CN103409418B - 与水稻大粒基因gs2紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记及其应用。通过重组自交系高代粒形分离群体，将水稻粒形主效基因GS2精细定位至第2染色体上GS2-6到GS2-8的33.2kb范围内，获得一批与GS2紧密连锁的分子标记，其中包括公共数据库标记RM3212及自行开发的22个InDel标记(GS2-1到GS2-22)。本发明可有效检测GS2基因位点，从而提高大粒型品种(或亲本)的选育效率。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体地说，涉及一种与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
全球有一半以上的人口以稻米作为主食，水稻是最重要的粮食作物之一。水稻粒形不仅影响千粒重继而间接影响产量，还对稻米品质有重要影响。国内外许多消费者对细长粒形的籼稻品种有所偏爱，在《中华人民共和国国家标准：优质稻谷GB/T17891-1999》中明确规定优质稻谷的稻米长宽比不能低于2.8。因此，培育长粒形水稻品种对提高稻谷产量和稻米质量具有重要意义。
稻谷粒形的遗传基础比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL(QuantitativeTraitLocus)进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行研究。利用这种方法，近年来已经发现和克隆了部分控制稻谷粒形的QTLs。总体来看，已克隆与粒形有关的基因主要有3类：第一类为多效基因，对粒形的影响只是其作用之一，但效应可能很大。其典型代表为矮秆小粒基因，如d11(Tanabeetal.2005.ANovelCytochromeP450IsImplicatedinBrassinosteroidBiosynthesisviatheCharacterizationofaRiceDwarfMutant,dwarf11,withReducedSeedLength.ThePlantCell3:776-790)、d1(Ueguchi-Tanakaetal.2000.Ricedwarfmutantd1,whichisdefectiveintheαsubunitoftheheterotrimericGprotein,affectsgibberellinsignaltransduction.ProcNatlAcadSciUSA21:11638-11643)等，均表现植株矮化，谷粒短而圆。此类基因一般难以直接应用于生产；第二类为粒宽主效控制基因，可能对水稻的籽粒灌浆速度有一定影响，对其它农艺性状的影响较小。已克隆的基因主要有GW2(Songetal.2007.AQTLforricegrainwidthandweightencodesapreviouslyunknownRING-typeE3ubiquitinligase.NatureGenetics39:623-630)、GW5(Wengetal.2008.IsolationandinitialcharacterizationofGW5,amajorQTLassociatedwithricegrainwidthandweight.CellResearch12:1199-1209)、GS5(Lietal.2011.NaturalvariationinGS5playsanimportantroleinregulatinggrainsizeandyieldinrice.NatureGenetics12:1266-1269)和qGW8(Wangetal.2012.Controlofgrainsize,shapeandqualitybyOsSPL16inrice.NatureGenetics8:950-954)；第三类为粒长主效控制基因，可能对粒宽或水稻的籽粒灌浆速度有一定影响，对其它农艺性状的影响较小。已克隆的基因主要有GS3(Fanetal.2006.GS3,amajorQTLforgrainlengthandweightandminorQTLforgrainwidthandthicknessinrice,encodesaputativetransmembraneprotein.TheoreticalandAppliedGenetics6:1164-1171)和GL3.1(Qietal.2012.ThenovelquantitativetraitlocusGL3.1controlsricegrainsizeandyieldbyregulatingCyclin-T1；3.CellResearch12:1666-1680)。
