KR100860001B1 - 벼 품종 판별을 위한 밥으로부터 디엔에이 추출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼의 품종 판별을 위한 밥으로부터 DNA의 추출 방법에 관한 것으로, 쌀을 호화시켜 얻은 밥을 시료로 하여, 2% CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 완충액 중에서 내열성 알파 아밀라제로 호화전분을 분해시키는 단계를 포함하는 본 발명의 DNA 추출 방법에 따르면, 밥의 호화전분을 분해함으로써 양질의 유전자(DNA)를 안정적으로 추출할 수 있으므로, 앞으로 유통 및 소비단계에서 밥 원료미 품종 판별 작업에 활용 가능성이 클 것으로 기대된다.
밥, 유전자추출, 품종판별, 알파 아밀라제

Description

벼 품종 판별을 위한 밥으로부터 디엔에이 추출 방법{THE RELIABLE DNA EXTRACTION METHOD FROM COOKED RICE FOR THE IDENTIFICATION OF RICE VARIETIES}
도 1은 밥으로부터 DNA를 추출하기 위한 시료 조제 과정을 보여주는 사진으로, 밥알 형태 그대로의 시료를 준비하여 추출 완충액을 넣고 유봉(pestle)을 이용하여 마쇄, 균질화 하는 단계를 보여준다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 얻어진 밥 유전자(DNA) 추출물을 Nanodrop spectrophotometer로 측정하여 유전자의 유무 및 양을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 추출된 밥 유전자(DNA) 추출물의 유무 및 양을 Pellet Paint Co-Precipitant(Novagen)법을 이용하여 재확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 대조구로서 뿌리와 줄기로부터 얻은 유전자(DNA) 추출물을 Nanodrop spectrophotometer로 측정하여 유전자의 유무 및 양을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 얻어진 유전자(DNA)와 쌀에서 추출한 유전자(DNA)를 PCR 방법에 의해 유전자를 증폭시키고 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 밥과 대조구(쌀, 뿌리 및 줄기)에서 추출한 DNA의 PCR 증폭 산물을 품종 판별용 SSR 프라이머(OSR20, RM249, RM257)와 함께 전기영동한 결과를 보여주 는 사진이다.
본 발명은 벼의 품종 판별을 위한 밥으로부터 DNA의 추출 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 밥 원료미의 품종 판별을 위해 밥으로부터 효소를 이용하여 호화된 전분을 분해한 후 양질의 유전자(DNA)를 추출하는 방법에 관련된다.
시중에 유통되는 브랜드 쌀의 신뢰성 확보와 우리 쌀의 고품질화, 그리고 2006년부터 시중에 판매되는 수입산 밥쌀용 쌀의 판매를 위한 대책으로서, 원산지 표시, 지리적 표시, GAP, 친환경인증, 유통 쌀의 이력 관리제가 추진되고 있다. 이와 함께 2005년부터는 포장 양곡 표시 기준을 강화함으로써 의무 표시 사항에 품종 및 도정 연월일이 추가되어 시행 중에 있다. 이처럼 강화되는 농산물 표시 제도에 대응하여 쌀 가공품 및 부산물에서의 품종 식별 연구 필요성이 대두 되고 있다.
현재까지 발표된 벼의 품종 판별을 위한 연구로는 전자코(작물화학지, 50(6): 447∼452, 2005), 화상분석(한식과지, 30(3): 473∼479, 1988), 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis; 한식과지, 30(6): 1252∼1258, 1998) 등 기기를 이용한 품종 판별에 대한 결과가 보고되어 있다. 그러나, 아직까지는 한 가지 기기를 이용하는 분석방법을 통해 품종을 판별하는 기술은 밝혀져 있지 않다.
품종 판별 방법에서 가장 정확하고 가능성이 있는 것은 분자생물학적 기법에 의한 것으로, UPOV 생화학 및 분자생물학적 기술 실무작업반(BMT) 회의에서도 품종 확인(Variety identification)에 대한 분자생물학적 기법 이용 가능성에 대한 검토가 논의 중에 있는 현안 사항이다. 일반적으로 품종 판별에 이용되고 있는 분자생물학적 분석법으로는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등이 있다. 이들 방법 외에 특히 쌀의 품종 확인방법으로 활용도 높아 보이는 것은 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커를 이용한 핵산지문 방법과 전체 DNA 중에서 하나의 염기 변이를 표지 인자로 이용하는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분자 표지를 활용한 방법 등이 있다.
이들 분자생물학적 분석방법은 모두 시료에서 유전자를 추출해서 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시킨 후 개발된 마커 세트를 이용하는 방법이다. 분자 표지를 이용한 핵산지문 방법에서 다양한 농축산물의 원재료 및 가공품으로부터 유전자를 추출하는 기술로는 올리브 오일(Busconi et al ., Food Chemistry, 83: 127~134, 2003), 제분된 밀과 빵(Tilley, Cereal Chemistry, 8: 44~47, 2004), 낫또 등 콩 발효식품(Kakihara et al ., Food Control, 17: 808~813, 2006), 생고기 및 조리된 고기(Hunt et al ., Food Chemistry, 60: 437~442, 1997) 등을 이용하는 연구가 보고되어 있다.
이처럼, 유전자 추출을 통한 PCR 방법으로 다양한 재료의 품종 판별이 이루어지기 위해서는, PCR 실시 전 단계에서 양질의 유전자 추출이 매우 중요하다. 특히 우리나라에서 쌀의 경우, 지금까지는 유통중인 쌀에서만 품종 확인이 필요했던 것에 비해 앞으로는 식당 등 소비처에서도 원산지를 표시해야 함에 따라, 점차 원 료미를 가공한 제품, 즉 밥이나 가공식품에서도 품종 판별이 필요해질 것이다.
현재 보고된 쌀에서의 유전자 추출 방법에 관한 연구로는, 벼 반립종자에서의 유전자 추출(Kang et al ., Korean J. Breed. 30: 1~7, 1998), 시리얼 등 상업적 쌀 가공품에서의 유전자 추출(Ren et al ., Food Research International 39: 433~439, 2006) 등이 알려져 있다.
본 발명의 목적은 밥으로부터 효소를 이용하여 양질의 유전자를 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 이 방법을 통하여 밥 원료미의 품종 확인 작업에 활용하도록 하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 쌀을 호화시켜 얻은 밥을 시료로 하여, CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 완충액 중에서 내열성 알파 아밀라제로 호화전분을 분해시키는 단계를 포함하는 DNA 추출 방법을 제공한다.
여기에서, 완충액은 100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA pH 8.0, 1.4M NaCl, 2 % CTAB인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 호화된 쌀, 즉 밥으로부터 호화전분을 분해하여 안정적으로 양질의 유전자(DNA)를 추출하는 방법을 확립하고, 이에 의해 추출된 유전자(DNA)를 가지고 종래 확립되어있는 PCR(Polymerase chain reaction) 방법과 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 OSR20 프라이머, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 RM249 프라이머, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 RM257 프라이머 중에서 선택된 어느 하나의 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머를 사용하는 핵산지문법을 이용하여, 대조구로서 밥과 동일한 품종의 쌀, 뿌리, 줄기에서 추출된 유전자와 비교하는 작업을 통해, 밥 원료미의 품종 판별이 가능함을 확인하였으며, 이에 따라 유통 및 소비단계에서 밥 원료미의 품종 판별에 활용할 수 있도록 하였다.
구체적으로, 본 발명은 형태가 보존된 밥알을 시료로 하고, 추출 완충액과 내열성 알파 아밀라제 효소를 이용하여 유전자(DNA)를 추출하는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 종래 식물체나 쌀에 대하여 실시하였던 시료의 분쇄 과정을 생략하고 호화전분을 분해함으로써 품종 판별에 필요한 양질의 유전자(DNA)를 획득할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 유전자를 PCR 후 기존 쌀 품종 판별에 사용된 SSR 방법으로 전기영동하여 원료미의 품종 판별이 가능하게 된다.
이하, 본 발명의 방법에 따라 밥으로부터 DNA를 추출하고, 이를 이용하여 원료미의 품종을 판별하는 방법을 단계별로 설명한다.
(1) 품종을 판별하고자 하는 쌀을 원료로 밥을 짓고 시험관에 밥알을 넣어 냉동 보관하며 시료로 사용한다. 대조구로는 밥의 원료미와 동일한 품종 벼의 뿌리, 줄기, 쌀을 사용한다.
(2) 밥알이 들어있는 시험관에서 CTAB 완충액을 이용하여 추출할 때 내열성 알파 아밀라제 효소를 넣어 유전자 추출 과정에 방해가 되는 호화전분을 분해하면서 유전자를 추출한다.
(3) 이어서, Nano-drop을 이용하여 추출된 유전자의 유무와 양을 점검하고 PCR 방법으로 유전자를 증폭시킨 후 아가로스 젤을 이용하여 PCR 산물을 확인한다.
(4) 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 OSR20 프라이머, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 RM249 프라이머, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 RM257 프라이머 중에서 선택된 어느 하나의 SSR 프라이머를 이용한 핵산지문법을 통해 대조구와 비교하여 밥의 유전자로부터 품종을 확인한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시료 준비
본 실시예에서는 2006년 재배된 벼를 원료로 하였으며, 운광벼, 태봉벼 및 상주벼의 세 가지 품종을 이용하였다.
벼 식물체에서 벼를 도정하여 쌀을 준비하고, 뿌리와 줄기도 채취하여 DNA를 추출하였다. 실험의 정확성을 기하기 위하여, 농촌진흥청 작물과학원 유전육종과에서 기본 품종의 쌀로부터 DNA를 추출하여 농도를 8 ㎍/㎕로 조정해놓은 유전자 추출물을 분양받아 대조구로 사용하였다.
밥 시료를 얻기 위해, 쌀 200 ｇ을 물에 4∼5 회 가볍게 씻고, 30 분간 물에 침지시킨 후, 일반 전기보온 밥솥을 이용하여 20 분간 취반을 하며 15 분간 뜸을 들인다. 호화된 밥알을 2 알씩 1.5 ㎖ 원심분리관(microcentrifuge tube)에 넣어 냉동실에 보관하면서 유전자 추출용 시료로 사용하였다. 시료는 마쇄하지 않았으며, 이때 호화된 밥의 수분 함량은 60∼63 %였다.
도 1은 밥으로부터 DNA를 추출하기 위한 시료 조제 과정을 보여주는 사진으로, 밥알 형태 그대로의 시료를 준비하여 추출 완충액을 넣고 유봉(pestle)을 이용하여 마쇄, 균질화 하는 단계를 보여준다.
실시예 2: 추출 완충액 조제 및 유전자 추출
(2-1) 추출 완충액과 효소에 의한 유전자 추출
호화된 쌀의 유전자를 추출하기 위한 완충액은 2% CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) 완충액을 기본으로 하고 이를 변형하여 사용하였다. 즉, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA pH 8.0, 1.4M NaCl, 2% CTAB로 조제하여 미리 65 ℃ 수조에서 보관한 완충액을, 밥알 형태 그대로의 시료가 담긴 원심분리관에 100 ㎕ 넣고 유봉을 이용하여 죽 상태로 밥알을 으깨며 균질화하였다(도 1의 C 참조). 원심분리관에 나머지 완충액 700 ㎕를 넣고 내열성 알파 아밀라제(Sigma, A3306) 2.5 ㎕를 첨가한 후 잘 혼합하여 65 ℃ 수조에서 30 분에 한 번씩 흔들어주면서 2 시간 동안 내열성 알파 아밀라제의 최적 온도 조건을 유지하였다.
(2-2) 유전자 추출물의 정제과정
원심분리관을 꺼내서 실온으로 식히고 400 ㎕ 클로로포름을 첨가하여 부드럽게 뒤집어 섞기로 10 분간 잘 혼합한 후, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15 분간 원심분리하고 상등액을 새 원심분리관에 옮겼다. 상등액의 25 % 부피의 에탄올과 11 % 부피의 5 M 아세트산칼륨(pH 8.0)을 첨가하여 잘 섞은 후 4 ℃, 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하고 다시 상등액을 새 원심분리관에 옮겼다. 상등액의 80 % 부피의 이소프로판올을 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 4 ℃, 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 추출된 DNA를 침전시켰다. 상등액을 버리고 75 % 에탄올로 세척 후 4 ℃, 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 버렸다. 원심분리관에 담긴 DNA를 건조시킨 후 RNase 50 ㎍/㎖가 포함된 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0 인 TE 완충액으로 부드럽게 잘 혼합하여 용해시켰다.
실시예 3: 밥 추출 DNA의 확인
내열성 알파 아밀라제 효소액을 이용하여 추출된 밥 DNA의 확인과 양 점검을 하기 위하여 Nanodrop spectrophotometer(ND-1000)로 측정하였다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 얻어진 밥 유전자(DNA) 추출물을 Nanodrop spectrophotometer로 측정하여 유전자의 유무 및 양을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 시료로 이용된 세 품종인 운광벼, 태봉벼 및 상주벼 모두에 대하여 DNA 검출 파장에서 안정되고 순도가 높은 피크를 얻어, 양질의 DNA를 추출하였음이 확인되었다.
또한, 작물과학원 유전육종과에서 대조구로서 분양 받은 쌀 추출 DNA 표준시료와, 효소액을 이용하여 추출된 밥 DNA 시료에 대하여, 다른 방법인 Pellet paint Co-Precipitant 방법(Novagen)을 이용하여 발광시켜 결과를 확인하였다.
도 3은 본 발명에 따라 추출된 밥 유전자(DNA) 추출물의 유무 및 양을 Pellet Paint Co-Precipitant (Novagen)법을 이용하여 재확인한 결과를 보여주는 사진으로, Nanodrop spectrophotometer의 결과와 마찬가지로 유전자 추출이 되었음을 재확인할 수 있었다.
실시예 4: 대조구에서 추출된 DNA의 확인
대조구로서는, 작물과학원에서 쌀의 품종 판별을 위해 기본 품종 쌀에서 미리 유전자를 추출하고 DNA를 확인해놓은 쌀 DNA 추출물을 분양받았으며, 또한 본 발명의 밥 DNA 추출을 위해 시료로 사용된 벼에서 채취한 뿌리와 줄기에서도 각 품종별로 DNA를 추출하여 대조구로 하였다.
이들 대조구에 대하여, 실시예 3의 밥 추출 DNA의 확인에 사용한 것과 동일 한 기기와 방법을 실시하였다.
도 4는 대조구로서 뿌리와 줄기로부터 얻은 유전자(DNA) 추출물을 Nanodrop spectrophotometer로 측정하여 유전자의 유무 및 양을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 대조구에서 얻어진 그래프는 본 발명에 따른 밥 추출 DNA를 측정하여 얻은 그래프와 동일한 패턴임을 확인할 수 있었다.
실시예 5: PCR을 이용한 유전자 증폭
유전자를 추출한 후 SSR 마커를 사용한 핵산지문법을 실시하여 품종 판별 가능성을 확인하기 위해, 추출한 유전자에 대하여 PCR을 실시하여 그 PCR 산물을 확인하였다.
PCR 방법 및 조건
1. DNA 4 ㎕, 10X 완충액 (12 mM Tris, 60 mM KCl, pH 8.3), 100 μM dNTP, 10 pM 프라이머, Taq 폴리머라제, 멸균수를 넣어 최종 반응액 부피를 20 ㎕로 함.
2. GeneAmp PCR System 9700(AB) 이용
94 ℃ 5 분 1 회
94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분 35 회
72 ℃ 5 분 1 회
3. 3X 로딩 완충액(1 mM NaOH, 1 % 포름아미드, 0.5 ㎍ 브롬페놀블루, 0.5 ㎍ 크실렌 시아놀 FF, 50 % 글리세롤) 10 ㎕ 첨가 후 95 ℃ 5 분.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 얻어진 유전자(DNA)와 쌀에서 추출한 유전자(DNA)를 PCR 방법에 의해 유전자를 증폭시키고 전기영동한 결과를 보여주는 사진 이다. 여기에서 보듯이, 벼에서 얻은 쌀, 뿌리 및 줄기에서 추출된 유전자(DNA)와 마찬가지로, 본 발명의 방법에 의해 추출된 밥 유전자(DNA)의 PCR 증폭이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 품종 판별용 SSR 프라이머를 이용한 밥과 대조구의 품종 확인
본 발명의 따라 밥으로부터 추출된 유전자(DNA)에 대하여, 품종 판별에 사용되는 SSR 마커를 이용하여 핵산지문법으로 원료미의 품종 판별이 가능한가 여부를 확인하였다. 품종은 운광벼, 태봉벼, 상주벼의 세 품종을 사용하였다. 밥을 지은 후 본 발명의 방법에 의해 밥에서 추출한 DNA와의 비교하기 위한 대조구로서는, 각 품종별로 작물과학원 유전육종과에서 품종 판별을 위하여 쌀로부터 유전자를 추출하여 확인해 놓은 쌀 DNA를 분양받았고, 밥을 짓기 전 동일 품종에서 얻은 벼의 뿌리와 줄기에서 추출된 DNA를 이용하였다.
실시예 5의 PCR 추출물을 다음 방법에 따라 전기영동을 실시하여 결과를 확인하였다:
(1) 4 % 아크릴아미드겔(OWl seperation system, S3S)로 100 Watt에서 40∼50 ℃로 pre-running시킨 후, PCR 증폭 산물 6 ㎕을 로딩하여 60∼90 분간 전기영동하였다.
(2) 다음 단계에 따라, 은 염색 용액(Silver staining solution)으로 염색하여 밴드를 확인하였다:
① 고정/정지 용액(fix/stop solution)에서 요소 제거 및 밴드 고정.
② 증류수로 세척 후 은 염색 용액에서 밴드 염색.
③ 증류수로 재세척 후 발색액으로 발색.
④ 고정/정지 용액(fix/stop solution)에서 밴드 고정 후 증류수로 세척 및 건조.
도 6은 밥과 대조구(쌀, 뿌리 및 줄기)에서 추출한 DNA의 PCR 증폭 산물을 품종 판별용 SSR 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 OSR20 프라이머, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 RM249 프라이머, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 RM257 프라이머)와 함께 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다. 여기에서 보듯이, 대조구로 사용된 쌀, 뿌리 및 줄기에서 추출된 유전자(DNA)와 함께 밥에서 추출한 유전자(DNA)로 전기영동을 실시한 결과, 대조구와 동일한 결과를 나타낸 것을 볼 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 방법에 따라 밥으로부터 추출한 유전자(DNA)를 사용하여, 소비단계에서 원료미의 품종판별이 가능함을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 밥의 호화전분을 분해함으로써 양질의 유전자(DNA)를 안정적으로 추출할 수 있으므로, 앞으로 유통 및 소비단계에서 밥 원료미 품종 판별 작업에 활용 가능성이 클 것으로 기대된다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> THE RELIABLE DNA EXTRACTION METHOD FROM COOKED RICE FOR THE IDENTIFICATION OF RICE VARIETIES <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer used to amplify SSR marker <400> 1 tggtcaagtg acttaggtgg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to amplify SSR marker <400> 2 agagctccaa ctctttacaa g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer used to amplify SSR marker <400> 3 ggcgtaaagg ttttgcatgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to amplify SSR marker <400> 4 atgatgccat gaaggtcagc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer used to amplify SSR marker <400> 5 cagttccgag caagagtact c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer used to amplify SSR marker <400> 6 ggatcggacg tggcatatg 19

Claims (3)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 쌀을 호화시켜 얻은 밥을 시료로 하여, 2% CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 완충액 중에서 내열성 알파 아밀라제로 호화전분을 분해시켜 DNA를 추출하는 단계;
    서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 OSR20 프라이머, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 RM249 프라이머, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 RM257 프라이머 중에서 선택된 어느 하나의 SSR 프라이머를 이용하여 상기 추출된 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키는 단계; 및
    상기 PCR 증폭산물로부터 핵산지문법에 의해 품종을 확인하는 단계;
    를 포함하는 쌀의 품종 판별 방법.
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