CN116516059B - 可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业与植物检疫检测技术领域，尤其涉及一种可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒，包括步骤：S1、管盖和管底分别放置RPA体系和CRISPR/Cas12a体系，对待测样品进行RPA扩增；S2、将CRISPR/Cas12a体系转入到反应管中孵育；在crRNA的介导下，切割两端修饰有FAM和BHQ1的报告序列，分别形成FAM‑ssDNA与BHQ1‑ssDNA；S3、进行荧光强度的检测；本发明的方法获得特定的靶位点，无需在扩增后开盖加入CRISPR/Cas12a试剂，能够有效避免气溶胶污染；具有特异性高，检测时间短，简单便携，不依赖大型仪器设备等优点；非常适合现场及临床标本的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及农业与植物检疫检测技术领域，尤其涉及一种可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法及试剂盒。
背景技术
大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthe aspalathi）侵染早期，主要在下部叶片的节点或叶痕处形成小的红褐色病斑，随后病斑向纵向扩展，病部溃烂，轻微下陷，形成长条形病斑，溃疡边缘呈红褐色，中央灰褐色。叶片沿叶脉褪绿、坏死，但植株叶片留存，不脱落。大豆南方茎溃疡病菌随灌溉水流和风雨传播，可侵染全生长期的大豆植株，其远距离传播的主要方式为带菌种子及病残体传播。大豆南方茎溃疡病在美国南部被首次报道，后逐渐蔓延至美国全境，造成严重损失。20世纪80年代，大豆南方茎溃疡在美国南部造成大豆产量损失，能导致田块损失80 %的产量。除美国外，大豆南方茎溃疡病菌也在其他大豆主产国造成了严重的产量损失。1994年，巴西大豆农户因大豆南方茎溃疡病菌损失了250万美元，发病严重地区产量下降可达100 %。同年，大豆南方茎溃疡在全球十大主要大豆生产国每年所造成的损失达到18.6万公吨。目前，某些国家及地区均有报道大豆南方茎溃疡病菌的发生。大豆南方茎溃疡病菌在全球影响范围广泛，影响程度严重。
目前，大豆南方茎溃疡病菌的相关快速检测技术研究尚不完备，缺乏快速、简便、灵敏、特异的检测技术。常规形态性鉴定方法操作繁琐、时间周期长且灵敏度不高，无法应对快速通关中检测需求；分子生物学检测技术的常规PCR及荧光定量PCR检测方法需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统等配套仪器；环介导等温扩增技术(LAMP)，可以根据菌株特有序列设计引物并进行特异序列扩增，从而达到菌株鉴定目的，该方法仅在65℃恒温下完成，无需须额外的仪器设备，但该方法如通过产物的浊度进行判断易发生误判，其余结果判定需要开盖进行检测，易导致气溶胶污染。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供一种基于RPA扩增结合CRISPR/Cas12a体系的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的引物、检测方法以及试剂盒，本发明的方法无需在扩增后开盖加入CRISPR/Cas12a体系，具有易于操作、快速灵敏、鉴定结果准确、有效避免气溶胶污染等特点。
本发明提供一种可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，所述可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法包括步骤：
S1、将RPA体系混匀置入反应管的管底，并加入待测样品基因组，将CRISPR/Cas12a体系混匀置入所述反应管的管盖，将所述管底置于保温装置中，对所述反应管中的待测样品的基因组中的目的片段进行RPA扩增；所述目的片段包括如SEQ ID No.4所示的核酸序列对应的DNA序列；
S2、完成所述RPA扩增后，所述反应管中含有RPA扩增产物，将所述管盖中的所述CRISPR/Cas12a体系转入到所述反应管中，孵育；
在crRNA的介导下，所述CRISPR/Cas12a体系蛋白特异性识别特异的扩增片段，激活核酸酶活性，切割两端修饰有FAM和BHQ1的报告序列，分别形成FAM-ssDNA与BHQ1-ssDNA；
S3、对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测；
当所述反应体系溶液发出荧光，所述待测样品含有大豆南方茎溃疡病菌；
当所述反应体系溶液未发出荧光，所述待测样品不含有大豆南方茎溃疡病菌。
优选的，所述RPA扩增使用的引物序列包括RPA-F和RPA-R；
所述RPA-F包括如SEQ ID No.1所示的核酸序列对应的DNA序列；
所述RPA-R包括如SEQ ID No.2所示的核酸序列对应的DNA序列。
优选的，所述RPA扩增的温度为37℃，所述RPA扩增的时间为20 min。
优选的，所述CRISPR/Cas12a体系包括针对所述目的片段的特异性crRNA、Cas12a蛋白和ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针用于进行荧光强度的检测。
优选的，所述CRISPR/Cas12a体系中，所述Cas12a蛋白的浓度为166 pM，所述Cas12a蛋白与所述crRNA的浓度比为1:1。
优选的，所述crRNA包括如SEQ ID No.3所示的核酸序列对应的RNA序列。
优选的，所述报告序列为ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
优选的，所述S2中，反应体系溶液的反应温度为36℃～40℃，反应体系溶液的反应时间为25 min～40min。
优选的，所述S2中，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育温度为37℃，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育时间为30 min。
优选的，对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测包括：
S31、使用RPA扩增38℃反应15min，检测FAM荧光；或者
S32、将所述反应管置于蓝光透射仪的照射下，确认是否展现出荧光。
另一方面，本发明还提供一种检测大豆南方茎溃疡病菌的试剂盒，所述试剂盒包括一对用于扩增大豆南方茎溃疡病菌的特异性RPA引物对，用于RPA扩增的第一缓冲液和第二缓冲液，用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA和ssDNA荧光探针，以及用于CRISPR/Cas12a反应的第三缓冲液和Cas12a蛋白。
与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：
本发明提供一种基于RPA结合CRISPR/Cas12a可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的引物、检测方法以及试剂盒，本发明的检测方法及试剂盒创造性的选择特定的靶位点，且无需在扩增后开盖加入CRISPR/Cas12a试剂，因此能够有效避免气溶胶污染；具有特异性高，检测时间短，简单便携，不依赖大型仪器设备等优点；非常适合现场及临床标本的快速检测。
附图说明
图1是根据本发明具体实施方式中可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法的流程示意图；
图2是根据本发明具体实施方式中三种不同光照下RPA结合CRISPR/Cas 12a的特异性检测可视化结果示意图；
图3是根据本发明具体实施方式中RPA结合CRISPR/Cas 12a的特异性检测扩增荧光曲线图；
图4是根据本发明具体实施方式中三种不同光照下RPA结合CRISPR/Cas 12a的灵敏度检测可视化结果示意图；
图5是根据本发明具体实施方式中RPA结合CRISPR/Cas 12a的灵敏度检测扩增荧光曲线图；
图6是根据本发明具体实施方式中不同发病程度的大豆叶片示意图；
图7是根据本发明具体实施方式中对照组LAMP方法检测不同发病程度的大豆叶片的示意图；
图8是根据本发明具体实施方式中RPA结合CRISPR/Cas 12a的方法检测不同发病程度的大豆叶片的示意图；
图9是根据本发明具体实施方式中对照组qPCR方法检测不同发病程度的大豆叶片的示意图；
图10是根据本发明具体实施方式中大豆叶片不同发病部位的示意图；
图11是根据本发明具体实施方式中对照组LAMP方法检测不同发病部位的大豆叶片的示意图；
图12是根据本发明具体实施方式中RPA结合CRISPR/Cas 12a的方法检测不同发病部位的大豆叶片的示意图；
图13是根据本发明具体实施方式中对照组qPCR方法检测不同发病部位的大豆叶片的示意图。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
如图1所示，本发明具体实施方式中提供一种可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，所述可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法包括步骤：