尽管已克隆出一批控制水稻粒形的基因，然而目前对其遗传基础的了解还相当有限。因此，迫切需要挖掘更多新的水稻粒形控制基因位点，为理解其遗传基础提供条件，也为更好更快地培育具有理想粒形的水稻新品种提供基因资源和技术支持。2012年，发明人在恢复系R1126的改造后代中(F6，R1126/川大粒，自F2代起采用系谱法选择)发现部分株系除粒形有差异外其它农艺性状均已基本稳定，初步遗传分析显示其粒形分离表现单基因分离特性，卡平方测验结果也显示大粒与小粒的株数符合3:1的分离比例，表明该粒形性状为一对核主效基因控制，大粒对小粒为不完全显性，后续定位结果将该基因定位于第2染色体上的33.2kb区间，遂将来自‘川大粒’的大粒基因命名为GS2(Grainshape2)。张分云(2010年)利用特大粒水稻资源特大籼在第2染色体RM6295标记6.2cM附近控制粒型的QTL，命名为qGS2，推测该基因可能为为水稻大粒基因GS2或与其等位。然而在该研究中，qGS2基因被定位在较大的区间，遗传距离远未达到实用分子标记的要求。
发明内容
本发明的目的是提供水稻大粒基因GS2的分子标记，通过检测这些与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记，可以预测及鉴定水稻的粒形，加快长粒(或大粒)水稻新品种(或亲本)的选育进度。
本发明的与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记，即水稻粒形主效基因位点GS2的分子标记(GS2-1、GS2-2、GS2-3、GS2-4、GS2-5、GS2-6、RM3212、GS2-7、GS2-8、GS2-9、GS2-10、GS2-11、GS2-12、GS2-13、GS2-14、GS2-15、GS2-16、GS2-17、GS2-18、GS2-19、GS2-20、GS2-21和GS2-22)，由下述之一的引物对经PCR扩增获得：
1)分子标记名称，GS2-1
正向引物：5’-ATACATTATGGGCACTAG-3’
反向引物：5’-ATATTAAGGGCAACAGCA-3’
2)分子标记名称，GS2-2
正向引物：5’-TTCAGTTCCTTCCTGGTCC-3’
反向引物：5’-CCAATCCCAATCTGACCC-3’
3)分子标记名称，GS2-3
正向引物：5’-GCCGTAGGAGTAAGACCC-3’
反向引物：5’-TTTCACTTGCTCCATCCA-3’
4)分子标记名称，GS2-4
正向引物：5’-GCCGCCTTTTGGGTGGTA-3’
反向引物：5’-CCTTCCTTCTCCCTGCTTC-3’
5)分子标记名称，GS2-5
正向引物：5’-GTGGCACCATTGTTCTGT-3’
反向引物：5’-CTCTGGCCCCTGCATTAA-3’
6)分子标记名称，GS2-6
正向引物：5’-GAGTATAGTATGTGGCGACGTG-3’
反向引物：5’-GATGTGGGAGGTTGGAGC-3’
7)分子标记名称，RM3212
正向引物：5’-AGACGACAAACACCTGCCTC-3’
反向引物：5’-CAAACACAAACGCAGCCTC-3’
8)分子标记名称，GS2-7
正向引物：5’-GAGAAAGCCATTAGTGCA-3’
反向引物：5’-TCTACCAAACCAAAACAA-3’
9)分子标记名称，GS2-8
正向引物：5’-GGGTGCCGCTGGTAGAAT-3’
反向引物：5’-ACCGCTCGCTGAGAAGAA-3’
10)分子标记名称，GS2-9
正向引物：5’-CATACCTCCGCAACCTTC-3’
反向引物：5’-AGCACGCAATACAAACAT-3’
11)分子标记名称，GS2-10
