CN103667494B - 一种甘薯黑斑病菌的检测方法 - Google Patents

一种甘薯黑斑病菌的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103667494B
CN103667494B CN201310693596.3A CN201310693596A CN103667494B CN 103667494 B CN103667494 B CN 103667494B CN 201310693596 A CN201310693596 A CN 201310693596A CN 103667494 B CN103667494 B CN 103667494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sweet potato
black rot
detection method
potato black
rot pathogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310693596.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103667494A (zh
Inventor
张德胜
张振臣
王爽
秦艳红
乔奇
田雨婷
王永江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201310693596.3A priority Critical patent/CN103667494B/zh
Publication of CN103667494A publication Critical patent/CN103667494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103667494B publication Critical patent/CN103667494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种甘薯黑斑病菌的检测方法，属于生物工程技术领域。具体步骤为：设计合成一对甘薯黑斑病菌特异性引物SPCPF和SPCPR；提取待检测样品的总DNA，以提取的总DNA作为模板，利用引物CSPCPF和SPCPR进行PCR扩增；用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明方法简便、快速、灵敏，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的薯苗和薯块进行检测；本发明的检测方法能实现对甘薯黑斑病的早期检测，还能有效区分甘薯上的相似病害黑痣病、软腐病、干腐病；对甘薯黑斑病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Description

一种甘薯黑斑病菌的检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及病菌检测方法，具体涉及一种甘薯黑斑病菌的检测方法。
背景技术
甘薯黑斑病由甘薯长喙壳菌（CeratocystisfimbriataEllisandHalsted）侵染甘薯引起，是严重危害甘薯生产的三大病害之一，每年由于该病造成的产量损失一般为5%～10%，危害严重时造成的损失高达20%~50%，甚至更高。此外，病薯还可产生甘薯黑斑霉酮(ipomeamarone)和甘薯黑斑霉二酮（ipomeanine）等有毒物质，人和家畜食用后可引起中毒，甚至死亡。甘薯长喙壳菌属子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，长喙壳科，长喙壳属。侵染甘薯主要从伤口侵入，也可从薯块上芽眼、皮孔、根眼侵入。
甘薯黑斑病在甘薯苗期、大田期和贮存期均可发生。常规检测和诊断甘薯黑斑病的方法是根据病害的症状和病菌形态的观察。但这些方法不能用于病害的早期诊断，而且病菌的形态观察需要进行病原菌的分离培养，费时费力，不能用于病害的快速检测。因此，建立一种简便、快速、灵敏的甘薯黑斑病菌的检测方法，对于该病的早期诊断、预警和防治具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快速、灵敏的甘薯黑斑病菌的检测方法。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种甘薯黑斑病菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）设计合成一对甘薯黑斑病菌特异性引物，引物序列是：
SPCPF：5'CATGATTGCCAGCGCCAT3'，
SPCPR：5'GACACGGCCAGCTTC3'；
（2）提取待检测样品的总DNA；
（3）将SPCPF和SPCPR引物置于PCR反应体系中，以步骤（2）总DNA作为PCR模板，进行PCR扩增；
（4）用琼脂糖凝胶电泳检测步骤（3）扩增产物。
步骤（2）的提取方法为CTAB方法或总DNA提取试剂盒方法；
所述的CTAB方法具体步骤为：
①称取待检测的植物组织或病残体0.1g，置入灭菌后的研钵，加入液氮，充分研磨成粉末；
②向步骤①粉末中加入600μLCTAB缓冲液，60-65℃水浴60min；
③向步骤②水浴处理溶液中加等体积的氯仿/异戊醇混合溶液(氯仿与异戊醇的体积比24:1)，温和摇动，接着室温下8000r/min离心10min，吸取上清液，重复步骤（3）一次，合并两次上清液；
④将步骤③上清液转移至另一离心管，加入RNAaseA至终浓度100μg/mL，混匀后，37℃孵育30min；
⑤逐滴向步骤④处理后的上清液加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃条件下放置1-3h，4℃条件下，以2000r/min低速离心10min，收集核酸沉淀；
⑥向步骤⑤沉淀中加1-2mL70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，接着在4℃条件下，以8000r/min离心10min，收集沉淀，晾干；
⑦向步骤⑥晾干沉淀中加50μLTE缓冲液，4℃溶解沉淀，得到总DNA溶液，-20℃保存备用。
所述的总DNA提取试剂盒方法参照试剂盒说明书进行操作。
所述的PCR扩增的反应体系25μL，组成为：2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10μmol/L的SPCPF和SPCPR各0.5μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2μLDNA模板，余量为ddH2O。
所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。
所述的步骤（4）琼脂糖凝胶电泳检测步骤（3）扩增产物的步骤为：取步骤（3）中3-8uLPCR扩增产物，用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出392bp的产物，则可判定存在甘薯黑斑病菌。
本发明的积极有益效果：
1．本发明的甘薯黑斑病菌检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的薯苗和薯块进行检测。
2．本发明的检测方法能实现对甘薯黑斑病的早期检测，即在病害显症前进行检测，可对病害的发生进行早期预警，防治病害的扩散蔓延。
3．本发明的检测方法能有效区分甘薯上的相似病害，例如黑痣病、软腐病、干腐病，可防治对病害的误诊。
附图说明
图1为本发明的甘薯黑斑病菌检测方法的特异性扩增电泳图；
图2为本发明的甘薯黑斑病菌检测方法对不同样品的扩增电泳图；
图3为本发明的甘薯黑斑病菌检测方法对田间病苗的检测结果图。
具体实施方式
下面结合一些具体实施例对本发明进一步描述。
实施例1甘薯黑斑病菌检测方法的特异性扩增实验
1.材料和方法
（1）引物来源：根据GenBank登陆的甘薯长喙壳菌（Ceratocystisfimbriata）基因序列
（GenBank登录号：EF017220.1～EF017226.1）设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增的目的片段大小为392bp。
（2）病菌材料：甘薯黑斑病菌、甘薯软腐病菌、甘薯干腐病菌（2012年5月，采自河南省农业科学院植物保护研究所，采集人张德胜），甘薯黑痣病菌（2011年10月，取自河北省农林科学院植物保护研究所，提供者陈书龙）。
（3）核酸提取：利用宝生物工程（大连）有限公司的总DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作，提取待检测样品的总DNA。
（4）PCR扩增的反应体系25μL，组成为：2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10μmol/L的SPCPF和SPCPR各0.5μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2μLDNA模板，余量为ddH2O；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。
（5）取3-8uLPCR扩增产物，用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出392bp的产物，则可判定存在甘薯黑斑病菌。
2.结果与分析
参见图1，图中各标号为：1：DL2000marker；2-5道依次为：软腐病菌、干腐病菌、黑痣病菌、黑斑病菌的菌丝风干物，6道为清水对照；
由图1可知：软腐病、干腐病、黑痣病的病原菌不能扩增出相应片段，清水对照同样没有目标条带出现，只有甘薯黑斑病的病原菌可被特异性扩增，扩增产物大致在392bp的位置，表明本发明甘薯黑斑病菌的检测方法可以对甘薯黑斑病菌进行特异性扩增。
实施例2甘薯黑斑病菌检测方法对不同样品的扩增实验
1.材料和方法
（1）引物来源：根据GenBank登陆的甘薯长喙壳菌（Ceratocystisfimbriata）基因序列（GenBank登录号：EF017220.1～EF017226.1）设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增的目的片段大小为392bp。
（2）病样材料：甘薯黑斑病菌风干菌丝、各种感染黑斑病的薯苗茎段（2012年5月，采自河南省农业科学院植物保护研究所，采集人张德胜）。
（3）核酸提取：利用宝生物工程（大连）有限公司的总DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作，提取待测样品的总DNA。
（4）PCR扩增的反应体系25μL，组成为：2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10μmol/L的SPCPF和SPCPR各0.5μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2μLDNA模板，余量为ddH2O；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。
（5）取3-8uLPCR扩增产物，用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出392bp的产物，则可判定存在甘薯黑斑病菌。
2.结果与分析
参见图2，图中各标号为：1：DL2000marker；2道为病苗的白色未显证茎段；3道为薯苗的绿色未显症茎段；4道为黑斑病风干菌丝；5道为病苗的白色显症茎段；6道为清水对照；
从图2可以看出，第2、4、5泳道可扩增出目的片段。4道为黑斑病的风干菌丝，扩增的条带最亮；2道为病苗的白色未显证茎段，扩增的条带相对较弱，说明在接近病薯的白色未显症茎段上已被病菌侵染，但病菌含量相对较少；5道为病苗的白色显症茎段，也扩增出较弱的条带；3道为薯苗的绿色未显症茎段，没有扩增出相应的条带，说明薯苗的绿色部位未被病菌侵染。
实施例3甘薯黑斑病菌检测方法对田间病苗的检测结果
1.材料和方法
（1）引物来源：根据GenBank登陆的甘薯长喙壳菌（Ceratocystisfimbriata）基因序列（GenBank登录号：EF017220.1～EF017226.1）设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增的目的片段大小为392bp。
（2）病样材料：薯苗和薯块（2012年5月，采自河南省洛阳市农业科学研究院育苗圃，采集人张德胜），样品表现典型的黑斑病症状。
（3）核酸提取：利用宝生物工程（大连）有限公司的总DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作，提取样品的总DNA。
（4）PCR扩增的反应体系25μL，组成为：2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10μmol/L的SPCPF和SPCPR各0.5μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2μLDNA模板，余量为ddH2O；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。
（5）取3-8uLPCR扩增产物，用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出392bp的产物，则可判定存在甘薯黑斑病菌。
2.结果与分析
参见图3，图中各标号为：1：DL2000marker；2～6：田间采集的病苗样品；7-田间采集的感染甘薯黑斑病菌的薯块；
从图3可以看出，2-7道均有明亮的条带出现，说明河南省洛阳市农业科学研究院育苗圃采集的具有黑斑病症状的薯苗和薯块均可扩增出目的片段，采集薯苗和薯块的育苗圃黑斑病发病非常严重，此育苗圃生产的秧苗如果不做高剪苗等无害化处理，将会造成黑斑病蔓延至其他田块。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>河南省农业科学院植物保护研究所
<120>一种甘薯黑斑病菌的检测方法
<130>/
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<400>1
catgattgccagcgccat18
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工
<400>2
gacacggccagcttc15

Claims (4)

1.一种甘薯黑斑病菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设计合成一对甘薯黑斑病菌特异性引物，引物序列是：
SPCPF：5'CATGATTGCCAGCGCCAT3'，
SPCPR：5'GACACGGCCAGCTTC3'；
（2）提取待测样品的总DNA；
（3）将SPCPF和SPCPR引物置于PCR反应体系中，以步骤（2）总DNA作为PCR模板，进行PCR扩增；
（4）用琼脂糖凝胶电泳检测步骤（3）扩增产物，步骤为：取3-8uLPCR扩增产物，用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出392bp的产物，则可判定存在甘薯黑斑病菌。
2.根据权利要求1所述的甘薯黑斑病菌的检测方法，其特征在于，步骤（2）的提取总DNA方法为CTAB方法或总DNA提取试剂盒方法。
3.根据权利要求1所述的甘薯黑斑病菌的检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系25μL，组成为：2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10μmol/L的SPCPF和SPCPR各0.5μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2μLDNA模板，余量为ddH2O。
4.根据权利要求1所述的甘薯黑斑病菌的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。
CN201310693596.3A 2013-12-18 2013-12-18 一种甘薯黑斑病菌的检测方法 Active CN103667494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310693596.3A CN103667494B (zh) 2013-12-18 2013-12-18 一种甘薯黑斑病菌的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310693596.3A CN103667494B (zh) 2013-12-18 2013-12-18 一种甘薯黑斑病菌的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103667494A CN103667494A (zh) 2014-03-26
CN103667494B true CN103667494B (zh) 2015-12-02

Family

ID=50306263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310693596.3A Active CN103667494B (zh) 2013-12-18 2013-12-18 一种甘薯黑斑病菌的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103667494B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104611450B (zh) * 2015-02-13 2015-10-28 湖南农业大学 一种油菜种子上黑斑病原菌的pcr检测方法
CN105010126B (zh) * 2015-07-06 2017-09-26 山东省农业科学院作物研究所 一种抗黑斑病甘薯品种的快速选育方法
CN110093450A (zh) * 2019-06-12 2019-08-06 福建省农业科学院植物保护研究所 一种甘薯黑斑病菌的lamp检测引物及其应用
CN111705158A (zh) * 2020-07-23 2020-09-25 福建省农业科学院植物保护研究所 一种用于检测甘薯黑斑病菌的lfd-rpa可视化检测引物组及检测方法
CN111705159B (zh) * 2020-07-28 2022-02-22 河北省农林科学院植物保护研究所 一种甘薯黑斑病菌的实时荧光rpa检测引物及其应用
WO2024036158A1 (en) * 2022-08-08 2024-02-15 North Carolina State University Methods and compositions for detecting the fungal pathogen ceratocystis fimbriata

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
New proteins orthologous to cerato-platanin in various Ceratocystis species and the purification and characterization of cerato-populin from Ceratocystis populicola;Cecilia Comparini et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20090422;第84卷;309-322 *
Rapid detection of Ceratocystis platani inoculum by quantitative real-time PCR assay;Nicola Luchi et al.;《Appl.Environ.Microbiol》;20130628;第79卷(第17期);摘要，第5395-5396页Materials and methods，第5400页左栏第3段 *
リアルタイム定量PCR 法によるイチジク株枯病菌の絶対定量および検出;三好 孝典&#12539;清水 et al.;《日植病報》;20111231;第77卷;96-104 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103667494A (zh) 2014-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103667494B (zh) 一种甘薯黑斑病菌的检测方法
CN104372104B (zh) 一种樟疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN102630640A (zh) 一种携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱的获得方法及其应用
CN105063219A (zh) 番石榴炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法
Oliva et al. Heartwood stump colonisation by Heterobasidion parviporum and H. annosum ss in Norway spruce (Picea abies) stands
CN101643788B (zh) 马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法
CN105506175A (zh) 一种prrsv、pcv2、prv和csfv的多重pcr检测试剂盒
CN105296393A (zh) 一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法
CN106381341A (zh) 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用
CN104928397A (zh) 豇豆疫霉菌pcr检测引物及其检测方法
CN105039535A (zh) 一种用于检测梨黑斑病菌的引物及利用其检测梨黑斑病菌的检测方法
CN104293922B (zh) 与大豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记GmSSR18-24及应用
CN105018612A (zh) 一种大蒜病毒的定量检测方法
CN103205504A (zh) 一种检测甘蔗黑穗病菌的实时荧光定量pcr方法
CN102031307B (zh) 一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒
CN104946747A (zh) 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN104450939B (zh) 粉大蕉枯萎病菌的二重pcr分子快速检测方法
CN103882108B (zh) 检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法
CN106399529A (zh) 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法
CN104164501B (zh) 一个大豆抗锈病基因位点及应用
CN102382819B (zh) 一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫dna提取方法及其应用
CN104032003A (zh) 一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法
CN103882125A (zh) 一种检测大白菜黄萎病病原菌的实时荧光定量pcr方法
CN104059968B (zh) 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法
CN104017884B (zh) 一种桉树焦枯病原菌的双重pcr检测试剂盒及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant