CN108315472A

CN108315472A - 一种用于链格孢菌lamp快速检测的引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN108315472A
Application number: CN201810389892.7A
Authority: CN
Inventors: 杨雪; 陈雨; 谷春艳; 臧昊昱
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明公开了一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。本发明的引物组合物，由以下引物组成：F3、B3、BIP、FIP。利用该引物组合物进行链格孢菌的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定链格孢菌中应用,为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为链格孢菌的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

Description

一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用。

背景技术

链格孢菌(Alternaria sp.)是全球分布最广，经济上重要的半知菌类真菌之一。95％以上的种类兼性寄生于植物上，引起多种植物病害，造成全球性的田间和产后巨大的经济损失。有几个链格孢小孢子种可侵染人和动物，引起皮癣、甲癣、颚骨髓炎等疾病。链格孢产生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面，链格孢菌也是有应用潜力的生物资源，某些链格孢种高产纤维素酶或可开发为生防制剂，作为植物内生菌的一些链格孢可产生长春碱、紫杉醇等抗癌药物。

近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测链格孢菌，尽管以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30‐90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在多种花卉、植物、农作物常见病虫害的快速检测中得到了应用，极大的提高了针对植物病虫害的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在链格孢菌的检测中尚无相关报道。

发明内容

本发明提供了一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物。

本发明还提供该引物组合物的应用。

本发明进一步提供一种链格孢菌LAMP快速检测方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，所述引物序列为：

F3：5’-GGCTCCTTTGAATGGTAAC-3’；

B3：5’-TGTCTTCAACCAAGCATCA-3’；

FIP：5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’；BIP：5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。

所述的LAMP引物组合物在制备链格孢菌检测试剂中的应用。

所述的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定链格孢菌中的应用。

一种用于检测链格孢菌的试剂，包含本发明的引物组合物。

一种链格孢菌LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；

(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，观察颜色变化；

2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果；

如果LAMP扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，判定为含有链格孢菌菌株；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，判定为不含有链格孢菌菌株。

所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增反应体系总体积为20μL，由下列浓度体积的组分组成：

用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μL。

步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

所述的显色剂为SYBR Green I。

本发明提供的快速检测链格孢菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不到1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要几个小时，这样大大缩短了检测时间，提高了检测效率；

3、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；

4、本发明是国内外首次利用LAMP技术对链格孢菌进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；

5、本发明所采集的20份梨样品的LAMP检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合。

综上所述，本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出链格孢菌菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为链格孢菌的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

附图说明

图1链格孢菌LAMP检测特异性验证扩增产物电泳谱带图

图中1电泳图谱为梯状条带，表明含有链格孢菌菌株；2-23电泳图谱无扩增条带，表明不含有链格孢菌菌株，其中M：2000bp Marker；1：链格孢菌(Alternaria alternata)；2：枇杷褐斑病菌(Ascochyta eriobotryae)；3：黑曲霉菌(Aspergillus niger)；4：黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；5：葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)；6：灰霉病菌(Botrytis cinerea)；7：胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；8：壳座月孢菌(Coniella granati)；9：葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodiella)；10：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；11：炭疽病菌(Glomerella acutata)；12：围小丛壳菌(Glomerellacingulata)；13：桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)；14：黑孢霉菌(Nigrosporasphaerica)；15：青霉病菌(Penicilliumpurpurogenum)；16：石榴拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis punicae)；17：茶拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis theae)；18：蓝莓枝枯病菌(Pestalotiopsis clavispora)；19：梨干枯病菌(Phomopsisfukushii)；20：石榴拟茎点霉(Phomopsispunicae)；21：拟茎点霉枝枯病菌(Phomopsis amygdalina)；22：霜霉病菌(Plasmopara viticola)；23：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；N：无菌双蒸水(阴性对照)。

图2 LAMP检测链格孢菌的灵敏度显色图(模板进行梯度稀释)

图A中1-9表示在20μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg链格孢菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，分别在扩增产物中加入0.25μL显色剂SYBR Green I，得到的相应的显色图，其中1-8反应管显黄绿色，显阳性；9反应管显橙红色，显阴性，N：无菌双蒸水(阴性对照)，显色结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg。

图B为PCR灵敏度检测电泳图，其中M：2000bp Marker；1-9表示在25μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg的稻曲病菌DNA为模板，进行PCR扩增反应，分别取扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-5泳道的图谱为有扩增条带，呈阳性反应，表示有扩增；6-9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，N为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出PCR反应的灵敏度只能达到1ng。

图3为LAMP检测技术用于梨样品检测的显色图

1为链格孢菌(Alternaria alternata)阳性对照(黄绿色)；2为无菌双蒸水阴性对照(橙红色)；3-22不同梨样品DNA，图中3、5、6、9、10、12、14、15、17、18、20、22显黄绿色，表示梨样品中含有链格孢菌；图中2、4、7、8、11、13、16、19、21显橙红色，表示梨样品中不含有链格孢菌。

图4Mg²⁺浓度对LAMP反应的影响(N：无菌双蒸水；2：4.8μL；3：4μL；4：3.2μL；5：2.4μL；6：1.6μL)。

图5反应时长对LAMP反应的影响(1：30min；2：45min；3：60min；4：75min；5：90min；N：无菌双蒸水)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1LAMP引物的设计

从GenBank中下载链格孢菌的cytochrome b(登录号：JQ437357)基因序列，根据基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为：

F3：5’-GGCTCCTTTGAATGGTAAC-3’

B3：5’-TGTCTTCAACCAAGCATCA-3’

FIP：5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’

BIP：5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。

所有引物合成量均为1OD，用ddH₂O溶解后分装，其中F3和B3的终浓度为10μM，FIP和BIP的终浓度为40μM，4℃保存备用。

实施例2LAMP扩增体系的建立，

运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，LAMP反应总体积为20μL，反应体系是：

用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μL。

LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

其中的显色剂为SYBR Green I。

实施例3链格孢菌LAMP反应特异性检测

首先用CTAB法提取链格孢菌及其他22种常见农作物病原菌基因组DNA(见表1)，再以链格孢菌及其他常见农作物病原菌基因组DNA为模板，利用实施例2建立的反应体系，分别进行LAMP扩增，当模板为链格孢菌时，电泳图谱成梯状条带；当模板为其他常见农作物病原菌时，电泳无条带(见图1)。试验结果验证本发明LAMP反应具有很好的特异性。

表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株

上表中：+表示具有LAMP引物扩增条带和颜色变化；－表示无扩增条带和颜色变化。

实施例4LAMP反应灵敏度检测

为了检测LAMP反应的灵敏度，本实验首先用CTAB法提取链格孢菌的基因组DNA，利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在20μL的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg链格孢菌DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应，反应结束后，分别在扩增产物中加入0.25μL显色剂SYBR Green I，得到的相应的显色图(图2A)；再以同样的稀释倍数进行PCR扩增，结果表明LAMP技术的最低检测下限为1pg，而普通PCR检测下限仅为1ng(图2B)。

实施例5LAMP技术在检测梨样品中的应用

首先用CTAB法提取20份梨样品的DNA；在利用实施例2建立的LAMP反应扩增体系，在25μL的反应体系中分别以20份梨样品的DNA为模板，进行LAMP等温扩增反应；反应结束后，分别加入荧光染料，观察颜色变化(见图3)，图中1为链格孢菌(Alternaria alternata)阳性对照，呈现黄绿色；2为无菌双蒸水阴性对照，呈橙红色；3-24分别为20个不同的梨样品，图中3、5、6、9、10、12、14、15、17、18、20、22显黄绿色，表示梨样品中含有链格孢菌；图中4、7、8、11、13、16、19、21显橙红色，表示梨样品中不含有链格孢菌。

对20份梨样品的LAMP检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合，说明该方法检测结果可靠。

序列表

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Alternaria alternata)

<400> 1

ggctcctttg aatggtaac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Alternaria alternata)

<400> 2

tgtcttcaac caagcatca 19

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Alternaria alternata)

<400> 3

cgctgcaagt aatctataaa tcggattcaa taggcaaatg ggga 44

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Alternaria alternata)

<400> 4

aatggatcaa gaacgttcaa cgaattggtt gtggggtact c 41

Claims

1.一种用于链格孢菌LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，所述引物序列为：

F3：5’-GGCTCCTTTGAATGGTAAC-3’；

B3：5’-TGTCTTCAACCAAGCATCA-3’；

FIP：5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’；

BIP：5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备链格孢菌检测试剂中的应用。

3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测和/或鉴定链格孢菌中的应用。

4.一种用于检测链格孢菌的试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。

5.一种链格孢菌LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，观察颜色变化；

2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果；

如果LAMP扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，表明含有链格孢菌；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，表明不含有链格孢菌。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增反应体系总体为20μL，由下列浓度体积的组分组成：

用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μL。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为：65℃保温60min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的显色剂为SYBR Green I。