CN102747161A

CN102747161A - 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸

Info

Publication number: CN102747161A
Application number: CN2012102535399A
Authority: CN
Inventors: 曾静; 马丹; 张蕾; 张西萌; 魏海燕
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-20
Also published as: CN102747161B

Abstract

本发明公开了一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸，具体涉及一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所示的寡核苷酸序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。

Description

一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸

技术领域

本发明涉及一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸，属生物技术领域。

背景技术

现如今，转基因技术在提高产量、改善品质、缓解粮食危机等方面作出了巨大贡献，同时，也为公众带来关于转基因生物安全的忧虑。在诸多争论中，转基因技术在作物种植中的应用仍迅猛发展，成为应用较快的农业新技术。随着转基因品系越来越多和转基因作物的种植面积逐年扩大，有关转基因技术的争议和质疑越来越多，我国也对转基因生物安全问题越来越重视。我国规定自2002年3月20日起，所有转基因农作物及其副产品都应加以标志，这时候就需要一种行之有效的检测方法来对相关产品进行检测。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种全新的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在一种链置换DNA聚合酶的作用下，等温条件保温60分钟，即可完成核酸扩增反应。具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本与检测所需时间远低于荧光定量PCR。目前国内外均未见利用-LAMP技术对转基因产品进行检测的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测转基因玉米品系Mon88017的LAMP寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其为利用PrimerExplorer V4.0在线软件（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计的一组LAMP引物，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状下游引物。详见表1。

表1引物序列

本发明所提供的引物具有以下优点：(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。(2)特异性强。

本发明提供一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒，包括以下试剂组成：

（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO₄、外侧上游引物（F3）、外侧下游引物（B3）、内侧上游引物（FIP）、内侧下游引物（BIP）、环状下游引物（LB）；

其中外侧上游引物（F3）是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物（B3）是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物（FIP）是序列表SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物（BIP）是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物（LB）是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；

（2）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

（3）DEPC水；

（4）阴性对照：DEPC水；

（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品，来源于AOCS，含量为990.5g/kg；

（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

其中所述LAMP反应液中：ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1% TritonX-100、10mM(NH4)₂SO₄、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)，

甜菜碱：购自Sigma公司，

dNTPs：购自天根。

本发明还提供了一种检测转基因玉米品系Mon88017试剂盒的使用方法：

（1）提取样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取；

（2）进行LAMP反应，该LAMP反应体系见下表：

表2LAMP反应体系

（3）反应条件：65℃恒温反应60min，80℃2min使酶失活，反应即结束。

（4）结果判定：

浊度观察：反应结果可通过肉眼观测反应产物浊度来判断，白色混浊的为阳性，澄清透明的为阴性。也可将PCR管12000rpm离心2分钟，反应阳性的可在管底见到白色沉淀。

颜色变化：向反应终体系加入1μl显色液即SYBR Green Ⅰ荧光染料，阳性反应呈荧光绿色，而阴性反应则保持SYBR Green Ⅰ染料的荧光橙色。

电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎—环状结构DNA，因此阳性反应通过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现，可作为辅助检测方法。

本发明的优点是：使用本发明的特异性引物序列，试剂盒以及LAMP检测方法，能够特异，灵敏，同时简单和快速的检测含有Mon88017品系的转基因玉米及其制品。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1LAMP检测灵敏度图；

图2荧光PCR检测灵敏度图；

图3LAMP检测的特异性分析图；其中，

1：转基因玉米品系Mon88017；2：转基因玉米品系Mon810；3：转基因玉米品系Bt11；4：转基因玉米品系Bt176；5：转基因大豆品系RRS；6：转基因玉米品系Tc1507；7：转基因番茄品系华番一号；8：垦区大米；9：大豆；10：棉花籽；11：小麦粉；12：经典牌香辣红椒意粉酱；13：早餐先生多谷物麦片；14：必胜客番茄糊；15：早餐先生松脆苹果麦片；16：转基因玉米品系Mon88017；17：黑香米；18：黄豆粉；19：饼干粉；20：冷冻玉米棒；21：斯博番茄洋葱蘑菇意面酱；22：早餐先生松脆蜂蜜坚果麦片；23：转基因玉米品系Mon88017；M：DL2000；NC：阴性对照；

图4LAMP法检测人工污染实验样品图；

图5荧光PCR检测人工污染实验样品图。

具体实施方式

实施例1：LAMP检测体系的建立与优化

1.方法：

1）Mg²⁺浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节Mg2+浓度至0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L，于65℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同Mg2+浓度对扩增效率的影响。

2）dNTPs浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节dNTP终浓度至0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.6μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L，于65℃保温60min后，80℃反应2min终止反应。比较不同浓度dNTP对扩增效率的影响。

3）甜菜碱浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节甜菜碱浓度至0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L，于65℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同浓度甜菜碱对扩增效率的影响。

4）内外引物浓度比：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节内外引物浓度比分别为1:1、1:2、1:4、1:8，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同内外引物浓度比对扩增效率的影响。

5）反应时间：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于65℃保温15min、30min、45min、60min、90min、120min，85℃反应2min终止反应。比较反应时间长短对扩增效果的影响。

6）反应温度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于63℃、65℃、67℃、69℃保温60min后，85℃反应2min终止反应。比较不同反应温度对扩增效果的影响。

2.结果：进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现Mg²⁺浓度选用4mM、dNTPs浓度选用1.4mM、甜菜碱浓度为1.0M、内外引物浓度比达1:8时，于65℃反应60min时所得扩增效果最佳，故以此做为试剂盒组成的依据和推荐反应条件。

实施例2：检测玉米转基因品系MON88017的试剂盒的组成

一、试剂盒的组成（保存于-20℃）

（2）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

（3）DEPC水；

（4）阴性对照：DEPC水

（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品，来源于AOCS，含量为990.5g/kg；购自上海惠诚生物科技有限公司

（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

其中所述LAMP反应液中：ThermoPol缓冲液，购自NEB公司，1×ThermoPol缓冲液含0.1% TritonX-100、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)，

甜菜碱：购自Sigma公司，

dNTPs：购自天根。

实施例3：检测玉米转基因品系MON88017的试剂盒的特异性和灵敏性试验

1.检测灵敏度分析

对Mon88017原始DNA溶液进行5倍梯度稀释，分别进行LAMP和荧光PCR检测。结果发现LAMP可检测到5^-4（图7），实时荧光PCR检测可检测到5^-5（图8）。

LAMP反应体系及反应条件如上所述。

25μL的实时荧光RT-PCR反应体系包括：2×Master mix（ABI公司，货号1110131）12.5μL、10μmol/L上游引物（5'-TGTCGTTTCCCGCCTTCA-3′，序列表中的编号为SEQ ID No.6）和下游引物（5'-CAGTATGCCGGAGTTGACCAT-3′，序列表中的编号为SEQ ID No.7）各1μL、10μmol/L探针（5'-FAM-TTTAAACAGAGTCGGGTTTG–TAMRA-3'，序列表中的编号为SEQ ID No.8）0.5μL以及DNA模板3μL。于ABI7900PCR仪中按以下条件进行反应：50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。

2.检测特异性分析

表3实验用样品列表

序号	样品名称
		1	转基因玉米品系Mon810
2	转基因玉米品系Bt11
		3	转基因玉米品系Bt176
4	转基因大豆品系RRS
		5	转基因玉米品系Tc1507
6	转基因番茄品系华番一号
		7	垦区大米
8	大豆

9	棉花籽
		10	小麦粉
11	经典牌香辣红椒意粉酱
		12	早餐先生多谷物麦片
13	必胜客番茄糊
		14	早餐先生松脆苹果麦片
15	黑香米
		16	黄豆粉
17	饼干粉
		18	冷冻玉米棒
19	斯博番茄洋葱蘑菇意面酱
		20	早餐先生松脆蜂蜜坚果麦片
21	转基因玉米品系Mon88017

对表2中所列实验样品DNA分别进行LAMP扩增检测，结果显示Mon88017的扩增产物经SYBR Green Ⅰ染色显荧光绿色，经琼脂糖凝胶电泳检测则出现典型的梯状扩增带；而其余实验样品均无特异性扩增（见图3），无任何假阳性和假阴性结果出现，说明该方法检测转基因玉米品系Mon88017具有良好的特异性。

实施例4：人工污染样品中转基因品系Mon88017的LAMP检测

在一种经检验无转基因分成的商品化玉米面中进行添加，添加的标准品为来自AOCS，浓度为990.5g/kg的Mon88017标准品。添加梯度分别为5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%。分别进行LAMP和荧光PCR检测。

结果表明，在人工污染样品中，LAMP检测到0.5%含量的添加（图4），荧光PCR检测到0.2%的添加（图5）。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒和寡核苷酸

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 外侧上游引物（F3）

<400> 1

gctagcttga tggggatcag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 外侧下游引物（B3）

<400> 2

cttgtagatg gcaccgcg 18

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 内侧上游引物（FIP）

<400> 3

ggcagtatgc cggagttgac ctcgtttccc gccttcagt 39

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 内侧下游引物（BIP）

<400> 4

ctggccgcac gcaggaaaaa tactgtcgtg tctgaccaag g 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 环状下游引物（LB）

<400> 5

gggcgaatca gaaagggcgt 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 6

tgtcgtttcc cgccttca 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 7

cagtatgccg gagttgacca t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 探针

<400> 8

tttaaacaga gtcgggtttg 20

Claims

1.一组检测转基因玉米品系Mon88017的寡核苷酸，其特征在于：由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状下游引物。

2.一种检测转基因玉米品系Mon88017的试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成：

（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol 缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO₄、外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物、内侧下游引物、环状下游引物；

其中所述外侧上游引物是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

（2）Bst DNA聚合酶；

（3）DEPC水；

（4）阴性对照：DEPC水；

（5）阳性对照：转基因玉米品系Mon88017的标准品；

（6）显色液：SYBR Green I 染料。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为1×ThermoPol缓冲液、1.0 M 甜菜碱、1.4 mM dNTPs、4.0 mM MgSO₄、0.2 μM外侧上游引物、0.2 μM外侧下游引物、1.6 μM内侧上游引物、1.6 μM内侧下游引物、0.8 μM环状下游引物。