CN116676428B - 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型的荧光定量pcr引物及其应用 - Google Patents
一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型的荧光定量pcr引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法。本发明的引物是针对呼吸道合胞病毒A型和B型的G蛋白基因的特异性引物。利用本发明的引物检测结果特异性好，与除呼吸道合胞病毒A型和B型之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为101 copies/μL；检测快速简便。本发明的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法，具有灵敏度高、特异性强、耗时短等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，RSV)是肺炎病毒科正肺病毒属成员，属于单负链病毒目，是人类急性呼吸道感染的重要病原体，临床表现从轻微的急性上呼吸道感染或中耳炎到严重的潜在危及生命的下呼吸道感染。
RSV病毒属于非节段性单股负链RNA病毒。RSV病毒基因组全长约15.2 Kb，包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白（F、G、M2-1、M2-2、SH、N、P、L）和3种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3)；其中融合蛋白（fusion protein，F）和粘附蛋白（attachment protein，G）是两个主要的包膜糖蛋白。根据F蛋白和G蛋白的突变，RSV病毒分为A和B两种亚型。
RSV首先是从黑猩猩中分离出来的。该病毒可以通过实验感染小鼠、大鼠、棉鼠、雪貂和仓鼠，但不会在这些动物种群中自然传播。而近年来发现马来亚穿山甲(Manisjavanica)自然感染了RSV，这些RSV与人类流行的菌株具有99.4%-99.8%的基因组同一性。
发明内容
本发明的目的是为穿山甲RSV-A和RSV-B检测提供了一种特异、敏感、快速、简便、可定量检测穿山甲RSV-A和RSV-B的荧光定量PCR引物及方法，是一种SYBR Green染料法荧光定量方法，可快速特异地检测RSV-A和RSV-B。
本发明的第一目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物，包括上游引物RSV-A/B-G-F和下游引物RSV-A/B-G-R，所述的上游引物RSV-A/B-G-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物RSV-A/B-G-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR试剂盒，包括所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物和SYBRGreen染料法荧光定量PCR试剂。
优选，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有呼吸道合胞病毒A型和呼吸道合胞病毒B型共同保守的G基因片段的重组质粒，所述的阴性对照品为无酶ddH2O。
本发明的第三个目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1. 提取待检样品的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物和SYBRGreen染料法荧光定量PCR试剂，以步骤S1获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S3. 反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有呼吸道合胞病毒A型或B型；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线，则待检样品中含有呼吸道合胞病毒A型和/或B型；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
本发明具有以下有益效果：
本发明的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂含有用于检测RSV-A和RSV-B的一对特异性引物。本发明的试剂盒检测结果特异性好，RSV-A和RSV-B可同时检测，且扩增曲线良好，其他可感染穿山甲的相关病原均未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为101copies/μL；检测快速简便，解决了现有RSV-A和RSV-B的检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等的问题，对于确定穿山甲是否感染RSV-A和RSV-B具有重要意义。
附图说明
图1为RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法的扩增曲线。图中：1代表RSV-B的扩增曲线；2代表RSV-A的扩增曲线；3代表阴性对照（无酶ddH2O）的扩增曲线。
图2为RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法特异性检测，图中：1代表RSV-B的扩增曲线；2代表RSV-A的扩增曲线；3代表东阳病毒（Dong yang pangolinvirus，DYPV）基因组的扩增曲线、4代表副流感病毒5型（PIV5）基因组的扩增曲线、5代表丽水穿山甲病毒（Lishui pangolin virus，LSPV）基因组的扩增曲线、6代表巴泰病毒（Bataivirus，BATV）基因组的扩增曲线、7代表盖塔病毒（Getah virus，GETV）基因组的扩增曲线及8代表阴性的扩增曲线。
图3为用荧光定量法检测RSV-A病毒灵敏性时，RSV-A病毒模板分别为3.05×105copies/μL到3.05×100copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品和阴性对照对应的扩增曲线；该结果显示检测灵敏性可达到3.05×101copies/μL。
图4为用荧光定量法检测RSV-B病毒灵敏性时，RSV-B病毒模板分别为1.82×105copies/μL到1.82×100copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品和阴性对照对应的扩增曲线；该结果显示检测灵敏性可达到1.82×101copies/μL。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
针对G基因保守区设计特异性引物和探针从GenBank上下载穿山甲RSV-A和RSV-B毒株的参考序列，根据序列比对结果，针对RSV-A和RSV-B的G基因的共同的高度保守片段，设计一对特异性引物(RSV-A/B-G-F和RSV-A/B-G-R)，扩增的目的片段长度为115 bp。引物序列如下：
RSV-A/B-G-F: 5’-AAATCTATAGCACAAATCACA-3’(SEQ ID NO.1)；
RSV-A/B-G-R: 5’-CAGTTGTTAGTGTGACTTTGT-3’( SEQ ID NO.2)。
RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法的建立按照体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书，分别提取RSV-A和RSV-B的RNA。进行反转录后作为模板，根据表1中的反应体系进行反应，反应条件：95℃（预变性） 2 min；95℃（变性）5 s，60℃（退火）40 s，40个循环(PCR扩增)；在60℃延伸时收集荧光信号。
表1 RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测体系
荧光定量检测荧光定量检测中，按照表1中检测体系加入各种组分。各组分混合均匀后进入循环，荧光信号检测40个循环。利用荧光检测判定检测体系检测活性。使用荧光定量用于测量检测反应的荧光，RSV-A和RSV-B病毒检测中，针对RSV-A和RSV-B病毒G蛋白基因监测。利用荧光法对结果进行判定，实现对RSV-A和RSV-B病毒的检测。
荧光定量用于检测RSV-A病毒和RSV-B病毒，如图1所示，分别以RSV-A和RSV-B的基因组为模板，用上述的引物(RSV-A/B-G-F和RSV-A/B-G-R)按照表1中的体系进行PCR扩增目的片段。检测中发现RSV-A病毒和RSV-B病毒的检出均有较高的荧光值。
根据所得结果，对检测的RSV-A病毒和RSV-B病毒基因均有较高荧光值，因此采用该体系进行后续检测。本检测采用20μL体系如表1所示，但不限于此。
实施例2：对RSV-A病毒和RSV-B病毒的特异性检测
检测样品分别为：吸道合胞病毒A型(RSV-A) 基因组、呼吸道合胞病毒B型(RSV-B)基因组、副流感病毒5型（PIV5）基因组、丽水穿山甲病毒（LSPV）基因组、巴泰病毒(BATV)基因组、盖塔病毒(GETV)基因组、东阳病毒(DYPV)基因组。利用实施例1所述的RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法进行检测，除RSV-A和RSV-B外，其他样品均未检测到特异性扩增信号(图2)，该结果说明设计的特异性引物(RSV-A/B-G-F和RSV-A/B-G-R)及所建立的检测方法具有良好的特异性。
实施例3：检测RSV-A病毒和RSV-B病毒灵敏度
在灵敏度检测中，将RSV的pUC57-RSV-A-G和pUC57-RSV-B-G重组质粒（其中，pUC57-RSV-A-G重组质粒是将RSV-A的G基因片段连接到pUC57得到的重组质粒，pUC57-RSV-B-G重组质粒是将RSV-B的G基因片段连接到pUC57得到的重组质粒）根据分子量转换为拷贝数，RSV-A阳性标准品3.05×105copies/μL到3.05×100copies/μL，RSV-B阳性标准品1.82×105copies/μL到1.82×100copies/μL，用实施例1建立的RSV-A和RSV-B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法进行检测，该方法对RSV-A检测的敏感性可达到3.05×101copies/μL（图3），对RSV-B检测的敏感性可达到1.82×101copies/μL（图4），敏感性良好。
本实施例所得结果如图3和图4所示，针对RSV-A病毒和RSV-B病毒灵敏性检测结果显示敏感性良好，可以应用于基层检测。
实施例4：定量检测RSV-A和RSV-B
1. 待检样品RNA模板的制备
利用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（诺唯赞），提取样品基因组RNA，具体方法如下：
a)向RNase-free离心管中加入200 μL样本(如样本量不足，使用PBS或0.9% NaCl补足)，加入500 μL Buffer VL，涡旋混匀15-30 s，将混合液瞬时离心收集至管底。
b)将FastPure RNA Columns置于Collection Tubes 2 mL中，转移上述混合液至FastPure RNA Columns中，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min，弃滤液。
c)向FastPure RNA Columns中加入600 μL Buffer RW，12,000 rpm (13,400×g)离心30 s，弃滤液。重复步骤3。空柱12,000 rpm (13,400×g)离心2 min。
d)小心将FastPure RNA Columns转移至新的RNase-free Collection Tubes 1.5mL (试剂盒提供)中，向膜中央悬空加入30 - 50 μL的RNase-free ddH2O，室温放置1 min，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min。
e)弃去FastPure RNA Columns，RNA可直接用于后续检测或置于-30 ~ -15℃短期保存或置于-85 ~ -65℃长期保存。
2. cDNA模板的制备
将上述制备的RNA模板逆转录反应为cDNA模板，反应体系见表2。反应程序为：30℃反应10 min，42℃反应40 min后95℃灭活5 min，产物-20℃储存备用。
表2 逆转录反应体系
3. 以制备的样品cDNA为模板，以实施1所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增。
4. 将阳性标准品pUC57-RSV A-G做3.05×105copies/μL到3.05×100copies/μL10倍系列稀释、pUC57-RSV B-G 做1.82×105copies/μL到1.82×100copies/μL 10倍系列稀释后提取RNA然后逆转录作为模板，以实施例1所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。
5. 根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量。
Claims (3)
1. 检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的荧光定量PCR引物在制备用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的试剂中的用途，其特征在于，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本，所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的荧光定量PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的试剂包括权利要求1所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的荧光定量PCR引物和SYBRGreen染料法荧光定量PCR试剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型的试剂还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有呼吸道合胞病毒A型的G基因片段的重组质粒，所述的阴性对照品为无酶ddH2O。
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