KR102258934B1 - 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 라임병 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 라임병을 유발하는 원인균을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 이용하여 보다 정확도 높게 라임병의 원인균인 보렐리아 균주를 검출하고, 신속하고 저렴하게 라임병을 진단할 수 있다.
Description
본 발명은 라임병 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에 포함된 프라이머 세트를 이용하여 보다 정확도 높게 라임병의 원인균인 보렐리아 균주를 검출하고, 신속하고 저렴하게 라임병을 진단할 수 있다.
라임병(Lyme disease)은 곤충인 진드기가 사람을 무는 과정에서 나선형의 보렐리아(Borrelia)균이 신체에 침범하여 여러 기관에 병을 일으키는 감염질환이다. 질병의 초기에는 발열, 두통, 피로감과 함께 특징적인 피부병변인 이동홍반(erythema migrans)이 나타나는 것으로 알려져 있다. 이동성 홍반은 특징적으로 황소 눈과 같이 가장자리는 붉고 가운데는 연한 모양을 나타내는 피부 증상이다. 치료하지 않으면 수일에서 수주 뒤에 여러 장기로 균이 퍼지게 되고 뇌염, 말초신경염, 심근염, 부정맥과 근골격계 통증을 일으킨다. 초기에 적절하게 항생제를 이용해서 치료하지 않으면 만성형이 되어 치료하기 어렵다. 이러한 경우에는 항생제 치료에도 불구하고 피곤감, 근골격계 통증, 신경계 증상이 수 년간 지속될 수 있으며 드물게는 사망에 이를 수도 있다. 따라서 라임병을 초기에 진단해 내는 것이 중요하다.
한편, 라임병의 원인균인 보렐리아 균은 라임병과 유사한 초기 증상을 나타내는 재귀열의 원인균이기도 한데, 재귀열의 경우 라임병과 달리 만성이동성 홍반이 나타나지 않는 특징이 있다. 그러나 이러한 증상의 발현 여부를 지켜보면서 라임병으로 진단하는 것은 환자에게 고통을 줄 뿐만 아니라, 적절한 치료 시기를 놓치게 될 수 있다. 따라서 라임병을 신속하고 정확하게 진단하기 위한 수단이 필요한 실정이다.
본 발명은 라임병 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 라임병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 라임병 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 시료로부터 라임병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예는 각각 6 개의 프라이머를 포함하는 라임병(Lyme disease) 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 6 개의 프라이머로 구성되는 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 중 선택된 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 라임병을 진단하기 위한 것으로서, 보다 구체적으로 라임병의 원인균인 보렐리아 종(Borellia sp.) 균주를 검출하기 위한 것일 수 있다.
상기 라임병의 원인균이 되는 보렐리아 균주는 보렐리아 아프젤리(B. Afzelii), 보렐리아 부르그도르페리(B. Burgdorferi), 및 보렐리아 가리니이(B.garinii)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "프라이머"는 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 각각의 프라이머는 표적하는 유전자에 특이적으로서, 용어 "유전자에 특이적" 또는 "상보적인"은 표적 유전자에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 염기쌍을 이룰 수 있는 것을 의미할 수 있다.
상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 서열번호 1 내지 18의 염기서열 중 하나의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있고, 라임병 원인 균의 유전 물질에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 18로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 또한, 유전자 합성의 개시점으로서 작동하는데 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위에서 추가의 특징을 더 포함하도록 개조될 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 각 정의된 서열번호의 염기서열을 포함하면서 약 1 내지 20 bp, 1 내지 15 bp, 1 내지 10 bp, 또는 1 내지 5 bp의 추가적인 염기 서열을, 상기 프라이머의 3' 말단, 5' 말단 또는 염기서열 내부에 더 포함할 수 있고, 필요한 경우 각 말단 또는 특정 염기에 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다.
상기 표지의 예로는, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드일 수 있다. 상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일수 있고, 상기 방사성 동위원소는 32P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭 (isothermal amplification)용으로 사용하기에 적합할 수 있다. 용어 “등온증폭(isothermal amplification)"은 하나의 온도 조건하에서 DNA를 증폭시키는 것을 의미한다. 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성 (Denaturation), 어닐링 (Annealing) 및 신장 (Extension) 단계가 각각 다른 온도와 조건을 요구함에 따라 특수한 PCR 장치로 수행해야 하는 것과 달리, 등온증폭 반응은 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 장점을 갖는다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 10^9개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 결과를 육안으로 관찰할 수 있으므로 간편하게 증폭을 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다. 용어 "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 외부 프라이머, 내부 프라이머, 및 반응 속도를 향상시키기 위한 추가의 루프 프라이머를 사용하여 등온에서 수행되는 증폭 방법이다. 상기 LAMP 반응에서 사용되는 프라이머 중 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 내부 프라이머는 균주의 유전물질에는 포함되지 않으나 반응의 효율성을 높이기 위하여 특정 염기, 예를 들어, 일련의 티민 염기를 더 포함하도록 설계될 수 있다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열(고리 부위)에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다. 상기 등온증폭 또는 고리매개 등온증폭 반응은 역전사 반응일 수 있다.
상기 등온증폭 반응은 50 내지 70℃, 52 내지 70℃, 52 내지 68℃, 52 내지 65℃, 55 내지 65℃, 50 내지 60℃또는 65℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 10 내지 90분, 20 내지 90분, 25 내지 90분, 10 내지 80분, 20 내지 80분, 25 내지 80분, 10 내지 70분, 20 내지 70분, 25 내지 70분, 10 내지 60분, 20 내지 60분, 25 내지 60분, 또는 30분 내지 40분 동안 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프라이머 세트를 이용하면 20 ㎕ 반응용액을 기준으로, 100 copies 이상, 또는 500 copies이상의 DNA, RNA와 같은 표적 유전자가 포함된 검체에서 라임병 원인 균의 검출이 가능하다. 또한, 일반적인 등온증폭반응 조건에서 빠른 시간 내에 라임병 원인 균의 검출이 가능하다. 예를 들어, 상기 프라이머 세트의 각 프라이머 0.2 내지 1.6 μM을 이용하여, 60 내지 65 ℃, 구체적으로 65 ℃에서 약 40 분, 예를 들어, 30 분 내지 60 분, 30 분 내지 50 분, 또는 30 분 내지 40 분 동안 등온증폭 반응하여 검출 결과를 확인할 수 있다. 상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 구체적으로, FIP 및 BIP 프라이머의 경우 각각 1.6 μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 각각 0.2 μM, 및 FL 및 BL 프라이머의 경우 각각 0.4 μM로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 등온증폭 반응은 등온이라는 제한된 환경에서 빠른 시간 내에 결과를 도출하여야 하므로 프라이머의 조합 및 각 성분비는 유의한 반응 결과를 얻기 위해 중요한 요소이다.
본 발명의 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 라임병 진단용 조성물 또는 키트를 포함한다.
상기 라임병 진단용 조성물 또는 키트는 등온증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 반응물 및 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 반응물 및 시약은, 예를 들어 추가의 프라이머, dNTP, 및 효소 (DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소)등을 포함할 수 있고, 반응의 효율을 위해 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산암모늄과 같은 무기염류나 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 반응물 및 시약은 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH4)2SO4, 10 내지 50nM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO4, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20, 보다 구체적으로 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20을 포함하는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.8의 용액일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 라임병 진단용 조성물 또는 키트는 반응 결과물을 육안으로 확인할 수 있는 시약을 더 포함할 수 있다. 그러한 시약은 통상적으로 알려지거나 상업적으로 구매 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, WarmStart®LAMP Mix가 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 반응이 효율적으로 일어나도록 하기 위해, 상기 언급한 바와 같은 Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, MgSO4, 및 Tween-20을 포함하는 것일 수 있고, DNA 중합효소, 역전사효소와 같이 증폭 반응을 수행하기 위한 효소를 더 포함할 수 있다.
상기 라임병 진단용 조성물 또는 키트는 진단 결과를 정확하게 판독하기 위해서 음성대조물질 또는 양성대조물질을 더 포함할 수 있다. 음성대조물질로는 라임병 원인 균주와 무관한 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있고, 양성대조물질로는 라임병 원인 균의 감염 환자로부터 수득된 생물학적 시료 또는 라임병 원인 균의 유전체 일부에 해당하는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있다. 이들 대조 물질은 필요에 따라 하나의 튜브에서 생물학적 시료와 함께 또는 개별적으로 유전자 증폭 반응에 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트 및 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 등온증폭 반응하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 라임병을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비 세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변 등을 이용할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 증폭 반응의 효율을 높이기 위해 전처리를 가할 수 있다. 전처리는 물로 10배, 50배, 100배, 200배, 또는 400배 희석하는 것일 수 있고, protenase K를 처리 후 열처리하는 것일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법과 같은 통상적으로 알려진 것을 이용하거나 상업적으로 판매하는 키트를 이용해 생물학적 시료로부터 유전자를 추출하거나 일정 수준으로 정제하는 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하여 사용하는 경우, 표적 유전자를 증폭하기 전에 cDNA로 역전사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전처리는 50mM Tris-HCl (pH8.0),150mM NaCl, 5mM EDTA, 및 1% NP-40를 포함하는 lysis buffer, Brij-35 0.1% ~ 0.5w/w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM (pH7.0 ~ 8.0), 및 CaCl2 1mM ~ 10mM, 구체적으로 Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM(pH7.5), 및 CaCl2 5mM을 포함하는 용액으로 검체 시료를 처리하는 것을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 용액으로 처리한 후 통상적인 방법으로 정제하여 시료로부터 유전자만 수득하는 것을 의미할 수 있다. 상기 전처리 용액의 조합은 검체로부터 유전자가 쉽게 추출되도록 하고, 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭 반응 효율을 증진시킬 수 있다.
상기 라임병 진단 방법은 증폭된 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 각 반응 시약을 담은 용기나 시험에 사용하기 위한 도구 및 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 라임병을 특이적으로 검출할 수 있고, 등온증폭반응을 이용하여 신속하고 정확하게 현장 검출이 가능하다.
또한, 등온증폭반응은 증폭 반응을 수행하기 위한 특정 온도 및 조건을 맞추는데 요구되는 고가의 기기와 전문 인력을 필요로 하지 않으므로, 효율적이면서도 저렴한 비용으로 수행이 가능하기에 다수의 검사 대상자를 조기에 진단할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 프라이머 제작
고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 사용하여 라임병 원인균을 검출하기 위해 프라이머를 설계 및 제작하였다. 프라이머 세트 후보군을 얻기 위해, 52개의 보렐리아 균주들 간의 블라스트 분석을 통하여 염기서열을 확인하고, 그 중 라임병 원인균으로 알려진 보렐리아 아프젤리(B. Afzelii), 보렐리아 부르그도르페리(B. Burgdorferi), 및 보렐리아 가리니이(B.garinii)를 표적하는 프라이머 서열 후보를 도출하였다. 도출된 프라이머 서열을 다른 보렐리아 균주들과 교차 반응이 없는지 프로그램을 이용한 확률적으로 테스트하고, 교차 반응 확률이 낮은 프라이머 후보군을 이용하여 52개 보렐리아 균주 중 라임병 원인균이 아닌 15개 보렐리아 균주에 대해 스크리닝하여 실제 교차 반응이 낮은 프라이머 세트를 선별하였다. 선별된 프라이머는 하기의 표 1에 표시하였다. 하기의 프라이머는 외부 프라이머와 내부 프라이머, 루프 프라이머를 포함하고, Loop 형성을 촉진하고 반응의 속도를 높이기 위하여 FIP 프라이머와 BIP 프라이머 내부에 4개의 티민을 포함시켰다.
| 프라이머 유형 |
서열 | |
| 프라이머 세트 1 (B.afzelii 표적) |
F3 | 5'-GGTATACTGACAGCAGCTT-3' (서열번호 1) |
| B3 | 5'-CTTGCAGCTTAATAATAGCCTT-3' (서열번호 2) | |
| FIP | 5'-GTTGCTCGGTCCTCCATGTTTAAATTTTTAATGTTATCCGTGATATGGTTCCGA-3' (서열번호 3) | |
| BIP | 5'-GGATTTCGTATCAATTTTGGAGGCATTTTAAGTTACAAAGGTCCCATTGC-3' (서열번호 4) | |
| FL | 5'-ATAAGGCCTTCGGTATTG-3' (서열번호 5) | |
| BL | 5'-ATTCTACGTTCCGATTCTCAGTAT-3' (서열번호 6) | |
| 프라이머 세트 2 (B.burgdorferi 표적) |
F3 | 5'-AGAGCAGCTGAGGAGCT-3' (서열번호 7) |
| B3 | 5'-CTTCCAGTTGAACACCATCTT-3' (서열번호 8) | |
| FIP | 5'-AAGTCCACGACGGTTGAGACCTTTTTGCAGCCTGCTTAAATTAACA-3' (서열번호 9) | |
| BIP | 5'-GAGCAAACGAAGTTGAAGCTATTTTAGCCTGAGCAGTTAGAGC-3' (서열번호 10) | |
| FL | 5'-TGAATGCGATCCTGGT-3' (서열번호 11) | |
| BL | 5'-TATGGAGCTAATGTTGCTAAT-3' (서열번호 12) | |
| 프라이머 세트 3 (B.garinii 표적) |
F3 | 5'-GCATCGTTGACGTCAGCT-3' (서열번호 13) |
| B3 | 5'-TGTAGAGGCGATTGTAGC-3' (서열번호 14) | |
| FIP | 5'-CCACGATTACTTGCTGGTAACTTTTGTGACGTGTTCGGTTAAGT-3' (서열번호 15) | |
| BIP | 5'-GATAAGAGTGCCGCTGATAAGTTTTTAGCCCAGCAGATAAGGG-3' (서열번호 16) | |
| FL | 5'-TAACAACGGTTGCGGTCG-3' (서열번호 17) | |
| BL | 5'-TGACGATGAGGTCAATTCAT-3' (서열번호 18) |
※ F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; FL, forward loop primer; BL, backward loop primer
시험예 1: 분석능 평가
(1) 등온증폭반응 시약의 제조
상기 표 1의 프라이머 세트는 하기의 표 2와 같은 조성과 농도의 primer mix 로서 제조하여 준비하였다. 라임병 원인균인 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 부르그도르페리, 및 보렐리아 가리니이 균주를 구하여, 각 균주에 lysis buffer (50mM Tris-HCl (pH8.0),150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40)를 처리하고, 원심 분리한 후 상등액을 취하여, RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 유전물질을 추출한 후, 정제수에 용해시켜 흡광도를 측정함으로써 농도를 동일하게 맞추고, 이를 하기의 시험예에 사용하였다. 상기 RNA 1㎕에 10x primer mix 2㎕, Colorimetric LAMP 2X Master Mix 10㎕ (WarmStart®Inc.), 및 dH2O 7㎕을 혼합하여 총 20㎕가 되도록 혼합액을 제조하였다. 대조군에는 균주의 유전물질을 넣지 않았다. 상기 혼합액은 하기의 표 3과 같은 조성을 갖는다. 제조된 혼합액을 65 ℃에서 40 분 동안 등온증폭반응한 후, 반응을 멈추고 육안으로 색 변화를 확인하였다.
| 프라이머 | 10X 농도(STOCK) (μM) | 1X 농도(FINAL) (μM) |
| FIP | 16 | 1.6 |
| BIP | 16 | 1.6 |
| F3 | 2 | 0.2 |
| B3 | 2 | 0.2 |
| FL | 4 | 0.4 |
| BL | 4 | 0.4 |
| DNA 표적 검출군 | 대조군 | |
| Colorimetric LAMP 2X Master Mix | 10㎕ | 10㎕ |
| Primer Mix(10X) | 2㎕ | 2㎕ |
| 표적 DNA | 1㎕ | 0 |
| dH2O | 7㎕ | 8㎕ |
| 총 부피 | 20㎕ | 20㎕ |
(2) 분석능 평가
상기 표 1의 프라이머 세트 3 개를 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.
구체적으로, 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 부르그도르페리, 및 보렐리아 가리니이 각 균주의 RNA를 연속 희석하여 반응 용액 20㎕ 당 100, 500, 및 1,000 copies가 되도록 반응 용액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다. 각 균주에는 그 균주를 표적하는 프라이머 세트를 이용하였다. 이후 색 변화를 육안으로 확인하고 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 반응산물의 색이 분홍색으로 남아있으면 음성(-)으로, 노란색으로 변하였으면 양성(+)으로 판단하였다. 또한 전기영동으로 증폭 결과물을 직접 확인하였다.
그 결과, 하기의 표 4에 나타낸 바와 같이 모든 균주가 100 또는 500 copies부터 반응산물의 색이 노란색으로 변하였고, 그에 일치하여 유전물질의 증폭됨을 확인하였다.
| 균주 | 프라이머 | 무처리 | 100 copies | 500 copies | 1,000 copies |
| 보렐리아 아프젤리 | 세트 1 | - | - | + | + |
| 보렐리아 부르그도르페리 | 세트 2 | - | + | + | + |
| 보렐리아 가리니이 | 세트 3 | - | + | + | + |
시험예 2: 반응 시간에 따른 분석능 평가
상기 표 1의 프라이머 세트 3 개를 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 반응 시간에 따른 분석능을 평가하였다.
구체적으로 시험예 1과 각 균주의 RNA 500 copies/20㎕를 주형으로 사용하여 시험예 1과 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 10분, 20분, 30분, 40분 및 60분 동안 등온증폭반응을 실시하였다. 이후 색 변화를 육안으로 확인하고 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 반응산물의 색이 분홍색으로 남아있으며 음성으로, 노란색으로 변하였으면 양성으로 판단하였다.
그 결과, 하기의 표 5와 같이 20 분 부터 양성 결과가 관찰되었고, 40 분 후에는 모든 반응산물의 색이 노란색으로 변하였고 그에 일치하여 유전물질의 증폭을 확인하였다.
| 균주 | 프라이머 | 무처리 (60분) |
10분 | 20분 | 30분 | 40분 | 60분 |
| 보렐리아 아프젤리 | 세트 1 | - | - | - | - | + | + |
| 보렐리아 부르그도르페리 | 세트 2 | - | - | - | + | + | + |
| 보렐리아 가리니이 | 세트 3 | - | - | + | + | + | + |
시험예 3: 분석 특이도 평가
상기 표 1의 프라이머 세트 3 개를 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 각 균주에 대한 분석 특이도를 평가하였다.
본 평가를 위한 비교군으로 보렐리아 균주 중 재귀열 (relapsing fever) 원인 균으로 알려진 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 보렐리아 크로시두라에(Borrelia crocidurae), 및 보렐리아 두토니(Borrelia duttoni)를 이용하였다. 상기 시험예 1과 같이 각 균주의 RNA를 준비하고, 이를 주형으로 사용하였다. 표적 균주인 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 부르그도르페리, 및 보렐리아 가리니, 및 상기 비교군 균주로 얻은 RNA 500 copies/20㎕ 와 상기 표 1의 프라이머 세트를 각각 이용하여 상기 시험예 1과 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 비교예도 충분히 반응시키기 위해 60 분간 등온증폭반응 하였다. 양성대조군으로는 각 프라이머 세트의 표적 균주의 RNA를 이용하였다. 반응 산물의 색 변화를 육안으로 확인하고 분홍색의 음성(-)과 노란색의 양성(+)으로 구분하였고, 전기영동으로 다시 검증하였다.
그 결과, 하기의 표 6에 나타낸 바와 같이, 표 1의 프라이머 세트 모두 적 균주에 대해서만 노란색으로의 색 변화와 유전자 증폭이 관찰된 반면, 비교군에서는 60 분 간 등온증폭반응 하였음에도 색 변화가 관찰되지 않았다.
따라서 본 발명의 프라이머 세트는 라임병 원인 균주에만 특이성이 있음을 확인하여, 재귀열과 구분하여 라임병을 진단하는데 적합함을 확인하였다.
| 양성대조군 | 보렐리아 레쿠렌티스 | 보렐리아 크로시두라에 | 보렐리아 두토니 | |
| 프라이머 세트 1 | + | - | - | - |
| 프라이머 세트 2 | + | - | - | - |
| 프라이머 세트 3 | + | - | - | - |
시험예 4: 가상 검체를 이용한 분석능 평가
실제 임상 검체에서 분석이 가능할지 평가하기 위해, 가상의 검체를 제조하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.
구체적으로, 진드기에 물리거나 라임병에 걸린 적이 없는 건강한 사람 40명의 혈액샘플에서 각 검체를 8 개의 군으로 나눈 후, 7개의 군에 3종의 라임병 원인균의 유전물질을 혈액샘플 당 500 copies/20㎕로 하기의 표 7과 같이 각각 또는 조합하여 혼합하여 가상의 환자 검체로 하였으며, 1개의 군은 아무 처리를 하지 않은 음성대조군으로 이용하였다. 상기의 시료를 이용하여 증폭반응을 위한 혼합액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다.
그 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.
| 샘플수 | 프라이머 세트 1 (보렐리아 아프젤리 표적) |
프라이머 세트 2 (보렐리아 부르그도르페리 표적) |
프라이머 세트 3 (보렐리아 가리니 표적) |
|
| B. afzerii | 30 | 30 | 0 | 0 |
| B. burgdorferi | 30 | 0 | 30 | 0 |
| B. garinii | 30 | 0 | 0 | 29/30 |
| B. afzerii + B. burgdoferi | 30 | 29/30 | 30 | 0 |
| B. afzerii + B. garinii | 30 | 30 | 0 | 30 |
| B. burgdoferi + B. garinii | 30 | 0 | 29/30 | 30 |
| B. afzerii + B. burgdorferi +B. garinii | 30 | 29/30 | 30 | 29/30 |
| 음성대조군 | 10 | 0 | 0 | 0 |
시험예 5: 등온증폭반응과 PCR의 분석능 비교
본 발명의 프라이머를 이용한 등온증폭반응의 분석능을 PCR과 비교하여 평가하였다.
구체적으로 시험예 4의 검체 중 검체를 임의로 선택하고, 각 검체를 두 개의 군으로 나눈 후, 한 개 군에는 보렐리아 부르그도르페리 유래 유전물질 500 copies/20 ㎕를 시험예 4와 같이 혼합하고, 다른 군에는 아무 처리를 하지 않은 것으로 검체 시료를 준비하였다. 그런 다음, 각 검체 시료에 대해 프라이머 세트 2를 이용하여 시험예 1과 같은 등온증폭반응을 수행하고, 프라이머 세트 2의 정방향 프라이머(F3)와 역방향 프라이머(B3)를 이용하여 표 8과 같은 시약을 만들어 표 9와 같은 조건으로 PCR 반응하였다. 그 결과를 샘플 수 대비 양성을 보인 경우로 (양성 결과/샘플 수) 하기의 표 10에 나타내었다.
| 균 처리 군 | 비처리 군 | |
| 2X PCR master mix(Quiagen) | 10㎕ | 10㎕ |
| 정방향 프라이머(F3, 10pmole) | 1㎕ | 1㎕ |
| 역방향 프라이머(B3, 10pmole) | 1㎕ | 1㎕ |
| 표적 DNA | 1㎕ | 0 |
| H2O | 7㎕ | 8㎕ |
| 총 부피 | 20㎕ | 20㎕ |
| 온도 | 시간 | 주기 | |
| 가열(Heat-inactivation) | 95℃ | 2 분 | 1 |
| 변성(Denaturation) | 95℃ | 10초 | 45 |
| 어닐링(Annealing) | 60℃ | 10초 | |
| 신장(Extension) | 72℃ | 20초 | |
| 냉각(Cooling) | 40℃ | 30초 | 1 |
| 분석방법 | 균 처리 군 | 비 처리 군 | 민감도/특이도(%) |
| LAMP | 29/30 | 0/30 | 96.7/100 |
| PCR | 27/30 | 2/30 | 90.0/93.3 |
따라서, 본 발명의 프라이머를 이용하여 등온증폭반응하는 것이 단순한 PCR을 이용하는 것에 비해 민감도와 특이도가 보다 우수한 것을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> NUTRIGENE
<120> Composition for diagnosis of Lyme disease and kit comprising the
same
<130> P2021-0150
<160> 18
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii forward primer
<400> 1
ggtatactga cagcagctt 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii backward primer
<400> 2
cttgcagctt aataatagcc tt 22
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii forward inner primer
<400> 3
gttgctcggt cctccatgtt taaattttta atgttatccg tgatatggtt ccga 54
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii backward inner primer
<400> 4
ggatttcgta tcaattttgg aggcatttta agttacaaag gtcccattgc 50
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii forward loop primer
<400> 5
ataaggcctt cggtattg 18
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Afzelii backward loop primer
<400> 6
attctacgtt ccgattctca gtat 24
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi forward primer
<400> 7
agagcagctg aggagct 17
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi backward primer
<400> 8
cttccagttg aacaccatct t 21
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi forward inner primer
<400> 9
aagtccacga cggttgagac ctttttgcag cctgcttaaa ttaaca 46
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi backward inner primer
<400> 10
gagcaaacga agttgaagct attttagcct gagcagttag agc 43
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi forward loop primer
<400> 11
tgaatgcgat cctggt 16
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B.Burgdorferi backward loop primer
<400> 12
tatggagcta atgttgctaa t 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii forward primer
<400> 13
gcatcgttga cgtcagct 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii backward primer
<400> 14
tgtagaggcg attgtagc 18
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii forward inner primer
<400> 15
ccacgattac ttgctggtaa cttttgtgac gtgttcggtt aagt 44
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii backward inner primer
<400> 16
gataagagtg ccgctgataa gtttttagcc cagcagataa ggg 43
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii forward loop primer
<400> 17
taacaacggt tgcggtcg 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. garinii backward loop primer
<400> 18
tgacgatgag gtcaattcat 20
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된, 라임병(Lyme disease) 진단용 프라이머 세트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 프라이머 세트는 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)하여 라임병을 진단할 수 있는 것인
프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 프라이머 세트는
서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 보렐리아 아프젤리(B. Afzelii) 균주를 검출하기 위한 것이고,
서열번호 7 내지 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 보렐리아 부르그도르페리(B. Burgdorferi) 균주를 검출하기 위한 것이고,
서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 보렐리아 가리니이(B.garinii) 균주를 검출하기 위한 것인
프라이머 세트. - 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는,
라임병 진단용 조성물. - 청구항 4의 조성물을 포함하는 라임병 진단용 키트.
- 청구항 4의 조성물 및 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및
혼합물을 증폭 반응하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는,
라임병 진단을 위한 정보 제공 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 증폭은 등온증폭인 것인
라임병 진단을 위한 정보 제공 방법.
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| GRNT | Written decision to grant | ||
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