S1、将RPA体系混合均匀后置入反应管的管底，将CRISPR/Cas12a体系混合均匀后置入所述反应管的管盖，将所述管底置于保温装置中，对所述反应管中的待测样品的基因组中的目的（特异）片段进行RPA扩增；具体的实施方式中，本发明独创性的发现了大豆南方茎溃疡病菌特异检测靶标序列包括如SEQ ID No.4所示的核酸序列对应的DNA序列；所述RPA扩增使用的引物序列包括RPA-F和RPA-R；所述RPA扩增的温度为37℃，所述RPA扩增的时间为30 min。
具体的实施方式中，所述RPA-F包括如SEQ ID No.1所示的核酸序列对应的DNA序列5’-CTTT GTCTGAGGCTGAACCCCAGGCGTATT-3’；所述RPA-R包括如SEQ ID No.2所示的核酸序列对应的DNA序列5’-CGCATCAACAACCAAGATCACGGGCAAGAC-3’。
S2、完成所述RPA扩增后，所述反应管中含有RPA扩增产物，将所述管盖中的所述CRISPR/Cas12a体系转入到所述反应管中，孵育；具体的，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育温度为37℃，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育时间为30 min；
在crRNA的介导下，所述CRISPR/Cas12a体系蛋白特异性识别特异的扩增片段，激活核酸酶活性，切割两端修饰有FAM和BHQ1的报告序列，即切割两端修饰有FAM和BHQ1的reporter序列，分别形成FAM-ssDNA与BHQ1-ssDNA；所述reporter序列为用于荧光定量PCR仪检测的ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；所述crRNA包括如SEQ ID No.3所示的核酸序列对应的RNA序列，5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCGGAUGCGUACAACAUGACA-3’。
具体的实施方式中，所述CRISPR/Cas12a体系包括针对所述目的片段的特异性crRNA、Cas12a蛋白和ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针用于进行荧光强度的检测；所述CRISPR/Cas12a体系中，所述Cas12a蛋白的浓度为166 pM，所述蛋白与crRNA的浓度比为1:1；该步骤中，整个反应体系溶液的反应温度为36℃～40℃，反应体系溶液的反应时间为25min～40min；优选的，CRISPR/Cas12a 反应约需2 min～10 min。
S3、对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测；
当所述反应体系溶液发出荧光，所述待测样品含有大豆南方茎溃疡病菌；当所述反应体系溶液未发出荧光，所述待测样品不含有大豆南方茎溃疡病菌。
具体的实施方式中，对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测包括：S31、使用RPA扩增38℃反应15min，检测FAM荧光；或者S32、将所述反应管置于蓝光透射仪的照射下，确认是否展现出荧光。
本发明提供的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的引物及检测方法，本发明的检测方法创造性的选择特定的靶位点，无需在扩增后开盖加入CRISPR/Cas12a试剂，因此能够有效避免气溶胶污染；具有特异性高，检测时间短，简单便携，不依赖大型仪器设备等优点；非常适合现场及临床标本的快速检测。
具体实施方式中，本发明还提供一种基于RPA结合CRISPR/Cas12a可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的试剂盒，所述试剂盒包含一对用于扩增大豆南方茎溃疡病菌的特异性RPA引物对，用于RPA扩增的BufferA（第一缓冲液）和BufferB（第二缓冲液），用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA和ssDNA荧光探针（即荧光报告探针），以及用于CRISPR/Cas12a反应的第三缓冲液和Cas12a蛋白。
本发明具体实施方式中，针对大豆南方茎溃疡病菌基因组中的特异片段，设计了RPA扩增引物对及crRNA引导序列；通过对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA序列介导下，引导CRISPR/Cas12a体系对RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA激活非特异性核酸酶功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到裂解产物，最后通过裂解产物的显色检测进行判断；具体的，所述ssDNA荧光探针为5’端FAM标记、3’端BHQ1标记的单链核苷酸序列，5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；FAM和BHQ1修饰的ssDNA荧光探针可使用定量PCR仪37℃反应30min，每隔30秒采集一次FAM荧光或用于在蓝光的激发下肉眼检出目标体系中是否存在大豆南方茎溃疡病菌。
具体的实施方式中，使用本发明所提供的试剂盒检测的大豆南方茎溃疡病菌时，RPA反应体系10μL：其中包括RPA上游扩增引物2μL（10μM），RPA下游扩增引物2μL（10μM），29.4μL BufferA，2.5μL BufferB，待检测样本其余用水补足45μL，并分装为10μL体系，加入基因组DNA1μL；RPA扩增程序：恒温37℃反应30min；优选的方案中，RPA反应约需20 min。
具体的实施方式中，使用本发明所提供的试剂盒检测大豆南方茎溃疡病菌时，荧光检测体系15uL：包含10μLRPA扩增靶基因产物，166 nM crRNA，166 nM Cas12a，5M荧光报告探针，1×Buffer，CRISPR程序为：使用恒温仪RPA扩增37℃反应30min，每隔30秒采集一次FAM荧光，或在37℃水浴锅反应30min，在蓝光的激发下，肉眼观察结果。
本发明所提供的技术方案，基于RPA结合CRISPR/Cas12a系统，建立了一种可以应用于快速检测大豆南方茎溃疡病菌的可视化检测方法；具体地，本发明选取大豆南方茎溃疡病菌特异片段，获得特定的靶位点，依据crRNA结合位点附近需带有PAM序列的特性，在保守区内设计并筛选CRISPR/Cas12a系统的探针crRNA，并根据该crRNA的结合位点设计并筛选特异性RPA引物，以实现RPA特异性靶基因扩增，以及CRISPR/Cas12a系统对报告基因的切割，建立可用于检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，并对RPA体系和CRISPR/Cas12a反应体系进行优化，并对该方法的特异性，灵敏度进行评价，结果表明：该检测方法大豆南方茎溃疡病菌特异性良好，对其它卵菌、疫霉菌及真菌均无交叉反应，灵敏度为0.1 ng/μL，最快可在20分钟到30分钟时间内获得检测结果。
本发明通过RPA结合Cas12a检测灵敏度，并利用CRISPR/Cas12a的反式切割活性，针对特异片段，对大豆南方茎溃疡病菌进行灵敏、特异、无需昂贵设备和可视化闭管的检测。该方法将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使增强的Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现地使用；同时，可以根据现有条件选取荧光法，比如通过蓝光激发肉眼观察。
综上所述，基于RPA-CRIPSR/RPA荧光检测大豆南方茎溃疡病菌的方法相比于分离培养具有更好的灵敏度，且检测时间极大缩短，20min～30min内可以完成检测。本发明提供的方法简便、耗时少、灵敏度高和特异性强等特点，全程在37℃环境下进行，对设备要求较低，易于在海关口岸现场检测广泛开展，具有优异的应用前景。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用于限制本发明的范围。
实施例1
RPA结合CRISPR/Cas12a反应体系及反应条件的建立
对RPA扩增时间优化、扩增温度及Cas12a蛋白和crRNA浓度等体系进行优化；以大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA为模板，以ddH2O代替DNA作为阴性对照，进行不同扩增时间、不同扩增温度反应条件进行扩增，以及Cas12a蛋白和crRNA不同浓度的反应体系进行反应，结果表明，最适反应温度为37 ℃，RPA最适扩增时间为20 min；Cas 12a蛋白和crRNA比例为1:1，最终以166 pM为Cas 12a蛋白和crRNA使用浓度。建立并优化了大豆南方茎溃疡病菌RPA结合CRISPR/Cas12a检测的反应体系及反应条件。
实施例2
本发明方法检测大豆南方茎溃疡病菌的特异性
为验证优化后的RPA-CRISPR/Cas 12a检测体系的特异性，利用本发明设计的引物D RPA 1F/1R和crRNA D RPA，对大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA和其他17株大豆病原菌的DNA进行扩增，以大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA为阳性对照，以ddH2O代替DNA作为阴性对照，用已经优化后的检测体系进行扩增，检测体系的特异性。结果如图2和图3所示，P：Positive；N：Negative；1-15号管依次代表：D. caulivora；F. virguliforme；P. sojae；C. destructivum；C. gloeosporioides MD；C. gloeosporioides LZ；F. graminearum；F. equiseti Feq 1；F. equiseti JF；F. solani DF1；F. solani Fs 01；F. proliferatum J-8；F. proliferatum Fp-1；F. oxysporum 9098；F. oxysporum 9393；由图3所示的荧光曲线可以看出，仅有加入大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA的体系有扩增，加入其它大豆病原菌DNA的体系和阴性对照均无非特异性扩增。以肉眼观察荧光及颜色反应，结果与荧光曲线展示结果一致；仅有加入大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA的阳性对照P有荧光发出，在白光下呈现淡绿色，而加入其他大豆病原菌DNA的1-16号管和加入ddH2O的阴性对照N均无荧光发出，且在白光下呈现淡红色。由以上结果可以判断，本发明所建立的RPA-CRISPR/Cas 12a检测体系具有良好的特异性。
实施例3
本发明方法检测大豆南方茎溃疡病菌的灵敏度
将已知浓度的大豆南方茎溃疡病菌DNA进行10倍梯度稀释，使DNA浓度分别达到100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL，7个浓度梯度；以大豆南方茎溃疡病菌稀释DNA为模板，以100 ng/μL浓度的大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA为阳性对照，以ddH2O代替DNA作为阴性对照，以其他浓度的基因组DNA进行灵敏度检测。
结果如图4和图5所示，1-7号管依次为（ng/μL）：100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001；N：Negative；1-4号管在蓝光和紫外光下有荧光，在白光下呈淡绿色，在qPCR上收集到荧光信号，有荧光曲线扩增；5-7号管及阴性对照均无荧光，在白光下呈现淡红色，无荧光曲线扩增；由以上结果可以得出，本发明所建立的RPA-CRISPR/Cas 12a检测体系的灵敏度为0.1 ng/μL，能在30 min内完成对DNA的检测。
实施例4
本发明方法用于大豆叶不同发病程度的检测
如图6所示，用从不同发病程度的大豆叶片中提取出来的DNA为模板，以大豆南方茎溃疡病菌纯培养DNA为阳性对照，ddH2O代替DNA为阴性对照进行检测，用已建立的对照组LAMP方法、本发明的RPA-CRISPR/Cas 12a体系可视化检测方法，以及对照组qPCR方法分别进行检测。
结果如图7-图9所示，1~5号依次为叶片发病程度：25 %、15 %、5 %、1 %、0 %；P：Positive；N：Negative ；其中，LAMP方法检测：1-4号管呈现绿色，5号管呈现橙色，阳性对照P呈现绿色或绿色荧光，阴性对照N呈现橙色或无荧光，检测体系工作正常，无污染发生；RPA-CRISPR/Cas 12a方法检测：1~4号管在蓝光下呈现绿色荧光，5号管未发出荧光，阳性对照P发出绿色荧光，阴性对照无荧光发出，检测结果具有很好的特异性和灵敏性，无污染发生。
以上三种检测方法检测结果相同，说明本发明的RPA-CRISPR/Cas 12a体系可视化检测方法能从发病程度的大豆叶片中检出大豆南方茎溃疡病菌，健康叶片中未检测到该菌；同时，也说明本发明的RPA-CRISPR/Cas 12a体系可视化检测方法不受大豆组织DNA影响，能准确检测出目的菌的携带情况。
实施例5
本发明方法用于大豆叶不同发病部位的检测
如图10所示，采用大豆叶片不同发病部位组织所提取的DNA作为模板，图中1~3依次代表：发病部，病健交界处，未发病部；以大豆南方茎溃疡病菌纯培养所提取DNA为阳性对照，ddH2O代替DNA的体系作为阴性对照，用已建立的对照组LAMP方法、本发明的RPA-CRISPR/Cas 12a体系可视化检测方法，以及对照组qPCR方法分别进行检测。
实验结果如图11-图13所示，P：Positive；N：Negative；1~3号管依次为大豆叶片不同发病部位：发病部，病健交界处，未发病部；具体的，LAMP检测结果：1、2号管呈现绿色，3号管呈现出橙色，阳性对照P呈现绿色，阴性对照呈现橙色；RPA-CRISPR/Cas 12a检测结果：1、2号管在蓝光下发出绿色荧光，3号管在蓝光下无荧光发出，阳性对照P发出绿色荧光，阴性对照无荧光发出；从以上结果可以得出本发明所建立的检测检测体系特异、灵敏，无污染发生，并具有相同的检测结果。
以上三种检测方法均能检测到叶片发病部和病健交界处所含有的大豆南方茎溃疡病菌，而未有病斑扩展到的未发病部，则未检测到大豆南方茎溃疡病菌；充分说明本发明的RPA-CRISPR/Cas 12a体系可视化检测方法能够快速高效的检测大豆南方茎溃疡病菌。
本发明提供的基于RPA结合CRISPR/Cas12a可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的引物、检测方法以及试剂盒，通过创造性的选择特定的靶位点，且无需在扩增后开盖加入CRISPR/Cas12a试剂，因此能够有效避免气溶胶污染；具有特异性高，检测时间短，简单便携，不依赖大型仪器设备等优点；非常适合现场及临床标本的快速检测。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (7)
1.一种可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，所述可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法包括步骤：
S1、将RPA体系混匀置入反应管的管底，并加入待测样品基因组，将CRISPR/Cas12a体系混匀置入所述反应管的管盖，将所述管底置于保温装置中，对所述反应管中的待测样品的基因组中的目的片段进行RPA扩增；所述目的片段包括如SEQ ID No.4所示的核酸序列对应的DNA序列；
其中RPA扩增使用的引物序列包括RPA-F和RPA-R；
所述RPA-F为SEQ ID No.1所示的核酸序列对应的DNA序列；
所述RPA-R为SEQ ID No.2所示的核酸序列对应的DNA序列；
S2、完成所述RPA扩增后，所述反应管中含有RPA扩增产物，将所述管盖中的所述CRISPR/Cas12a体系转入到所述反应管中，孵育；
在crRNA的介导下，所述CRISPR/Cas12a体系蛋白特异性识别特异的扩增片段，激活核酸酶活性，切割两端修饰有FAM和BHQ1的报告序列，分别形成FAM-ssDNA与BHQ1-ssDNA；
所述CRISPR/Cas12a体系中，其中Cas12a蛋白的浓度为166 pM，所述Cas12a蛋白与所述crRNA的浓度比为1:1；
所述crRNA为SEQ ID No.3所示的核酸序列对应的RNA序列；
S3、对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测；
当所述反应体系溶液发出荧光，所述待测样品含有大豆南方茎溃疡病菌；当所述反应体系溶液未发出荧光，所述待测样品不含有大豆南方茎溃疡病菌。
2.如权利要求1所述的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，所述RPA扩增的温度为37℃，所述RPA扩增的时间为20 min。
3.如权利要求1所述的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系包括针对所述目的片段的特异性crRNA、Cas12a蛋白和ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针用于进行荧光强度的检测。
4.如权利要求1所述的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，所述报告序列为ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
5.如权利要求1所述的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育温度为37℃，所述CRISPR/Cas12a体系的孵育时间为30 min。
6.如权利要求1所述的可视化检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于，对S2中的反应体系溶液进行荧光强度的可视化检测包括：
S31、使用RPA扩增，检测FAM荧光；
S32、将所述反应管置于蓝光透射仪的照射下，确认是否展现出荧光。
7.一种检测大豆南方茎溃疡病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一对用于扩增大豆南方茎溃疡病菌的特异性RPA引物对，用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA和ssDNA荧光探针，以及用于CRISPR/Cas12a反应的Cas12a蛋白；
其中RPA扩增使用的引物序列包括RPA-F和RPA-R；
所述RPA-F为SEQ ID No.1所示的核酸序列对应的DNA序列；
所述RPA-R为SEQ ID No.2所示的核酸序列对应的DNA序列；
所述crRNA为SEQ ID No.3所示的核酸序列对应的RNA序列。
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