CN107523632A - 稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒 - Google Patents

稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒 Download PDF

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张书亚
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Abstract

本发明公开了一种用于稻曲病菌孢子的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，该LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成。本发明还同时公开了一种用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其包含上述LAMP特异性引物组合物，还包含甜菜碱、10×SYBR Green I、8U/μL Bst DNA聚合酶等。本发明还相应公开了一种用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增方法。

Description

稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种稻曲病的实时定量环介导等温扩增(q-LAMP)检测方法及试剂盒，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警技术领域。
背景技术
水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak.)引起的一种世界性水稻病害，在中国、日本和印度等国家危害较重。该病害为穗部病害，刚开始在穗部形成白色的稻曲球，然后很快转变成黄色或是墨绿色的稻曲球。该病显著地影响水稻产量和稻米品质，发病严重的年份产量损失率为30-50％，并且加工后的稻米混有大量厚垣孢子。稻曲病菌厚垣孢子含有真菌毒素Ustilaxin。日本研究者的动物毒性实验结果表明，厚垣孢子水浸出液和微量Ustilaxin A能引起动物器官病变和植物生长异常。我国研究者的试验也表明用混有稻曲病粒的谷糠饲养家畜、家禽能引起慢性中毒，使其内脏发生病变。稻曲病的发生不但对水稻的产量造成很大影响，而且稻曲病菌能够产生大量毒素不仅对畜禽业生产带来威胁，还会对人的健康构成危害，稻曲病已成为稻米安全的重要问题之一。当前，我国人民对农产品的需求已经逐渐从数量型消费向质量型消费转变，随着人们对绿色食品的日益重视，稻曲病对我国稻米无公害生产的影响将日益突出。
稻曲病是目前最难防控的水稻主要有害生物之一，主要原因是现有技术难以及时快捷地掌握其侵染动态。这导致很多药剂对稻曲病菌有很高的抑制活性，但实际应用时效果不佳。主要原因是由于缺乏灵敏、快捷的病菌监测技术，无法做到科学用药、科学防治。目前虽然采用人工分离培养和常规的显微镜观察可以检查土壤中越冬厚垣孢子的数量；但是稻田中微生物种类繁多，稻曲病菌生长速度缓慢，并且厚垣孢子萌发产生的菌丝和分生饱子没有特异的形态特征，采用显微镜观察和分离培养等病理学手段都难以鉴定，无法了解水稻生长季节田间稻曲病菌的数量变化和对植株的侵染及其在植株中的增殖状况，这些监测技术耗时都在一周以上。
随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于病原菌的检测，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，且反应容易受PCR抑制剂的影响，前处理过程复杂。同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。由于反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套用于实时定量检测稻曲病菌的环介导等温扩增引物组合物、含有该引物的试剂盒以及相应的用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测稻曲病菌孢子的q-LAMP引物组合物(LAMP特异性引物组合物)，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：
上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；
下游外引物(B3)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；
上游内引物(FIP)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；
下游内引物(BIP)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。
本发明还同时提供了用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒(q-LAMP试剂盒)：包含上述LAMP特异性引物组合物。具体为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。
本发明所述的q-LAMP试剂盒，包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、4mM MgCl2、0.6M甜菜碱、10×SYBR Green I、8U/μL BstDNA聚合酶、ddH2O。
检测溶液共19μL，加入待测DNA模板1μL，构成20μL检测反应体系。所述20μL反应体系中含有8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM的FIP引物2.0μL、20μM的BIP引物2.0μL、10μM的F3引物0.5μL、10μM的B3引物0.5μL、25mM的MgCl24.0μL、10mM的dNTPs 2.5μL、5M的甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL。
本发明还提供所述引物组合或所述试剂盒在定量检测稻曲病菌的应用。
本发明还提供了一种用于定量检测的稻曲病菌的环介导等温扩增方法，利用上述20μL检测反应体系进行q-LAMP扩增反应。q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min，终止反应。
扩增结果的分析和判定方法包括：
在扩增前加入SYBR Green I作为反应指示剂，以荧光信号做为结果判定依据，反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果。根据CT值与梯度稀释稻曲病菌孢子溶液的基因组制成标准曲线，再根据待测样品的CT值，可准确算出该样品的孢子起始浓度。
定量线性回归方程为y＝-0.2866x+13.829，其中为y为稻曲病菌孢子数对数值，x为CT值。
基于已定量的标准样品做出的标准曲线方程，标准品浓度的对数值与Ct值之间的相关系数R2>0.99，为定量未知样品的DNA提供了理论依据。
本发明的方法能定量检测稻曲病菌，克服以往实时荧光定量PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，采用不开盖就能灵敏地检测反应产物的策略，该方法不易受污染物的影响且能现场检测环境中的样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。
本发明的方案包括：
(1)根据稻曲病菌毒素合成相关的核糖体肽合成酶基因序列(NCBI登录号为：BR001221.1)的DNA序列设计特异性引物；
(2)q-LAMP扩增及扩增反应的检测；
(3)q-LAMP引物的特异性检测；
(4)稻曲病菌孢子的q-LAMP检测。
本发明的方案具体如下：
1、引物的设计：
首先发明人从NCBI上下载了稻曲病菌的核糖体肽合成酶基因序列，使用primerexplorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素进行引物的设定和选择。最后为稻曲病菌的检测选择了4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物信息见表1。
表1引物序列信息：
引物名称 序列5'-3'
UV-2F3 CGGCCCTTATACCCCATTC
UV-2B3 GAGGATCTTCAAGCACCTTGG
UV-2FIP TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG
UV-2BIP AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC
2、引物的特异性检测
为检测引物特异性，以稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)作为阳性对照，以藤仓镰孢菌(Fusarium fujikurio)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、青霉菌(Penicilliusp.)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、链格孢菌(Alternaria alternate)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)七种病原菌作为阴性对照，并以双蒸水作为空白对照进行测试。q-LAMP反应体系为：20μL体系中含有8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer 2.5μL、20.0μM的FIP引物2.0μL、20.0μM的BIP引物2.0μL、10μM的F3引物0.5μL、10μM的B3引物0.5μL、25.0mM的MgCl 4.0μL、10.0mM的dNTPs 2.5μL、5.0M的甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL；
反应结果显示如图1，引物组UV-2具有对稻曲病菌(U.virens)的特异性。
2、反应温度优化
以建立能定量检测稻曲病菌的q-LAMP最佳反应温度为目的，利用上述UV-2引物组合，同反应预混液构成检测液，加入稻曲病菌DNA模板1μL，将反应温度分别设置为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，q-LAMP扩增程序为1min，60个循环；80℃，10分钟，终止反应。反应结果显示如图2，在反应温度为64℃时，荧光信号最强且Ct值较低。
以建立能定量检测稻曲病菌的q-LAMP最佳反应时间为目的。利用用上述引物组合，同反应预混液构成检测液，加入稻曲病菌DNA模板1μL，将反应时间设置为60min，扩增反应结束后，检查荧光信号强度和Ct值。
3、引物的灵敏度检测
提取稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)基因组的DNA，利用紫外分光光度计测量DNA溶液浓度为200ng/μL。将DNA溶液释按10倍梯度稀释成7个浓度，具体梯度为0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL。配置成由下的20μL反应体系：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、上述各浓度梯度的DNA模板1μL(以双蒸水1μL作为空白对照)，最后用双蒸水各补足至20μL。
使用引物组UV-2，q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
结果如图3所示，所建立的q-LAMP体系对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)基因组DNA的检测最低浓度为10fg/μL。
4、q-LAMP扩增和标准曲线的建立
用10％SDS对稻曲病的孢子进行稀释，获得1.0×104、2.0×103、4×102、8×101、1.6×101、3.2×100、5.4×10-1个/ml孢子悬浮液，用ddH2O作为阴性对照。各取1ml孢子悬浮液放入2.0ml离心管，加入0.4g酸洗珠，置于Fsat-prep仪器中，以6m/s的速度转40s，重复三次，冰上放置2min。取1μl冷却后的裂解液直接作为DNA模板，按照优化后的反应体系和扩增条件在BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪上进行q-LAMP检测。
根据梯度稀释的孢子DNA模板扩增结果(图4)，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果构建标准曲线(图5)。根据实例3中孢子量与CT值的线性关系换算孢子数量。标准曲线是根据孢子数量的对数值与相应的Ct值之间的关系构建的，x轴表示为CT值，y轴孢子数量的对数值。孢子数量的计算方法为，y＝-0.2717x+13.241(x为CT值)，相关系数R2＝0.9851，(x为CT值)，孢子数(个)＝100.65y。
此方法可用于空气中稻曲病菌孢子量的检测。
本发明建立了稻曲病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的定量检测技术体系，该方法的建立对稻曲病的绿色防控具有十分重要的意义。
本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：
(1)特异性强，鉴定快速：检测方法结果显示，水稻上常见的真菌均为检测的阴性结果，只有稻曲病菌才产生阳性结果。整个检测过程无需开盖，且只需60min，克服了显微观察和分离纯化培养等常规方法耗时以及结果难以判定的缺点。
(2)准确定量，灵敏度高：通过倍比稀释稻曲病菌孢子基因组DNA进行灵敏度检测，q-LAMP技术可检测到最低稻曲病菌孢子浓度为3.2个/mL，且在3.2×100～1.0×104个/mL浓度范围内都有很好的线性关系。
(3)实用性好、应用范围广：可以定量检测土壤、水稻生长季节空气和稻田中稻曲病菌，适用于稻曲病菌田间动态监测，同时可用于稻曲病菌在水稻植株的中的增殖速度和种子带菌的定量检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为引物特异性测定对比图；
1为模板为稻曲病基因组DNA模板；2为藤仓镰孢菌(Fusarium fujikurio)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、青霉菌(Penicilliu sp.)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、链格孢菌(Alternaria alternate)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和ddH2O对照；
显示本发明的该引物组能特异地检测稻曲病菌。
图2为反应温度优化图；
1为66℃；2为62.5℃；3为64.4℃；4为62.1℃；5为61.8℃；6为65.2℃；7为66℃；8为60℃；
显示64℃扩增效率最高。
图3为梯度稀释的稻曲病菌基因组DNA模板扩增结果；
1为1ng/μl；2为100pg/μl；3为10pg/μl；4为1pg/μl；5为100fg/μl；6为10fg/μl和阴性对照；
显示在60min内，浓度为10fg/μL～1ng/μL的DNA模板均能有效扩增。
图4为梯度稀释的稻曲病菌孢子基因组DNA模板扩增结果；
1为1.0×104个/ml、2为2.0×103个/ml、3为4×102个/ml、4为8×101个/ml、5为1.6×101个/ml、6为3.2×100个/ml、7为5.4×10-1个/ml孢子和阴性对照。
图5为根据梯度稀释的稻曲病菌孢子基因组DNA建立的q-LAMP检测标准曲线；
显示y＝-3.24x+47.64，R2＝0.9854，在3.2×100～1.0×104个/mL之间呈现良好的线性关系。
图6为人为添加的的稻曲病菌孢子基因组DNA模板扩增结果；
1、2、3和4分别对应450、116、29和9个孢子。
具体实施方式
下面通过实例并结合附图对本发明进行进一步描述，以下描述对本发明的保护范围不构成任何意义上的限定，仅仅做示例说明。
以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs、MgCl2(Sigma)，dNTPs(南京诺唯赞生物科技有限公司)，甜菜碱、ddH2O水、分子质量标准DNAMaker(TaKaRa生物工程公司基因组)、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)、BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪。
实施例1、引物的特异性分析
以稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)作为阳性对照，以藤仓镰孢菌(Fusariumfujikurio)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、青霉菌(Penicilliu sp.)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、链格孢菌(Alternaria alternate)、纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)七种病原菌作为阴性对照，并以双蒸水作为空白对照进行测试。
使用20μL反应体系，由以下成分配比而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至20μL。
用以下引物组合进行试验：
上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；
下游外引物(B3)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；
上游内引物(FIP)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；
下游内引物(BIP)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。
使用的q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
如图1所示，试验结果除了稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)以外的模板都显示为阴性，表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系可以特异性地检测出稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)。
对比例1-1、
以以下引物组合进行试验：
上游外引物(F3-1)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTA—3’；
下游外引物(B3-1)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGT—3’；
上游内引物(FIP)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；
下游内引物(BIP)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。
注：两条外引物的的3’端最后一个碱基C和G分别替换为A和T，以验证引物的特异性。
使用20μL反应体系，由以下成分配比而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、以浓度分别为1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的稻曲病菌DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至20μL。
试验结果都显示为阴性，未检出荧光信号。表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出稻曲病菌(U.virens)，即使将DNA模板的浓度增加至100ng/μL，仍然无法有效区分。
以对比例1-1所述引物按照上述实施例所述方式进行引物的特异性分析，该引物组不能有效检测出稻曲病菌(U.virens)，表明只有本发明的表1引物组合构成的环介导等温扩增体系能够特异性地检测出稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)。
对比例1-2、
以以下引物组合进行试验：
上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；
下游外引物(B3)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；
上游内引物(FIP-1)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCA—3’；
下游内引物(BIP-1)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATT—3’。
注：两条外引物的的3’端最后一个碱基G和C分别替换为A和T，以验证引物的特异性。
使用20μL反应体系,由以下成分配比而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、以浓度分别为1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的稻曲病菌DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至20μL。
试验结果都显示为阴性，未检出荧光信号。表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)，即使将DNA模板的浓度增加至100ng/μL，仍然无法有效区分。
以对比例1-2所述引物按照上述实施例所述方式进行引物的特异性分析，该引物组不能有效检测出稻曲病菌(U.virens)，表明只有本发明的表1引物组合构成的环介导等温扩增体系能够特异性地检测出稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)。
实施例2、引物的灵敏度检测
提取稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)基因组的DNA，利用紫外分光光度计测量DNA溶液浓度为200ng/μL。将DNA溶液释按10倍梯度稀释成7个浓度(10ng/μL～1ng/μL)，具体梯度为0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL。配置成由下的20μL反应体系：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、上述各浓度梯度的DNA模板1μL(以双蒸水1μL作为空白对照)，最后用双蒸水各补足至20μL。用引物组合UV-2进行试验。q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
反应完成后，如图3所示，在DNA模板浓度为0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL时反应结果均显示为阳性，各浓度的DNA模板的Ct值均在60min。在浓度低于0.01ng/μL时，荧光信号极弱，且在60分钟未检出荧光信号。
结果显示对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)DNA的检测最低浓度为10fg/μL。
实施例3、稻曲病菌孢子DNA的q-LAMP检测
孢子悬浮液基因组的提取：用10％SDS对稻曲病菌孢子进行稀释，获得1.0×104、2.0×103、4×102、8×101、1.6×101、3.2×100、5.4×10-1个/ml孢子悬浮液。各取1ml孢子悬浮液放入2.0ml离心管，加入0.4g酸洗珠，置于Fsat-prep仪器中，以6m/s的速度转40s，重复三次，冰上放置2min。取1μl冷却后的裂解液直接作为DNA模板进行LAMP检测。以以下引物组合进行试验：
上游外引物(F3-1)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；
下游外引物(B3-1)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；
上游内引物(FIP)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；
下游内引物(BIP)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。
使用20μL反应体系，由以下成分配比而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、上述DNA模板各加1μL，以ddH2O为阴性对照，双蒸水补足至20μL。
使用的q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
反应完成后，如图4所示，在孢子浓度为1.0×104、2.0×103、4×102、8×101、1.6×101、3.2×100个/ml时反应结果均显示为阳性，各浓度的DNA模板的Ct值均在60min。
根据梯度稀释的孢子DNA模板扩增结果，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果构建标准曲线(图5)。6个梯度稀释的稻曲病菌孢子DNA模板对应的CT值分别为17.90、31.44、34.68、37.92、41.16和44.4，且与孢子数量的Log10值呈现良好的线性关系，y＝-0.2866x+13.829(x为CT值)，相关系数R2＝0.9942，孢子数量(个)计算方法为＝100.65y。结果显示所建立的q-LAMP检测体系最低可检测出3.20个/ml的稻曲病菌孢子。
实施例4、对空气传播孢子捕捉样品的定量检测
对浙江省宁海县稻区甬优12栽培区设置捕捉点。于7月25日开启孢子捕捉仪，连续1d不间断收集空气悬浮可以于聚脂胶片上。对收集的吸附有孢子的胶片进行裁切后放入2ml离心管，加入10％的SDS溶液1ml，酸洗珠0.4g，置于Fsat-prep仪器中，以6m/s的速度转40s，重复三次，冰上放置2min。取1μl冷却后的裂解液直接作为DNA模板，按照优化后的反应体系和扩增条件在BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪上进行q-LAMP检测，记录CT值。
q-LAMP反应体系总体积20μL，其中8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、上述DNA模板各加1μL，以ddH2O为阴性对照，双蒸水补足至20μL。
q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
以此DNA模板按照实施例3所述体系和扩增条件进行检测，CT值为36.6，所得结果代入定量线性回归方程y＝-0.2866x+13.829，孢子数量(个)计算方法为＝100.65y。
结果显示所测样品的CT值为36.6，经计算得出空气中的稻曲病孢子浓度为148.1个/立方米空气。利用本发明实时监测稻曲病菌孢子数量和动态变化，将为深入研究稻曲病病害流行学提供技术支持。
实施例5、对人为添加孢子的样品定量检测
在超净工作台分别在四个聚脂胶片上人为添加稻曲病菌的孢子，各胶片的孢子数量分别为450、116、29和9个。对吸附有孢子的胶片进行裁切后放入2ml离心管，加入10％的SDS溶液1ml，酸洗珠0.4g，置于Fsat-prep仪器中，以6m/s的速度转40s，重复三次，冰上放置2min。取1μl冷却后的裂解液直接作为DNA模板，按照优化后的反应体系和扩增条件在BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪上进行q-LAMP检测，记录CT值。
q-LAMP反应体系总体积20μL，其中8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、上述DNA模板各加1μL，以ddH2O为阴性对照，双蒸水补足至20μL。
q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min。
按照上述所述体系和扩增条件进行检测，CT值分别为34.03、37.12、40.46和43.17，所得结果代入定量线性回归方程y＝-0.2866x+13.829，孢子数量(个)计算方法为＝100.65y。
结果显示所测样品的CT值34.03、37.12、40.46和43.17，对应的孢子量分别为446.07、118.51、28.29和8.85个。孢子数量的q-LAMP检测结果与人为添的数量一致。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)
<400> 1
cggcccttat accccattc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)
<400> 2
gaggatcttc aagcaccttg g 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)
<400> 3
tctaccccgc aactcagccc gcggttcgtc cgttttcg 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)
<400> 4
aggaggggaa ctgacacagg gattggccat gcgtccatc 39

Claims (5)

1.用于稻曲病菌孢子的q-LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；
上游外引物：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；
下游外引物：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；
上游内引物：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；
下游内引物：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。
2.用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP特异性引物组合物。
3.根据权利要求2所述的用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×ThermoPol Buffer、1mmol/L dNTPs、4mmol/L MgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、10×SYBR Green I、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH2O。
4.用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增方法，其特征在于：
LAMP反应体系为20μL，
8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl2 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、10×SYBR Green I 1μL、稻曲病菌DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL；
扩增条件为64℃，1min，60个循环；80℃反应10min，终止反应。
5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：定量线性回归方程为y＝-0.2866x+13.829，其中为y为稻曲病菌孢子数对数值，x为CT值。
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