CN102031253A - 用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物类型鉴别技术领域，具体为一种利用一粒稻谷(或稻米)和插入或缺失(InDel)分子标记来鉴定籼稻和粳稻的方法。本发明从一粒稻谷中提取DNA，利用籼稻93-11和粳稻日本晴的全基因组DNA序列对比而获得的40对特异InDel引物，对水稻种子中提取的DNA进行片段扩增、电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定该水稻样本的籼、粳稻特性。具体而言，以一粒稻谷中提取的DNA为模板，利用40对InDel引物组合，基于聚合酶链式反应和琼脂糖电泳获得的分子指纹图谱进行分析和统计，根据样本40个InDel位点上的93-11基因型和日本晴基因型分子指纹计算出的基因频率(Fi或Fj)，确定被测水稻种子(样品)的籼稻或粳稻特性。本发明仅需检测一粒种子的样品便可获得结果，方法简便快捷，鉴定准确，具有良好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物类型鉴别技术领域，具体涉及一种在一粒水稻种子（或稻米）中提取DNA，并鉴定其籼稻和粳稻特性的方法。
技术背景
栽培稻（Oryza sativa L.）是我国重要的三大粮食作物之一，在我国的农业生产和经济发展中占有举足轻重地位。栽培稻起源于我国，已有8000多年的栽培历史，目前广泛种植于全球。在栽培稻的栽培和驯化过程中，由于适应不同的生态环境，产生了显著的籼稻和粳稻遗传分化。典型的籼稻和典型的粳稻之间已经形成了明显的生殖隔离，故通常将籼稻和粳稻分成两个亚种：籼稻亚种（Oryza sativa subsp. indica）和粳稻亚种（Oryza sativa subsp. japonica）。籼稻和粳稻不仅在形态、生理和生化性状方面产生了较大的差异，而且也形成了不同的稻米品质和口感品味等特点。稻米的不同消费人群对于籼稻或粳稻的喜好是不同的，如北方人更偏重选择粳稻，这就造成了不同类型稻米在价格上有较大差异。同时在育种中，由于籼稻和粳稻的遗传分化以及上述特征特性，进行籼稻和粳稻的亚种间有性杂交，可以产生丰富的遗传变异类型而培育出优异的水稻品种；籼稻和粳稻的亚种间杂种优势，在杂交稻的培育中也具有重要的价值。因此，对于籼稻和粳稻的鉴定，不仅可以确定特定稻米的商品价值，而且在水稻育种中也具有重要的实践意义。
虽然籼稻和粳稻的准确鉴定极为重要，但是一直以来，对籼稻和粳稻的准确鉴定都存在较大的问题。传统鉴定籼、粳稻的方法主要依赖于形态性状变异(如：株高，株型等)以及生理生化功能差异。目前用来鉴定籼稻和粳稻最常用的方法是以形态鉴定为基础的“程氏指数法”，（包括6个性状：稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比）。这个方法的最大缺点：1）由于形态性状受环境的影响较大而导致检测的不准确；2）形态测量必须要栽种被测水稻样品，从播种到成熟一般需要3-5个月，耗时长；3）形态测量需要一定的样品群体，故需要较多的水稻样品；大大影响了籼稻和粳稻鉴定的效率。专利“利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法”大大提高了籼稻和粳稻鉴定的准确性和效率。但是，水稻DNA的提取通常是以新鲜叶片来进行，需要将稻种进行萌发，形成幼苗，1周甚至10天以后才能提取DNA，耗时较长。对于不能萌发出苗的种子，无法提取DNA。以一粒稻米中提取的DNA为模板，结合InDel分子标记方法，能更快速和高效地确定稻米样品的籼、粳特性。
发明内容
本发明的目的是提供一种仅用一粒稻谷（或稻米）提取DNA，并利用InDel分子标记电泳和分析，快速和精确鉴定稻谷样品籼稻和粳稻特性的方法。
本发明提出的一粒稻谷鉴定水稻的籼稻和粳稻特性方法，是一种利用一粒稻谷（或稻米）中提取的微量DNA为模板、插入或缺失（InDel）分子标记以及琼脂糖电泳技术鉴定水稻品种的方法。具体来说是以一粒稻谷中提取的DNA为模板，利用水稻亚种间DNA序列的特异性差异InDel片段，设计扩增引物组合以及衍生物，对籼稻型等位基因（I）和粳稻性等位基因（J）的频率（F i 或F j ）进行计算，并根据这些频率的值（0-100%）来确定籼稻和粳稻的方法。
本发明用于提取一粒稻米中微量DNA样本的方法，具体步骤如下：
（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL CTAB 提取缓冲液；
（2）缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在7000~13000转/分钟条件下离心；
（3）上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20℃放置30分钟，按步骤（2）离心；所述缓冲液配方可选为：0.5~1.5% CTAB，40~60 mmol/L Tris-HCl pH7.8~8.5，9.5~10.5 mmol/L EDTA pH7.8~8.5；
（4）沉淀物中加入500μL纯化液，重复步骤（2）；所述纯化液配方可选为：9.5~10.5 mmol/L Tris-HCl pH7.8~8.5，0.8~1.2 mmol/L EDTA pH7.8~8.5，0.8-1.2 mol/L NaCl；
（5）上清液加入无水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步骤（2）离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离心后烘干。
本发明用于鉴定籼稻和粳稻的InDel 特异引物一共有40对，具体如下表1：
| 编号 | 引物对名称 | 正向引物DNA序列(5'-3') | 反向引物DNA序列(5'-3') |
| 1 | R1M7 | ATTCCTGGTTCTACATTACTTA | CGCCTCACTAGAATATCGGA |
| 2 | R1M30 | AAGGGGCCCTAATTTATCTA | TGTTTACTTTGTTCTTGGACTG |
| 3 | R1M37 | ATAGTTCGCCATCGTCAT | ACACGCCATAGCAAGGAA |
| 4 | R1M47 | AATAGAATTACTGATGAAACCTTA | GCCCGTTACCGCTTATGT |
| 5 | R2M10 | CCCAGTCTGCTGCCATCT | GAATGTATTTCAGTTCCAGTAAG |
| 6 | R2M24 | GGGCAACAACGGCTCTG | AGGGAATAAGGCGATACGG |
| 7 | R2M26 | GCAGCAAAGTGCGGAGTA | CAGGTGAATTGCCAATTT |
| 8 | R2M50 | CCTGAAGGAAATGATAGCAATAG | GTTTTGTATGCTCTTCACTTGTC |
| 9 | R3M10 | CCGAGTACCATTGCTTTC | CTGCCATAGTTACTGCTCTGTT |
| 10 | R3M23 | TGCTTACAAGGGTCCAAT | GGAGGTGCCTACCAAGAG |
| 11 | R3M30 | AGGCTAAGTGAAGAAATAATAAG | CTCCGTATTCATTACTGGTTG |
| 12 | R3M53 | ACACTGGCTACGGCAAAG | TTTGTTCGGGAATAATGATGC |
| 13 | R4M13 | TACACGGTAGACATCCAACA | ATGATTTAACCGTAGATTGG |
| 14 | R4M17 | AGTGCTCGGTTTTGTTTTC | GTCAGATATAATTGATGGATGTA |
| 15 | R4M43 | CTTGAACCTGAGTGAGTGG | CGATGAAAATGATGTCTA |
| 16 | R5M13 | GAGAAAGAGTGGAAGGAG | AGTATCGTCAGGAGGGTC |
| 17 | R5M30 | CTCAATTTCACCCATCCC | CGCTCCGTCTCCAACCTC |
| 18 | R5M40 | TTCTGCCGCTATCCTGCTA | TGCCCTTGCTATTATCGTTGT |
| 19 | R6M14 | AAATGTCCATGTGTTTGCTTC | CATGTGTGGAATGTGGTTG |
| 20 | R6M44 | TTAGGAATAAAGGCTGGATA | TTACCGTTAATAGGTGGAA |
| 21 | R7M7 | ACCTTCCCTCCCCTTTTGAT | AACTTGGTCTTCCTGTTTTATTG |
| 22 | R7M24 | GGCACGGGCTATAAAGTG | AGGGAAGATACGGTTGGT |
| 23 | R7M30 | ATTGTTATGCTCGCTCTTAC | GAGTGCTGACTGATTACGG |
| 24 | R7M37 | CAGCCCTAAATCTAAATACCC | ACGTTGAGACAGGCGAGC |
| 25 | R8M23 | CCTATTCACTCTACCGACAT | GTTTAGTTCCCATTGCTTT |
| 26 | R8M32 | ATCGGACTGTTTCTCACC | CAACACTAACCTCGCTCA |
| 27 | R8M33 | CGAAAGAGGAGAGGGGTAGT | CGAAAACGAGAAACAAATA |
| 28 | R8M46 | CAGCAGAGTCCAGAGAAGAT | GCATAAGATGGCGAGTGA |
| 29 | R9M10 | CTTTGGATTCAGGGGGA | AACTTGAAACGGAGGCAG |
| 30 | R9M14 | ATGGCATTCAATCCAGAAA | GAGACGGTCAACGAGCA |
| 31 | R9M42 | CTATAAGACCAAAACGAAAACT | GAAAACCATTGTGTCACTGTA |
| 32 | R10M17 | TGAACAATAAACCACAGAAGCA | CCCTTTATTCCCTCCTTTG |
| 33 | R10M30 | CCCTAAAAATAGAGCAACCT | ACCCATAATACTACCAATCAAC |
| 34 | R10M40 | GTCCCTAGGCCATCTCTTG | GCGAATAGGGGTGGACAG |
| 35 | R11M23 | AAGGTTGACAAGGACAGAAG | TCGCAGGAATGGATAAAA |
| 36 | R11M40 | AAGAAAAATATCTATTGAGGAGTG | GGAGGACCATAAATGACGG |
| 37 | R12M10 | ATCATTTCAGCCTGTGCC | AGCTTAATAGGGGGGACG |
| 38 | R12M16 | GGAACCAGGCTATCCACT | GAAGCTGCTCGATCACAA |
| 39 | R12M27 | ATTTCATTGCCATCAGTT | GTAATCTTCTATCCGTTCA |
| 40 | R12M43 | CCGCCGAGAAGAAACAAA | CCCAAGAACAGGATTACA |
以上序列依次记为： SEQ ID NO.1～ SEQ ID NO.40。
从一粒稻米中提取DNA样品，并对样品DNA进行聚合酶链式扩增，扩增产物使用琼脂糖电泳检测。本发明使用的一粒稻谷提取DNA的方法和聚合酶链式扩增方法均为常规方法，不需要特殊的试剂和特殊的仪器，任何公司生产的离心机、PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可以使用而达到目的。
PCR反应条件如下（10μl体系）：
（1）10×PCR缓冲液(含25 mmo l/L MgCl2) 1.0μl；
（2）2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.8μl；
（3）20 μmol/L PCR引物 0.2μl；
（4）1U Taq DNA Polymerase 0.05μl；
（5）DNA 模板 1.0μl；
（6）ddH2O 补足至10μl。
PCR反应程序：
（1）94℃预变性4分钟；
（2）94℃变性30秒；
（3）退火温度：55℃，退火时间：30秒；
（4）72℃延伸40秒；
（5）循环步骤为（2）（3）（4），35个循环；
（6）72℃延伸7分钟；
（7）4℃保存。
电泳检测：
利用3.5%琼脂糖胶电泳、溴化乙锭（EB）显色和紫外光检测DNA的方法，检测分析水稻DNA样品的PCR产物，以及在各个位点（引物对）上的籼、粳基因型。水稻DNA样品扩增的电泳产物为：1）纯合籼稻型基因型（II），与基因组测序水稻品种93-11一致；2）纯合粳稻型基因型（JJ），与基因组测序水稻品种日本晴一致；或3）籼-粳杂合基因型（IJ），分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。从这40对引物中可以任意选取6~40对进行组合，均可对水稻样本进行鉴定。引物数目越多，鉴定结果越准确。
总上所述，利用InDel分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法，具体步骤如下：
（1）从一粒稻谷或稻米中提取DNA样品；
（2）采用所述的40对特异引物，对提取的水稻DNA样品进行PCR扩增；
（3）利用琼脂糖电泳方法检测PCR产物；
（4）计算基因频率。
基因频率的计算：根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果种样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型基因频率（F i ）或粳稻型基因频率（F j ），其变化在0-100%之间：
籼稻型基因频率（%） 
粳稻型基因频率（%） 
式中：
X ii 为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型；
X jj 为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型；
X ij 为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型；
N为使用引物对的数目（具体可取6~40对之间）；
籼稻和粳稻的确定：
根据检测的一粒稻谷DNA样品中各特异位点的平均基因频率F i 或F j ，确定水稻样品为不同类型的籼稻或粳稻，具体判断标准如下：
。
本发明利用一粒稻谷（稻米）中提取的DNA为模板，水稻全基因组特异位点上的InDel片段差异设计的特异引物进行琼脂糖凝胶电泳，籼稻基因型、粳稻基因型和籼-粳杂合基因型的确定，以及籼稻型等位基因频率和粳稻型等位基因频率的计算来鉴定籼稻和粳稻的特性，速度快，方法简便，准确性高。从一粒稻谷或稻米中提取DNA，节省了培育水稻植株提取DNA的时间，同时也扩大了适用范围，使不能萌发的种子甚至稻米都可以得到籼、粳特性的鉴定，可以直接用于市场上出售稻米品质的鉴定（如以籼稻充粳稻）。基于PCR扩增反应，利用籼-粳稻全基因组上40个位点上的InDel片段序列的差异和PCR反应的快速高效性，在短时间内能精确鉴定水稻样本的籼、粳特性。同时，由于本发明利用了来自水稻基因组不同染色体上的40个InDel位点，不仅能够准确鉴定典型的籼稻和典型的粳稻、籼稻和粳稻。而且还能够鉴定籼-粳分化程度不高的偏籼和偏粳的类型以及中间类型，大大提高了鉴定的精确度。而由于不同的引物对扩增出来的条带大小不同，还可以在同一块琼脂糖胶上进行多对引物的分型，大大提高了鉴定的效率。本发明方法简便，效果快捷高效，有很好的推广应用前景。
附图说明
图1、利用一粒稻米快速提取DNA方法所获得的各水稻样本DNA含量，不同泳道代表水稻品种名。泳道1. 日本晴；2. 南京11号；3. 93-11；4. 明恢86；5. 湖北早；6. 红粘谷；7. 傍秋糯；8. 日本晴与93-11杂种F2；9. 韦南红芒稻；10. 永年露水白；11. 红秆齐头；12. 白芒粳；13. 须谷早；14. 鸡油糯；15. 老白术；16. 霸王鞭2；17；日本谷；M. 分子量标记。
图2、以图1所获得的DNA为模板，利用一对InDel引物（R1M30）PCR扩增的产物电泳结果，不同泳道代表水稻品种名。泳道1. 标准纯合粳稻基因型（日本晴）；2. 标准纯合籼稻基因型（南京11号）；3. 93-11；4. 明恢86；5. 湖北早；6. 红粘谷；7. 傍秋糯；8. 日本晴与93-11杂种F2（杂合基因型）；9. 韦南红芒稻；10. 永年露水白；11. 红秆齐头；12. 白芒粳；13. 须谷早；14. 鸡油糯；15. 老白术；16. 霸王鞭2；17；日本谷；M. 分子量标记。
图3、以图1获得的DNA为模板，利用三对InDel引物（从上至下. R5M40，R1M30，R8M46）PCR扩增的产物电泳结果，不同泳道代表水稻品种名。泳道1. 标准纯合粳稻基因型（日本晴）；2. 标准纯合籼稻基因型（南京11号）；3. 93-11；4. 明恢86；5. 湖北早；6. 红粘谷；7. 傍秋糯；8. 日本晴与93-11杂种F2；9. 韦南红芒稻；10. 永年露水白；11. 红秆齐头；12. 白芒粳；13. 须谷早；14. 鸡油糯；15. 老白术；16. 霸王鞭2；17；日本谷；M. 分子量标记。
具体实施方式
实施例1：
以一粒稻米快速提取DNA方法获得的各水稻样本DNA为模板（见图1），利用一对InDel分子标记（见图2）结合琼脂糖凝胶电泳方法鉴定17个水稻品种的籼、粳特性。
表2. 用于实施例1鉴定的实验材料
| 序号 | 水稻品种 | 来源 | 籼-粳基因频率（Fi/Fj）(%) | InDel鉴定结果 |
| 1 | 日本晴 | 日本 | 0/100 | 典型粳稻 |
| 2 | 南京11号 | 扬州 | 100/0 | 典型籼稻 |
| 3 | 93-11 | 中国 | 100/0 | 典型籼稻 |
| 4 | 明恢86 | 福州 | 98/2 | 典型籼稻 |
| 5 | 湖北早 | 江西 | 99/1 | 典型籼稻 |
| 6 | 红粘谷 | 贵州 | 98/2 | 典型籼稻 |
| 7 | 傍秋糯 | 安徽 | 93/7 | 典型籼稻 |
| 8 | 日本晴和93-11杂种F2 | 武汉 | 54/46 | 中间类型 |
| 9 | 韦南红芒稻 | 河北 | 0/100 | 典型粳稻 |
| 10 | 永年露水白 | 河北 | 100/0 | 典型籼稻 |
| 11 | 红秆齐头 | 云南 | 90/10 | 典型籼稻 |
| 12 | 白芒粳 | 江苏 | 3/97 | 典型粳稻 |
| 13 | 须谷早 | 江西 | 94/6 | 典型籼稻 |
| 14 | 鸡油糯 | 贵州 | 3/97 | 典型粳稻 |
| 15 | 老白术 | 福建 | 93/7 | 典型籼稻 |
| 16 | 霸王鞭2 | 湖北 | 3/97 | 典型粳稻 |
| 17 | 日本谷 | 广东 | 73/27 | 具粳稻血缘籼稻 |
DNA提取方法如下：
（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL CTAB 提取缓冲液；
（2）缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在7000~13000转/分钟条件下离心；
（3）上清液中加入等体积沉淀缓冲液（0.5~1.5% CTAB，40~60 mmol/L Tris-HCl pH7.8~8.5，9.5~10.5 mmol/L EDTA pH7.8~8.5），于-20℃放置30分钟，按步骤（2）离心；
（4）沉淀物中加入500μL纯化液（9.5~10.5 mmol/L Tris-HCl pH7.8~8.5，0.8~1.2 mmol/L EDTA pH7.8~8.5，0.8-1.2 mol/L NaCl），重复步骤（2）；
（5）上清液加入无水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步骤（2）离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离心后烘干。
使用反应体系如下：
PCR反应条件如下（10μl体系）：
（1）10×PCR缓冲液(含25 mmo l/L MgCl2) 1.0μl；
（2）2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.8μl；
（3）20 μmol/L PCR引物 0.2μl；
（4）1U Taq DNA Polymerase 0.05μl；
（5）DNA 模板 1.0μl；
（6）ddH2O 补足至10μl。
PCR反应程序：
（1）94℃预变性4分钟；
（2）94℃变性30秒；
（3）退火温度：55℃，退火时间：30秒；
（4）72℃延伸40秒；
（5）循环步骤为（2）（3）（4），35个循环；
（6）72℃延伸7分钟；
（7）4℃保存。
电泳检测：
利用3.5%琼脂糖胶电泳、溴化乙锭（EB）显色和紫外光检测DNA的方法，检测分析水稻DNA样品的PCR产物，以及在各个位点（引物对）上的籼、粳基因型。水稻DNA样品扩增的电泳产物为：1）纯合籼稻型基因型（II），与基因组测序水稻品种93-11一致；2）纯合粳稻型基因型（JJ），与基因组测序水稻品种日本晴一致；或3）籼-粳杂合基因型（IJ），分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。
图1的结果表明，利用一粒稻米快速提取DNA方法能够获得的各种类型水稻品种以及杂种分离后代的DNA样本。说明该方法确实能够从一粒稻米中提取足以用于InDel分析的DNA样本。
图2的结果表明，利用一粒米快速提取DNA方法结合一对InDel引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳可将不同水稻样品在这一位点的籼、粳基因型予以确定。如与标准籼稻品种南京11号一致的纯合籼稻基因型，和标准粳稻品种日本晴一致的纯合粳稻基因型，以及籼-粳杂合基因型。
通过对水稻不同样品在40个InDel位点上基因型的读取（见表3中的 II、JJ、IJ基因型）和分析获得各水稻样品的籼、粳特性鉴定结果见表3。
由实例1的实验结果可见，利用一粒稻米快速提取DNA方法结合40对InDel引物对DNA样本的扩增和对各特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型的分析，可以快速、准确、高效鉴定出水稻品种样本的籼稻或粳稻属性。
实施例2：
以一粒稻米快速提取DNA方法获得的各水稻样本DNA为模板（见图1），利用三对InDel分子标记来更高效地鉴定未知水稻品种的籼、粳稻特性（见图3）。实验材料与实施例1同（见表3）。
水稻样本的DNA提取方法、PCR反应所使用反应体系、 PCR反应的程序以及电泳检测和各水稻不同样品的基因型读取和分析方法与实施例1相同。
图3的结果表明，将三对InDel引物分别对不同的水稻品种进行PCR扩增，并将PCR产物同时进行电泳检测，能够将这三对InDel引物的PCR产物清晰地分辨开，同时可以对不同水稻DNA样本进行这三个InDel位点上的籼、粳基因型的鉴定。
由实例2的实验结果可见，利用一粒稻米快速提取DNA方法和40对InDel引物对DNA样本的扩增产物，结合三至多对InDel引物PCR扩增的产物同时进行琼脂糖凝胶电泳的方法，可以更高效的对未知水稻品种样本的籼稻或粳稻属性进行鉴定。
实施例1和2的实验结果表明，利用一粒稻米快速提取DNA方法，结合40对InDel引物PCR扩增以及对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和分析就可以快速（1-2天）、微量（一粒稻米）、准确地鉴定水稻样本的籼稻或粳稻属性。
表3. 随机选取的17个不同来源水稻样品的基因型确定结果
SEQUENCELISTING
<110> 复旦大学
<120> 用一粒稻谷鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法
<130> 001
<160> 40
<170> PatentInversion3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213>
<400> 1
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<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213>
<400> 2
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<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213>
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<211> 42
<212> DNA
<213>
<400> 4
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<211> 41
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<211> 36
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<211> 36
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<213>
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<211> 46
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<213>
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<211> 36
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<213>
<400> 10
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<211> 44
<212> DNA
<213>
<400> 11
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<213>
<400> 12
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<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213>
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<211> 42
<212> DNA
<213>
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<211> 37
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<212> DNA
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<400> 40
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Claims (3)
1.一种用一粒稻米提取DNA样本的方法，其特征在具体步骤如下：
（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL CTAB 提取缓冲液；
（2）缓冲液经氯仿/异戊醇萃取后，在7000~13000转/分钟条件下离心；
（3）上清液中加入等体积沉淀缓冲液，于-20℃放置30分钟，按步骤（2）离心；
（4）沉淀物中加入500μL纯化液，重复步骤（2）；
（5）上清液加入无水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步骤（2）离心，沉淀物经70%乙醇漂洗、离心后烘干。
2.一种用于鉴定籼稻和粳稻的InDel特异性引物对，其特征在于PCR产物长度差异为24-67bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，共40对，列表如下：
。
3.一种利用InDel分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）按照权利要求书1所述，从一粒稻谷或稻米中提取DNA样品；
（2）采用如权利要求书2所述的40对特异引物，对提取的水稻DNA样品进行PCR扩增；
（3）利用琼脂糖电泳方法检测PCR产物；
（4）计算基因频率：
根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型基因频率F i 或粳稻型基因频率F j ，其变化在0-100%之间：
籼稻型基因频率（%） 
粳稻型基因频率（%） 
式中：
X ii 为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型；
X jj 为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型；
X ij 为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型；
N为使用引物对的数目，取6—40；
（5）籼稻和粳稻的确定
根据检测的一粒稻谷DNA样品中各特异位点的平均基因频率F i 或F j ，确定水稻样品为不同类型的籼稻或粳稻，具体判断标准如下：
。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012055254A (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-22 | National Agriculture & Food Research Organization | 国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法 |
| CN103060224A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-04-24 | 中国人民解放军总医院 | 一种空间屎肠球菌lct-ef258菌株 |
| CN103798127A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-21 | 复旦大学 | 一种利用InDel分子标记预测籼-粳稻杂种F1结实率的方法 |
| CN104789671A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-07-22 | 上海交通大学 | 基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法 |
| CN105420354A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-03-23 | 江苏天丰种业有限公司 | 基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法 |
| CN107475426A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-15 | 山东省水稻研究所 | 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用 |
| CN109628444A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-16 | 华南农业大学 | 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用 |
| CN110669864A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-01-10 | 福州海关技术中心 | 一种基于叶绿体dna差异的籼粳稻米种类荧光pcr快速检测鉴定方法 |
| CN112725510A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-30 | 中国水稻研究所 | 一套用于水稻品种籼粳鉴定的snp标记、引物组、试剂盒及应用 |
| CN113637727A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-11-12 | 江苏省农业科学院 | 用于构建半糯型粳稻品种dna指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用 |
| CN114657172A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-24 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101323878A (zh) * | 2008-05-08 | 2008-12-17 | 复旦大学 | 利用水稻dna插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法 |
-
2010
- 2010-12-16 CN CN 201010591787 patent/CN102031253B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101323878A (zh) * | 2008-05-08 | 2008-12-17 | 复旦大学 | 利用水稻dna插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《Plant Physiology》 20040731 Ying-Jia Shen，et al Development of Genome-Wide DNA Polymorphism Database for Map-Based Cloning of Rice Genes 第135卷, 2 * |
| 《上海交通大学学报（农业科学版）》 20020331 彭锁堂等 水稻单粒种子DNA 提取及RAPD 程序优化研究 第20卷, 第1期 2 * |
| 《复旦学报(自然科学版)》 20060630 蔡星星，等 籼稻93-11和粳稻日本晴DNA插入缺失差异片段揭示的水稻籼-粳分化 第45卷, 第3期 2 * |
| 《自然科学进展》 20090630 卢宝荣，等 籼稻和粳稻的高效分子鉴定方法及其在水稻育种和进化研究中的意义 第19卷, 第6期 2 * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012055254A (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-22 | National Agriculture & Food Research Organization | 国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法 |
| CN103060224A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-04-24 | 中国人民解放军总医院 | 一种空间屎肠球菌lct-ef258菌株 |
| CN103060224B (zh) * | 2012-09-26 | 2015-03-18 | 中国人民解放军总医院 | 一种空间屎肠球菌lct-ef258菌株 |
| CN103798127A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-21 | 复旦大学 | 一种利用InDel分子标记预测籼-粳稻杂种F1结实率的方法 |
| CN103798127B (zh) * | 2014-01-24 | 2015-07-29 | 复旦大学 | 一种利用InDel分子标记预测籼-粳稻杂种F1结实率的方法 |
| CN104789671A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-07-22 | 上海交通大学 | 基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法 |
| CN104789671B (zh) * | 2015-04-10 | 2017-08-01 | 上海交通大学 | 基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法 |
| CN105420354B (zh) * | 2015-11-20 | 2018-12-25 | 江苏天丰种业有限公司 | 基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法 |
| CN105420354A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-03-23 | 江苏天丰种业有限公司 | 基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法 |
| CN107475426A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-15 | 山东省水稻研究所 | 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用 |
| CN109628444A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-16 | 华南农业大学 | 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用 |
| CN109628444B (zh) * | 2019-01-07 | 2022-11-15 | 华南农业大学 | 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用 |
| CN110669864A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-01-10 | 福州海关技术中心 | 一种基于叶绿体dna差异的籼粳稻米种类荧光pcr快速检测鉴定方法 |
| CN112725510A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-30 | 中国水稻研究所 | 一套用于水稻品种籼粳鉴定的snp标记、引物组、试剂盒及应用 |
| CN113637727A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-11-12 | 江苏省农业科学院 | 用于构建半糯型粳稻品种dna指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用 |
| CN113637727B (zh) * | 2021-08-24 | 2024-05-14 | 江苏省农业科学院 | 用于构建半糯型粳稻品种dna指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用 |
| CN114657172A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-24 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
| CN114657172B (zh) * | 2022-02-28 | 2024-03-26 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
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