CN114657172A

CN114657172A - 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用

Info

Publication number: CN114657172A
Application number: CN202210186070.5A
Authority: CN
Inventors: 李白; 王蕾; 马燕欣; 潘月云; 杨海龙
Original assignee: JIAXING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: JIAXING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-02-28
Also published as: CN114657172B

Abstract

本发明公开了一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法及应用，属于农业生物技术领域。本发明提供的方法，其提取的主要对象为少量稻米及稻米部分组织；本发明采取了一系列针对性的实验步骤，能有效地破碎组织、去除淀粉、充分裂解细胞，从而获得浓度纯度较高的基因组DNA。利用本发明提供的方法从稻米中提取基因组DNA，能满足大部分PCR技术的需要，可用于稻米品种真实性鉴定，还可用于水稻基因功能分析。利用本发明稻米基因组DNA提取方法，能从少量稻米中获得基因组DNA，与以水稻幼苗为对象的种子发芽提取DNA方法相比，取材极为方便，不受种子发芽失败影响，可大大减少实验准备的时间。

Description

一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法及应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法及应用。

背景技术

稻米是淀粉质种子，质地较硬，不易研磨、破碎。稻米中淀粉含量可达70％左右，经过碾磨处理后的稻米，所剩胚乳的淀粉含量可高达75％左右，淀粉与DNA都属多糖类物质，在提取过程中易发生共沉淀现象，高淀粉含量严重影响提取DNA产物的质量。稻米PCR鉴定分析中还会遇到样品较少如单粒甚至部分稻米组织的情况，这种样品不仅组织质地硬、淀粉含量高，且DNA含量少，经不起提取纯化中的损失，因此一种能高效破碎、损失率较低的提取方法是下一步鉴定分析的必要前提。

目前，稻米品种真实性和纯度鉴定的方法虽然较多，如碾米品质法、外观观察法、蒸煮食味法、蛋白质分析法等，但这些方法的适用范围狭窄，可靠性不高，鉴定效果也并不理想。随着分子生物学的发展，基于DNA变异的分子标记开始被广泛应用于不同植物品种的真实性和纯度鉴定，由于该方法直接以DNA的形式出现，其差异体现的是不同品系的基因型差异，因而较其它物理、化学方法更为简单、准确(金伟栋等，上海农业学报，2006，22(1)：104-108)。因此，利用分子标记技术来进行稻米品种真实性和纯度鉴定是目前最佳的技术方案。

目前PCR技术以及建立在PCR基础上的分子生物学技术已被广泛应用于稻米品种鉴别和基因功能分析。PCR技术以样品DNA为标的，其检测结果体现了样品自身核酸序列的差异，较物理、化学方法更准确、稳定。PCR技术对样品基因的检出限很低，但易受杂质干扰，提取稻米DNA中的杂质有时会降低扩增效率甚至导致实验失败。目前由于检测需求的增长和PCR技术的成熟导致检测样品的数量日益增长，过于繁琐或不易批量化操作的DNA提取方法限制了PCR技术的大规模应用。因此一种简易、可批量化操作、并能获得较好稻米基因组DNA的提取方法是稻米品种鉴定和基因分析的有力保障。

目前对于水稻稻米基因组DNA的提取，常用的方法是利用种子发芽提取DNA，该过程需要等种子发芽并长出叶片，一般要一周时间，有些种子还会发芽失败，且该方法不适用于无胚芽的组织，如精米或部分胚乳组织。也有用稻米胚乳直接提取DNA的，常见的方法是CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法，但胚乳质地较硬、淀粉含量高，且少量稻米组织DNA含量少，用研钵或仪器直接研磨提取样品损失率较高，且操作不便。

因此，需要探索并建立一种能有效提取少量稻米基因组DNA的方法，损失率较低，可以批量化操作。

发明内容

针对少量稻米组织质地硬、淀粉含量、DNA含量少，采用一系列的提取步骤，如浸泡、酶解淀粉、裂解细胞、沉淀等，从组织中获得浓度纯度较高的基因组DNA。提取的DNA能用于该稻米样品的品种鉴定和基因分析。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将1/3-6粒稻米浸泡在淀粉酶溶液中，浸泡至稻米吸胀；

(2)将步骤(1)中吸胀后的稻米研磨成浆，60-75℃浸泡后，离心，获得离心沉淀物1；

(3)向步骤(2)中的离心沉淀物1中加入提取液，60-75℃浸泡后，离心去，获得离心上清液；

(4)向步骤(3)中的离心上清液中加入等体积的低温异丙醇，混匀后离心，获得离心沉淀物2；

(5)使用体积比为75％乙醇溶液洗涤步骤(4)中的离心沉淀物2后，弃去上清液，干燥沉淀，于保存液中溶解，获得稻米基因组DNA。

优选的，步骤(1)中所述的淀粉酶溶液成分为：100mM NaAc，100mM NaCl，0.3mMCaCl₂，体积比为0.5％的Triton X-100和100mg/Lα-淀粉酶，淀粉酶溶液成分中的浓度表示为终浓度。

优选的，所述的淀粉酶溶液的pH为5.5，步骤(1)中淀粉酶溶液的加入量为300-1500μL。

优选的，步骤(3)中所述提取液成分为：100mM Tris，20mM EDTA和1M KCl，所述提取液的pH为8.3，步骤(3)中提取液的加入量为300-1000μL；提取液成分中的浓度表示为终浓度。

优选的，步骤(5)中所述保存液的成分为：10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，所述保存液的pH为8.0，加入量为50μL；保存液成分中的浓度表示为终浓度。

本发明提供了上述的方法在稻米品种鉴定或基因分析中的应用。

与现有水稻基因组DNA提取方法相比，具有以下优点：

(1)本发明提供的方法，其提取的主要对象为少量稻米及稻米部分组织；由于稻米组织具有质地硬、淀粉含量高、DNA含量少的问题，现有DNA提取方法较难从中获得浓度、纯度较高的基因组DNA。而本发明采取了一系列针对性的实验步骤，能有效地破碎组织、去除淀粉、充分裂解细胞，从而获得浓度纯度较高的基因组DNA。

(2)利用本发明提供的方法从稻米中提取基因组DNA，能满足大部分PCR技术的需要，可用于稻米品种真实性鉴定，还可用于水稻基因功能分析。

(3)利用本发明稻米基因组DNA提取方法，能从少量稻米中获得基因组DNA，与以水稻幼苗为对象的种子发芽提取DNA方法相比，取材极为方便，不受种子发芽失败影响，可大大减少实验准备的时间。

附图说明

图1为对比例1中样品酶解后的离心沉淀与未酶解沉淀对比示意图；其中，A为秀水134品种，左为对比例1中处理方式1处理后的沉淀图，右为对比例1中处理方式2处理后的沉淀图；B为中嘉早17品种，左为对比例1中处理方式1处理后的沉淀图，右为对比例1中处理方式2处理后的沉淀图。

图2为对比例1中样品酶解后离心的上清与未酶解上清I₂-KI检测对比示意图；其中，1为秀水134品种使用处理方式1处理；2为中嘉早17品种使用处理方式1处理；3为秀水134品种使用处理方式2处理；4为中嘉早17品种使用处理方式2处理；5为I₂-KI溶液。

图3为实施例1中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳对比示意图；其中，1为秀水134品种使用处理方式1处理；2为中嘉早17品种使用处理方式1处理；3为秀水134品种使用处理方式2处理；4为中嘉早17品种使用处理方式2处理；5为DNA；分子量标准：100-5000bp。

图4为实施例1中提取的基因组DNA为模板扩增微卫星(SSR)分子标记RM206的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为秀水134品种使用处理方式1处理；2为中嘉早17品种使用处理方式1处理；3为对照样品。

图5为实施例1中提取的基因组DNA为模板进行抗稻瘟病基因Pita四引物扩增受阻PCR(ARMS-PCR)的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为秀水134品种使用处理方式1处理；2为中嘉早17品种使用处理方式1处理；3为对照样品。

图6为实施例1中提取的基因组DNA为模板扩增水稻谷蛋白基因Lgc的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为秀水134品种使用处理方式1处理；2为中嘉早17品种使用处理方式1处理；3为对照样品。

具体实施方式

对比例1

选用粳稻和籼稻两种样品，分别是秀水134和中嘉早17。

1)2种样品各取2颗米粒装入2.0mL离心管，放入1颗6mm研磨钢珠，处理方式1：加入600μL淀粉酶溶液，于室温浸泡60min；淀粉酶溶液成分为：100mM NaAc，100mM NaCl，0.3mMCaCl₂，体积比为0.5％的Triton X-100(v/v)和100mg/Lα-淀粉酶，pH 5.5；

处理方式2：加入600μL对照溶液，于45℃浸泡60min。对照溶液成分为：100mMNaAc，100mM NaCl，0.3mM CaCl₂和0.5％Triton X-100(v/v)，pH 5.5。

2)将两种处理的离心管置于研磨仪，1100r/min研磨60s至样品成浆状，无明显颗粒，65℃浸泡60min，10,000×g离心5min。比较2种处理方式的沉淀，如图1所示，处理方式1中大部分淀粉被酶解，沉淀较处理方式2明显减少。取2种处理方式的上清液做I₂-KI检测，如图2所示，处理方式1中可溶性淀粉被完全水解，遇碘不变色，处理方式2中含有可溶性淀粉，遇碘变色。

实施例1

选用粳稻和籼稻两种样品，分别是秀水134和中嘉早17。

(1)提取稻米基因组DNA

1)2种样品各取2米粒装入2.0mL离心管，放入1颗6mm研磨钢珠，加入600μL淀粉酶溶液，于45℃浸泡60min；处理方式1：淀粉酶溶液成分：100mM NaAc，100mM NaCl，0.3mMCaCl₂，0.5％Triton X-100(v/v)和100mg/Lα-淀粉酶，pH 5.5。设置对照组即处理方式2，浸泡溶液中不含淀粉酶；

2)米粒吸胀后，将离心管置于研磨仪，1100r/min研磨60s至样品成浆状，无明显颗粒，65℃浸泡60min，以充分酶解淀粉，10,000×g离心5min，弃上清；

3)沉淀中加入500μL提取液，于70℃放置60min，10,000×g离心5min，吸取上清液转至1.5mL离心管；提取液成分：100mM Tris，20mM EDTA和1M KCl，pH 8.3；

4)加入等体积-20℃预冷异丙醇，上下颠倒混匀，10,000×g离心2min，弃上清；

5)加入500μL体积比为75％的乙醇(v/v)，清洗后弃上清；

6)干燥沉淀，加入50μL保存液溶解，获得DNA提取溶液，4℃短期保存，-20℃长期保存。保存液成分：10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH 8.0。

(2)提取基因组DNA的质量测定

采用微量紫外分光光度计对步骤(1)中2种DNA提取溶液进行浓度和纯度检测。结果如表1所示。用1％琼脂糖凝胶对DNA溶液进行电泳检测，分析基因组DNA的完整性，结果如图3所示。两种检测结果表明，处理方式1酶解后提取的DNA较处理方式2未酶解提取的纯度高，处理方式2电泳孔道内有明显的杂质，这些杂质导致了处理方式2根据OD值计算的浓度虚高。利用处理方式1方法提取的稻米胚乳基因组DNA浓度、纯度OD260/280和完整性都较好。

表1 DNA溶液OD值纯度、浓度检测数据

(3)以提取稻米基因组DNA为模板进行SSR分子标记的扩增

以步骤(1)中2个样品的基因组DNA为模板，利用水稻抗白叶枯病Xa23基因的微卫星(SSR)标记RM206(正向外引物序列5'-CCCATGCGTTTAACTATTCT-3'，反向外引物序列5'-CGTTCCATCGATCCGTATGG-3')对其进行扩增。20μL的PCR反应体系为：2×PCR预混液10μL，2.5nmol/L的SSR正反引物各0.5μL，超纯水8.5μL，DNA 0.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。取6μL PCR产物上样，经4％琼脂糖凝胶对PCR进行电泳检测，电泳检测结果如图4所示，由图4可以看出扩增条带清晰，说明利用该方法提取的基因组DNA可以用于SSR标记PCR扩增。

(4)以提取稻米基因组DNA为模板进行四引物扩增受阻PCR扩增

四引物扩增受阻PCR(ARMS-PCR)是一种针对SNP突变检测的多重PCR。根据水稻Pita基因(GenBank号：AF207842.1)第918氨基酸的G/T变异，利用两对特异PCR引物(正向外引物序列为5'-CTCTTATGGTTGATATACAATGGGTGGA-3'，反向外引物序列为5'-ACCTCTACTCTGAAGACGTGAAGAGGA-3'，正向内引物序列为5'-TCTGCCGTGGCTTCTATCTTTACTTT-3'，反向内引物序列为5'-AAGTCAGGTTGAAGATGCATGGC-3')，并以步骤(1)中2个样品的基因组DNA为模板，对其进行扩增。PCR扩增体系为：20μL的PCR反应体系为：2×PCR预混液10μL，2.5nmol/L的4种引物各0.5μL，超纯水7.5μL，DNA 0.5μL；PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。取6μL PCR产物上样，经3％琼脂糖凝胶对PCR进行电泳检测，由图5可以看出扩增条带清晰，说明利用该方法提取的基因组DNA可以用于四引物扩增受阻PCR扩增。

(5)以提取稻米基因组DNA为模板扩增水稻谷蛋白的编码基因

以步骤(1)中2个水稻类型的稻米基因组DNA为模板，利用两个谷蛋白基因GluB4(GenBank号：4328969)和GluB5(GenBank号：4328968)的引物对其进行扩增，正向外引物序列5'-AGTTGTTGCTCTATATGTCTT-3'，反向外引物序列5'-TGCCACTCGAATGATAGTTCTAG-3'。PCR扩增体系为：20μL的PCR反应体系为：2×PCR预混液10μL，2.5nmol/L的正反引物个0.5μL，超纯水8.5μL，DNA 0.5μL；PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸180s，35个循环；72℃延伸10min。取6μL PCR产物上样，经2％琼脂糖凝胶对PCR进行电泳检测，检测结果如图6所示，可以看出扩增条带清晰，说明利用该方法提取的基因组DNA可以用于长片段PCR扩增。

序列表

<110> 嘉兴市农业科学研究院

<120> 一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcttatggt tgatatacaa tgggtgga 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctctactc tgaagacgtg aagagga 27

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgccgtgg cttctatctt tacttt 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagtcaggtt gaagatgcat ggc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agttgttgct ctatatgtct t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgccactcga atgatagttc tag 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccatgcgtt taactattct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgttccatcg atccgtatgg 20

Claims

1.一种从少量稻米中提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将1/3-6粒稻米浸泡在淀粉酶溶液中，浸泡至稻米吸胀；

(3)向步骤(2)中的离心沉淀物1中加入提取液，60-75℃浸泡后离心，获得离心上清液；

(4)向步骤(3)中的离心上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后离心，获得离心沉淀物2；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的淀粉酶溶液成分为：100mMNaAc，100mM NaCl，0.3mM CaCl₂，体积比为0.5％的Triton X-100和100mg/Lα-淀粉酶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的淀粉酶溶液的pH为5.5，步骤(1)中淀粉酶溶液的加入量为300-1500μL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述提取液成分为：100mM Tris，20mM EDTA和1M KCl。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取液的pH为8.3，步骤(3)中提取液的加入量为300-1000μL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述保存液的成分为：10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述保存液的pH为8.0，步骤(5)中保存液的加入量为50μL。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法在稻米品种鉴定或基因分析中的应用。