CN108642191A - 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 - Google Patents
艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108642191A CN108642191A CN201810265403.7A CN201810265403A CN108642191A CN 108642191 A CN108642191 A CN 108642191A CN 201810265403 A CN201810265403 A CN 201810265403A CN 108642191 A CN108642191 A CN 108642191A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tcda
- clostridium difficile
- lamp
- detection reagent
- virulent gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 101150032575 tcdA gene Proteins 0.000 title 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003100 Pseudomembranous Enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 description 1
- 230000004673 intestinal mucosal barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒及艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLamp)，不仅节省时间、特异性强、灵敏度高，且可以达到tcdA毒株分型以及定量的目的。
Description
技术领域
本发明属于定量检测试剂盒领域，尤其涉及一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒。
背景技术
艰难梭菌1935年由Hall等人首次发现，因其严格厌氧且很难分离培养，故得名。艰难梭菌是一种条件致病型菌株，当病人为长期摄入抗生素类药物后，导致肠道菌群失衡，此时艰难梭菌大量繁殖，并释放大量毒素，对人体肠道造成极大损伤。研究发现大部分艰难梭菌都产生外毒素A和外毒素B这两种毒蛋白。外毒素A首先与粘膜细胞的毒素受体结合，破坏肠道粘膜屏障，造成肠道炎症及损伤，然后外毒素B进一步破坏肠道健康，最终导致伪膜性肠炎和炎症性肠病。tcdA是编码艰难梭菌毒素A的基因，它是艰难梭菌破坏肠道的第一步，因此我们的研究致力于检测tcdA基因，从而尽早检测出有毒性的艰难梭菌，使患者做到早发现早治疗，也可以有效避免抗生素滥用。
目前常用的艰难梭菌检测方法主要有：细胞常规培养法、酶联免疫法、酶联免疫层析法、PCR检测、Real-time PCR检测。这些方法有些检测时间长，有些灵敏度不够且很难做到毒株分型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便的tcdA定量检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒、艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测引物组包括所述内引物FIP/BIP、所述外引物F3/B3和所述环引物LB。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
（1）反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mM Tris-HCl，10 mM (NH)4SO4，50 mM KCl，2mM MgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 @25℃）；0.2-2.2 mM dNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8μLLB；ddH2O补足至17 μL；
（2）0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；
（3）320 U/mL Bst DNA聚合酶；
（4）DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；
（5）反应温度：49-71℃；
（6）标准品：S1，S2，S3，S4，S5。分别是浓度为10ng/μL,1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌 ATCC 43255 菌株DNA。
优选的，所述内引物FIP/BIP为用于检测tcdA的环介导扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3 Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3 Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号。
优选的，所述内引物FIP/BIP的序列号为FIP Sequence(5'to3')：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIP Sequence（5'to3'）：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号。
优选的，所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA所示的序列号。
优选的，还包括艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μL Bst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLamp 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；95℃，2min；4℃，2 min。qLamp试剂恒温59-71℃反应15-60 min，95℃灭活聚合酶可以降低气溶胶污染，4℃降低体系温度，可以使下机时离心管盖不会弹开，有效避免气溶胶污染。
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量。
优选的，所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法的步骤（2）中恒温反应温度为59-71℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的试剂盒可根据荧光定量结果确定个体是否含有携带毒素基因tcdA的艰难梭菌，同时可以获知个体tcdA基因的表达量，艰难梭菌tcdA毒性基因检测可以通过荧光定量系统测试获得准确结果。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，基因型定位精准、节省时间、特异性强、灵敏度高，且可以达到定量的目的。
附图说明
图1中：A1：tcdA引物特异性验证图，1-14泳道分别为Marker，艰难梭菌（ATCC43255）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、表皮葡萄球菌（CMCCB 26069）、粪肠球菌（CICC10396）、无乳链球菌（CICC 10465）、屎肠球菌（CICC 21605）、肺炎链球菌（CMCC(B)31001）、大肠埃希氏菌（CMCC 44102）、鲍曼不动杆菌（CICC 22933）、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（CMCCB 46120）、铜绿假单胞菌（CGMCC 1.1785）、阴沟肠杆菌（CICC 21539）DNA，无DNA空白对照；
A2：LAMP反应液MgSO4浓度优化电泳图，1-10泳道分别是Marker，0-14 mM MgSO4，无DNA空白对照；
A3：LAMP反应液dNTPs浓度优化电泳图，1-13泳道分别是Marker，0-2.2mM dNTPs；
A4：LAMP反应液甜菜碱浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8M 甜菜碱，无DNA空白对照；
A5：LAMP反应温度优化图，1-15泳道分别是Marker，45-71℃反应温度；
A6：LAMP反应引物FIP/BIP浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8μM FIP/BIP，无DNA空白对照。
A7：LAMP反应引物LB浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8μM LB,无DNA空白对照。
图2中：
B1：qLAMP测试不同浓度Evagreen荧光信号图；
B2：qLAMP测试tcdA检测限荧光信号图；
B3：tcdA标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了如图1-2所示的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒和检测方法。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组包括所述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
（1）反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mM Tris-HCl，10 mM (NH)4SO4，50 mM KCl，2mM MgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 @25℃）；0.2-2.2 mM dNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8μMLB，ddH2O补足至17μL；
（2）0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；
（3）320 U/mL Bst DNA聚合酶；
（4）DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；
（5）反应温度：49-71℃；
（6）标准品：S1，S2，S3，S4，S5。分别是浓度为10ng/μL,1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌 ATCC 43255 菌株DNA。
具体的，所述内引物FIP/BIP为用于检测tcdA的环介导扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3 Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3 Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号。
具体的，所述内引物FIP/BIP的序列号为FIP Sequence(5'to3')：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIP Sequence（5'to3'）：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号。
具体的，所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA所示的序列号。
具体的，还包括所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μL Bst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLAMP 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；25℃，5min。
最优反应为：配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1μL Bst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。将配置好的反应体系放入qPCR仪器中扩增，扩增流程设置为：63℃ 15s； 63℃ 30s, 63℃ 30s，40个循环；95℃，2min；4℃，2min。
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量。
具体的，所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法的步骤（2）中恒温反应温度为59-71℃。
具体的，还包括对所述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB特异性验证：以该引物同时扩增艰难梭菌(ATCC 43255)及金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、表皮葡萄球菌（CMCCB 26069）、粪肠球菌（CICC 10396）、无乳链球菌（CICC 10465）、屎肠球菌（CICC21605）、肺炎链球菌（CMCC(B)31001）、大肠埃希氏菌（CMCC 44102）、鲍曼不动杆菌（CICC22933）、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（CMCCB 46120）、铜绿假单胞菌（CGMCC 1.1785）、阴沟肠杆菌（CICC 21539）DNA，仅艰难梭菌DNA组正常扩增，由此进一步验证该引物特异性好。
具体的，艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒最优体系为：1×ThermoPol反应缓冲液；1.4 mM dNTPs；4 mM MgSO4；0.4 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.8 μMFIP/BIP；1X 荧光显色剂Evagreen；320 U/mL Bst DNA聚合酶；DNA样本1μL，ddH2O补足体系至20 μL。63℃恒温反应45 min。
本发明利用环介导等温基因扩增技术，将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，环介导等温基因扩增技术是一种利用链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等温条件（65℃左右）温浴15-60分钟，就可以完成核酸扩增反应。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，根据艰难梭菌tcdA毒性基因序列特征，针对性设计特异性LAMP引物，建立了检测艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP检测方法。该方法具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、可定量的特点。
（1）操作简单：完成反应只需要一台通用型qPCR仪，不需要特定仪器；
（2）快速高效：反应仅需45min；
（3）特异性强：针对tcdA基因设置5条引物，充分囊括了整个基因序列，多重保障使得针对性极强；
（4）灵敏度高：最低检测限为1pg/μL DNA。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒及所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法；
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组包括所述内引物FIP/BIP外引物F3/B3和环引物LB；
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mM Tris-Hcl，10 mM (NH)4SO4，50 mM KCl，2 mMMgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 @25℃）；0.2-2.2 mM dNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8 mM LB，ddH2O补足至17μL；0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；320 U/mL Bst DNA聚合酶；DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；反应温度：49-71℃；标准品：S1，S2，S3，S4，S5，分别是浓度为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌ATCC 43255菌株DNA。
2.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：所述外引物F3/B3为用于检测tcdA的环介导等温扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号。
3.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：所述内引物FIP/BIP的序列号为FIPSequence(5'to3')：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIPSequence（5'to3'）：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号。
4.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA。
5.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，还包括艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μL Bst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本；
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLAMP 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；95℃，2min；4℃，2min；
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量。
6.根据权利要求4所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：所述步骤（2）中恒温反应的温度为59-71℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810265403.7A CN108642191B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810265403.7A CN108642191B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108642191A true CN108642191A (zh) | 2018-10-12 |
| CN108642191B CN108642191B (zh) | 2023-08-04 |
Family
ID=63745144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810265403.7A Active CN108642191B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108642191B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006333785A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Japan Health Science Foundation | ＬＡＭＰ法を用いたクロストリディウム・ディフィシルｔｏｘｉｎＢ遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| CN104328204A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-02-04 | 南方医科大学南方医院 | 艰难梭菌ab毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| CN106947838A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-07-14 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN107523632A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-29 | 浙江农林大学 | 稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒 |
-
2018
- 2018-07-06 CN CN201810265403.7A patent/CN108642191B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006333785A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Japan Health Science Foundation | ＬＡＭＰ法を用いたクロストリディウム・ディフィシルｔｏｘｉｎＢ遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| CN104328204A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-02-04 | 南方医科大学南方医院 | 艰难梭菌ab毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| CN106947838A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-07-14 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN107523632A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-29 | 浙江农林大学 | 稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 汪川等: "《分子生物学检验技术》", 31 July 2016, 四川大学出版社 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108642191B (zh) | 2023-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111187804A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a的肺炎支原体核酸快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| Lu et al. | Ultrasensitive microchip electrophoretic detection of the mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) based on isothermal strand-displacement polymerase reaction | |
| JP6108407B2 (ja) | マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キット | |
| Hu et al. | Rapid and visual detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic foods using blaCARB-17 gene-based loop-mediated isothermal amplification with lateral flow dipstick (LAMP-LFD) | |
| KR20170030746A (ko) | Lamp를 이용한 살모넬라 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| WO2009061752A1 (en) | Methods for detecting toxigenic microbes | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| ITVT20110002A1 (it) | Metodo di determinazione dell'origine di fluidi o tracce biologiche e kit di reagenti per la loro identificazione in un campione. | |
| EP2633082A2 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
| CN105349526B (zh) | 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用 | |
| CN104328206B (zh) | 艰难梭菌二元毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 | |
| US20150322497A1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
| Cao et al. | Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of streptococcal pyrogenic exotoxin B | |
| KR101765677B1 (ko) | 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| CN108642191A (zh) | 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 | |
| CN107904284A (zh) | 编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用 | |
| EP3523447B1 (en) | A method for the detection of legionella | |
| KR101938557B1 (ko) | Lamp를 이용한 닭의 골격계 질환 유발 원인균 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| EP2300620B1 (en) | Lepa / guf1 gene sequences as a diagnostic target for the identification of bacterial species | |
| Wang et al. | A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2 | |
| KR102502129B1 (ko) | Pna 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법 및 키트 | |
| WO2009099037A1 (ja) | クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法 | |
| KR102520374B1 (ko) | Pna 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법 및 키트 | |
| US20230125922A1 (en) | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection | |
| EP2723891B1 (en) | Diagnostic methods for detecting clostridium difficile |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xiao Chuanxing Inventor after: Yang Luxi Inventor after: Li Xiaoyan Inventor before: Yang Luxi Inventor before: Li Xiaoyan |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231218 Address after: Building 2, 3, 4, 5, 6 and 7, 112-118 Gaoyi Road, Baoshan District, Shanghai, 201900 Patentee after: Shanghai Chengge Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room W606A, Taiwanese Science and Technology Enterprise Development Center, No. 88 Xiangxing Road, Torch High-tech Zone, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee before: XIAMEN LANTE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |