CN114427010A - 一种检测水疱性口炎病毒滴度的引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒滴度检测领域，具体涉及一种检测水疱性口炎病毒滴度的引物、试剂盒及方法，通过构建并筛选出水疱性口炎病毒的特异性逆转录引物和特异性扩增引物，并利用上述引物对提取的水疱性口炎病毒的RNA在温度稳定性逆转录酶的作用下进行逆转录及扩增，进而基于扩增结果计算得到水疱性口炎病毒的滴度，该方法能够在1×10～1×107稀释倍数下实现对水疱性口炎病毒滴度的准确检测，具有较高的检测敏感性。
Description
技术领域
本发明属于病毒滴度检测领域，具体涉及一种检测水疱性口炎病毒滴度的引物、试剂盒及方法。
背景技术
水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)水疱病毒属(Vesiculovirus)，是一种有包膜、不分节段的线性负链RNA病毒，主要感染猪、牛、马等牲畜，引起口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，而在人类仅引起轻微的流感样症状并很快自愈。作为一种极具潜力的候选病毒载体，VSV病毒具有以下优势：1)对人类的低致病性；2)大多数人呈VSV血清阴性，不存在预存免疫；3)易于利用其他病毒的糖蛋白形成假病毒；4)病毒复制速度快、滴度高；5)整个生活周期都在细胞质中进行，且不产生任何DNA形式的中间产物，避免了整合风险。目前，VSV病毒载体不仅被广泛应用于研究病毒颗粒入侵宿主细胞机制、辨认介导病毒感染细胞的细胞表面受体、筛选抑制病毒药物，而且在疫苗开发以及溶瘤免疫治疗等临床应用中也取得了突破性的进展，首个基于VSV病毒载体的埃博拉疫苗Ervebo V920于2019年12月获得FDA批准上市，这极大地增强了人们对基于VSV病毒载体新药研发的信心。
病毒滴度是VSV临床应用中衡量治疗性病毒给药剂量的重要指标，因此，如何选择一种准确而又具有广泛通用性的病毒滴度检测方法便显得尤为关键。目前应用最广泛的VSV病毒滴度测定方法是空斑试验(plaque assay)，该方法利用病毒感染并裂解细胞后的空斑形成单位(PFU/mL)来衡量样品中感染性病毒颗粒的数量。主要流程是将VSV病毒原液进行梯度稀释，分别取相同体积的稀释液加入到已接种VSV病毒易感细胞的细胞培养皿中，待病毒完全吸附到细胞中后，加入低熔点琼脂糖覆盖细胞表面以限制病毒随机扩散，继续培养至形成在显微镜下清晰可见且分散的空斑，该过程一般耗时一周左右。一个空斑是由单个感染性病毒颗粒对周围细胞进行持续感染裂解细胞所形成的，因此可通过计算空斑的数量来换算出感染性VSV病毒原液的感染滴度。
空斑试验的必要条件是病毒样品必须具备对选定细胞的感染性，主要包含两个方面的因素，其一是病毒表面糖蛋白，其二是选定细胞表面的受体，作用机理是病毒表面糖蛋白通过特异性识别细胞表面的受体，在受体介导的内吞作用下进入细胞，从而实现对细胞的侵染过程。因此，对于同一份病毒样品，利用不同的选定细胞进行空斑试验所得到的病毒滴度往往不同，即空斑试验具有细胞限制性。同时，空斑试验检测周期长，这无疑浪费了很多科研人员的宝贵时间。另外，空斑试验无法测定无侵染能力的无包膜VSV病毒(noninfectious bald particles)的病毒滴度，这就大大限制了空斑试验的应用范围。因此，有必要开发一种准确而又具有广泛通用性的病毒滴度检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种检测水疱性口炎病毒滴度的引物、试剂盒及方法，该方法能够对水疱性口炎病毒滴度进行快速检测且具有较高的检测敏感性。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供温度稳定性逆转录酶在水疱性口炎病毒滴度检测中的应用，所述温度稳定性逆转录酶的逆转录温度为65℃～75℃。
我们在研发过程中发现VSV病毒在逆转录过程中出现了以自身基因组序列为引物进行逆转录的现象。所以需要设计具有高Tm值的逆转录引物和相应高的逆转录温度(65℃～75℃)才能特异性的逆转录VSV病毒，从而才能准确地计算病毒拷贝数。高的逆转录温度就需要温度稳定性逆转录酶。故而，在水疱性口炎病毒滴度检测中使用温度稳定性逆转录酶是特异性的逆转录VSV病毒的关键之一。
第二方面，本发明提供一组检测水疱性口炎病毒的引物，包括逆转录引物和扩增引物；其中，逆转录引物的退火温度与逆转录温度相匹配，逆转录引物的退火温度为65℃～75℃。
优选地，逆转录引物的核苷酸序列为：
GGCAGAGTGCACATTTGAAGCATCGGGAGAAGGGGTC；
扩增引物的核苷酸序列为：
VSV-P-QPF1：TCTCTGTCGGAGGTAACGGA；
VSV-M-QPR1：GACCTTGATCTGCCAATACCG。
经试验发现，由本发明提供的引物对水疱性口炎病毒的反转录及扩增具有较高的特异性和敏感性，能够在1×10～1×107稀释倍数下实现对水疱性口炎病毒滴度的准确检测。
第三方面，本发明提供一种检测水疱性口炎病毒滴度的试剂盒，该试剂盒中含有上述温度稳定性逆转录酶、逆转录引物和扩增引物。
第四方面，本发明提供一种水疱性口炎病毒滴度的检测方法，包括如下步骤：
1)稀释水疱性口炎病毒并提取其RNA，利用上述逆转录引物将RNA在上述温度稳定性逆转录酶的作用下反转录为cDNA；
2)以cDNA为模板，利用上述扩增引物进行qPCR扩增反应获得扩增产物；
3)依据扩增产物的拷贝数及稀释倍数计算得到水疱性口炎病毒滴度值。
优选地，在步骤1)反转录过程中，逆转录引物的退火温度为65℃～75℃。
正如前述，VSV病毒基因组是负链RNA病毒，我们在研发过程中发现逆转录过程中出现了以自身基因组序列为引物进行逆转录的现象，试验发现，通过调高其逆转录过程的温度至65℃～75℃，能够有效规避其以自身基因组序列为引物进行逆转录的现象，从而提高了病毒拷贝数的准确度。
另外，本发明规避了空斑试验的细胞局限性、周期冗长及适用性受限等缺点，构建一种具有较高普适性的水疱性口炎病毒滴度的检测方法，通过提取水疱性口炎病毒的RNA，并在温度稳定性逆转录酶的作用下逆转录为cDNA，再以之为模板，利用特异性扩增引物进行qPCR扩增，根据qPCR扩增结果得到VSV病毒的基因组拷贝数即病毒滴度，与空斑试验相比，本发明方法能够在1天内获得待测样品中病毒基因组的拷贝数，具有快速、高效、适用范围广的特点。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明构建了一种快速高效的水疱性口炎病毒滴度的检测方法，通过构建并筛选出水疱性口炎病毒的特异性逆转录引物和特异性扩增引物，并利用上述引物对提取的水疱性口炎病毒的RNA进行逆转录及扩增，进而基于扩增结果计算得到水疱性口炎病毒的滴度，该方法能够在1×10～1×107稀释倍数下实现对水疱性口炎病毒滴度的准确检测，具有较高的检测敏感性。
附图说明
图1为由标准品扩增获得的qPCR标准曲线图；
图2为不同稀释倍数的水疱性口炎病毒样品的PCR扩增曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
EcoRV购自NEB；QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒购自Qiagen；MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒购自Takara；pVSV[Exp]-EGFP(https://www.vectorbuilder.cn/vector/VB010000-9315gcp.html)；。
实施例1
使用不同的逆转录引物对VSV病毒进行病毒滴度检测，具体步骤如下：
1、VSV病毒RNA的提取
将VSV病毒在冰上溶解，从中取20μL VSV病毒，根据MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书提取基因组RNA，最后提取的基因组RNA体积为50μL。
2、取2μL基因组RNA经过DNase I(RNase-free)消化，使用SuperScriptTMIV逆转录酶和5种逆转录特异性引物，在55℃下将RNA反转录为cDNA，其中SuperScriptTMIV逆转录酶即为温度稳定性逆转录酶；另外取2μL基因组RNA经过DNA酶的消化，但在反转录过程中不加逆转录酶，记为无逆转录对照组。5种逆转录引物如表1所示，分别为1)Oligo(dT)18Primer，该引物通常靶向成熟RNA的polyA；2)Random Hexamer Primer，该引物可靶向任一RNA序列；3)随机引物1、随机引物2和随机引物3是与VSV基因组无关的短引物；Oligo(dT)18是指18个连续的T；Random Hexamer Primer是随机的6个碱基的组合，两者属于行业基本常识。
随机引物1的核苷酸序列为：AAGCACTAAATCGGAACCCTAAAG
随机引物2的核苷酸序列为：GAGAAAGGCGGACAGGTATC
随机引物3的核苷酸序列为：GTTCAAGCGATTCTCCTGCCT。
3、根据试剂盒SuperScript IV One-Step RT-PCR步骤，使用扩增引物对1和扩增引物对2对获得的cDNA进行qPCR扩增并记录相应Ct值，Ct值越大表明模板量越少。其中扩增引物对1靶向VSV病毒M基因，扩增引物对2同时靶向VSV病毒的P基因和M基因。
其中，扩增引物对1的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下：
VSV-M-QPF1：TCGTCCGTTCAGAACATACTCAG；
VSV-M-QPR1：GACCTTGATCTGCCAATACCG；
扩增引物对2的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下：
VSV-P-QPF1：TCTCTGTCGGAGGTAACGGA；
VSV-M-QPR1：GACCTTGATCTGCCAATACCG。
结果分析：理论上，由于VSV病毒没有成熟的polyA，Oligo(dT)18 Primer无法针对VSV病毒进行逆转录。随机引物1、随机引物2和随机引物3由于不能与VSV完全匹配，理论上也不能针对VSV进行逆转录。5种逆转录引物中，理应只有Random Hexamer Primer能对VSV病毒进行逆转录。但由下表1结果可知5种逆转录引物在55℃下均能对RNA样品进行逆转录。说明针对VSV病毒基因组结构的独特性，不能使用常规的逆转录和检测方法进行滴度检测。
表1
实施例2
使用不同的逆转录温度对VSV病毒进行病毒滴度检测，具体步骤如下：VSV病毒RNA的提取、逆转录引物同实施例1，同时在N基因和P基因分别设计新的逆转录引物(见表2)进行平行测试，逆转录引物的退火温度与逆转录温度相匹配。使用温度稳定性逆转录酶RapiDxFire Thermostable Reverse Transcriptase(货号：30250-1)进行逆转录，将逆转录温度于55℃～85℃进行梯度测试；使用扩增引物对2对获得的cDNA进行qPCR扩增并记录相应Ct值(见表3)。
表2
表3
结果分析：qPCR结果(见表3)表明，当逆转录温度提升至60℃时，Oligo(dT)18Primer和随机引物3还能非特异性地发生逆转录；当逆转录温度提升至65℃～75℃时，只有特异性逆转录引物能有效地进行逆转录。进一步确定了针对特定病毒，需要配套逆转录温度和逆转录引物的重要性。
实施例3
本实施例提供一种水疱性口炎病毒滴度的检测方法，具体方法步骤如下：
一、qPCR标准品的制备
取30μg pVSV[Exp]-EGFP质粒用EcoRV进行酶切，用QIAquick Gel ExtractionKit试剂盒回收1688bp片段，用Qubit荧光计测得回收片段的浓度为11.3ng/μL、体积为35μL，换算成拷贝数为6.106×109copies/μL。取15μL回收片段加入1816.8μL超纯水中稀释至5×107copies/μL，作为qPCR标准品。
二、VSV病毒基因组RNA的提取
将VSV病毒在冰上溶解，从中取100μL VSV病毒加入900μLPBS作为实验组V1，将实验组V1按照10倍梯度稀释得到实验组V2，将实验组V2按照10倍梯度稀释得到实验组V3，按照相同操作10倍梯度稀释，分别得到实验组V4、V5、V6和V7。
从实验组V1～V7中分别取200μL VSV病毒溶液，根据MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书提取实验组V1～V7病毒溶液的基因组RNA，最后提取的基因组RNA体积为50μL。
三、逆转录和qPCR
取2μL的实验组V1～V7的基因组RNA经过DNase I(RNase-free)消化，使用MaximaH Minus(货号:EP0753)逆转录酶和逆转录特异性引物VSV-P-RT在70℃下将RNA反转录为cDNA；另外取2μL实验组V1的基因组RNA经过DNA酶的消化，但在反转录过程中不加逆转录酶，记为对照组V8。V1～V8得到的溶液体积为20μL。
取出任意一管qPCR标准品，取10μL加上90μL超纯水稀释成5×106copies/μL，按照相同操作依次稀释成5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL，从稀释好的6组标准品和V1～V8的cDNA均各取2μL作为模板，使用qPCR扩增引物VSV-P-QPF1和VSV-M-QPR1进行qPCR，qPCR配制体系见表4，引物信息见表5。标准品扩增获得的qPCR标准曲线见图1，本检测方法在103～107拷贝/反应数量级范围内具有良好的线性关系，相关系数R2＞0.99。样品PCR扩增曲线见图2。
样品滴度的换算(GC/mL)＝qPCR结果×稀释倍×2500，2500倍数的来源是：1)200μL病毒提取RNA，要转换成1mL，5倍；2)从提取的50μL样品RNA中取2μL做逆转录，25倍；3)从20μL样品cDNA中取2μL做qPCR，10倍；4)样品cDNA是单链DNA，而标准品是双链DNA，2倍。因此qPCR结果×稀释倍数×5×25×10×2＝qPCR结果×2500＝样品滴度(GC/mL)。
不同稀释梯度VSV病毒的RT-qPCR检测结果见表6。
表4 qPCR扩增配制体系
| 成分 | 加入体积(μL) |
| TB Green | 10 |
| Rox II | 0.4 |
| VSV-M-QPF1(59.6) | 1 |
| VSV-M-QPR1(59.6) | 1 |
| 样品或标准品 | 2 |
| 超纯水 | 5.6 |
表5 引物信息
| 逆转录特异性引物 | VSV-P-RT | CCAACCCAAGAAAGCAAGTCTTCAGCC |
| qPCR扩增引物 | VSV-P-QPF1 | TCTCTGTCGGAGGTAACGGA |
| qPCR扩增引物 | VSV-M-QPR1 | GACCTTGATCTGCCAATACCG |
表6 样品RT-qPCR检测结果
由表6可知，没有感染能力的Bald无包膜病毒组测定的滴度高达4.79E+9GC/mL，实验组V1～V7稀释前的qPCR检测滴度相差较小，平均滴度为3.59E+10GC/mL。表明本发明方法可高效、快速运用于VSV病毒的滴度检测中。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (6)
1.温度稳定性逆转录酶在水疱性口炎病毒滴度检测中的应用，其特征在于，所述温度稳定性逆转录酶的逆转录温度为65℃～75℃。
2.一组检测水疱性口炎病毒的引物，其特征在于，包括逆转录引物和扩增引物，逆转录引物的退火温度与逆转录温度相匹配，逆转录引物的退火温度为65℃～75℃。
3.根据权利要求2所述引物，其特征在于，
所述逆转录引物的核苷酸序列为：
GGCAGAGTGCACATTTGAAGCATCGGGAGAAGGGGTC；
所述扩增引物的核苷酸序列为：
VSV-P-QPF1：TCTCTGTCGGAGGTAACGGA；
VSV-M-QPR1：GACCTTGATCTGCCAATACCG。
4.一种检测水疱性口炎病毒滴度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述温度稳定性逆转录酶和权利要求3所述逆转录引物和扩增引物。
5.一种水疱性口炎病毒滴度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)稀释水疱性口炎病毒并提取其RNA，利用权利要求3所述逆转录引物将RNA在权利要求1所述温度稳定性逆转录酶的作用下反转录为cDNA；
2)以cDNA为模板，利用权利要求3所述扩增引物进行qPCR扩增反应获得扩增产物；
3)依据扩增产物的拷贝数及稀释倍数计算得到水疱性口炎病毒滴度值。
6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，在步骤1)反转录过程中，逆转录引物的退火温度为65℃～75℃。
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