CN108642191B - 艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒及艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLamp)，不仅节省时间、特异性强、灵敏度高，且可以达到tcdA毒株分型以及定量的目的。
Description
技术领域
本发明属于定量检测试剂盒领域，尤其涉及一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒。
背景技术
艰难梭菌1935年由Hall等人首次发现，因其严格厌氧且很难分离培养，故得名。艰难梭菌是一种条件致病型菌株，当病人为长期摄入抗生素类药物后，导致肠道菌群失衡，此时艰难梭菌大量繁殖，并释放大量毒素，对人体肠道造成极大损伤。研究发现大部分艰难梭菌都产生外毒素A和外毒素B这两种毒蛋白。外毒素A首先与粘膜细胞的毒素受体结合，破坏肠道粘膜屏障，造成肠道炎症及损伤，然后外毒素B进一步破坏肠道健康，最终导致伪膜性肠炎和炎症性肠病。tcdA是编码艰难梭菌毒素A的基因，它是艰难梭菌破坏肠道的第一步，因此我们的研究致力于检测tcdA基因，从而尽早检测出有毒性的艰难梭菌，使患者做到早发现早治疗，也可以有效避免抗生素滥用。
目前常用的艰难梭菌检测方法主要有：细胞常规培养法、酶联免疫法、酶联免疫层析法、PCR检测、Real-time PCR检测。这些方法有些检测时间长，有些灵敏度不够且很难做到毒株分型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便的tcdA定量检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒、艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测引物组包括所述内引物FIP/BIP、所述外引物F3/B3和所述环引物LB。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
（1）反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mM Tris-HCl，10 mM (NH)4SO4，50 mMKCl，2 mM MgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 @25℃）；0.2-2.2 mM dNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8μLLB；ddH2O补足至17 μL；
（2）0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；
（3）320 U/mL Bst DNA聚合酶；
（4）DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；
（5）反应温度：49-71℃；
（6）标准品：S1，S2，S3，S4，S5。分别是浓度为10ng/μL,1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌 ATCC 43255 菌株DNA。
优选的，所述内引物FIP/BIP为用于检测tcdA的环介导扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3 Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3 Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号。
优选的，所述内引物FIP/BIP的序列号为FIP Sequence(5'to3')：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIP Sequence（5'to3'）：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号。
优选的，所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA所示的序列号。
优选的，还包括艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μL BstDNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLamp 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；95℃，2min；4℃，2 min。qLamp试剂恒温59-71℃反应15-60 min，95℃灭活聚合酶可以降低气溶胶污染，4℃降低体系温度，可以使下机时离心管盖不会弹开，有效避免气溶胶污染。
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量。
优选的，所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法的步骤（2）中恒温反应温度为59-71℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的试剂盒可根据荧光定量结果确定个体是否含有携带毒素基因tcdA的艰难梭菌，同时可以获知个体tcdA基因的表达量，艰难梭菌tcdA毒性基因检测可以通过荧光定量系统测试获得准确结果。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，基因型定位精准、节省时间、特异性强、灵敏度高，且可以达到定量的目的。
附图说明
图1中：A1：tcdA引物特异性验证图，1-14泳道分别为Marker，艰难梭菌（ATCC43255）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、表皮葡萄球菌（CMCCB 26069）、粪肠球菌（CICC10396）、无乳链球菌（CICC 10465）、屎肠球菌（CICC 21605）、肺炎链球菌（CMCC(B)31001）、大肠埃希氏菌（CMCC 44102）、鲍曼不动杆菌（CICC 22933）、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（CMCCB 46120）、铜绿假单胞菌（CGMCC 1.1785）、阴沟肠杆菌（CICC 21539）DNA，无DNA空白对照；
A2：LAMP反应液MgSO4浓度优化电泳图，1-10泳道分别是Marker，0-14 mM MgSO4，无DNA空白对照；
A3：LAMP反应液dNTPs浓度优化电泳图，1-13泳道分别是Marker，0-2.2mM dNTPs；
A4：LAMP反应液甜菜碱浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8M 甜菜碱，无DNA空白对照；
A5：LAMP反应温度优化图，1-15泳道分别是Marker，45-71℃反应温度；
A6：LAMP反应引物FIP/BIP浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8μM FIP/BIP，无DNA空白对照。
A7：LAMP反应引物LB浓度优化图，1-12泳道分别是Marker，0-1.8μM LB,无DNA空白对照。
图2中：
B1：qLAMP测试不同浓度Evagreen荧光信号图；
B2：qLAMP测试tcdA检测限荧光信号图；
B3：tcdA标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了如图1-2所示的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒和检测方法。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组包括所述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB。
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
（1）反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mM Tris-HCl，10 mM (NH)4SO4，50 mMKCl，2 mM MgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 @25℃）；0.2-2.2 mM dNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8μMLB，ddH2O补足至17μL；
（2）0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；
（3）320 U/mL Bst DNA聚合酶；
（4）DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；
（5）反应温度：49-71℃；
（6）标准品：S1，S2，S3，S4，S5。分别是浓度为10ng/μL,1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌 ATCC 43255 菌株DNA。
具体的，所述内引物FIP/BIP为用于检测tcdA的环介导扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3 Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3 Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号。
具体的，所述内引物FIP/BIP的序列号为FIP Sequence(5'to3')：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIP Sequence（5'to3'）：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号。
具体的，所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA所示的序列号。
具体的，还包括所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μL BstDNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLAMP 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；25℃，5min。
最优反应为：配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1μL Bst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本。将配置好的反应体系放入qPCR仪器中扩增，扩增流程设置为：63℃ 15s； 63℃ 30s, 63℃ 30s，40个循环；95℃，2min；4℃，2min。
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量。
具体的，所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法的步骤（2）中恒温反应温度为59-71℃。
具体的，还包括对所述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB特异性验证：以该引物同时扩增艰难梭菌(ATCC 43255)及金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、表皮葡萄球菌（CMCCB 26069）、粪肠球菌（CICC 10396）、无乳链球菌（CICC 10465）、屎肠球菌（CICC21605）、肺炎链球菌（CMCC(B)31001）、大肠埃希氏菌（CMCC 44102）、鲍曼不动杆菌（CICC22933）、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（CMCCB 46120）、铜绿假单胞菌（CGMCC 1.1785）、阴沟肠杆菌（CICC 21539）DNA，仅艰难梭菌DNA组正常扩增，由此进一步验证该引物特异性好。
具体的，艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒最优体系为：1×ThermoPol反应缓冲液；1.4 mM dNTPs；4 mM MgSO4；0.4 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.8 μMFIP/BIP；1X 荧光显色剂Evagreen；320 U/mL Bst DNA聚合酶；DNA样本1μL，ddH2O补足体系至20 μL。63℃恒温反应45 min。
本发明利用环介导等温基因扩增技术，将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，环介导等温基因扩增技术是一种利用链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等温条件（65℃左右）温浴15-60分钟，就可以完成核酸扩增反应。本发明将tcdA基因LAMP检测技术与实时荧光定量技术有效结合(qLAMP)，根据艰难梭菌tcdA毒性基因序列特征，针对性设计特异性LAMP引物，建立了检测艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP检测方法。该方法具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、可定量的特点。
（1）操作简单：完成反应只需要一台通用型qPCR仪，不需要特定仪器；
（2）快速高效：反应仅需45min；
（3）特异性强：针对tcdA基因设置5条引物，充分囊括了整个基因序列，多重保障使得针对性极强；
（4）灵敏度高：最低检测限为1pg/μL DNA。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于，包括：所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组、艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒及所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法；
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP检测引物组包括内引物FIP/BIP外引物F3/B3 和环引物LB；
所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：
反应液：1×ThermoPol反应缓冲液（2 mMTris-Hcl，10 mM (NH)4SO4，50 mMKCl，2 mMMgSO4，0.1％ Tween-20，pH 8.8 ，25℃）；0.2-2.2 mMdNTPs；2-12 mM MgSO4；0-1.8 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.0-1.8μM FIP/BIP；0-1.8 mM LB，ddH2O补足至17μL；0.2X-2.2X 荧光显色剂Evagreen；320 U/mL Bst DNA聚合酶；DNA样本1μL，共混合成20 μL反应体系；反应温度：49-71℃；标准品：S1，S2，S3，S4，S5，分别是浓度为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10 pg/μL，1pg/μL艰难梭菌ATCC 43255菌株DNA；
所述艰难梭菌tcdA毒性基因定量检测的方法，包括以下步骤：
（1）配置反应体系：取200μL离心管，加入17 μL反应液、1μL Evagreen、1 μLBst DNA聚合酶、1 μL标准品或待测DNA样本；
（2）将配置好的反应体系放入qPCR仪器中，恒温反应；qLAMP 流程设置为：59-71℃15s； 59-71℃ 30s，59-71℃ 30s，15-60个循环；95℃，2min；4℃，2min；
（3）结果判断：通过观察荧光曲线是否有指数增长判断样本中是否含有tcdA毒性艰难梭菌；通过各样本CT值读数和标准曲线计算tcdA具体表达量；
所述外引物F3/B3为用于检测tcdA的环介导等温扩增反应引物，且外引物F3/B3的序列号为：F3Sequence(5'to3')：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA和B3Sequence(5'to3')：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG所示的序列号；
所述内引物FIP/BIP的序列号为FIPSequence(5'to3')；GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT和BIPSequence（5'to3'）： TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA所示的序列号；
所述环引物LB的序列号为LB Sequence(5’-3’):AGCTACMGTTGCAGCTATAGA。
2.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于：所述步骤（2）中恒温反应的温度为63℃。
3.根据权利要求1所述的一种艰难梭菌tcdA毒性基因的LAMP定量检测试剂盒，其特征在于，所述艰难梭菌tcdA毒性基因的qLAMP定量检测试剂盒包含以下组分：1× ThermoPol反应缓冲液；1.4 mMdNTPs；4 mM MgSO4；0.4 M甜菜碱；0.2μM F3/B3；1.8 μM FIP/BIP；1X荧光显色剂Evagreen；320 U/mL Bst DNA聚合酶；DNA样本1μL，ddH2O补足体系至20 μL。
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