CN116064906A - 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 - Google Patents
一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116064906A CN116064906A CN202211205565.4A CN202211205565A CN116064906A CN 116064906 A CN116064906 A CN 116064906A CN 202211205565 A CN202211205565 A CN 202211205565A CN 116064906 A CN116064906 A CN 116064906A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- soybean
- primer pair
- detection
- primer
- phoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 90
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims description 23
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 53
- 241000948155 Phytophthora sojae Species 0.000 claims abstract description 36
- 241001503951 Phoma Species 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 7
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 7
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 3
- 241000866066 Diaporthe caulivora Species 0.000 description 3
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000233788 Arecaceae Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 1
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241001508801 Diaporthe phaseolorum Species 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 241001556359 Fusarium solani f. sp. glycines Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 244000183278 Nephelium litchi Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 241001480007 Phomopsis Species 0.000 description 1
- 241000233616 Phytophthora capsici Species 0.000 description 1
- 241001443921 Phytophthora litchii Species 0.000 description 1
- 241000233629 Phytophthora parasitica Species 0.000 description 1
- 241000948146 Phytophthora vignae Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 244000000034 soilborne pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/77—Fusarium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法。所述引物组由用于大豆疫霉菌的检测引物对SoqF/SoqR、用于大豆南方茎溃疡病菌的检测引物对DPM1F/DPM1R、用于大豆北方茎溃疡病菌的检测引物对DPC2F/DPC2R、用于北美大豆猝死综合症病菌的检测引物对FV3F/FV3R组成。在同一个PCR反应体系里加入上述引物组，经多重PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，分别得到不同大小的特异扩增产物。本发明引物组及检测方法特异性强、敏感性高，可快速准确地在一个体系里同步检测大豆中的多种检疫性病原菌。可用于口岸检验检疫、田间病害的早期诊断、病菌的监测与鉴别。
Description
技术领域
本发明属于农业病原菌检测技术领域，具体涉及一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法，更具体的，涉及一种同步检测大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌中的多种病原菌的简单、快速、特异、灵敏的多重PCR引物及检测方法。
背景技术
大豆是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。目前可为害大豆的病虫害有上百种，已列入我国检疫性有害生物、且在生产上可造成重大危害的有大豆疫霉菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌及北美大豆猝死综合症病菌。大豆的这四种病原菌，是目前严重影响大豆生产及贸易的病原菌，具有重要的检疫重要性和经济重要性。
大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)侵染大豆，引起大豆疫霉根腐病菌，该病菌在我国被列为进境植物有害生物名录，1991年首次在我国黑龙江省发现该病害，此后，该病害呈逐年扩大趋势，目前该病害已对我国大豆生产构成了威胁。大豆疫霉根腐病是一种土传病原害，病原菌可以经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，而且其侵染能力强，由其引起的病害多属于多循环病害，在较短的时间内可造成植株死亡。因此，开展大豆疫霉根腐病菌检测，防止其从口岸进入或从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，以及海关进出境快速检测鉴定，对大豆疫霉根腐病的传播与控制具有重要意义。
大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis，DPM)，该病害于1973年在美国首次报道，目前已经被我国列入检疫性名录，是我国的重要检疫性病原，严重影响大豆生产及贸易，具有检疫重要性和经济重要性。茎溃疡病菌以菌丝和子囊壳在大豆植株残体上越冬，并且抗逆性很强，病残体在-18℃～15℃下可存活14个月。通过种子和混在大豆中的病残体可进行远距离传播，种子带菌是传病因素之一。目前分布于美国、巴西、阿根廷、玻利维亚、巴拉圭等国，是国外大豆生产上的重要病害。由于传入风险高，但我国绝大部分地区都适合该病菌生长，由此亟需一种快速简便方法应对口岸进出货物检测。
大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora，DPC)，目前严重影响大豆生产及贸易，具有检疫重要性和经济重要性。大豆北方茎溃疡病菌于1950年在美国爱荷华州首次发现，侵染大豆所引起严重病害，且严重影响大豆的生产，在某些地区损失率高达100％。目前主要分布于巴西、玻利维亚、巴拉圭、美国、阿根廷等美洲地区，在欧洲部分地区如保加利亚、意大利亦有分布，迄今为止，在我国暂未发现大豆茎溃疡病菌，但是从文献相关报道来看，疫情还在不断蔓延，严重影响大豆生产。由于传入风险高，且我国绝大部分地区都适合该病菌生长，因此已经被我国列为检疫性有害生物，由此亟需一种快速简便方法应对口岸进出货物检测。
北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)引起大豆猝死综合症，英文名称为Sudden Death Syndorme of Soybean，简称SDS，是近二十年来在美国等国大豆上发生的一种由镰刀菌引起的较新的真菌病害。该病于1971年在美国阿肯色州首次发现，到1982年此病害导致该州大豆产量严重下降后，引起了人们的重视，根据其发病迅速的特点，定名为大豆碎死综合症。大豆碎死综合症危害性很大，在适宜的条件下可引致100％的损失。
目前大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌及北美大豆猝死综合症病菌等病原菌是我国重要进境检疫病原菌，已列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。其中本发明涉及的四种大豆检疫性病原菌是目前严重影响大豆生产及贸易的病害，具有检疫重要性和经济重要性。大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌的常用检测方法有传统分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。传统分离鉴定、免疫学方法检测过程费时费力，且灵敏度较低。随着生物技术的发展，基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用，主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术，这些技术可对多个靶标进行同时检测，具有快速、高通量、样品消耗少等特点。多重PCR是一种PCR衍生方法，它的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有两对或多对引物，分别扩增不同模板，可对多个靶标进行同时检测。多重PCR(multiplex polymerase chainreaction)是在同一个反应体系对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，能够一次实现对多种病原菌的检测，其特点是耗时短的同时提高准确性和灵敏度。多重PCR技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，在植物病原菌的鉴定和检测，尤其是对作物携带多种病原菌或病原菌复合侵染的检测中具有广泛的应用前景。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法。本发明的多重PCR检测引物组合特异性强、灵敏度高，检测方法简便快速，且结果可靠。
本发明方案包括以下内容：
针对大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌的特异性靶标，设计出特异性检测引物。其中，大豆疫霉菌(PHYSODRAFT_299276)特异检测靶标序列如SEQ ID NO：1所示，大豆南方茎溃疡病菌(MS-SSC91)特异检测靶标序列scaffold_2633如SEQ ID NO：2所示，大豆北方茎溃疡病菌(EF-1α序列)特异检测靶标序列如SEQ ID NO：3所示，北美大豆猝死综合征病菌(AEYB01000435.1)特异检测靶标序列如SEQ ID NO：4所示。
一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组，由以下引物对中的至少两对组成；
a.用于大豆疫霉菌的检测引物对SoqF/SoqR，其核苷酸序列为SoqF：5’-CACTTGTGGCTCTGTAG-3’,SoqR：5’-GCAGCTTTCTCTAGGTAG-3’；(SEQ ID NO：5～6)
b.用于大豆南方茎溃疡病菌的检测引物对DPM1F/DPM1R，其核苷酸序列为DPM1F：5’-GAATCCTTGTGGGTATTTG-3’,DPM1R：5’-GTCAATATGCTATGGTCAC-3’；(SEQ ID NO：7～8)
c.用于大豆北方茎溃疡病菌的检测引物对DPC2F/DPC2R，其核苷酸序列为DPC2F：5’-ACTCCCATCCCAGTGCTA-3’,DPC2R：5’-AGAAGAGGTCAGCATCATGC-3’；(SEQ ID NO：9～10)
d.用于北美大豆猝死综合症病菌的检测引物对FV3F/FV3R，其核苷酸序列为FV3F：5’-ATCGCTCATCTCTCTTCC-3’,FV3R：5’-TCGTCTCTTTCTCGCTTAG-3’。(SEQ ID NO：11～12)
进一步的，本发明提供一种用于同步检测大豆疫霉菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌及北美大豆猝死综合症病菌的多重PCR专用引物组，由引物对SoqF/SoqR、引物对DPM1F/DPM1R、引物对DPC2F/DPC2R和引物对FV3F/FV3R组成。
本发明涉及所述的引物组在同步检测多种大豆检疫性病原菌中的应用。
本发明涉及所述的引物组在制备用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的试剂盒中的应用。
另一方面，本发明进一步提供采用所述的引物组同步检测多种大豆检疫性病原菌的方法，包括如下步骤：
步骤一：以待测样品的DNA为模板，利用设计的特异引物进行多重PCR反应；
步骤二：将多重PCR扩增的产物进行电泳，观察是否出现1310bp、678bp、279bp、112bp条带；若出现1310bp条带，则判断为大豆疫霉病菌阳性；若出现678p条带，则判断为大豆南方茎溃疡病菌阳性；若出现279p条带，则判断为大豆北方茎溃疡病菌阳性；若出现112bp条带，则判断为北美大豆猝死综合症病菌阳性；若未出现对应大小条带，则判断为对应病原菌阴性。
优选的，每20μL多重PCR反应体系包括：2×Taq PCR Master Mix Ⅱ 10μL，10μM的检测引物对各0.25μL，50μg/mL-1的DNA模板1μL，dd.H2O补足20μL。
优选的，多重PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
本发明所取得的效果：
综上所述，本发明对病菌基因组全序列进行分析，发现其特异性靶标位点，针对特异性靶标设计了大豆检疫性病原菌特异靶标位点PCR引物对，本发明引物具有非常好的特异性。利用本发明的PCR引物对，用于多目标同步检测大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌，该检测方法对于口岸检验检疫、农业生产中引起的病害防治具有重要的实用价值。
1、特异性高。本发明通过对病菌全基因组序列分析获得特异的靶标位点，设计特异检测引物组合进行检测。已经对来自不同病原菌的其它不同近缘种进行验证，结果具有很强的特异性；
2、操作简便快速。应用本发明方法，对带病菌的DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切，也无需昂贵的仪器设备及复杂的操作，一般整个检测过程可简单在1-2小时内完成，提高进境大豆疫情截获率，提高防范外来有害生物入侵能力，都具有重要实用性和技术性。
3、省时省力，检测成本低。本发明的多目标同步检测方法，能够同时检测大豆上的四种重要检疫性病原菌，大大提高了海关口岸检验检疫速度；尤其是近年来大豆进口量日益增加的情况下，提供了一种快速、灵敏、特异的检测方法，可以缩短传统检测时间，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本。
附图说明
图1：实施例3的多重PCR特异性试验结果。
其中，M：标准DNA分子量2000；1：大豆疫霉；2：大豆南方茎溃疡病菌；3：大豆北方茎溃疡病菌；4：大豆北美猝死综合症病菌；5：大豆疫霉+大豆南方茎溃疡病菌；6：大豆疫霉+大豆北方茎溃疡病菌；7：大豆疫霉+大豆北美猝死综合症病菌；8：大豆南方茎溃疡病菌+大豆北方茎溃疡病菌；9：大豆南方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；10：大豆北方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；11：大豆疫霉+大豆南方茎溃疡病菌+大豆北方茎溃疡病菌；12：大豆疫霉+大豆南方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；13：大豆疫霉+大豆北方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；14：大豆南方茎溃疡病菌+大豆北方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；15：大豆疫霉+大豆南方茎溃疡病菌+大豆北方茎溃疡病菌+大豆北美猝死综合症病菌；16：阴性对照(H2O)；17：豇豆疫霉；18：黄瓜疫霉；19：致病疫霉；20：棕榈疫霉；21：寄生疫霉；22：掘氏疫霉；23：辣椒疫霉；24：樟疫霉；25：芋头疫霉；26：恶疫霉；27：荔枝疫霉；28：拟茎点霉；29：荔枝炭疽；30：白菜炭疽；31：辣椒炭疽；32：毛豆炭疽；33：黄色镰刀菌；34：多丝镰刀菌；35：尖镰刀菌；36：茄镰刀菌；37：禾谷镰刀菌。
图2：实施例4的多重PCR灵敏性试验结果。其中，M：标准DNA分子量2000；1-8：大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌混合物DNA浓度依次梯度稀释为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，0.0001ng/μL，0.00001ng/μL；9：蒸馏水(阴性对照)
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图，对本发明做进一步的说明。
实施例1大豆病原菌单重PCR反应体系及反应条件的建立
1.引物设计及筛选
分别先对大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌四种大豆病原菌的全基因组特异靶标位点分析，找出各检测靶标序列独有的碱基位点。设计出具有如下的核酸序列的引物对；
大豆疫霉菌检测特异引物对：
SoqF：5’-CACTTGTGGCTCTGTAG-3’
SoqR：5’-GCAGCTTTCTCTAGGTAG-3’；
大豆南方茎溃疡病菌检测特异引物对：
DPM1F：5’-GAATCCTTGTGGGTATTTG-3’,
DPM1R：5’-GTCAATATGCTATGGTCAC-3’
大豆北方茎溃疡病菌病菌检测特异引物对：
DPC2F：5’-ACTCCCATCCCAGTGCTA-3’
DPC2R：5’-AGAAGAGGTCAGCATCATGC-3’
北美大豆猝死综合症病菌检测特异引物对：
FV3F：5’-ATCGCTCATCTCTCTTCC-3’
FV3R：5’-TCGTCTCTTTCTCGCTTAG-3’
2.PCR反应体系及反应条件的建立
本研究分别对大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌单重PCR检测反应体系及反应条件进行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。
最佳PCR反应体系为(以20μL的PCR最终反应溶液计算)：
2×Taq PCR MasterMix 10μL，PCR引物对各0.25μM，四种大豆病原菌模板DNA各1μL，ddH2O补足至20μL；
针对大豆疫霉病菌的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；
针对大豆南方茎溃疡病菌的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；
针对大豆北方茎溃疡病菌的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；
针对北美大豆猝死综合症病菌的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
实施例2：大豆病原菌多重PCR反应体系及反应条件的建立
基于单重PCR检测的反应体系及反应条件，本发明对多重PCR检测中的各参数进行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。
2×Taq PCR MasterMix 10μL，PCR引物对各0.25μM，四种大豆病原菌模板DNA各1μL，ddH2O补足至20μL；
上述多重PCR反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
实施例3：大豆病原菌多重PCR检测用引物组的检测特异性的验证
在进行检测前对实验所采用的各菌株进行培养，提取基因组DNA，用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测DNA浓度，以浓度为10ng/μL的DNA作为模板进行PCR扩增。
利用实施例2中建立的多重PCR反应体系及反应条件进行多重PCR检测，对PCR产物进行电泳分析。结果如图1所示，只有大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌及其混合物可扩增出特异的目的片段，其他的均为阴性，结果与预期相符，说明本发明的多重PCR检测体系特异性良好。
实施例4：大豆病原菌多重PCR检测用引物组的检测灵敏度的验证
在进行检测前对实验所采用的各菌株进行培养，提取基因组DNA，用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测DNA浓度，进行10倍梯度稀释，利用实施例1中所示的各引物对，分别以不同浓度的DNA作为模板进行PCR扩增，其它反应体系及反应条件如实施例2中所述，对PCR产物进行电泳分析。结果如图2所示，本发明大豆疫霉多重PCR方法的灵敏度为1ng/μL。
采用本发明的PCR方法检测大豆疫霉病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌，能够大大提高检测的灵敏度、特异性；并且较传统的细菌分离方法相比大大缩短了检测的周期，提高了检测的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组，其特征在于，由以下引物对中的至少两对组成；
a.用于大豆疫霉菌的检测引物对SoqF/SoqR，其核苷酸序列为SoqF：5’-CACTTGTGGCTCTGTAG-3’,SoqR：5’-GCAGCTTTCTCTAGGTAG-3’；
b.用于大豆南方茎溃疡病菌的检测引物对DPM1F/DPM1R，其核苷酸序列为DPM1F：5’-GAATCCTTGTGGGTATTTG-3’,DPM1R：5’-GTCAATATGCTATGGTCAC-3’；
c.用于大豆北方茎溃疡病菌的检测引物对DPC2F/DPC2R，其核苷酸序列为DPC2F：5’-ACTCCCATCCCAGTGCTA-3’,DPC2R：5’-AGAAGAGGTCAGCATCATGC-3’；
d.用于北美大豆猝死综合症病菌的检测引物对FV3F/FV3R，其核苷酸序列为FV3F：5’-ATCGCTCATCTCTCTTCC-3’,FV3R：5’-TCGTCTCTTTCTCGCTTAG-3’。
2.用于同步检测大豆疫霉菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌及北美大豆猝死综合症病菌的多重PCR专用引物组，其特征在于，由权利要求1所述的引物对SoqF/SoqR、引物对DPM1F/DPM1R、引物对DPC2F/DPC2R和引物对FV3F/FV3R组成。
3.权利要求1或权利要求2所述的引物组在同步检测多种大豆检疫性病原菌中的应用。
4.权利要求1或权利要求2所述的引物组在制备用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的试剂盒中的应用。
5.采用权利要求1所述的引物组同步检测多种大豆检疫性病原菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：以待测样品的DNA为模板，利用设计的特异引物进行多重PCR反应；
步骤二：将多重PCR扩增的产物进行电泳，观察是否出现1310bp、678bp、279bp、112bp条带；若出现1310bp条带，则判断为大豆疫霉病菌阳性；若出现678p条带，则判断为大豆南方茎溃疡病菌阳性；若出现279p条带，则判断为大豆北方茎溃疡病菌阳性；若出现112bp条带，则判断为北美大豆猝死综合症病菌阳性；若未出现对应大小条带，则判断为对应病原菌阴性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每20μL多重PCR反应体系包括：2×Taq PCRMaster MixⅡ10μL，10μM的检测引物对各0.25μL，50μg/mL-1的DNA模板1μL，dd.H2O补足20μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，多重PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211205565.4A CN116064906A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211205565.4A CN116064906A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116064906A true CN116064906A (zh) | 2023-05-05 |
Family
ID=86182688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211205565.4A Pending CN116064906A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116064906A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116516059A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 海南大学三亚南繁研究院 | 可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒 |
| CN116516058A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 海南大学三亚南繁研究院 | 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211205565.4A patent/CN116064906A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116516059A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 海南大学三亚南繁研究院 | 可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒 |
| CN116516058A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 海南大学三亚南繁研究院 | 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒 |
| CN116516059B (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-29 | 海南大学三亚南繁研究院 | 可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116064906A (zh) | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 | |
| CN107557446B (zh) | 用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN114292944B (zh) | 一种与辣椒疫病抗性连锁的snp分子标记及其应用 | |
| CN109280715B (zh) | 一种检测花生黑腐病菌的lamp引物组及其快速检测方法和试剂盒 | |
| Forcelini et al. | Development of high-throughput SNP genotyping assays for rapid detection of strawberry Colletotrichum species and the G143A mutation | |
| CN110982922B (zh) | 基于lamp快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物及方法 | |
| CN108949916B (zh) | 油菜黑胫病菌特异性序列及lamp检测引物和应用 | |
| CN104946760B (zh) | 一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒 | |
| CN112813189A (zh) | 利用四重实时荧光pcr快速鉴定转基因玉米品系的方法 | |
| CN109868329B (zh) | 刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法 | |
| CN111850155A (zh) | 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用 | |
| Yang et al. | Development of loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of pomegranate twig blight and crown rot disease caused by Coniella granati | |
| CN114507743B (zh) | 一种快速检测菲利普孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用 | |
| Yuan et al. | Rapid detection of the E198A mutation of carbendazim-resistant isolates in Colletotrichum gloeosporioides by loop-mediated isothermal amplification | |
| WO2003068988A1 (en) | A method of pcr based detection and identification of rice blast fungus magnaporthe grisea | |
| KR100560996B1 (ko) | 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자 | |
| Kusunoki et al. | A leafhopper (Hishimonus sellatus) transmits phylogenetically distant phytoplasmas: Rhus yellows and Hovenia witches' broom phytoplasma | |
| KR102213231B1 (ko) | 고추 감염 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| Munusamy et al. | RT-qPCR profiling of pathogenesis related genes in Musa acuminata cv.‘Berangan’seedlings challenged with Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 | |
| Liao et al. | Triplex real-time PCR detection of three quarantine Phytophthora pathogens infecting Malus Miller | |
| CN106480231B (zh) | 一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重rt-pcr方法及其应用 | |
| CN112143825B (zh) | 一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重pcr检测引物及应用 | |
| KR101491776B1 (ko) | 옥수수이삭썩음병균 검출용 pcr 프라이머 쌍 및 이를 이용한 옥수수이삭썩음병균 검출 방법 | |
| CN113430296B (zh) | 一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法 | |
| CN110669862B (zh) | 与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |