CN104059968B - 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法 - Google Patents

一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104059968B
CN104059968B CN201410231881.8A CN201410231881A CN104059968B CN 104059968 B CN104059968 B CN 104059968B CN 201410231881 A CN201410231881 A CN 201410231881A CN 104059968 B CN104059968 B CN 104059968B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
dry rot
detection
rot germ
pomegranate dry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410231881.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104059968A (zh
Inventor
陈雨
杨雪
张爱芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Original Assignee
Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS filed Critical Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority to CN201410231881.8A priority Critical patent/CN104059968B/zh
Publication of CN104059968A publication Critical patent/CN104059968A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104059968B publication Critical patent/CN104059968B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种石榴干腐病菌的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高效、稳定可靠的检测石榴干腐病菌的分子检测方法。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物。可用于田间调查和植物产品的检测，对控制石榴干腐病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原物的检测提供了技术指导和理论支持。

Description

一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测石榴干腐病菌的引物，以及利用所述引物检测石榴干腐病菌的分子检测方法。
背景技术
石榴干腐病菌(Coniellagranati)引起石榴果实干腐病。该病害在希腊，韩国，土耳其等国均有报道，在我国多个省份也有发生，但对其病原物的鉴定存在较大分歧。该病害按常规方法分离会产生很多杂菌，影响病原菌的准确分离，常规的病害诊断技术难以快速准确鉴定该病原菌。随着分子生物学技术的发展，采用分子检测方法为该病害的诊断提供了很好的检测手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种石榴干腐病菌的检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测石榴干腐病菌，速度快，准确，灵敏度高，稳定可靠。
本发明提供的技术方案是:
一种用于检测石榴干腐病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列如S1所述，下游引物序列如S2所述,其中，
S1为：AAGGACACAACCCCAGATAC
S2为：ATAAACTACTACGCTCAGAG。
一种利用上述引物检测石榴干腐病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为450bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
上述的检测石榴干腐病菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为：所述PCR反应的扩增体系为：10×Taqbuffer2.5μL、25mmol/LMgCl22.0μL、2.5mmol/LdNTP2.0μL、10μmol/L正反向引物各1.0μL、5U/LTagase0.2μL、20ng/μLDNA模板2μL,补水至总体积25μL。
所述的检测石榴干腐病菌的方法，所述PCR反应的反应程序为：94℃、4min；94℃、30s,52℃、30s,72℃、30s,35个循环；72℃、10min，4℃保存。
本发明还提供另一种检测石榴干腐病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的引物S1和S2，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳检测，如果存在分子量约为450bp的DNA条带，则证明所检样品中含有石榴干腐病菌。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的Coniellagranati。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制石榴干腐病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。
本发明对从GeneBank中得到Coniellagranati和其他同属的rDNA-ITS序列进行分析，设计了一对特异性引物，利用该引物对其他病原菌进行特异性扩增，发现只能从该属中扩增得到一条450bp的条带，其他菌株均无扩增条带出现，表明该对引物具有属间特异性。以真菌的rDNA-ITS序列设计特异性引物来进行病害的诊断和植物病原真菌的分子检测已得到广泛应用。
高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否快速检测技术直接应用在植物产品的检验检疫中。在25μL的反应体系中，普通的PCR方法能检测到10ng的基因组DNA。曾经报道套式PCR能把检测灵敏度提高10～1000倍，在本发明建立的体系中采用套式PCR技术将检测基因组DNA的灵敏度提高到了1000倍。
附图说明
图1根据GeneBank中所有Coniellagranati和其他同属的rDNA-ITS序列进行分析设计的一对特异性引物；
图2特异性引物的验证，M：2000bpmarker；泳道1：石榴干腐病菌；泳道2-22：其他菌株；泳道23：阴性对照；
图3常规PCR对石榴干腐病菌的灵敏度检测，M：2000bpmarker；泳道1-9：模板浓度分别为100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg；泳道10：阴性对照；
图4套式PCR对石榴干腐病菌的灵敏度检测，M：2000bpmarker；泳道1-9：模板浓度分别为100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg；泳道10：阴性对照；
图5发病植株中石榴干腐病菌的PCR检测，M：2000bpmarker；泳道1：以分离病菌提取DNA为模板的PCR产物；泳道2-5：以发病植株粗提取DNA为模板的PCR扩增产物；泳道6：健康植株对照；泳道7：阴性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。
实施例1：设计、合成引物并建立石榴干腐病菌的PCR反应体系
一、引物设计与合成
特异性引物的设计：对GeneBank中Coniellagranati和其他同属的rDNA-ITS序列进行分析，设计了一对特异性引物，序列如下：
S1：AAGGACACAACCCCAGATAC
S2：ATAAACTACTACGCTCAGAG。设计的引物重新在GeneBank中BLAST分析验证其特异性。
同时还使用了一对植物病原真菌ITS通用引物ITS1和ITS4作为套式PCR的外引物，序列如下：
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC
所有引物都委托上海生工合成部合成。
二、建立常规PCR反应体系
常规PCR扩增体系为：10×Taqbuffer2.5μL、25mmol/LMgCl22.0μL、2.5mmol/LdNTP2.0μL、10μmol/L正反向引物各1.0μL、5U/LTagase0.2μL、20ng/μLDNA模板2μL,补水至总体积25μL，在PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
三、建立套式PCR反应体系
为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以植物病原真菌通用引物ITS1/ITS4为第一轮反应引物，反应体系如上述常规PCR体系。反应程序中退火温度为58℃，其他参数同上述常规PCR反应程序。然后以特异性引物，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，所用引物为权利要求1所述的特异性引物S1和S2。体系同上，退火温度为55℃，其他参数不变。所有试剂均购于合肥志宏生物有限公司。取5μL扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为450bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
实施例2：制备DNA模板
提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下：
1、菌丝体的培养、收集及DNA提取
PDA培养基：琼脂粉20g，土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。将供试病菌转至PDA培养基平板上，20℃黑暗培养5d后从菌落边缘切取10块2cm×2cm菌落块，转至PDA液体培养基，28℃振荡培养7天，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨成粉，-20℃保存备用。
基因组DNA的提取依照分子克隆提供的CTAB法，具体操作如下：
取少量菌丝粉，加入900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，涡旋混匀，于60℃水浴1h，期间每隔10min上下颠倒几次，常温条件下12000rpm离心10min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；将上清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；上清转移至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20℃条件沉淀15min；常温条件下12000rpm离心5min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，37℃条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或者TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mlRNase)，37℃消解30min后电泳检测，-20℃保存备用。
2、发病植物组织DNA的提取
将供试病菌转至PDA培养基平板上，28℃黑暗培养5d后从菌落边缘切取2cm×2cm菌落块，创伤接种于石榴植株上。一段时间后切取发病组织提取基因组DNA，具体操作：取一些发病的植株组织，每毫克组织加入10μL、0.5mol/LNaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的离心管中，12,000g离心5min，取5μL上清液加入495μL、0.1mmol/LTris(PH8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。
实施例3：检测引物的特异性和灵敏度
一、特异性检测本发明所用菌株及相关信息见表1。采用本发明所设计的特异性引物对表1中所有的供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，仅能从Coniellagranati菌株中特异地扩增出一条450bp的条带，而其他供试菌株及空白对照均无扩增条带。表明该引物具有种属特异性，可以将Coniellagranati与其他种属区分开。
表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
菌株 菌株数目 用S1/S2扩增结果
Coniella granati 1 +
Alternaria alternata 2 -
Botryosphaeria dothidea 2 -
Botrytis cinerea 2 -
Coniothyrium diplodiella 2 -
Colletotrichum gloeosporioides 2 -
Podosphaera leucotricha 2 -
Gymnosporangium yamadae 2 -
Gymnosporangium haraeanum 2 -
Glomerella acutata 2 -
Plasmopara viticola 2 -
Pestalotiopsis theae 2 -
上表中：+表示具有引物S1/S2的特异性扩增条带，长度为450bp；-表示无扩增产物。
二、灵敏度检测
在25μL的反应体系中测定了上述所建立的检测体系的灵敏度，引物S1和S2可稳定地从至少10ng的基因组模板中扩增得到450bp的特异性条带。而以植物病原真菌的通用引物ITS1和ITS4对Coniellagranati菌株不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再使用特异性引物S1和S2进行第二轮套式PCR扩增，可稳定地检测到10pg的基因组DNA，使灵敏度提高了1000倍。
实施例4：植物病组织中的病原物检测
从人工接种的植物上剪取发病组织，提取DNA进行PCR扩增，发病样品均扩增出了450bp的特异性条带，而健康植株扩增不出条带，说明该套技术能用于植物病组织中Coniellagranati的快速分子检测。

Claims (4)

1.一种用于检测石榴干腐病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列如S1所述，下游引物序列如S2所述,其中，S1为：AAGGACACAACCCCAGATACS2为：ATAAACTACTACGCTCAGAG。
2.一种利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用上述设计的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量为450bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
3.根据权利要求2所述的利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特征在于：所述PCR反应的扩增体系为：10×Taqbuffer2.5μL、25mmol/LMgCl22.0μL、2.5mmol/LdNTP2.0μL、10μmol/L正反向引物各1.0μL、5U/LTagase0.2μL、20ng/μLDNA模板2μL,补水至总体积25μL。
4.根据权利要求3所述的利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特征在于：所述PCR反应的反应程序为：94℃、4min；94℃、30s,52℃、30s,72℃、30s,35个循环；72℃、10min，4℃保存。
CN201410231881.8A 2014-05-26 2014-05-26 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法 Active CN104059968B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410231881.8A CN104059968B (zh) 2014-05-26 2014-05-26 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410231881.8A CN104059968B (zh) 2014-05-26 2014-05-26 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104059968A CN104059968A (zh) 2014-09-24
CN104059968B true CN104059968B (zh) 2016-06-01

Family

ID=51547898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410231881.8A Active CN104059968B (zh) 2014-05-26 2014-05-26 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104059968B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108315391B (zh) * 2018-04-27 2021-10-22 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所 一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104059968A (zh) 2014-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103352078B (zh) 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物
CN101974650B (zh) 一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒
CN104774955B (zh) 一种葡萄座腔菌的检测方法
CN105063219A (zh) 番石榴炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法
CN105039535B (zh) 一种用于检测梨黑斑病菌的引物及利用其检测梨黑斑病菌的检测方法
CN110117592A (zh) 一种基于rpa快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法
CN104232782B (zh) 一种检测烟草土传真菌病原物的pcr引物及应用与方法
CN101603091A (zh) 西瓜细菌性果斑病菌免疫pcr的检测试剂盒和试剂盒使用方法
CN103468806B (zh) 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法
CN105112533A (zh) 用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法
CN104059968B (zh) 一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法
CN103882109B (zh) 甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的分子检测方法
CN104293957B (zh) 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
CN101086015A (zh) 一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用
CN105734165A (zh) 一种舒伯特气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用
CN106434990B (zh) 一种苜蓿疫霉菌巢式pcr检测方法
CN105420372A (zh) 检测梨黑斑病菌的pcr引物以及使用该引物的检测方法
CN105039560B (zh) 一种荔枝炭疽菌lamp引物及其快速检测方法和应用
CN108330178A (zh) 一种检测番茄早疫病菌的环介导等温扩增引物及应用
CN101086017B (zh) 一种香菇507菌种的分子标记及其获得方法与应用
CN102925568B (zh) 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
CN101864484B (zh) 一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法
CN105039331A (zh) 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用
CN105506072A (zh) 检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用
CN106244721B (zh) 一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant