CN112410468A - 一种用于检测草莓斑驳病毒的专用引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测草莓斑驳病毒的专用引物、试剂盒及检测方法，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5；所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。本发明利用草莓斑驳病毒专用引物与探针，通过筛选草莓斑驳病毒SMoV特异保守引物，基于RT‑nfo RNA恒温快速扩增方法，优化恒温扩增条件，在探索病毒核酸RNA现场快提的基础上，实现草莓斑驳病毒SMoV简单、快速、高灵敏检测。并将检测所需试剂和器材组装成易于携带和可供现场使用的试剂盒。适用于草莓种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓斑驳病毒SMoV快速检测和生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测草莓斑驳病毒的专用引物、试剂盒及检测方法，属于草莓斑驳病毒检测技术领域。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa)为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)宿根性多年生草本植物。草莓病毒病在世界各地分布广泛，削弱植株生长势，降低产量和品质，危害草莓生产。目前已报道的可浸染草莓的病毒有20多种，其中草莓斑驳病毒(Strawberrymottle virus，SMoV)是危害草莓较为严重的一种潜隐性病毒，也是危害草莓生产的4 种主要病毒之一。
由于草莓种苗通过匍匐茎营养繁殖而来，一旦母株带毒，繁殖的后代均带毒。植物病毒病害一旦发生难以控制，造成植株的长势减弱，从而增加了其他病害的浸染几率，若从根本上解决病毒病的危害，需提前对草莓组培苗和种苗圃草莓进行病毒病的检测筛选，后及时清除携带病毒种苗，从而可保证在生产中使用无毒种苗栽培。随着分子生物技术的发展，草莓斑驳病毒(SMoV)分离、PCR检测、实时荧光定量PCR检测、特异性片段克隆、序列分析等方面有一些的研究进展。
重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在 23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强，灵敏度高，非常适用于现场检测和疾病控制。RPA技术在核酸特异性扩增和检测领域已经显示出强大的威力，具有取代PCR扩增和检测的趋势，但该技术在草莓领域的应用研究较少。
逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增(Reverse transcription-Recombinasepolymerase amplification，简称RT-RPA)技术，该检测技术的第一步是将病毒RNA片段逆转录为 cDNA以便于后续核酸扩增；接下来用RPA恒温扩增的方式，搭配合适探针，进而实现对cDNA的指数扩增以及对扩增后的核酸产物的检测。检测结果既可以通过观察荧光，琼脂糖凝胶电泳，也可以用更为简便的试纸条方式呈现出来。
但是，目前对于草莓斑驳病毒的检测，并没有上述相关技术有效的应用。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种用于检测草莓斑驳病毒的专用引物，其特异性强，灵敏度高。
本发明第二个目的是提供一种包括上述引物的试剂盒，并且其中还包括探针。
本发明第三个目的是提供一种利用上述引物或试剂盒快速检测草莓斑驳病毒的方法，其操作简单、耗时短、灵敏度高。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测草莓斑驳病毒的专用引物，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5；
所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
优选正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2。
优选，所述反向引物序列的5′端用Biotin标记。
一种检测草莓斑驳病毒的试剂盒，包括所述的专用引物。
优选，上述试剂盒还包括具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针。
进一步的，所述探针序列的5′端用FAM标记，3′端用C3space标记，从5′端开始计算，第31个碱基‘T’用-THF-替代。
所述的专用引物、所述的试剂盒在检测草莓斑驳病毒中的应用。
一种快速检测草莓斑驳病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测草莓样品的总RNA核酸；
(2)以步骤(1)的总RNA为模板，利用权利要求1所述的专用引物进行逆转录- 重组酶聚合酶恒温扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法或者试纸条夹心检测技术对恒温扩增产物进行检测，确定待测草莓样本是否含有草莓斑驳病毒。
优选，步骤(1)中采用改良柏雷丁生物免提取核酸RNA释放剂试剂盒法提取待测草莓样品的基因组核酸RNA。
步骤(2)是在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA 为模板进行快速核酸扩增反应。依赖nfo酶的作用，加入根据模板设计的特异分子探针，使用胶体金(三明治夹心法)可以对最终结果进行检测。
优选，步骤(2)中所述逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增的反应体系，以总体积为50μL计，包括：10μM的正向引物1.5-2.5μL、5μM的反向引物1.5-2.5μL和10μM具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针0.4-0.8μL。进一步的，还包括恒温扩增反应再水合缓冲液A液28-32μL、恒温扩增反应启动缓冲液B液2-3μL、模板0.5-1.5μL，水 11-13μL。
所述恒温扩增反应再水合缓冲液A液和恒温扩增反应启动缓冲液B液可以选自君诺德生物逆转录-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。
优选，步骤(2)中所述逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增的温度为37-42℃，更优选40℃，反应时间为10-20min，更优选15min。
步骤(3)中的具体方法如下：
琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法:对扩增产物用水进行10倍稀释后，取5μL优选正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，成像后能形成220bp的条带；
试纸条夹心检测技术采用Genline Hybridetect-1试纸条显色法：对扩增产物用水进行10倍稀释后，将5μL稀释样本转移至Hybridetect-1试纸条的样本垫上，将点样后的试纸条竖立于加有100μL电泳缓冲液的1.5mL的离心管中，2-5分钟后出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。这通常是一种便捷的试纸条显色做法。
所述试剂盒可以用于草莓斑驳病毒现场快检，优选的，可以包含有如下的组分：
(1)样本采集管；
(2)核酸释放剂溶液A和核酸释放剂溶液B，来自柏雷丁生物免提取核酸释放剂(DNA/RNA)试剂盒；
(3)电泳缓冲液；
(4)阳性对照模板，草莓斑驳病毒(SMoV)阳性感染样本的核酸；
(5)阴性对照模板，不含草莓斑驳病毒(SMoV)感染样本的核酸或者蒸馏水；
(6)清洗管：内装无水乙醇；
(7)漂洗管：内装蒸馏水；
(8)样本核酸提取处理和恒温扩增仪器设备：金属浴；
(9)反应酶微球管：逆转录-nfo恒温扩增用酶，干粉状态；
(10)检测管：PCR管，内装恒温扩增反应液。扩增反应液组成成分：正向引物，反向引物，探针；
(11)A液：恒温扩增反应再水合缓冲液；
(12)B液：恒温扩增反应启动缓冲液；
(13)一次性可视化封闭式核酸检测横向流动试纸条；
(14)纸质包装盒；
(15)使用说明书。
将上述试剂盒用于草莓脱种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓斑驳病毒(SMoV)快速检测和生产应用等过程中草莓斑驳病毒(SMoV)检测，具体的检测操作步骤如下：
(1)取待检测样本置于样品采集管中，加入核酸释放剂溶液A和核酸释放剂溶液 B提取RNA模板，稀释后直接当模板进行检测；
(2)在检测管中依次加入稀释后的RNA模板和A液，然后将检测管中的反应液完全加入到反应酶微球管中，混合均匀；
(3)在上一步的反应酶微球管中加入B液，混合均匀，置于水浴中进行逆转录- 恒温扩增；
(4)将恒温扩增产物用水稀释，吸取点样在封闭式核酸检测横向流动试纸条的样本垫上，将试纸条末端的样本垫放入电泳缓冲液中，2-5分钟后读取结果。
(5)结果读取：出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。
具体的，在试纸条检测线和质控线位置均出现有色检测线，表明该样品的草莓斑驳病毒(SMoV)检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现有色检测线，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无有色检测线出现，表明试纸条失效，检测失败。
在上述试剂盒检测步骤中，RNA模板稀释后，将阳性对照和阴性对照分别置于另外的草莓斑驳病毒(SMoV)检测管内，参照采样一同处理，直至检测完成。
本发明通过筛选草莓斑驳病毒(SMoV)特异专用引物，优化适用于草莓斑驳病毒检测的稳定性RNA核酸提取方法，通过恒温扩增各个技术环节条件优化，结合横向流动试纸条可视化分析结果，建立草莓斑驳病毒(SMoV)的现场、高灵敏度、高效率检测方法及试剂盒。该研究为在理论和方法上进一步为草莓斑驳病毒(SMoV)现场可视化检测提供了一条高效途径。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明在分析了草莓斑驳病毒(SMoV)基因组序列保守区、已经发表的SMoV 检测引物和大量草莓斑驳病毒(SMoV)携带样本的序列保守区分析基础上，经过反复尝试和条件优化，在多条候选引物中，最终确定了多对扩增引物，尤其是扩增引物对 SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，既保证了检测的特异性，又保证了稳定性。
(2)本发明采用等温扩增方法，不需要核酸变性步骤，通过条件优化，在等温条件下实现病毒特异性核酸片段的大量扩增，灵敏度高，适用于田间现场诊断，检测效果好
(3)本发明系统性优化了草莓斑驳病毒(SMoV)逆转录-重组酶恒温扩增的反应时间、反应温度、引物和探针比例等条件，可以实现实试纸条最低核酸检出限浓度为500 fg，琼脂糖凝胶电泳最低核酸检出限浓度为100pg。
(4)本发明在SEQ ID NO:2的5’端进行Biotin标记，SEQ ID NO:9的5′端用 FAM标记，3′端用C3space标记，从5′端开始计算，第31个碱基‘T’用-THF-替代。
(5)利用横向流试纸条对逆转录-重组酶恒温扩增产物进行特异性检测，比普通的核酸染料染色法更准确、方便，能有效分辨检测。
(6)本发明所提供的检测方法和试剂盒，检测草莓斑驳病毒(SMoV)时，从取样到获得检测结果仅需30分钟，快速、方便，适宜于草莓斑驳病毒(SMoV)的田间现场快速检测。
(7)本发明检测试剂盒配套提供了草莓斑驳病毒(SMoV)检测所需的所有试剂且有序排列，使草莓斑驳病毒(SMoV)的检测能方便、快速地有序进行，能在田间现场使用且检测结果可靠。
综上，本发明提供的草莓斑驳病毒(SMoV)的检测方法和试剂盒操作简单、耗时短、灵敏度高，适用于草莓种苗繁育、脱毒培养、田间调查时的草莓斑驳病毒(SMoV) 快速检测和监控，具有很高的实用价值和应用前景。
附图说明
图1草莓斑驳病毒特异性稳定高效PCR引物筛选。
图2上海地区草莓斑驳病毒携带样本病毒检测分析(1-5：携带斑驳病毒样品；6：阴性对照样品)。
图3上海地区草莓斑驳病毒携带样本病症调查分析(叶面不规则坏死成枯斑图(a)；大小叶，皱缩(b)；叶片皱(c)；叶片褪绿，皱缩，大小叶(d)；叶片皱缩褪绿(e)；叶片变小，叶面皱缩(f))。
图4草莓斑驳病毒C114/C115引物逆转录-重组酶恒温扩增反应特异性检测。
图5利用C114/C115引物检测草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应灵敏度。
图6草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应引物和探针浓度筛选。
图7草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应上样量筛选。
图8草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应温度筛选。
图9草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应时间筛选。
图10草莓斑驳病毒携带病样的RT-nfo SMoV-RNA RPA检测实例。
图11无设备草莓斑驳病毒nfo-SMoV RNA-RPA检测操作流程。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1草莓斑驳病毒(SMoV)基因组特异性保守序列分析和高效引物筛选
基于多年对携带草莓斑驳病毒(SMoV)的草莓病样进行检测和收集，测序分析草草莓斑驳病毒(SMoV)最新变异情况。结合NCBI数据库中查找草莓斑驳病毒(SMoV) 基因组已经发表序列，找出相对特异保守的区域。根据恒温扩增引物要求，利用 https://www.genscript.com/tools/pcr-primers-designer/advanced网站，在草莓斑驳病毒(SMoV)基因组特异保守序列上设计逆转录-重组酶恒温扩增引物和探针。
为了筛选草莓斑驳病毒(SMoV)特异性高效恒温扩增引物，依据草莓斑驳病毒(SMoV)基因组序列和目前已经发表的草莓斑驳病毒(SMoV)引物，设计了多对引物并进行普通PCR扩增分析。按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通 PCR扩增检测。通过普通PCR扩增结果显示，本发明所设计多对引物均可以从草莓斑驳病毒(SMoV)基因组上扩增出一段特异的序列片段，从多对引物中筛选出M4引物对(C114/C115)扩增条带最亮，效率最高(图1为6对RPA候选引物扩增效率灵敏度检测)。
实施例2携带草莓斑驳病毒(SMoV)的草莓病样调查与检测分析
通过调查，收集上海各区草莓病毒病疑似样品113份。提取113份样品RNA，利用候选C114/C115高效引物，按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通PCR 扩增检测。通过普通PCR检测结果显示：在113份收集样品中，检测出5份样品中携带草莓斑驳病毒，检出率为4.4％(图2上海地区草莓斑驳病毒携带样本病毒检测分析)。进一步重点分析草莓斑驳病毒阳性携带样品，发现其主要发病症状特征主要为：植株表现为生长势弱，叶片表现不一，如斑驳、皱缩、失绿、叶脉褪绿、大小叶等(图3上海地区草莓斑驳病毒携带样本病症调查分析)。以上检测结果，为本发明后期草莓斑驳病毒快速恒温检测奠定了材料基础。
实施例3草莓斑驳病毒(SMoV)基因组特异保守序列恒温扩增特异高效引物筛选
基于普通PCR筛选的结果，进一步通过恒温扩增进行验证，发现M4引物组合在健康草莓植株不同组织器官均没有检测出草莓斑驳病毒(SMoV)(扩增不出条带)，但是可以在携带草莓斑驳病毒(SMoV)的草莓样本中检测出草莓斑驳病毒(SMoV)(扩增出263bp特异条带)(图4草莓斑驳病毒C114/C115引物逆转录-重组酶恒温扩增反应特异性检测)。
实施例1所设计恒温扩增引物进行PCR扩增效率筛选，结果发现恒温扩增正向引物(C114：5'-ATGTTGTAGTTTAGTGACAATCCAAGCGGAAAGAC-3')和反向引物 (C115：5'-TTCACGTGTTATCTTTCACCGTAATGACCAATATG-3')，以草莓斑驳病毒 (SMoV)携带病样或标准品质粒为模板，进行普通PCR扩增和逆转录-重组酶恒温扩增效率最高，克隆获得草莓斑驳病毒(SMoV)263bp长度的核酸特异性保守序列片段，其核酸序列如SEQ ID NO:10所示，电泳条带如图1和图3所示。
按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通PCR，C114和C115引物在普通PCR中的扩增模板最低检出限线是100pg；按照
nfo恒温扩增体系和反应程序进行恒温扩增，C114和C115引物在恒温扩增中模板最低检出限线是500fg(图 5利用C114/C115引物检测草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应灵敏度)。
实施例4草莓斑驳病毒(SMoV)逆转录-重组酶恒温扩增引物于探针筛选
由于扩增产物带有反向引物的Biotin标记和探针的FAM荧光标记，为了获得草莓斑驳病毒(SMoV)RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增检测的最佳反应体系，首先对反应参数引物和探针的浓度进行测试。本发明优化反向引物和探针的浓度，使扩增时引物和探针的效率最大化。利用LF试纸条对6种不同比例、不同浓度的反向引物和探针组合进行测试(如表1)。
| 组合 | 反向引物和探针浓度比例 |
| Group 1 | 10μM&10μM |
| Group 2 | 5μM&10μM |
| Group 3 | 2.5μM&10μM |
| Group 4 | 10μM&5μM |
| Group 5 | 5μM&5μM |
| Group 6 | 2.5μM&5μM |
分析结果发现，6个引物和探针组合进行RT-nfo-SMoV RNA-RPA恒温扩增，C band处均可以产生清晰鲜明的条带，说明试纸条检测恒温扩增产物检测方法有效。在6个组合中T band处产生条带有差异，其中Group1和Group2的T band处的条带最亮，说明RT-nfo-SMoVRNA-RPA反应的扩增产物量非常高；Group4的T band处的条带次亮，说明RT-nfo-SMoV RNA-RPA反应的扩增产物量比较低；Group5和Group6的T band处的条带很淡，不稳定，说明RT-nfo-SMoV RNA-RPA反应的扩增产物量非常少。在考虑反向引物、探针成本和检测效果的因素下，本发明发现，第2组反向引物和探针浓度分别是5μM和10μM时，草莓斑驳病毒(SMoV)RT-nfo-SMoV RNA-RPA恒温扩增效率和引物探针用量组合最佳(图6草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应引物和探针浓度筛选)。
实施例5草莓斑驳病毒(SMoV)逆转录-重组酶恒温扩增上样量筛选
为了获得草莓斑驳病毒(SMoV)RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增反应的最佳反应体系，其次，对草莓斑驳病毒(SMoV)逆转录-重组酶恒温扩增产物的最佳检测上样量(添加在LF试纸条上RPA扩增产物的体积)进行分析。本发明将草莓斑驳病毒(SMoV) RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增产物用水稀释10倍后进行不同梯度的上样量检测分析，设置了4种不同体积的上样量，分别为1、2、5和10μL。1μL的上样量T band处没有条带，说明没有恒温扩增产物积累；2μL的上样量产生的T band条带几乎看不见，不稳定，可能造成假阴性的结果。5μL上样量和10μL上样量产生的T band条带明显，同时C band条带也很清晰(图7草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应上样量筛选)。由此可见，以上4组上样量，1μL上样量和2μL上样量均观察不到条带，5μL上样量和10 μL上样量产生的T band条带明显，所以选择可检测范围内最小量5μL的稀释扩增产物作为后续研究的最佳上样量。
实施例6草莓斑驳病毒(SMoV)RT-nfo-RPA恒温扩增反应温度筛选
为了获得草莓斑驳病毒RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增检测的最佳反应条件，本发明对恒温扩增反应最适合温度进行筛选。RPA恒温扩增通常温度为37-42℃进行(Lobato andO'sullivan,2017)，然而，田间植物病原物的检测环境复杂多变。为了评价 RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增检测反应温度的实用性，本发明分别测试了25-50℃的反应温度对草莓斑驳病毒RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增的影响。在最低(25℃)的反应温度下T band处检测不到条带，在最高(50℃)的反应温度下T band处也未能检测到扩增产物条带。在30℃时，试纸条上有非常模糊、不稳定的条带。随着温度的升高，35℃、 40℃时条带变得越来越清晰，45℃开始又呈现出条比较淡的条带，模糊不稳定，直到 50℃条带消失(图8草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应温度筛选)。这表明 RT-nfo-SMoV-RPA恒温检测方法，针对本发明草莓斑驳病毒特异专用引物，可以在35 到45℃这一温度范围内检测出条带来。此外，在40℃时，RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增产物量最大，试纸条检测效果最好。因此，为了保证RT-nfo-SMoV-RPA恒温检测高效地进行，本发明选择了40℃作为恒温最佳反应温度。
实施例7草莓斑驳病毒(SMoV)逆转录-重组酶恒温扩增反应时间筛选
我们对草莓斑驳病毒(SMoV)RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增时间进行了优化分析。整个RT-nfo-SMoV-RPA恒温快速检测反应时间包括RT-RPA恒温扩增时间和LF试纸条孵育时间。我们的实验表明，2-5min LF试纸条孵育时间足以显示清晰的T band，这与之前的文献报道的一致(Poulton&Webster,2018)。为了确定合适草莓斑驳病毒的 RT-RPA扩增反应时间，在40℃反应温度下，分别进行不同时长的RT-nfo-SMoV-RPA 扩增，随后添加5μL RPA扩增产物10倍稀释液到LF试纸条上，室温下在电泳缓冲液中孵育2-5min后观察显色结果。结果发现，草莓斑驳病毒RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增反应在5min和10min时T band处呈现较为淡的条带，说明反应5min和10 min时扩增产物的积累比较少。随着扩增时间延长至15min时，恒温扩增产物不断积累增加，T band变得更清晰、明亮。恒温扩增反应延长至20min、30min时，T band处条带逐渐变淡，直到反应50min时，T band处条带消失。试验结果表明恒温扩增在 5-30min的时间段内，均可以通过试纸条在T band处检测到条带。但是在恒温扩增反应15min时，RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增产物量最大，检测条带最亮。(图9草莓斑驳病毒RT-nfo-RNA-RPA反应时间筛选)。
一般而言，样品中模板RNA的含量越高，达到用于检测的扩增产物的时间就会缩短，而如果样品中模板的RNA含量比较少，理论上延长反应的时间就可以增加产物的积累量。但是如图7所示，当反应时间延长至30min，50min时，条带变弱，直至消失。造成以上结果的原因有可能是，随着反应时间的延长酶的活力逐步减弱，也可能是反应时间越长，影响探针和试纸条上胶体金标记结合的特异性。
由以上分析发现，草莓斑驳病毒(SMoV)LF-RPA恒温扩增的最佳反应时间为10-20min，为了满足田间快速检测的目标，本发明选择15min作为之最佳反应时间进行后续研究。
实施例8携带草莓斑驳病毒样本的RT-nfo-SMoV-RPA恒温检测示例
为了验证本发明草莓斑驳病毒田间现场快速检测方法的效果，本发明进一步利用草莓斑驳病毒携带样本验证检测方法的灵敏度和可行性。
基于改良柏雷丁生物免提取核酸释放剂提取草莓斑驳病毒携带样本RNA，将RNA模板梯度稀释10、100、1000、10000倍后进行RT-nfo-SMoV-RPA恒温扩增，通过琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法观察恒温扩增结果。结果发现将通过改良柏雷丁生物免提取核酸释放剂提取的核酸RNA梯度稀释10、100、1000和1000倍时，进行RT-nfo SMoV-RNA RPA恒温扩增，恒温扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳在第二个梯度中可以检测到明显的电泳条带，随着模板稀释梯度的增加，电泳条带消失；同时通过试纸条可以在前四个梯度扩增产物的检测区中检测到条带，第五、六个梯度开始条带消失(图10草莓斑驳病毒携带病样的RT-nfo SMoV-RNARPA检测)。
由此可见，改良柏雷丁生物免提取核酸释放剂现场快速提取草莓RNA，进行草莓斑驳病毒RT-nfo SMoV-RNA RPA现场恒温扩增，同时结合试纸条观察恒温扩增效果。试纸条的检测灵敏度和效率均比琼脂糖凝胶电泳高，耗时短，操作方面，适合田间快速观察检测结果(图11无设备草莓斑驳病毒nfo-SMoV RNA-RPA检测操作流程)。
实施例9现场快速检测草莓斑驳病毒(SMoV)的方法示例
一、基于柏雷丁生物免提取核酸释放剂(DNA/RNA)改良的草莓样本RNA核酸现场快提的方法，包括如下步骤：
(1)取0.5mg或者1.5mm大小(约半粒绿豆大小)的新鲜草莓叶片加入到50μL 核酸释放剂溶液A中(注意：样品加入量可能需要根据其核酸的含量稍做调节，如果样品核酸含量少，则用量要增加，但总固体样品用量最好不要超过1mg/10μL的比例)；
(2)65℃放置5-7分钟；
(3)加入60μL核酸释放剂溶液B，震荡5-10秒；
(4)室温放置10分钟，释放完成。
二、以步骤一所得的基因组RNA为模板，用专用引物(C114引物和C115引物组合)进行恒温快速扩增，反应体系包括：A buffer 29.5μL；10μM C114引物和5μM C115 引物分别2.1μL，10μM探针(SEQ ID NO:9所示)P 0.6μL，模板1μL，水12.2μL，最后加B buffer 2.5μL，扩增体系总体积为50μL；反应条件为40℃，15分钟。
其中，A buffer和B buffer分别来自君诺德生物逆转录-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。
三、恒温扩增产物可以采用如下方法中的一种检测：
(1)琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法:对扩增产物用水进行10倍稀释后，取5μL 扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，成像后能形成263bp的条带；
(2)Genline Hybridetect-1试纸条显色法：对扩增产物用水进行10倍稀释后，将5μL稀释样本转移至Hybridetect-1试纸条的样本垫上，将点样后的试纸条竖立于加有 100μL电泳缓冲液的1.5mL的离心管中，2-5分钟后出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。
实施例10本发明试剂盒用于草莓脱种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓斑驳病毒(SMoV)快速检测和生产应用等过程中草莓斑驳病毒(SMoV)检测示例
一、一种草莓斑驳病毒(SMoV)现场快检的试剂盒，包含有如下的组分：
(1)样本采集管：采样用1.5ml离心管；
(2)核酸释放剂溶液A和核酸释放剂溶液B，来自柏雷丁生物免提取核酸释放剂(DNA/RNA)试剂盒；
(3)电泳缓冲液；
(4)阳性对照模板，草莓斑驳病毒(SMoV)阳性感染样本的核酸；
(5)阴性对照模板，不含草莓斑驳病毒(SMoV)感染样本的核酸或者蒸馏水；
(6)清洗管：内装无水乙醇；
(7)漂洗管：内装蒸馏水；
(8)样本核酸提取处理和恒温扩增仪器设备：金属浴；
(9)反应酶微球管：逆转录-nfo恒温扩增用酶，干粉状态(君诺德公司)；
(10)检测管：0.2ml PCR管，内装恒温扩增反应液。扩增反应液组成成分：2.1μLC114引物(10μM)，2.1μL C115引物(5μM)，0.6μL P探针(SEQ ID NO:9)(10μM)；
(11)A液：恒温扩增反应再水合缓冲液，由君诺德公司提供；
(12)B液：恒温扩增反应启动buffer，由君诺德公司提供；
(13)一次性可视化封闭式核酸检测横向流动试纸条(由君诺德公司提供)；
(14)纸质包装盒：将上述材料和物品统一装在一个大小适当的长方形纸盒内，适合上表面覆盖有试剂盒名称的不粘胶贴纸，纸盒内具有若干可以放置1.5mL离心管和0.2mL PCR管的孔洞纸质块1个。
(15)使用说明书
(16)试剂盒储存条件：储存温度≤-20℃，避光保存，避免重压、反复冻融；产品有效期：12个月。
二、现场快速检测方法：
(1)取待检测样本约0.5mg或者1.5mm新鲜叶片置于样品采集管中；
(2)在样品采集管中加入50μL核酸释放剂溶液A，65℃水浴5-7分钟；
(3)加入60μL核酸释放剂溶液B，震荡5-10秒；
(4)室温放置10分钟，RNA模板释放完成。
(5)将上述RNA释放模板用水稀释10倍后直接当模板进行检测；
(6)在检测管中加入稀释后的RNA模板1μL和A液，然后将检测管中的反应液完全加入到反应酶微球管中，混合均匀；
(7)在上一步的反应酶微球管中加入2.5μL B液，混合均匀；
(8)将上一步酶微球管置于40℃水浴15分钟，进行逆转录-恒温扩增；
(9)将恒温扩增产物用水稀释10倍；
(10)将上一步稀释的扩增产物吸取5μL点样在封闭式核酸检测横向流动试纸条的样本垫上。
(11)将试纸条末端的样本垫放入100μL电泳缓冲液中，2-5分钟后读取结果。
(12)结果读取：出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的，
具体的，在试纸条检测线和质控线位置均出现有色检测线，表明该样品的草莓斑驳病毒(SMoV)检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现有色检测线，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无有色检测线出现，表明试纸条失效，检测失败。
在上述试剂盒检测步骤中，从第(5)步开始将阳性对照和阴性对照分别置于另外的草莓斑驳病毒(SMoV)检测管内，参照采样一同处理，直至检测完成。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种用于检测草莓斑驳病毒的专用引物、试剂盒及检测方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 正向引物/C114(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttgtagt ttagtgacaa tccaagcgga aagac 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/c115(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcacgtgtt atctttcacc gtaatgacca atatg 35
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 正向引物/xhvir0051(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttgtagt ttagtgacaa tccaagcgga aag 33
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/xhvir0052(Artificial Sequence)
<400> 4
atactccaac accttagtga ggaatacacc accag 35
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 正向引物/xhvir0053(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccacgact gtgacaaagg gtcttttaat ttac 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 反向引物/xhvir0054(Artificial Sequence)
<400> 6
actgtttaca gtgttccttg gtatcccact tagg 34
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 反向引物/xhvir0055(Artificial Sequence)
<400> 7
actgtttaca gtgttccttg gtatcccact tag 33
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/c117(Artificial Sequence)
<400> 8
taccagcaca gatgaaagaa tattcacgtg ttatc 35
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 探针(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgcctcctg ttagcgagat caggtgacga tccaagccca aagagg 46
<210> 10
<211> 263
<212> DNA
<213> 草莓斑驳病毒特异性克隆片段(Artificial Sequence)
<400> 10
atgttgtagt ttagtgacaa tccaagcgga aagacgctgg gcgccgacag ttctctatgt 60
aggacaccgg ctcttggtag tagggtgtta cagcccttct ttgcccctaa gtgggatacc 120
aaggaacact gtaaacagtg cctcctgtta gcgagatcag gtgacgatcc aagcccaaag 180
aggctggtgg tgtattcctc actaaggtgt tggagtatcg ggaaccccca tattggtcat 240
tacggtgaaa gataacacgt gaa 263
Claims (9)
1.一种用于检测草莓斑驳病毒的专用引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5；
所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
2.根据权利要求1所述的用于检测草莓斑驳病毒的专用引物，其特征在于，所述反向引物序列的5′端用Biotin标记。
3.一种检测草莓斑驳病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物。
4.根据权利要求3所述的检测草莓斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，还包括具有SEQ IDNO:9所示核苷酸序列的探针。
5.根据权利要求4所述的检测草莓斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针序列的5′端用FAM标记，3′端用C3 space标记，从5′端开始计算，第31个碱基‘T’用-THF-替代。
6.权利要求1所述的专用引物、权利要求3所述的试剂盒在检测草莓斑驳病毒中的应用。
7.一种快速检测草莓斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测草莓样品的总RNA核酸；
(2)以步骤(1)的总RNA为模板，利用权利要求1所述的专用引物进行逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法或者试纸条夹心检测技术对恒温扩增产物进行检测，确定待测草莓样本是否含有草莓斑驳病毒。
8.根据权利要求7所述的快速检测草莓斑驳病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增的反应体系，以总体积为50μL计，包括：10μM的正向引物1.5-2.5μL、5μM的反向引物1.5-2.5μL和10μM具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针0.4-0.8μL。
9.根据权利要求7所述的快速检测草莓斑驳病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增的温度为37-42℃，优选40℃，反应时间为10-20min，优选15min。
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