CN108315391B - 一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。本发明的引物组合物，由以下引物组成：F3、B3、BIP、FIP。利用该引物组合物进行石榴干腐病菌的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定石榴干腐病菌中应用，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为石榴干腐病菌的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

Description

一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。

背景技术

石榴干腐病病原菌属于半知菌亚门，鲜壳孢菌属真菌。分生孢子器球形或扁球形，分生孢子菱形，深黄色，常与黏液粘在一起。僵果上的菌丝在翌年4月中旬前后产生新的孢子器，成为此病的传播源。在我国多个省份均有发生，严重影响我国石榴生产和粮食安全。为了阻止石榴干腐病传播范围的不断扩大，对其进行快速、准确地检测鉴定尤为重要。

近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测石榴干腐病菌，尽管以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30-90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在多种花卉、植物、农作物常见病虫害的快速检测中得到了应用，极大的提高了针对植物病虫害的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在石榴干腐病菌的检测中尚无相关报道。

发明内容

本发明提供了一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物。

本发明还提供该引物组合物的应用。

本发明进一步提供一种石榴干腐病菌LAMP快速检测方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于，由F3、 B3、FIP和BIP四条引物组成，所述引物F3、B3、FIP和BIP的核苷酸序列分别如下所示：

F3：5’-GGTCACCGTGACTTCATCAA-3’；

B3：5’-CCTTCCACTCAGCAGTGTC-3’；

FIP：5’-CACCAGTACCGGAGGCAATGATCATGATCACTGGTACCTCGC -3’；

BIP：5’-GCTGGTATCTCCAAGGATGGCCACGATGAGCTGCTTGACAC -3’。

本发明的LAMP引物组合物在制备石榴干腐病菌检测试剂中的应用。

本发明的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定石榴干腐病菌中的应用。

一种用于检测石榴干腐病菌的试剂，包含本发明的引物组合物。

一种石榴干腐病菌LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA，采用CTAB法提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行 LAMP扩增；

(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察颜色变化，扩增产物显示为黄绿色，表明待测样品中含有石榴干腐病菌；扩增产物显示为橙红色，表明待测样品中不含有石榴干腐病菌；

2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果，如果LAMP 扩增产物的电泳图谱为梯状条带，表明含有石榴干腐病菌；如果扩增产物的电泳图谱无扩增条带，表明不含有石榴干腐病菌。

所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增反应体系总体积为20μL，由下列浓度体积的组分组成：

用无菌双蒸水补充扩增体系总体积到20μL。

步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

所述的显色剂为SYBR Green I。

LAMP反应体系优化

1.1 Bst DNA聚合酶的优化为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，实验对Bst DNA聚合酶的用量进行了优化。根据Bst DNA聚合酶的浓度，从4U-8U进行了梯度优化，确定了LAMP反应最适Bst DNA聚合酶单位为6.4U。

1.2 Mg²⁺浓度的优化Mg²⁺浓度的高低，会影响到反应的扩增效率，实验在20μL反应体系中加入MgCl₂(25mM)从1.6μL到4.8μL，以0.8μL递增，以确定最佳Mg²⁺浓度为4μL。(图4)

1.3引物浓度的优化此步骤的目的是确定获得最适的引物浓度。引物浓度过高，会增大检测成本；当引物浓度过低时，扩增效率也会受到影响。实验在20μL 反应体系中分别按不同配比加入外引物FIP/BIP及内引物F3/B3，从1:4、1:6 及1:8的配比中，确定了最佳引物浓度配比为1:4。

1.4甜菜碱浓度的优化对20μL反应体系中甜菜碱浓度进行优化。反应体系中甜菜碱(4M)的加入量分别为0.8μL，1.6μL，2.4μL，3.2μL，4μL。从而筛选出最适宜浓度为甜菜碱(4M)1.6μL。

1.5为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，实验对反应参数中的反应温度(60-65℃)及时间(45-90min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别为65℃和60min。(见图5)

本发明提供的快速检测石榴干腐病菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不足1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要几个小时，这样大大缩短了检测时间、提高了检测的效率；

3、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；

4、本发明是国内外首次利用LAMP技术对石榴干腐病菌进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；

5、本发明所采集的20份石榴样品的LAMP检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合。

综上所述，本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出石榴干腐病菌菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为石榴干腐病的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

附图说明

图1石榴干腐病菌及其他常见病原菌LAMP反应电泳谱带图

图中1电泳图谱为梯状条带，表明含有石榴干腐病菌菌株；2-23电泳图谱无扩增条带，表明不含有石榴干腐病菌菌株，其中M：2000bp Marker；1：石榴干腐病菌(Coniellagranati)；2：链格孢菌(Alternaria alternata)；3：葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)；4：灰霉病菌(Botrytis cinerea)；5：葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)；6：胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；7：白粉病菌(Podosphaera leucotricha)；8：苹果锈病菌(Gymnosporangium yamadae)；9：梨锈病菌(Gymnosporangium haraeanum)；10：油桃炭疽病菌 (Glomerella acutata)；11：霜霉病菌(Plasmopara viticola)；12：茶拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis theae)；13：梨干枯病菌(Phomopsisfukushii)；14：围小丛壳菌(Glomerella cingulata)；15：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；16：稻瘟病菌(Pyricularia grisea)；17：稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)；18：水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；19：串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)；20：石榴拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsispunicae)；21：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；22：黄曲霉菌(Aspergillusflavus)；23：枇杷褐斑病菌(Ascochyta eriobotryae)；24：无菌双蒸水(阴性对照)。

图2石榴干腐病菌LAMP灵敏度检测电泳谱带图(模板进行梯度稀释)

图A中1-11表示在20μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、 1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg石榴干腐病菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增； 9-11泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，12为无菌双蒸水 (阴性对照)，电泳结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg。

图B为PCR灵敏度检测电泳图，其中M：2000bp Marker；1-9表示在25μL 的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、 100fg的石榴干腐病菌DNA为模板，进行PCR扩增反应，分别取扩增产物在 1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-5泳道的图谱为有扩增条带，呈阳性反应，表示有扩增；6-9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，N为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出PCR反应的灵敏度只能达到1ng。

图3为20份石榴样品的LAMP反应显色图(1：石榴干腐病菌(Coniella granati)；2：无菌双蒸水；3-22：不同石榴样品的DNA)

图中1为石榴干腐病菌(Coniellagranati)阳性对照(黄绿色)；2为无菌双蒸水阴性对照(橙红色)；3-22为不同石榴样品的DNA，图中4、5、7、8、10、 13、15、16、17、18、20显黄绿色，表示石榴样品中含有石榴干腐病菌；图中， 3、6、9、11、12、14、19、21、22显橙红色，表示石榴样品中不含有石榴干腐病菌。

图4为Mg²⁺浓度对LAMP反应的影响(1：无菌双蒸水；2：4.8μL；3：4μL； 4：3.2μLl；5：2.4μL；6：1.6μL)。

图5反应时长对LAMP反应的影响(1：30min；2：45min；3：60min；4： 75min；5：90min；6：无菌双蒸水)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1 LAMP引物的设计

从GenBank中下载石榴干腐病菌的elongation factor 1-alpha基因(登录号：JQ281778)基因序列，根据基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种 LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为：

F3：5’-GGTCACCGTGACTTCATCAA-3’；

B3：5’-CCTTCCACTCAGCAGTGTC-3’；

FIP：5’-CACCAGTACCGGAGGCAATGATCATGATCACTGGTACCTCGC-3’； BIP：5’-GCTGGTATCTCCAAGGATGGCCACGATGAGCTGCTTGACAC-3’。

所有引物合成量均为1OD，用ddH₂O溶解后分装，其中F3和B3的终浓度为10μM，FIP和BIP的终浓度为40μM，4℃保存备用。

实施例2 LAMP扩增体系的建立，

运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组DNA进行LAMP恒温扩增， LAMP反应总体积为20μL，反应体系是：

用无菌双蒸水补充扩增体系总体积到20μL。

LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

其中的显色剂为SYBR Green I。

实施例3石榴干腐病菌LAMP反应特异性检测

本实验采用石榴干腐病菌和22种其他常见农作物病原菌为供试材料(见表 1)，首先用CTAB法提取石榴干腐病菌及其他常见农作物病原菌基因组DNA，再以石榴干腐病菌及其他常见农作物病原菌基因组DNA为模板，利用实施例2 建立的反应体系，分别进行LAMP扩增，当模板为石榴干腐病菌时，电泳图谱成梯状条带；当模板为其他常见农作物病原菌时，电泳无条带，说明LAMP反应具有很好的特异性(见图1)。

表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株

上表中：+表示具有LAMP引物扩增条带和颜色变化；－表示无扩增条带和颜色变化。

实施例4 LAMP反应灵敏度检测

为了检测LAMP反应的灵敏度，本实验首先用CTAB法提取石榴干腐病菌的基因组DNA，利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在20μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、 10fg、1fg石榴干腐病菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，反应结束后，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中 1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增；9-11泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，电泳结果表明LAMP反应的灵敏度达到 1pg。以同样的梯度浓度进行常规的PCR扩增，结果表明LAMP技术的最低检测下限为1pg(图2A)，而普通PCR检测下限仅为1ng(图2B)。

实施例5 LAMP技术在检测石榴样品中的应用

取20份石榴样品，首先用CTAB法提取20份石榴样品的DNA；在利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在25μL的反应体系中分别以20份石榴样品的DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应；反应结束后，分别加入荧光染料，观察颜色变化，结果见图3。图中1为石榴干腐病菌(Coniella granati)阳性对照，呈现黄绿色；2为无菌双蒸水阴性对照，呈橙红色；3-22分别为20个不同的石榴样品，图中4、5、7、8、10、13、15、16、17、18、20显黄绿色，表示梨石榴样品中含有石榴干腐病菌；图中3、6、9、11、12、14、19、21、22显橙红色，表示石榴样品中不含有石榴干腐病菌。

对20份石榴样品的LAMP检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合，该方法检测结果可靠，重复性好。

序列表

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Coniella granati)

<400> 1

ggtcaccgtg acttcatcaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Coniella granati)

<400> 2

ccttccactc agcagtgtc 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Coniella granati)

<400> 3

caccagtacc ggaggcaatg atcatgatca ctggtacctc gc 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Coniella granati)

<400> 4

gctggtatct ccaaggatgg ccacgatgag ctgcttgaca c 41

Claims (7)

1.一种用于石榴干腐病菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于，由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，所述引物F3、B3、FIP和BIP的核苷酸序列分别如下所示：

F3：5’-GGTCACCGTGACTTCATCAA-3’；

B3：5’-CCTTCCACTCAGCAGTGTC-3’；

FIP：5’-CACCAGTACCGGAGGCAATGATCATGATCACTGGTACCTCGC-3’；

BIP：5’-GCTGGTATCTCCAAGGATGGCCACGATGAGCTGCTTGACAC-3’。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备石榴干腐病菌检测试剂中的应用。

3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定石榴干腐病菌中的应用。

4.一种用于检测石榴干腐病菌的试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。

5.一种石榴干腐病菌LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA，采用CTAB法提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；

(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察颜色变化，扩增产物显示为黄绿色，表明待测样品中含有石榴干腐病菌；扩增产物显示为橙红色，表明待测样品中不含有石榴干腐病菌；

2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果，如果LAMP扩增产物的电泳图谱为梯状条带，表明含有石榴干腐病菌；如果扩增产物的电泳图谱无扩增条带，表明不含有石榴干腐病菌：

所述的显色剂为SYBR Green I。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为20μL，由下列浓度体积的组分组成：

用无菌双蒸水补充扩增体系体积到20μL。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

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