正向引物：5’-TATAGATGATGCATGAGA-3’
反向引物：5’-ATTGTAGATGGTGTCGTC-3’
12)分子标记名称，GS2-11
正向引物：5’-GGGGTCTTGTACCTTTCA-3’
反向引物：5’-ATGGAGTATGGGATTTGG-3’
13)分子标记名称，GS2-12
正向引物：5’-TGGATCTAACGAGGAAAG-3’
反向引物：5’-CATCTGCCAATAGGTAAT-3’
14)分子标记名称，GS2-13
正向引物：5’-AAGGGAACAAGTTGTAAA-3’
反向引物：5’-AGTGAAGTGAGCAAGGAC-3’
15)分子标记名称，GS2-14
正向引物：5’-GCACCTCTTGGTTCGTCA-3’
反向引物：5’-CGTTCATCCGGCTATTGT-3’
16)分子标记名称，GS2-15
正向引物：5’-CCCGTGTTCACTGTTCAA-3’
反向引物：5’-TACGCCAGGATCTCGTCA-3’
17)分子标记名称，GS2-16
正向引物：5’-ACCTTTCCCGTATTTGCTC-3’
反向引物：5’-CCCTTGGGTATCATCTAGTGC-3’
18)分子标记名称，GS2-17
正向引物：5’-TAGTAGATAGTCAAGGATTC-3’
反向引物：5’-ATGATGGTTTGCTTTTCA-3’
19)分子标记名称，GS2-18
正向引物：5’-ACATCAACCCTAAAGTAT-3’
反向引物：5’-CACTGACGAGATTGTATC-3’
20)分子标记名称，GS2-19
正向引物：5’-TCGGAGACCAAGCACATAG-3’
反向引物：5’-GAGCAGTCACGACCAACG-3’
21)分子标记名称，GS2-20
正向引物：5’-GAGGACGCCGTTTACCAG-3’
反向引物：5’-GTGAGCGAGCTACCGAAT-3’
22)分子标记名称，GS2-21
正向引物：5’-CCCATCTCCATACTTCAA-3’
反向引物：5’-CAAACCAAACCAGCCCTA-3’
23)分子标记名称，GS2-22
正向引物：5’-AATAGTCGTAGGCTCTTAG-3’
反向引物：5’-CGCCTTATTATCCCATAT-3’。
本发明还提供所述与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记在选育水稻大粒品种中的应用。
本发明还提供一种鉴定和选育水稻大粒品种的方法，包括以下步骤：
1)分别以水稻大粒基因GS2的供体、受体材料作为亲本，提取亲本基因组DNA，利用权利要求1所述的用于PCR扩增与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记的引物对进行PCR扩增，选取1～2对在供体材料与受体材料间扩增产物多态性好、易于鉴定识别的引物对作为检测标记；
2)提取待测水稻的基因组DNA，利用步骤1)中筛选到的检测标记进行PCR扩增，检测扩增产物。
如果待测水稻具有纯合GS2供体带型，判定其基因型为GS2GS2，如果待测水稻具有杂合带型，判定其基因型为GS2gs2，如果待测水稻具有纯合受体带型，判定其基因型为gs2gs2。
PCR扩增体系按10μl计为：模板DNA10ng、正向、反向引物各0.8μmol、dNTPs0.2mmol、10×PCR缓冲液1μl、TaqDNA聚合酶0.25U，用ddH2O补齐至10μl。
PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟。
PCR扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色法检测，或采用琼脂糖凝胶电泳和EB染色法检测，或采用本领域已知的常规检测技术。
本发明中涉及的水稻大粒基因GS2的供体材料包括‘川大粒’，‘川大粒’携带大粒基因GS2的衍生材料及其它具有大粒基因GS2的材料。
本发明中涉及的水稻大粒基因GS2的受体材料包括稻属所有材料，例如栽培稻及野生稻。
本发明还提供水稻粒形主效基因位点GS2的分子标记检测方法，即用上述之一的引物对扩增大粒基因GS2的供体(包括‘川大粒’及其携带大粒基因GS2的衍生材料)及受体(包括栽培稻及野生稻在内的稻属所有材料)基因组DNA，扩增产物多态性好、易于辨别的引物对即可作为检测标记，选用其中1～2个引物对作为检测标记。待测材料具有GS2纯合供体带型说明其基因型为GS2GS2，杂合带型(既有供体带型又有受体带型)说明其基因型为GS2gs2，纯合受体带型说明其基因型为gs2gs2。
该基因位点位于水稻基因组第2染色体长臂的分子标记GS2-6和GS2-8之间的区域内。本发明利用粒形存在分离的高世代重组自交系(F6)将GS2初步定位在分子标记RM13819和RM13863之间。接着扩大分离群体(F7)，利用745个隐性小粒单株将其定位在GS2-1和GS2-21之间。GS2-1和GS2-21(自己开发的InDel标记)均只有一个单交换，交换率为(1/745)×100％＝0.13％；其它20个标记均无交换。根据NCBIPrimer-Blast的结果，GS2-1和GS2-21在粳稻品种日本晴上物理距离为154K。上述分子标记与大粒基因GS2的遗传距离均在1cM以下，可用于分子标记辅助选择育种。2013年上半年，利用这些标记对2576个隐性单株进行了分析，GS2基因位于GS2-6和GS2-8之间，物理距离33.2kb，GS2与SSR标记RM3212、GS2-7共分离。此次结果缩小了范围，进一步确认了前面结果的正确性。在筛选用于辅助选择的分子标记时，可优先选择RM3212和GS2-7；如RM3212和GS2-7无多态性，优先选择接近RM3212和GS2-7的分子标记用于辅助选择。
筛选上述标记引物的过程如下：
(1)2012年春，在恢复系R1126的改造后代中(F6，R1126/川大粒，自F2代起采用系谱法选择)发现部分株系除粒形有差异外其它农艺性状均已基本稳定，初步遗传分析显示其粒形分离表现单基因分离特性。定位群体包括F6、F7和F8。F6(R1126/CDL)为初定位群体，F7和F8为精细定位群体。2012年-2013年3季(F6、F7和F8代)卡平方测验结果显示，大粒与小粒的株数符合3:1的分离比例(χ2﹤χ20.05＝3.84)，表明该粒形性状为一对核主效基因控制，大粒对小粒为不完全显性，后续定位结果表明该基因位于第2染色体上，遂将来自‘川大粒’的大粒基因命名为GS2(Grainshape2)。
(2)从分子生物学数据库网站(http://www.gramene.org/)和公开发表文献中获得SSR、SFP和ILP标记共400个，用这些标记对双亲(R1126和‘川大粒’)基因组DNA进行PCR扩增，筛选双亲具有多态性的分子标记，总共筛选到129对在双亲之间呈现多态性的标记。从多态性引物中选取113个均匀分布于水稻12条染色体上的标记扩增近等基因池，将显性大粒基因GS2初步定位在RM3289到RM13863之间。从分子生物学数据库网站(http://www.gramene.org/)查找标记RM3289到RM13863目标区段的SSR标记，并对双亲进行扩增，共筛选到4个双亲间具有多态性的标记，将大粒基因GS2定位在RM13819到RM13863之间(图2)。通过BLAST程序在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)比对分析R1126(籼稻，已完成全基因组重测序)和‘日本晴’(粳稻)在目标区间的序列差异，寻找差异在3bp及以上的InDel，用primerPremier5.0软件设计InDel标记，筛选在双亲间具有多态性的标记用于精细定位。
(3)齐穗期后开始取样，目测选取隐性小粒(粒长≤11mm)单株幼嫩叶片，取样单株挂牌与叶片对应，如分子检测显示发生交换，则取样测量验证。粒长的测定方法为：随机数取完整无损的稻谷10粒，平放于测量板上，按照头对头、尾对尾的，不重叠、不留隙的方式，紧靠直尺摆成一行，读出长度。重复2次，2次误差不超过0.5mm，求其平均值即为粒长。基因组DNA提取采用CTAB法。
本发明提供了一种筛选大粒水稻的方法，利用本发明提供的上述23个引物对之一进行PCR扩增供体、受体及待检水稻基因组DNA，如果供体和受体水稻基因组DNA的扩增产物存在易于识别、稳定的多态性，该引物对即可用于检测待检水稻。如果均为大粒基因GS2供体带型，说明为纯合大粒基因型GS2GS2；如果既有供体带型又有受体带型，说明为杂合基因型GS2gs2；如果均为受体带型，说明为纯合小粒基因型gs2gs2。
