CN110878380A - 一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法。本发明设计筛选出的引物组合物包括2组特异性引物和探针，在本发明优选的反应体系和反应条件下，能够在同一反应管中同时鉴别检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型，具有特异性好、灵敏度高、抗干扰、无污染、操作简便快速、成本低等特点。

Description

一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合 物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法

背景技术

水泡性口炎是由弹状病毒科(Rhabdoviridae)水泡病毒属(Vesiculovirus) 的水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)引起的多种哺乳动物的高度接触性传染病。VSV可以自然感染牛、猪、马及其他哺乳动物，此外昆虫和植物也是VSV潜在的贮存者,节肢动物媒介也可以传播VSV。该病可以引起感染动物舌部、口腔、蹄部和乳房出现水泡以及溃疡，并使患畜丧失生产力，且很难在临床症状上和口蹄疫进行区别，已经被世界卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在我国该病属于外来病，在进出口检疫中被列为二类必检传染病。 VSV可分为两个血清型：印第安纳型(Indiana,IND)和新泽西型(New Jersey,NJ)，两个血清型间的同源性很低，型内的同源性很高。不同血清型的VSV对动物体的致病性各有不同。快速、准确区分VSV的不同血清型可及时掌握其流行特点，从而制定对应的防控策略。因此,有必要建立VSV分型检测技术。

目前VSV的实验室诊断主要有病毒分离、血清学诊断和生物学方法。血清学诊断包括:血清中和试验，补体结合试验，琼脂扩散试验和ELISA。生物学方法主要有RT-PCR和荧光定量RT-PCR。但RT-PCR和荧光RT-PCR都有一些自身的局限性，如RT-PCR敏感性较低，荧光RT-PCR成本较高，需要昂贵的仪器设备等。环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，突破了恒温扩增的技术难点，已在多种疾病的检测上得到应用。国内现有的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能确定具体到底是哪一种阳性反应所引起的结果，不是真正意义上的鉴别诊断。花群义等在“实时荧光定量TaqMan RT-PCR鉴别检测水泡性口炎印第安那型和新泽西型病毒”(中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集，p1312-1318)一文中虽然公开了一种鉴别检测方法，但是这种检测方法的灵敏度较低，使用的仪器也复杂，且其只能鉴别VSV,不能区分两种型。范晴等在“二重荧光RT-LAMP方法鉴别检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒”(畜牧兽医学报，2018,49(5):996-1004)一文中公开了一种鉴别检测方法，但该方法的灵敏度低，不能区分水泡性口炎病毒两种型，且反应后需要电泳才能判断结果，电泳污染大，只能在实验室进行，不能在基层进行检疫。

发明内容

本发明提供了一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物，引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括IND-F3，IND-B3，IND-FIP，IND-BIP，以及IND-Probe，第二组特异性引物和探针包括NJ-F3，NJ-B3，NJ-FIP，NJ-BIP，以及NJ-probe，第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示核苷酸序列，或为将序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；IND-probe的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694nm波长下呈大红色；NJ-probe 的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520 nm波长下呈黄绿色。

本发明还提供一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒, 该试剂盒包括前述的引物组合物。

进一步的，试剂盒还包括Bst DNA 3.0聚合酶。

进一步的，试剂盒的每25ul反应体系中包括1μL RNA模板，2×缓冲液12.5 μL，BstDNA 3.0聚合酶15U，AMV逆转录酶20U，内引物IND-FIP，IND-BIP， NJ-FIP和NJ-BIP各40pmol，外引物IND-F3，IND-B3，NJ-B3和NJ-F3各5pmol，探针IND-Probe和NJ-Probe各0.1μM，加双蒸水补足至25μL；其中，所述2 ×缓冲液成分为40mM Tris–HCl，20mM KCl，16mMMgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％ (v/v)Tween 20，1.6M betaine，and 2.8mM dNTPs。

本发明还提供一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法，该方法包括采用前述的引物组合物或试剂盒进行环介导等温扩增反应，环介导等温扩增反应的反应过程包括60-68℃反应60分钟。

进一步的，环介导等温扩增反应的反应过程包括62℃反应60分钟。

本发明还提供一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒、检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法在同时检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型中的应用。

本发明在FIP与BIP之间添加分子信标探针，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。本发明的LAMP扩增效率极高，扩增产物的数量比real-time PCR多，断裂的探针数量多,因此能在反应管内凭肉眼可直接读取反应结果，不需要电泳，且荧光基团所显示颜色的不同判断结果，能准确鉴别两种病毒。因此本发明具有以下优点：

1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低，减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染，可在基层条件差的地方现场检疫。

2特异性高：探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，我们尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不会断裂，因此不能发光，由此可见该二重荧光RT-LAMP方法特异性较好。

3本发明通过对环介导等温扩增反应体系的优化，尤其是采用了Bst DNA 3.0聚合酶后，检测灵敏度得到极大提高，可达1个拷贝/反应。

4结果准确：本研究使用了新型的探针：分子信标探针，这种探针比普能的Taqman探针更特异，可识别1个碱基的差异。分子信标探针标记了两种荧光基团，FAM和CY5.5,这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FAM，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物观察,电泳等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

由此可见，本发明成功建立了在同一反应管里鉴别诊断VSV IND型和NJ型的二重荧光LAMP检测方法，该方法特异性好，敏感性高，最低能检测到1个混合模板拷贝/反应，反应时间快，全程只需要1个小时就能完成检测，可在条件差的基层地区开展。

附图说明

图1为二重荧光RT-LAMP特异性实验结果图，其中A为520和670荧光双通道图,B为520荧光通道图，C为670荧光通道图；图1A-1C中的1-3为VSV-NJ 型,4-6为VSV-IND型,7、8为VSV-NJ型和VSV-IND型,9为FMDV A型,10 为FMDV O型,11为FMDV Asia 1型,12为BTV,13为PPRV,14为SVDV,15为VEV,16 为阴性对照；

图2为二重荧光RT-LAMP敏感性实验结果图，其中A为520和670荧光双通道图,B为520荧光通道图，C为670荧光通道图；图2A-2C中的1-7依次为 10⁴～10^-2拷贝/μl(IND和NJRNA混合模板标准品)，8为阴性对照；

图3为二重荧光RT-LAMP干扰性实验结果图，其中A为520和670荧光双通道图,B为520荧光通道图，C为670荧光通道图；图3A-3C中的1-7依次为样品1-7。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，LAMP RNA扩增试剂盒，Loopamp LA-320C实时浊度仪购自日本荣研公司； RNA抽提试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自全式金公司；premixTaq PCR试剂盒购自大连宝生物公司；pGM-T载体购自天根公司；T7体外转录试剂盒购自 Ferments公司；NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific 公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司。

实施例中所用病毒毒株如表1所示,包括水泡性口炎病毒新泽西型 (VSV-NJ型)和印第安型(VSV-IND型)，口蹄疫灭活病毒(FMDV)O型、A型、 Asia 1型，蓝舌病病毒(BTV)，小反刍兽疫(PPRV),猪水泡病(SVDV)和水泡疹(VEV)灭活病毒,均由云南出入境惠赠。

表1毒株和菌株来源

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、引物组合物的设计

下载Genebank上已登录的VSV-NJ和VSV-IND NS基因(phosphoprotein)，用 MEGA5.0进行比对分析，利用primer 5.0和Primer explore V5设计2套LAMP 特异性引物组成引物组合物。每套包括4条引物和1条探针：外引物F3和B3，内引物FIP(FIP＝F1c+F2)和BIP(BIP＝B1c+B2))，探针Probe。探针Probe设计在F1c 和B1c之间，两条探针Probe分别标记不同的荧光基团：IND-Probe在序列表中SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的5’端标记CY 5.5荧光，3’端标记BHQ3淬灭基团，在694nm波长下呈大红色；NJ-Probe在序列表中SEQ ID No：10所示的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光，3’端标记BHQ1淬灭基团，在520nm波长下呈黄绿色。引物由大连宝生物公司合成,HPLC级纯化。引物组合物中的各条引物的序列见表 2。

表2引物序列

实施例2、水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型二重荧光RT-LAMP检测方法的验证试验

1.RNA/DNA模板的提取

参照全式金RNA抽提试剂盒EasyPure RNA Kid说明书，抽提表1所示的毒株的RNA，RNA模板置-70℃保存，备用。

2.二重荧光RT-LAMP反应体系和反应条件

以VSV-NJ型和VSV-IND型RNA为实验模板，分别对反应体系中的引物浓度， BstDNA 3.0聚合酶，反应温度和反应时间进行优化。二重荧光RT-LAMP最佳的反应体系为：1μLRNA模板，2×buffer 12.5μL(成分为40mM Tris–HCl，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％(v/v)Tween 20，1.6M betaine，and 2.8mM dNTPs。)，Bst DNA 3.0聚合酶15U，AMV逆转录酶20U，内引物(IND-FIP， IND-BIP，NJ-FIP和NJ-BIP)各40pmol，外引物(IND-F3，IND-B3，NJ-B3和NJ-F3) 各5pmol，探针Probe(IND-Probe和NJ-Probe)各0.1μM，加双蒸水补足25μL。各组份混合均匀，置恒温仪或水浴锅，62℃反应60分钟。

3.标准品制备

分别用反转录PCR扩增VSV NJ型的外引物(NJ-B3，NJ-F3)片断198bp和IND 型外引物(IND-F3,IND-B3)片断244bp，用琼脂糖凝胶回收纯化连入pGM-T载体，筛选阳性重组菌，用质粒试剂盒提取阳性重组菌的质粒。参照T7体外转录试剂盒说明书将NJ型和IND型的2种质粒进行体外转录，获得靶基因的RNA模板，用D₂₆₀测定RNA浓度，根据阿弗加德罗常数换为拷贝数：拷贝数(copies˙μL^-1)＝质粒浓度(g˙μL^-1)×10^-9×6.02×10²³/660×3000,将两种体外反转录RNA分别梯度稀释制备成浓度分为1×10⁸～10^-2拷贝/μL的标准品，-70℃保存备用。

4.特异性验证实验

将步骤1获得的抽提好的口蹄疫A型,O型,Asia 1型,蓝舌病病毒,小反刍兽疫病毒,猪水泡病病毒，水泡疹病毒的RNA加入到步骤2建立的二重荧光RT-LAMP 反应体系中进行扩增，同时做阴性对照，验证VSV NJ型和IND型二重荧光RT-LAMP 方法的特异性。

如图1所示，结果表明用建立的二重荧光RT-LAMP方法对口蹄疫A型，O型， Asia 1型，蓝舌病病毒，小反刍兽疫病毒，猪水泡病病毒，水泡疹病毒均无交叉反应，仅对VSV IND和NJ病毒有特异性扩增，可见该方法具有良好特异性。

4.敏感性验证实验

步骤(3)中制备的标准品各取1μL为模板，将同浓度的两种体外反转录RNA等体积混合，用步骤2的二重荧光RT-LAMP反应体系进行敏感性实验，结果见图2。从图2可以看出，二重荧光RT-LAMP灵敏度可达1个混合模板拷贝/反应，可见该方法灵敏性高。

5.干扰性验证实验

将步骤(3)制备的NJ和IND标准样品按不同浓度进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品：样品1：NJ(10⁸copies/μL)+IND(10³copies/μL)，样品2：NJ(10³copies/μL)+IND(10⁸copies/μL)，样品3：NJ(10⁷copies/μL) +IND(10²copies/μL)，样品4：NJ(10²copies/μL)+IND(10⁷copies/μL)，样品5：NJ(10⁶copies/μL)+IND(10³copies/μL)，样品6：NJ(10³copies/μL) +IND(10⁶copies/μL)，样品7：NJ(10⁸copies/μL)+IND(10²copies/μL)，用二重荧光RT-LAMP检测，确定不同模板浓度相差较大时，各模板间是否存在干扰现象。

如图3所示，对不同浓度模拟混合感染样品的检测发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，二重荧光LAMP仍然可同时检测到两个模板，不影响彼此扩增结果，干扰性小。

Claims (8)

1.一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括IND-F3，IND-B3，IND-FIP，IND-BIP，以及IND-Probe，第二组特异性引物和探针包括NJ-F3，NJ-B3，NJ-FIP，NJ-BIP，以及NJ-probe，所述第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQID No.1至SEQ ID No.10所示核苷酸序列，或为将所述序列表中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述IND-probe的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694nm波长下呈大红色；所述NJ-probe的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520nm波长下呈黄绿色。

2.一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Bst DNA 3.0聚合酶。

4.根据权利要求2或3所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每25ul反应体系中包括1μL RNA模板，2×缓冲液12.5μL，Bst DNA3.0聚合酶15U，AMV逆转录酶20U，内引物IND-FIP，IND-BIP，NJ-FIP和NJ-BIP各40pmol，外引物IND-F3，IND-B3，NJ-B3和NJ-F3各5pmol，探针IND-Probe和NJ-Probe各0.1μM，加双蒸水补足至25μL；所述2×缓冲液成分为40mM Tris–HCl，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M betaine，and 2.8mM dNTPs。

5.一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的引物组合物或试剂盒进行环介导等温扩增反应。

6.根据权利要求5所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程包括60-68℃反应60分钟。

7.根据权利要求6所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程包括62℃反应60分钟。

8.权利要求1所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、权利要求2-4任一项所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的试剂盒、权利要求5-7任一项所述的检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的方法在同时检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型中的应用。

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