，设计引物，RNAi-BamH I F：5’-CGGGATCCcaggagtttgatgaggccaag-3’和RNAi-Xba I R：5’-GCTCTAGA aagctgatctcgccttcctgg-3’。以GW8基因全长cDNA为模板扩增GW8基因C端长31lbp的序列，将扩增产物连接到中间载体pBluescript SK(+)(购自Invitrogen，USA)，质粒测序正确后，经Xba I和BamH I双酶切回收插入片段，连接到经Xba I和BamH I双酶切的质粒pUCCRNAi(本实验构建的中间载体，详细构建方法参见Huang et al.，Nature Genetics，2009，41(4)：494-497)上，将连接好的质粒经Spe I和Bgl II双酶切，回收质粒部分，再与经Xba I和BamH I双酶切回收的片段经同尾酶连接。这样质粒pUCCRNAi上连接有两段插入方向相反的GW8基因的同一cDNA片段，构建成pUCCRNAi：GW8-RNAi，该质粒经Pst I单酶切，与同样经Pst I酶切的质粒pCAMBLA-2300-Actin连接，构建成RNAi干涉载体pAct：GW8-RNAi。采用农杆菌介导的转化法导入华粳籼74中。

转基因阳性植株中GW8基因表达量显著下降。转基因植株的株高、抽穗期和穗型等农艺性状没有明显变化，但转基因水稻的谷粒粒型改变明显，籽粒变窄、变长(图7所示)。在NIL-gw8背景下，过表达GW8基因导致籽粒变宽、粒变短(图6所示)。这说明我们可以通过适当调节GW8基因的表达来改变粒宽、长宽比和粒重等表型，进而影响水稻产量。

参考文献

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Claims

1.控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：1-6中的任何一个所示的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs：9、10和11中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.一种重组构建体，其特征在于包含权利要求1的基因GW8的多核苷酸序列，所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

3.一种重组宿主细胞，其特征在于包含权利要求1的基因GW8的多核苷酸序列或权利要求2的重组构建体，或它的基因组中整合有权利要求1的基因GW8的多核苷酸序列，其中所述细胞选自动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞。

4.权利要求3所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为植物细胞。

5.权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为水稻细胞。

6.分离的多肽，其由权利要求1的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8编码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NOs：9、10和11中任何一个所示的氨基酸序列，

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，

(3)与SEQ ID NOs：9、10和11中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列，

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，

(5)由权利要求1的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

7.生产产量提高的作物的方法，该方法包括：从权利要求4的重组宿主细胞再生转基因植物，或者将含有权利要求1所述的控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的植株与另一植株杂交，其中所述植物优选是粒宽增加，千粒重增加的植物，其中所述植物优选是农作物，例如水稻。

8.控制水稻粒宽、粒重和产量的基因GW8的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NOs：7和8所示的核苷酸序列；

(4)(1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

(5)与(1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

9.包含权利要求8的启动子序列的构建体。

10.包含权利要求9的构建体的细胞，其中所述细胞为植物细胞，优选水稻细胞。