本发明首次发现了与大粒基因GS2紧密连锁的分子标记，借助分子标记辅助选择技术可有目的地进行大粒基因的导入和聚合，培育大粒(或长粒)型水稻新品种(或亲本)。本发明的有益效果表现在：
(一)本发明首次精细定位了水稻材料‘川大粒’中的大粒主效基因GS2。
(二)纯合大粒基因型(GS2GS2)较纯合小粒基因型(gs2gs2)粒长增加约3mm，粒宽增加约0.4mm。但粒形遗传相当复杂，在某些特殊遗传背景下，大粒基因GS2对粒形的作用有可能受到抑制。研究过程中发现，在某些遗传背景条件下，GS2的粒宽效应可能被抑制，粒长效应受影响较小或不受影响，有利于培育出高档特长粒优质米品种。
(三)通过本发明分子标记定位的主效基因位置明确，鉴定方便。通过检测与GS2基因位点连锁的分子标记，即可预测水稻的粒形，可用于苗期早期筛选、检测基因型纯合与否及进行多基因聚合育种。在聚合多个长粒(或大粒)基因培育(或创制)高档特长粒品种(或亲本)时效果尤其显著。而且，本发明检测方便快速，不受环境影响。
附图说明
图1为大粒基因GS2的初步定位；其中，垂直线表示水稻第2染色体，水平短线表示染色体上的分子标记，垂直线左边的数值表示标记间的遗传距离(cM)。
图2为大粒基因GS2的精细定位；其中，GS2定位于InDel标记GS2-6和GS2-8之间的33.2kb区域。
图3为稻谷粒长分离(粒长：GS2GS2＝13.08；gs2gs2＝10.06)。
图4为稻谷粒宽分离(粒宽：GS2GS2＝3.39；gs2gs2＝2.96)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用材料均可从国家种质资源库或相关育种单位获得。
实施例1与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记的获得及应用
(一)定位群体及表型鉴定
2011-2012年海南南繁期间，在育种材料中[F6，R1126(稻谷粒长接近10mm)/川大粒(稻谷粒长13mm左右，由四川省农业科学院水稻高粱研究所提供)，自F2代起采用系谱法选择]发现部分株系除粒形有分离外其它农艺性状已基本稳定，遗传分析显示其粒形表现单基因分离特性，通过海南2季和长沙1季的考察，发现该材料粒形分离均符合单基因分离特性，且粒形差异明显，大粒对小粒表现为不完全显性。首先选用农艺性状基本稳定、粒形分离的株系作为初级定位群体，大粒、小粒各取10株构建近等基因池。获得初定位结果后，利用连锁分子标记从大粒材料中筛选杂合带型单株，分单株收获和种植，进一步获得较大的定位群体(F7)。按照上述方法，继续扩大群体(F8)。
齐穗期后开始取样，粒长的测定方法为：随机数取完整无损的稻谷10粒，平放于测量板上，按照头对头、尾对尾的，不重叠、不留隙的方式，紧靠直尺摆成一行，读出长度。重复2次，2次误差不超过0.5mm，求其平均值即为粒长。由于粒形差异显著，除遗传分析采取上述方法外，一般采取目测选取隐性小粒(粒长≤11mm)单株，取样单株挂牌与叶片对应，如分子检测显示发生交换，则取样测量验证。
(二)分子标记获得及开发
从分子生物学数据库网站(http://www.gramene.org/)和公开文献中获得312对SSR标记，31对SFP标记和57对ILP标记，水稻12条染色体均有分布。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，筛选在双亲间具有多态性的标记用于初步定位。通过BLAST程序在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)比对分析R1126(籼稻)和‘日本晴’(粳稻)在目标区间的序列差异，寻找差异在3bp及以上的InDel，用PrimerPremier5.0软件设计InDel标记，引物(表1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，筛选在双亲间具有多态性的标记用于精细定位。
表1多态性标记引物对、扩增产物大小及在第2染色体上的位置
| 引物名称 | 产物大小 | 正向引物(5′-3′) | 反向引物(5′-3′) | 位置(NCBI) |
| GS2-1 | 280bp | ATACATTATGGGCACTAG | ATATTAAGGGCAACAGCA | 29702045 |
| GS2-2 | 119bp | TTCAGTTCCTTCCTGGTCC | CCAATCCCAATCTGACCC | 29705167 |
| GS2-3 | 152bp | GCCGTAGGAGTAAGACCC | TTTCACTTGCTCCATCCA | 29716981 |
| GS2-4 | 145bp | GCCGCCTTTTGGGTGGTA | CCTTCCTTCTCCCTGCTTC | 29720382 |
| GS2-5 | 144bp | GTGGCACCATTGTTCTGT | CTCTGGCCCCTGCATTAA | 29737769 |
| GS2-6 | 84bp | GAGTATAGTATGTGGCGACGTG | GATGTGGGAGGTTGGAGC | 29741153 |
| RM3212 | 186bp | AGACGACAAACACCTGCCTC | CAAACACAAACGCAGCCTC | 29754013 |
| GS2-7 | 657bp | GAGAAAGCCATTAGTGCA | TCTACCAAACCAAAACAA | 29767941 |
| GS2-8 | 180bp | GGGTGCCGCTGGTAGAAT | ACCGCTCGCTGAGAAGAA | 29774335 |
| GS2-9 | 179bp | CATACCTCCGCAACCTTC | AGCACGCAATACAAACAT | 29786025 |
| GS2-10 | 102bp | TATAGATGATGCATGAGA | ATTGTAGATGGTGTCGTC | 29795504 |
| GS2-11 | 267bp | GGGGTCTTGTACCTTTCA | ATGGAGTATGGGATTTGG | 29797737 |
| GS2-12 | 112bp | TGGATCTAACGAGGAAAG | CATCTGCCAATAGGTAAT | 29800233 |
| GS2-13 | 88bp | AAGGGAACAAGTTGTAAA | AGTGAAGTGAGCAAGGAC | 29805737 |
| GS2-14 | 92bp | GCACCTCTTGGTTCGTCA | CGTTCATCCGGCTATTGT | 29816288 |
| GS2-15 | 90bp | CCCGTGTTCACTGTTCAA | TACGCCAGGATCTCGTCA | 29822141 |
| GS2-16 | 199bp | ACCTTTCCCGTATTTGCTC | CCCTTGGGTATCATCTAGTGC | 29822237 |
| GS2-17 | 125bp | TAGTAGATAGTCAAGGATTC | ATGATGGTTTGCTTTTCA | 29824346 |
| GS2-18 | 135bp | ACATCAACCCTAAAGTAT | CACTGACGAGATTGTATC | 29835997 |
| GS2-19 | 100bp | TCGGAGACCAAGCACATAG | GAGCAGTCACGACCAACG | 29843775 |
| GS2-20 | 83bp | GAGGACGCCGTTTACCAG | GTGAGCGAGCTACCGAAT | 29845395 |
| GS2-21 | 224bp | CCCATCTCCATACTTCAA | CAAACCAAACCAGCCCTA | 29856355 |
| GS2-22 | 186bp | AATAGTCGTAGGCTCTTAG | CGCCTTATTATCCCATAT | 29688978 |
(三)大粒基因GS2的初步定位
