CN102747161A - 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 - Google Patents
一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102747161A CN102747161A CN2012102535399A CN201210253539A CN102747161A CN 102747161 A CN102747161 A CN 102747161A CN 2012102535399 A CN2012102535399 A CN 2012102535399A CN 201210253539 A CN201210253539 A CN 201210253539A CN 102747161 A CN102747161 A CN 102747161A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- seq
- mon88017
- downstream primer
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 10
- 235000021306 genetically modified maize Nutrition 0.000 title abstract 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 32
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 32
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 10
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 10
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000021152 breakfast Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 5
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 2
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 2
- 235000007862 Capsicum baccatum Nutrition 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 2
- 239000001728 capsicum frutescens Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000008519 pasta sauces Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000015113 tomato pastes and purées Nutrition 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸，具体涉及一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所示的寡核苷酸序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸，属生物技术领域。
背景技术
现如今，转基因技术在提高产量、改善品质、缓解粮食危机等方面作出了巨大贡献，同时，也为公众带来关于转基因生物安全的忧虑。在诸多争论中，转基因技术在作物种植中的应用仍迅猛发展，成为应用较快的农业新技术。随着转基因品系越来越多和转基因作物的种植面积逐年扩大，有关转基因技术的争议和质疑越来越多，我国也对转基因生物安全问题越来越重视。我国规定自2002年3月20日起，所有转基因农作物及其副产品都应加以标志，这时候就需要一种行之有效的检测方法来对相关产品进行检测。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种全新的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在一种链置换DNA聚合酶的作用下，等温条件保温60分钟，即可完成核酸扩增反应。具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本与检测所需时间远低于荧光定量PCR。目前国内外均未见利用-LAMP技术对转基因产品进行检测的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测转基因玉米品系Mon88017的LAMP寡核苷酸。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其为利用PrimerExplorer V4.0在线软件（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计的一组LAMP引物，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状下游引物。详见表1。
表1引物序列
本发明所提供的引物具有以下优点：(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。(2)特异性强。
本发明提供一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒，包括以下试剂组成：
（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO4、外侧上游引物（F3）、外侧下游引物（B3）、内侧上游引物（FIP）、内侧下游引物（BIP）、环状下游引物（LB）；
其中外侧上游引物（F3）是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物（B3）是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物（FIP）是序列表SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物（BIP）是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物（LB）是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；
（2）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；
（3）DEPC水；
（4）阴性对照：DEPC水；
（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品，来源于AOCS，含量为990.5g/kg；
（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。
其中所述LAMP反应液中：ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1% TritonX-100、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)，
甜菜碱：购自Sigma公司，
dNTPs：购自天根。
本发明还提供了一种检测转基因玉米品系Mon88017试剂盒的使用方法：
（1）提取样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取；
（2）进行LAMP反应，该LAMP反应体系见下表：
表2LAMP反应体系
（3）反应条件：65℃恒温反应60min，80℃2min使酶失活，反应即结束。
（4）结果判定：
浊度观察：反应结果可通过肉眼观测反应产物浊度来判断，白色混浊的为阳性，澄清透明的为阴性。也可将PCR管12000rpm离心2分钟，反应阳性的可在管底见到白色沉淀。
颜色变化：向反应终体系加入1μl显色液即SYBR Green Ⅰ荧光染料，阳性反应呈荧光绿色，而阴性反应则保持SYBR Green Ⅰ染料的荧光橙色。
电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎—环状结构DNA，因此阳性反应通过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现，可作为辅助检测方法。
本发明的优点是：使用本发明的特异性引物序列，试剂盒以及LAMP检测方法，能够特异，灵敏，同时简单和快速的检测含有Mon88017品系的转基因玉米及其制品。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1LAMP检测灵敏度图；
图2荧光PCR检测灵敏度图；
图3LAMP检测的特异性分析图；其中，
1：转基因玉米品系Mon88017；2：转基因玉米品系Mon810；3：转基因玉米品系Bt11；4：转基因玉米品系Bt176；5：转基因大豆品系RRS；6：转基因玉米品系Tc1507；7：转基因番茄品系华番一号；8：垦区大米；9：大豆；10：棉花籽；11：小麦粉；12：经典牌香辣红椒意粉酱；13：早餐先生多谷物麦片；14：必胜客番茄糊；15：早餐先生松脆苹果麦片；16：转基因玉米品系Mon88017；17：黑香米；18：黄豆粉；19：饼干粉；20：冷冻玉米棒；21：斯博番茄洋葱蘑菇意面酱；22：早餐先生松脆蜂蜜坚果麦片；23：转基因玉米品系Mon88017；M：DL2000；NC：阴性对照；
图4LAMP法检测人工污染实验样品图；
图5荧光PCR检测人工污染实验样品图。
具体实施方式
实施例1：LAMP检测体系的建立与优化
1.方法：
1）Mg2+浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节Mg2+浓度至0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L，于65℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同Mg2+浓度对扩增效率的影响。
2）dNTPs浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节dNTP终浓度至0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.6μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L，于65℃保温60min后，80℃反应2min终止反应。比较不同浓度dNTP对扩增效率的影响。
3）甜菜碱浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节甜菜碱浓度至0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L，于65℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同浓度甜菜碱对扩增效率的影响。
4）内外引物浓度比：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节内外引物浓度比分别为1:1、1:2、1:4、1:8，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同内外引物浓度比对扩增效率的影响。
5）反应时间：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于65℃保温15min、30min、45min、60min、90min、120min，85℃反应2min终止反应。比较反应时间长短对扩增效果的影响。
6）反应温度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于63℃、65℃、67℃、69℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同反应温度对扩增效果的影响。
2.结果：进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现Mg2+浓度选用4mM、dNTPs浓度选用1.4mM、甜菜碱浓度为1.0M、内外引物浓度比达1:8时，于65℃反应60min时所得扩增效果最佳，故以此做为试剂盒组成的依据和推荐反应条件。
实施例2：检测玉米转基因品系MON88017的试剂盒的组成
一、试剂盒的组成（保存于-20℃）
（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO4、外侧上游引物（F3）、外侧下游引物（B3）、内侧上游引物（FIP）、内侧下游引物（BIP）、环状下游引物（LB）；
其中外侧上游引物（F3）是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物（B3）是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物（FIP）是序列表SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物（BIP）是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物（LB）是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；
（2）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；
（3）DEPC水；
（4）阴性对照：DEPC水
（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品，来源于AOCS，含量为990.5g/kg；购自上海惠诚生物科技有限公司
（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。
其中所述LAMP反应液中：ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1% TritonX-100、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)，
甜菜碱：购自Sigma公司，
dNTPs：购自天根。
实施例3：检测玉米转基因品系MON88017的试剂盒的特异性和灵敏性试验
1.检测灵敏度分析
对Mon88017原始DNA溶液进行5倍梯度稀释，分别进行LAMP和荧光PCR检测。结果发现LAMP可检测到5-4（图7），实时荧光PCR检测可检测到5-5（图8）。
LAMP反应体系及反应条件如上所述。
25μL的实时荧光RT-PCR反应体系包括：2×Master mix（ABI公司，货号1110131）12.5μL、10μmol/L上游引物（5'-TGTCGTTTCCCGCCTTCA-3′，序列表中的编号为SEQ ID No.6）和下游引物（5'-CAGTATGCCGGAGTTGACCAT-3′，序列表中的编号为SEQ ID No.7）各1μL、10μmol/L探针（5'-FAM-TTTAAACAGAGTCGGGTTTG–TAMRA-3'，序列表中的编号为SEQ ID No.8）0.5μL以及DNA模板3μL。于ABI7900PCR仪中按以下条件进行反应：50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。
2.检测特异性分析
表3实验用样品列表
| 序号 | 样品名称 |
| 1 | 转基因玉米品系Mon810 |
| 2 | 转基因玉米品系Bt11 |
| 3 | 转基因玉米品系Bt176 |
| 4 | 转基因大豆品系RRS |
| 5 | 转基因玉米品系Tc1507 |
| 6 | 转基因番茄品系华番一号 |
| 7 | 垦区大米 |
| 8 | 大豆 |
| 9 | 棉花籽 |
| 10 | 小麦粉 |
| 11 | 经典牌香辣红椒意粉酱 |
| 12 | 早餐先生多谷物麦片 |
| 13 | 必胜客番茄糊 |
| 14 | 早餐先生松脆苹果麦片 |
| 15 | 黑香米 |
| 16 | 黄豆粉 |
| 17 | 饼干粉 |
| 18 | 冷冻玉米棒 |
| 19 | 斯博番茄洋葱蘑菇意面酱 |
| 20 | 早餐先生松脆蜂蜜坚果麦片 |
| 21 | 转基因玉米品系Mon88017 |
对表2中所列实验样品DNA分别进行LAMP扩增检测，结果显示Mon88017的扩增产物经SYBR Green Ⅰ染色显荧光绿色，经琼脂糖凝胶电泳检测则出现典型的梯状扩增带；而其余实验样品均无特异性扩增（见图3），无任何假阳性和假阴性结果出现，说明该方法检测转基因玉米品系Mon88017具有良好的特异性。
实施例4：人工污染样品中转基因品系Mon88017的LAMP检测
在一种经检验无转基因分成的商品化玉米面中进行添加，添加的标准品为来自AOCS，浓度为990.5g/kg的Mon88017标准品。添加梯度分别为5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%。分别进行LAMP和荧光PCR检测。
结果表明，在人工污染样品中，LAMP检测到0.5%含量的添加（图4），荧光PCR检测到0.2%的添加（图5）。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 外侧上游引物（F3）
<400> 1
gctagcttga tggggatcag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 外侧下游引物（B3）
<400> 2
cttgtagatg gcaccgcg 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 内侧上游引物（FIP）
<400> 3
ggcagtatgc cggagttgac ctcgtttccc gccttcagt 39
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 内侧下游引物（BIP）
<400> 4
ctggccgcac gcaggaaaaa tactgtcgtg tctgaccaag g 41
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 环状下游引物（LB）
<400> 5
gggcgaatca gaaagggcgt 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 6
tgtcgtttcc cgccttca 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 7
cagtatgccg gagttgacca t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针
<400> 8
tttaaacaga gtcgggtttg 20
Claims (3)
1.一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其特征在于：由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状下游引物。
2.一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成：
（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol 缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO4、外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物、内侧下游引物、环状下游引物；
其中所述外侧上游引物是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
（2）Bst DNA聚合酶；
（3）DEPC水；
（4）阴性对照：DEPC水；
（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品；
（6）显色液：SYBR Green I 染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为1×ThermoPol缓冲液、1.0 M 甜菜碱、1.4 mM dNTPs、4.0 mM MgSO4、0.2 μM外侧上游引物、0.2 μM外侧下游引物、1.6 μM内侧上游引物、1.6 μM内侧下游引物、0.8 μM环状下游引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210253539.9A CN102747161B (zh) | 2012-07-20 | 2012-07-20 | 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210253539.9A CN102747161B (zh) | 2012-07-20 | 2012-07-20 | 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102747161A true CN102747161A (zh) | 2012-10-24 |
| CN102747161B CN102747161B (zh) | 2014-02-26 |
Family
ID=47027648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210253539.9A Expired - Fee Related CN102747161B (zh) | 2012-07-20 | 2012-07-20 | 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102747161B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104830857A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-08-12 | 四川省农业科学院分析测试中心 | 转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 |
| CN105039555A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-11-11 | 吉林省农业科学院 | 转基因大豆mon87701的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101985661A (zh) * | 2010-12-08 | 2011-03-16 | 北京农业生物技术研究中心 | 一种利用lamp法快速检测转基因玉米的方法 |
| CN102051416A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 用于转基因玉米品系mir604常温检测的lamp引物组 |
-
2012
- 2012-07-20 CN CN201210253539.9A patent/CN102747161B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102051416A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 用于转基因玉米品系mir604常温检测的lamp引物组 |
| CN101985661A (zh) * | 2010-12-08 | 2011-03-16 | 北京农业生物技术研究中心 | 一种利用lamp法快速检测转基因玉米的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LILI CHEN等: "Development of the Visual Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays for Seven Genetically Modified Maize Events and Their Application in Practical Samples Analysis", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 * |
| 瞿勇等: "转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化", 《农业生物技术学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104830857A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-08-12 | 四川省农业科学院分析测试中心 | 转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 |
| CN104830857B (zh) * | 2015-05-27 | 2018-07-24 | 四川省农业科学院分析测试中心 | 转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 |
| CN105039555A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-11-11 | 吉林省农业科学院 | 转基因大豆mon87701的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105039555B (zh) * | 2015-08-10 | 2018-03-30 | 吉林省农业科学院 | 转基因大豆mon87701的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102747161B (zh) | 2014-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vaagt et al. | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based method for rapid mushroom species identification | |
| CN107022624B (zh) | 从稻种中快速检测水稻恶苗病病菌的lamp法及试剂盒 | |
| CN107760795B (zh) | 一种快速检测茶树炭疽病菌的lamp引物及检测方法 | |
| CN109486970B (zh) | 一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒 | |
| CN108220474A (zh) | 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用 | |
| Akkurt | Comparison between modified DNA extraction protocols and commercial isolation kits in grapevine (Vitis vinifera L.) | |
| CN116064906A (zh) | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 | |
| JP6466725B2 (ja) | ウナギの種の同定補助方法 | |
| CN101724698B (zh) | 检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒 | |
| CN102747161A (zh) | 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸 | |
| CN108588091A (zh) | 一种黄秋葵内参基因及其应用 | |
| CN102827936B (zh) | 检测转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的组合物及其试剂盒 | |
| CN112813189A (zh) | 利用四重实时荧光pcr快速鉴定转基因玉米品系的方法 | |
| CN103725777B (zh) | 一种快速检测转基因大豆mon89788的实时荧光pcr方法 | |
| CN104293957B (zh) | 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 | |
| CN103667530A (zh) | 一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法 | |
| CN106868147B (zh) | 一种香蕉叶斑病菌分子检测引物及其快速检测方法 | |
| CN111088392B (zh) | 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法 | |
| CN114395617A (zh) | 一种草莓白粉病菌lamp可视化快速检测方法及应用 | |
| CN112195257A (zh) | 一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法 | |
| JP5956389B2 (ja) | 耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法 | |
| CN113215269A (zh) | 一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化检测的检测试剂盒及其应用 | |
| CN114645100A (zh) | 一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测h7亚型禽流感病毒的方法 | |
| JP2016002005A (ja) | イチゴ種子のｄｎａ粗抽出液を用いたイチゴｆ１種子の純度検定法 | |
| CN104164486B (zh) | 一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140226 Termination date: 20210720 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |