CN111705159B - 一种甘薯黑斑病菌的实时荧光rpa检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘薯黑斑病菌的实时荧光RPA检测引物，所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；本发明还公开了RPA检测引物和探针的组合，所述探针由SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成；还公开了它们在甘薯黑斑病菌检测上的应用。本发明实时荧光RPA检测引物特异性强，尤其使用探针后特异性更好；其次，本发明RPA引物检测灵敏度高，仅需不到10个孢子的DNA即可进行检测；检测速度快，只需20分钟即可完成；此外，本发明检测方法反应温度低、操作简便、检测成本低，适于口岸检疫和田间现场实时检测。

Description

一种甘薯黑斑病菌的实时荧光RPA检测引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘薯黑斑病菌的实时荧光RPA检测引物；还涉及该RPA检测引物的应用。

背景技术

甘薯黑斑病(又称黒疤病，俗名黑膏药、黒疔、黑创等)是由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis&Halsted)引起的一种真菌性病害，可以引起甘薯储藏期烂窖，育秧期烂床和死苗等，每年因该病给我国甘薯生产造成的产量损失为5％～10％，严重时达20％～50％，甚至更高，已成为我国三大甘薯病害之一。此外，受甘薯长喙壳菌侵染的甘薯还会产生对人畜均有毒性的甘薯黑疱霉酮(ipomeamarone)等呋喃萜类物质，在用甘薯生产酒精的过程中，该毒性物质会严重影响发酵过程，导致酒精的产量和质量下降。目前防治甘薯黑斑病的方法主要以培育健康种薯为基础，以培育健康种苗、选种无病地、苗床选用无病土等为保证，以化学药剂防治为辅助的策略进行。但如何保证种薯、种苗健康，选种地块和苗床用土不带病已成为亟待解决的问题，建立对种薯、种苗以及选种地块和苗床用土的甘薯黑斑病菌早期快速检测体系，是解决这一问题的有效方法。

随着分子生物学的发展，利用PCR技术等分子手段对甘薯黑斑病菌进行鉴定已获得广泛应用。如张德胜等(CN103667494A)、王荣波等(CN107868845A)分别利用甘薯黑斑病的cf-cro基因序列或Tsr1基因序列开发的PCR技术对甘薯黑斑病菌进行鉴定。虽然PCR扩增技术具有灵敏度高、特异性强、准确高效等优点，但是该技术对于仪器设备、实验环境以及操作人员的素质要求较高，另外还具有成本高，耗时长，无法实现现场检测等缺点，使其应用受到限制。

LAMP恒温扩增技术可以弥补PCR技术存在的弊端，在恒温下实现对甘薯黑斑病菌的检测(CN110093450A)，该技术具有对仪器设备要求较低、灵敏度高、操作简便、检测速度快等优点；但是，其反应体系需要4～6条引物，存在引物设计复杂，最优引物组合以及最佳反应体系筛选难度大，且易出现假阳性等缺点，使其应用受到一定限制。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种新型的恒温扩增技术，该技术只需一对30bp～35bp的引物，在25～42℃的恒温下扩增反应5～20min，即可完成检测。其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点，可以满足口岸检疫和现场检测等快速检测的要求。目前，RPA技术已广泛应用于植物病原菌的快速检测，如已用于对日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)(CN106048010A)、樱桃灰霉病菌(Botrytis cinerea)(CN108220475A)、甘薯薯瘟病菌(Ralstonia solanacearum)、茄腐镰孢菌(Fusarium solani)(CN109825628A)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)(CN109897910A)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(CN110144421A)等快速检测。

经检索，尚未发现将RPA技术用于甘薯黑斑病菌快速检测的报道。

发明内容

针对现有PCR技术以及LAMP恒温扩增技术难以满足植物病原菌实时和现场检测需要的缺陷，本发明目的在于提供利用RPA方法实现对甘薯黑斑病菌的实时快速检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于检测甘薯黑斑病菌的RPA引物，所述的引物由TUB-F1和TUB-R3组成；其中所述的TUB-F1由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成；所述的TUB-R3由SEQ IDNo：2所示的核苷酸序列组成；所述引物如下：

TUB-F1：5′-CCATCTTGTACGTATACCCCTTGAAAAGAT-3′(SEQ ID No：1)，

TUB-R3：5′-GGGTTAGCAAATGGTCATAGAAAGCATAGT-3′(SEQ ID No：2)。

本发明还提供了上述RPA引物在检测甘薯黑斑病菌上的应用。

本发明还提供了一种用于检测甘薯黑斑病菌的RPA引物和探针组合，所述的RPA引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针为TUB-PS2；所述的TUB-PS2由SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成。

TUB-PS2：5′-CGTATACCCCTTGAAAAGATTAGCCCAT-FAMdT-G-THF-BHQ1dT-GTTTTCTTCGTACAT-C3 Spacer-3′(SEQ ID No：3)；

其中，FAM-dT为携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸；THF为四氢呋喃；BHQ1-dT为携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸；C3-Spacer用于在3′末端引入间臂从而阻止链的延伸。

本发明还提供了上述RPA引物和探针组合在检测甘薯黑斑病菌上的应用。

本发明还提供了一种甘薯黑斑病菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含上述RPA引物和探针组合；所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成。

进一步地，上述检测试剂盒，还包括再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、280mM醋酸镁(Magnesium acetate)、RPA冻干酶粉和ddH₂O。

所述RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物，以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中。

进一步地，所述检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉(50μL体系用量)，再水化缓冲液29.5μL，上游引物TUB-F1(10μM)2.1μL，下游引物TUB-R3(10μM)2.1μL，探针TUB-PS2(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL。

本发明还提供上述检测试剂盒在鉴定甘薯黑斑病菌上的应用。

本发明还提供了利用上述RPA引物或探针组合对甘薯黑斑病菌进行实时荧光RPA检测的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测真菌DNA：利用Fungal gDNA Kit(Biomiga)试剂盒提取，并按照说明书进行操作；

(2)配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，上游引物TUB-F1(10μM)2.1μL，下游引物TUB-R3(10μM)2.1μL，探针TUB-PS2(10μM)0.6μL，待测样品DNA 2μL，ddH₂O 11.2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL；充分混合均匀；

(3)RPA扩增及结果的判读：将步骤(2)的反应管置于恒温荧光核酸扩增仪中，在39℃反应20min，且每20s收集一次荧光信号，采集荧光数据，并在反应第4min时取出反应管并混匀反应液，然后再放回恒温荧光核酸扩增仪继续反应；绘制时间-荧光信号图，构建扩增曲线；如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：(1)特异性强。本发明RPA引物仅在以甘薯黑斑病菌DNA为模板时能得到扩增产物，在其他真菌DNA中不能扩增出产物，因此，其对甘薯黑斑病菌是特异性的，尤其本发明中使用了探针，其检测的特异性更强；而普通PCR和LAMP均没有使用探针，特异性相对差一些。因此，用本发明RPA引物对甘薯黑斑病菌鉴定的结果准确、可靠。(2)灵敏度高。本发明RPA引物灵敏度高，仅需不到10个孢子真菌的DNA量即可进行检测，因而检测灵敏度高。(3)检测速度快。用本发明方法检测甘薯黑斑病菌只需20min，而用PCR和LAMP技术则至少需要50min，甚至更久。(4)反应温度低。用本发明方法检测在37～42℃恒温下即可实现，而PCR和LAMP技术则需要60～94℃，还需要不停地变温，且需要有专业的仪器配合才可以完成检测。(5)操作简便。本发明方法仅需将几个组分混匀，并置于相应设备即可完成实时检测。另外，所使用的RPA冻干酶粉及其它组分均可以在常温下长时间保存，便于携带至现场进行检测，因而可满足现场实时快速检测要求。(6)检测成本低。本发明中所用到的仪器设备价格在3～5万元，而PCR或qPCR所用到的设备则需要几十万甚至更贵。

附图说明

图1.甘薯黑斑病菌RPA引物筛选扩增曲线图；其中1为TUB-F1/TUB-R1，2为TUB-F1/TUB-R2，3为TUB-F1/TUB-R3，4为TUB-F1/TUB-R4，5为TUB-F1/TUB-R5，6为TUB-F2/TUB-R1，7为TUB-F2/TUB-R2，8为TUB-F2/TUB-R3。

图2.本发明引物和探针组合对甘薯黑斑病菌的特异性测试RPA扩增曲线图；其中1为甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)，2～11分别为：甘薯黑痣病菌(Monilochaetesinfuscans)、半裸镰刀菌(Fusarium′semitectum)、茄镰刀菌(Fusarium solani)、甘薯寄生菌未鉴定JXX2，甘薯软腐菌(Rhizopus stolonifer)、甘薯寄生菌未鉴定JXX3、甘薯腐烂溃疡菌(F.solani)、甘薯内寄生菌(Cladosporium anthropophilum)、甘薯蔓割菌(F.oxysporum)、甘薯寄生菌(F.fujikuroi),12为空白对照。

图3.甘薯黑斑病菌基因组DNA的RPA检测灵敏度扩增曲线图；其中1～7分别为甘薯黑斑病菌的基因组DNA原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，8号为空白对照。

图4.甘薯黑斑病菌孢子的RPA检测灵敏度扩增曲线图；其中1～6分别为甘薯黑斑病菌孢子DNA原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6,7号为空白对照。

图5.土壤中甘薯黑斑病菌孢子的RPA检测扩增曲线图；其中1～4分别为在100g土壤中分别加入1ml、2ml、5ml，7ml孢子液(孢子浓度为4.4×10⁶个/ml)的土壤总DNA，5为阳性对照，6为不加孢子液的土壤总DNA(阴性对照)，7为空白对照。

图6.土壤中甘薯黑斑病菌孢子的RPA检测灵敏度扩增曲线图；其中1为加入4.4×10⁶个孢子的土壤总DNA原液，2～7为1号样品进行10倍梯度稀释为原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6,8为空白对照。

图7.甘薯组织中黑斑病菌的RPA鉴定扩增曲线图；其中1～3为发病薯块，4为阳性对照，5～7为健康薯块，8为空白对照。

具体实施方式

实施例1、甘薯黑斑病菌RPA引物设计与筛选

(1)RPA引物设计：以甘薯黑斑病菌的β-tubulin基因的保守序列为基础，根据RPA引物和探针的设计原则设计了5条上游引物和5条下游引物，以及一探针(见表1)，引物和探针由上海生工生物工程有限公司负责合成。

表1.甘薯黑斑病菌候选RPA引物和探针表

其中：FAM-dT为携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF为四氢呋喃，BHQ1-dT为携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3-Spacer为在3′末端引入间臂，用于阻止链的延伸。

(2)真菌基因组DNA的提取：利用Fungal gDNA Kit(Biomiga)试剂盒提取，并按照说明书进行操作。

(3)RPA反应体系：按照

exo试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，上游引物(10μM)2.1μL，下游引物(10μM)2.1μL，探针TUB-PS2(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，最后加入醋酸镁(280mM)2.5μL；充分混合均匀。

(4)RPA反应条件：将步骤(3)已加入各种组分的RPA反应管置于恒温荧光核酸扩增仪(T8-ISO,Axxin)中，在39℃反应20min，每20s收集一次荧光信号，并在反应第4min时取出反应管并混匀反应液后再放回恒温荧光核酸扩增仪以促进反应。通过仪器软件分析不同时间节点收集的荧光信号强度来构建扩增曲线，并根据曲线情况对结果进行判断，如果出现扩增曲线，待测样品为阳性，即待测真菌为甘薯黑斑病菌；如果没有出现扩增曲线，那么就为阴性，即待测真菌不是甘薯黑斑病菌。

结果(见图1)基于交叉配对法原则进行了大量筛选，并综合其特异性、灵敏度和扩增效率等，最终筛选出综合表现最好的一组RPA引物：TUB-F1和TUB-R3，以及探针TUB-PS2。序列信息如下：

TUB-F1：5′-CCATCTTGTACGTATACCCCTTGAAAAGAT-3′(SEQ ID No：1)，

TUB-R3：5′-GGGTTAGCAAATGGTCATAGAAAGCATAGT-3′(SEQ ID No：2)。

TUB-PS2：CGTATACCCCTTGAAAAGATTAGCCCAT-FAMdT-G-THF-BHQ1dT-GTTTTCTTCGTACAT-C3 Spacer-3′(SEQ ID No：3)。

从图1可以看出，该RPA引物和探针组合的扩增曲线上升最早，灵敏度最高。

实施例2、本发明RPA引物对甘薯黑斑病菌的特异性检测试验

按照如下方法进行：

(1)待测真菌：甘薯黑痣病菌(Monilochaetes infuscans)、半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)、茄镰刀菌(Fusarium solani)、甘薯寄生菌未鉴定JXX2，甘薯软腐菌(Rhizopus stolonifer)、甘薯寄生菌未鉴定JXX3、甘薯腐烂溃疡菌(F.solani)、甘薯内寄生菌(Cladosporium anthropophilum)、甘薯蔓割菌(F.oxysporum)、甘薯寄生菌(F.fujikuroi)、甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)共11种，均保存于河北省农林科学院植物保护研究所。

(2)真菌基因组DNA的提取：利用Fungal gDNA Kit(Biomiga)试剂盒提取，并按照说明书进行操作。

(3)RPA反应体系：按照

exo试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，上游引物TUB-F1(10μM)2.1μL，下游引物TUB-R3(10μM)2.1μL，探针TUB-PS2(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，最后加入醋酸镁(280mM)2.5μL；充分混合均匀。

(4)RPA反应条件：参见实施例1步骤(4)。

结果(见图2)只有以甘薯黑斑病菌DNA为底物时有扩增曲线出现，说明获得了扩增产物；而其它真菌如甘薯黑痣病菌、甘薯软腐菌、甘薯腐烂溃疡菌、甘薯蔓割菌等10种真菌和空白对照都没有扩增曲线，说明没有得到扩增产物；上述结果说明本发明引物TUB-F1/TUB-R3和探针TUB-PS2对甘薯黑斑病菌具有很好的特异性。

实施例3、本发明用于检测甘薯黑斑病菌的RPA引物的灵敏度试验

按照如下方法进行：

(1)DNA制备：a)对甘薯黑斑菌基因组DNA的检测灵敏度：以实施例2步骤(2)所述方法提取甘薯黑斑病菌的基因组DNA，以10倍的梯度稀释法进行稀释，分别稀释为原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。b)对甘薯黑斑菌孢子量的检测灵敏度：提取甘薯黑斑菌孢子数为：3.9×10⁶个,将提取的基因组DNA以10倍的梯度进行稀释，分别稀释为原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。

(2)RPA反应体系：参见实施例2步骤(3)，模板相应加入2μL各梯度浓度的基因组DNA。

(3)RPA反应条件：参见实施例1骤(4)。

结果：甘薯黑斑病菌基因组DNA的原始浓度为15.2ng/μL，利用本发明的RPA引物探针组合扩增后，只有在稀释倍数为10^-1、10^-2、10^-3的DNA被检出(见图3)，即基因组DNA最低检出量为30.4pg。而对梯度稀释的黑斑病菌孢子DNA最低可以检测出10^-4稀释倍数的样品(见图4)，因为提取基因组DNA以100ul ddH₂0回溶，即原始浓度为3.9×10⁴个/ul，检测用模板量为2ul，则可得本发明引物和探针组合对甘薯黑斑病菌孢子的检测灵敏度为7.8个孢子的DNA量。说明本发明引物和探针组合对甘薯黑斑病菌的检测灵敏度很高。

实施例4、利用本发明引物组检测田间土壤中甘薯黑斑病菌试验

按照如下方法进行：

(1)土壤总DNA的制备：用大量土壤DNA提取法，提取起始量为100g土，实验设计：在3份100g土壤中分别加入1ml、2ml、5ml，7ml孢子液(孢子浓度为4.4×10⁶个/ml)，混匀，背阴处晾干后提取土壤总DNA，并以不加孢子液的土壤为阴性对照。

(2)灵敏度测试：以加入1mL孢子液的土壤总DNA为原液进行10倍梯度稀释，分别稀释为原浓度的：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6后进行RPA反应。

(3)RPA反应体系和反应条件：反应体系和反应条件分别参照实施例2步骤(3)和实施例1步骤(4)，模板相应加入步骤(1)和(2)中所述土壤DNA，以甘薯黑斑病菌DNA为阳性对照，水为空白对照。

结果：阳性对照和加入1ml、2ml、5ml、7ml孢子液的土壤DNA样品的RPA结果均出现扩增曲线(见图5)，而空白对照水和未加孢子的土壤DNA均未出现扩增曲线，而对土壤中黑斑菌孢子的检测灵敏度测试中(见图6)，原液和稀释10倍的样品出现了扩增曲线，其他浓度均未出现扩增曲线，综上，本发明所述的RPA引物探针组合可以有效的从土壤中检出甘薯黑斑菌，且灵敏度可以达到88个甘薯黑斑菌孢子每克土，可用于对待栽植甘薯土壤中甘薯黑斑病菌的现场实时检测。

实施例5、利用本发明方法对发病薯块甘薯黑斑病的鉴定试验

按照如下方法进行：

(1)甘薯DNA的提取：采集了三块健康薯和三块发病薯，并利用通用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，购自大连宝生物)提取基因组DNA，按照说明书进行操作。

(2)RPA反应体系和反应条件：分别参照实施例2步骤(3)和实施例1步骤(4)所述进行。

结果(见图7)阳性对照和病薯均出现典型的扩增曲线即检测出甘薯黑斑病菌，而健康薯块和空白对照均未出现扩增曲线即没有受病菌侵染。说明本发明RPA引物和探针组合对甘薯黑斑病菌的检测准确、可靠，可以用于对甘薯是否感染甘薯黑斑病菌进行检测鉴定。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制，本领域技术人员依据本发明可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在本发明的权利要求保护范之内。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 一种甘薯黑斑病菌的实时荧光RPA检测引物及其应用

<130> 2020S1803IHCY

<141> 2020-07-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Ceratocystis fimbriata

<400> 1

ccatcttgta cgtatacccc ttgaaaagat 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Ceratocystis fimbriata

<400> 2

gggttagcaa atggtcatag aaagcatagt 30

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is FAM-dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n is THF

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n is BHQ1-dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n is C3-Spacer

<400> 3

cgtatacccc ttgaaaagat tagcccatng nngttttctt cgtacatn 48

Claims (7)

1.一种用于检测甘薯黑斑病菌的RPA引物和探针组合，其特征在于，所述的RPA引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成。

2.权利要求1所述的RPA引物和探针组合在检测甘薯黑斑病菌上的应用。

3.一种甘薯黑斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括再水化缓冲液、280mM醋酸镁、RPA冻干酶粉和ddH2O；所述的RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉，再水化缓冲液 29.5 μL，10 μM上游引物 2.1 μL，10 μM下游引物 2.1 μL，10 μM探针0.6 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 11.2 μL，280mM醋酸镁 2.5 μL。

6.权利要求3-5任一所述的检测试剂盒在鉴定甘薯黑斑病菌上的应用。

7.利用权利要求1所述的RPA引物或探针组合对甘薯黑斑病菌进行实时荧光RPA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测真菌DNA：利用Fungal gDNA Kit 试剂盒提取，并按照说明书进行操作；

（2）配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5 μL，10 μM上游引物 2.1 μL，10 μM下游引物2.1 μL，10 μM探针 0.6 μL，待测样品DNA 2 μL，ddH2O 11.2 μL，280mM醋酸镁2.5 μL；充分混合均匀；

（3）RPA扩增及结果的判读：将步骤（2）的反应管置于恒温荧光核酸扩增仪中，在39℃反应20 min，且每20 s收集一次荧光信号，采集荧光数据，并在反应第4 min时取出反应管并混匀反应液，然后再放回恒温荧光核酸扩增仪继续反应；绘制时间-荧光信号图，构建扩增曲线；如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。

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