以400个SSR、SFP和ILP标记对双亲基因组DNA进行PCR扩增，筛选双亲具有多态性的分子标记，总共筛选到129对在双亲之间呈现多态性的标记。2012年上半年，从多态性性引物中选取113个均匀分布于水稻12条染色体上的标记扩增近等基因池，将显性大粒基因GS2初步定位在RM3289到RM13863之间。从分子生物学数据库网站(http://www.gramene.org/)查找标记RM3289到RM13863目标区段的SSR标记，筛选到4个双亲间具有多态性的标记：RM1342、RM5305、RM13819、RM3212，再用这6个标记检测179株隐性单株，RM3289、RM1342、RM5305、RM13819、RM3212、RM13863和RM13870与显性大粒基因GS2的遗传距离分别为8.10、6.42、6.98、0.84、0、0.28和0.56cM，于是将显性大粒基因GS2定位在RM13819到RM13863之间(图1)。
(四)大粒基因GS2的精细定位
由于初定位目标区段(标记RM13819到RM13863)已公布的SSR标记在亲本R1126和‘川大粒’之间仅有1个多态性标记(RM3212)，利用R1126全基因组重测序数据和已公布的‘日本晴’基因组数据的比对结果设计了一批InDel标记用于精细定位。2012年下半年，利用这些标记对745个隐性单株进行了分析，GS2基因位于GS-1和GS-21之间，物理距离约154kb；2013年上半年，利用这些标记对2576个隐性单株进行了分析，GS2基因位于GS-6和GS-8之间，物理距离为33.2kb，GS2与SSR标记RM3212和InDel标记GS2-7共分离(图2)。
(五)结果与分析
在定位过程中，以标记RM3212筛选了80个杂合单株构建了30000株的F8定位群体，杂合单株单收单种，每个株系均出现了粒形分离，其筛选准确率达到100％(图3和图4)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献：
Tanabeetal.2005.ANovelCytochromeP450IsImplicatedinBrassinosteroidBiosynthesisviatheCharacterizationofaRiceDwarfMutant,dwarf11,withReducedSeedLength.ThePlantCell3:776-790.
Ueguchi-Tanakaetal.2000.Ricedwarfmutantd1,whichisdefectiveintheαsubunitoftheheterotrimericGprotein,affectsgibberellinsignaltransduction.ProcNatlAcadSciUSA21:11638-11643.
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张分云.水稻大粒品种“特大籼”的粒型和粒重QTL定位[D].长沙:湖南农业大学，2010年。
Claims (1)
1.一种鉴定和选育水稻大粒品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别以水稻大粒基因GS2的供体、受体材料作为亲本，提取亲本基因组DNA，利用分子标记的引物对对分子标记进行PCR扩增，选取1～2对在供体材料与受体材料间扩增产物多态性好、易于鉴定识别的引物对对分子标记进行扩增；
其中，所述GS2基因为来自‘川大粒’的大粒基因，位于第2染色体上的GS2-6和GS2-8之间，物理距离33.2kb，GS2基因与SSR标记RM3212、GS2-7共分离；
其中，所述的GS2的供体为‘川大粒’；
其中，所述的GS2的受体材料为除‘川大粒’及其衍生材料外的水稻品种；
(2)提取待测水稻的基因组DNA，利用步骤(1)中筛选到的引物对进行PCR扩增，检测扩增产物；
如果待测水稻具有纯合GS2供体带型，判定其基因型为GS2GS2，如果待测水稻具有杂合带型，判定其基因型为GS2gs2，如果待测水稻具有纯合受体带型，判定其基因型为gs2gs2；
其中，在步骤(1)和(2)中，首先选择分子标记RM3212和GS2-7；如RM3212和GS2-7无多态性，再选择接近RM3212和GS2-7的分子标记用于辅助选择；
所述用于辅助选择的分子标记为与水稻大粒基因GS2紧密连锁的分子标记，分子标记选自GS2-1、GS2-2、GS2-3、GS2-4、GS2-5、GS2-6、GS2-8、GS2-9、GS2-10、GS2-11、GS2-12、GS2-13、GS2-14、GS2-15、GS2-16、GS2-17、GS2-18、GS2-19、GS2-20、GS2-21和GS2-22中的至少一种；
所述用于PCR扩增分子标记的引物对为：
1)分子标记名称，GS2-1
正向引物：5’-ATACATTATGGGCACTAG-3’
反向引物：5’-ATATTAAGGGCAACAGCA-3’
2)分子标记名称，GS2-2
正向引物：5’-TTCAGTTCCTTCCTGGTCC-3’
反向引物：5’-CCAATCCCAATCTGACCC-3’
3)分子标记名称，GS2-3
正向引物：5’-GCCGTAGGAGTAAGACCC-3’
反向引物：5’-TTTCACTTGCTCCATCCA-3’
4)分子标记名称，GS2-4
正向引物：5’-GCCGCCTTTTGGGTGGTA-3’
反向引物：5’-CCTTCCTTCTCCCTGCTTC-3’
5)分子标记名称，GS2-5
正向引物：5’-GTGGCACCATTGTTCTGT-3’
反向引物：5’-CTCTGGCCCCTGCATTAA-3’
6)分子标记名称，GS2-6
正向引物：5’-GAGTATAGTATGTGGCGACGTG-3’
反向引物：5’-GATGTGGGAGGTTGGAGC-3’
7)分子标记名称，GS2-7
正向引物：5’-GAGAAAGCCATTAGTGCA-3’
反向引物：5’-TCTACCAAACCAAAACAA-3’
8)分子标记名称，GS2-8
正向引物：5’-GGGTGCCGCTGGTAGAAT-3’
反向引物：5’-ACCGCTCGCTGAGAAGAA-3’
9)分子标记名称，GS2-9
正向引物：5’-CATACCTCCGCAACCTTC-3’
反向引物：5’-AGCACGCAATACAAACAT-3’
10)分子标记名称，GS2-10
正向引物：5’-TATAGATGATGCATGAGA-3’
反向引物：5’-ATTGTAGATGGTGTCGTC-3’
11)分子标记名称，GS2-11
正向引物：5’-GGGGTCTTGTACCTTTCA-3’
反向引物：5’-ATGGAGTATGGGATTTGG-3’
12)分子标记名称，GS2-12
正向引物：5’-TGGATCTAACGAGGAAAG-3’
反向引物：5’-CATCTGCCAATAGGTAAT-3’
13)分子标记名称，GS2-13
正向引物：5’-AAGGGAACAAGTTGTAAA-3’
反向引物：5’-AGTGAAGTGAGCAAGGAC-3’
14)分子标记名称，GS2-14
正向引物：5’-GCACCTCTTGGTTCGTCA-3’
反向引物：5’-CGTTCATCCGGCTATTGT-3’
15)分子标记名称，GS2-15
正向引物：5’-CCCGTGTTCACTGTTCAA-3’
反向引物：5’-TACGCCAGGATCTCGTCA-3’
16)分子标记名称，GS2-16
正向引物：5’-ACCTTTCCCGTATTTGCTC-3’
反向引物：5’-CCCTTGGGTATCATCTAGTGC-3’
17)分子标记名称，GS2-17
正向引物：5’-TAGTAGATAGTCAAGGATTC-3’
反向引物：5’-ATGATGGTTTGCTTTTCA-3’
18)分子标记名称，GS2-18
正向引物：5’-ACATCAACCCTAAAGTAT-3’
反向引物：5’-CACTGACGAGATTGTATC-3’
19)分子标记名称，GS2-19
正向引物：5’-TCGGAGACCAAGCACATAG-3’
反向引物：5’-GAGCAGTCACGACCAACG-3’
20)分子标记名称，GS2-20
正向引物：5’-GAGGACGCCGTTTACCAG-3’
反向引物：5’-GTGAGCGAGCTACCGAAT-3’
21)分子标记名称，GS2-21
正向引物：5’-CCCATCTCCATACTTCAA-3’
反向引物：5’-CAAACCAAACCAGCCCTA-3’
22)分子标记名称，GS2-22
正向引物：5’-AATAGTCGTAGGCTCTTAG-3’
反向引物：5’-CGCCTTATTATCCCATAT-3’。
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