KR20230093118A - 호흡기 세포융합 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

호흡기 세포융합 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 Download PDF

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Abstract

민감도가 뛰어난 호흡기 융합세포 바이러스(RSV) 검출 방법 및 검출 키트가 제공된다. RSV 검출 방법은 RSV-F VLP, RSV-preF VLP, 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 시료내에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

호흡기 세포융합 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 {Method and kit for detecting respiratory syncytial virus}
본 발명은 민감도가 뛰어난 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus; RSV) 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 세계적으로 영유아의 하기도 질환의 주요 원인이다. 또한, 호흡기 세포융합 바이러스는 소아 및 성인에서 감기, 기관지염, 폐렴, 세기관지염을 야기하는 바이러스로 5세 미만의 소아에서 폐렴을 일으키는 가장 흔한 원인이며, 거의 모든 소아가 대부분 생후 1년에 그리고 4세까지 감염된 경험이 있다. 미국에서는 대략 70,000-120,000 명의 유아가 RSV 관련 폐렴 또는 세기관지염으로 매년 입원한다. 호흡기 세포융합 바이러스는 호흡기분비물의 흡입, 경구 접촉에 의해서 전염되며, 잠복기는 4-5일이다.
호흡기 세포융합 바이러스에 감염된 경우, 효과적인 치료법은 널리 사용 가능하지 않으며, 소단위 백신, 약독화된 바이러스를 개발하기 위해 DNA 또는 생 벡터 백신이 사용되었지만 허가된 백신은 나오지 않았다.
RSV에는 11개의 단백질을 암호화하는 10개의 유전자가 있다. 그 중, 융합 단백질 F와 당단백질 G가 바이러스 표면에서 발현되는 주요 항원이고, 중화 및 보호 항체의 중요한 표적이다.
바이러스 유사 입자(VLP) 백신은 바이러스성 유전물질이 결여되어 복제할 수 없는 입자상 바이러스 유사 구조에서 단백질 항원의 여러 복사본의 유전자 조작 복합체이다. VLP 또는 재조합 백신으로 제시된 바이러스 단백질은 높은 면역원성과 보호를 유도한다.
RSV 융합(F) 및 부착 당단백질(G)은 모든 중화 항체 에피토프 및 여러 가지 T 세포 에피토프를 포함한다. 따라서 F 또는 G를 포함하는 VLP는 강한 RSV 특이적 면역 반응과 면역성을 가지는 것으로 개념화된다.
바이러스에 의한 호흡기 질환에서 효과적인 백신이 개발되지 않은 상태이며 치료법 역시 확립되지 않은 상태이므로 발열 시 적절한 수분 공급과 안정, 해열제 복용, 2차 감염방지를 위한 항생제 투여 등의 대중적인 요법 이외에는 특별한 치료법이 없는 실정이다. 따라서 원인 바이러스의 보다 신속하고 정확한 진단은 질환 확산의 조기 예방과 환자의 효과적인 치료에 매우 중요하다. 그러나, 바이러스성 호흡기 감염 질환은 비교적 특징적인 임상 증상을 나타내는 경우를 제외하고는 임상적으로 원인 바이러스의 규명이 어려울 뿐 아니라 세균성 호흡기 감염과 감별이 어렵기 때문에 정확한 진단에 많은 어려움이 있는 실정이다.
대한민국 공개 특허 제10-2012-7006411호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 민감도가 뛰어난 호흡기 세포융합 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 민감도가 뛰어난 호흡기 세포융합 바이러스 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, RSV-F VLP, RSV-preF VLP, 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 시료내에서 호흡기 융합 세포 바이러스(RSV)를 검출하는 단계를 포함하는 RSV 검출방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, RSV-F VLP, RSV-preF VLP 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 포함하는 RSV 검출 키트가 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 높은 민감도로 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV-F VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV-preF VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따른 RSV-G VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV 검출방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 마우스 혈청에 대한 RSV-F VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 마우스 혈청에 대한 RSV-preF VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 마우스 혈청에 대한 RSV-G VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따른 RSV 검출 방법은 RSV-F VLP, RSV-preF VLP, 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 시료내에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 “바이러스 유사 입자(VLP)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 아단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 VLP는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분 석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시료는 RSV에 감염된 개체의 혈청일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RSV-F VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-F 단백질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 RSV-preF VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-preF 단백질을 포함할 수 있으며, 상기 RSV-G VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-G 단백질을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명의 일 구현예에 따른 VLP 는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 구조 단백질(core protein)로서 인플루엔자 바이러스 유래의 매트릭스 단백질(M1)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질 단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C로 명명된 서브타입으로 구성된다. 상기 인플루엔자 바이러스는 코어와 바이러스 외피 간의 연결체로 작용하는 매트릭스 단백질(M1)의 층으로 둘러싸여 외형을 이루며, 상기 M1 단 백질은 VLP의 개발에 있어서 구조 단백질로서 널리 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 구조 단백질로서 포함하여, 그 표면에 RSV에서 유래한 RSV-F 항원 단백질, RSV-preF 항원 단백질, 및 RSV-G 항원 단백질 중에서 선택된 1종 이상의 표면 항원 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 VLP는 표면에 RSV에서 유래한 표면 항원 단백질을 포함하고 있으므로 RSV에 감염된 개체에 대하여 ELISA 법으로 항체를 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 VLP는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
VLP는 구조 단백질 및 표면 항원 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상청액으로 배출될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
<서열번호 1>
Figure pat00001
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RSV-F 단백질은 하기 서열번호 2를 갖는 것일 수 있다:
<서열번호 2>
Figure pat00002
상기 RSV-preF 단백질은 하기 서열번호 3을 갖는 것일 수 있다:
<서열번호 3>
Figure pat00003
상기 RSV-G 단백질은 하기 서열번호 4를 갖는 것일 수 있다:
<서열번호 4>
Figure pat00004
본 발명에서 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1); RSV 항원 단백질 F, RSV 항원 단백질 pre-F 항원 단백질, 및 RSV G 항원 단백질은 각각 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 적어 도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 각각 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1), RSV 항원 단백질 F, RSV pre-F 항원 단백질, 또는 RSV G 항원 단백질과의 구조적, 기능적 상동성으로 인해 RSV 항체에 대한 특이적인 항원 항체 반응을 유도할 수 있는 VLP 로서의 활성을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 핵산 서열; 및 RSV-F 항원 단백질, RSV-preF 항원 단백질 및 RSV-G 항원 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 VLP 제조용 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 VLP를 발현시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 발현 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다. 본 발명에서 발현 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1ac(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GALccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 상기 VLP를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 VLP를 코딩하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 VLP를 코딩하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.
한편, 상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 숙주 세포는 바이러스에 의해 감염될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 상기 숙주 세포는 형질전환에 의해 대사 조작될 수 있다. 상기 숙주 세포는 미생물, 동물 세포, 식물 세포, 동물에서 유래한 배양 세포, 또는 식물에서 유래한 배양 세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 숙주 세포는 공학적 방법에 의해 형질전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며 바람직하게는 곤충 세포일 수 있다. 상기 곤충 세포는 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발되거나 시판되는 모든 세포가 사용될 수 있으며, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 곤충 세포(Spodoptera frugiperda) SF21, SF9, 트리코플루시아니(Trichoplusiani), 안티카르사 겜미탈리스 (Anticarsa gemmitalis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae), 만두카 섹스타 (Manduca sexta), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 목적하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다. 상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름 (metabolic flux)의 최적화를 더 포함할 수 있다.
생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.
따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 숙주 세포는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다. 예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다. 상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포 내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다. 상기 "변형된 숙주 세포(modified host cell)"는 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하도록 유전적으로 설계된 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형된 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 부모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다. 한편, 상기 “형질전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질전환하고자 하는 세포가 원핵 세포인 경우에는, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
형질전환하고자 하는 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질 감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질전환에 의해 상기 VLP를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 본 발명의 VLP 단백질을 수득할 수 있다. 이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.
표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다. 계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다. 예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV-F VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV-preF VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 RSV-G VLP 제조공정을 단계별로 나타낸 도면이다.
이하, 상기 도면을 참고로 하여 본 발명의 일 구현예에 따른 VLP 제조공정을 설명하기로 한다.
RSV-F 항원의 유전자는 RSV 감염된 Hep2 세포로부터 RNA를 수득한 뒤, 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 RSV-F 유전자를 증폭한다(도 1의 ①). 이렇게 얻어진 RSV-F 유전자를 pFastBac 벡터에 삽입하여 dh5a 세포에 클로닝하고(도 1의 ②), 이후에 얻어진 유전자를 dh10bac 벡터에 다시 클로닝한다(도 1의 ③). 클로닝된 dh10bac 벡터의 유전자를 곤충 세포인 sf9 세포에 삽입하여 목적하는 유전자 RSV-F 항원 단백질을 수득하며, RSV-F 항원 단백질의 유전자는 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하게 된다(도 1의 ④).
한편, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 유전자는 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에 형질감염시킨 뒤, 세포를 분쇄하여 바이러스를 수득하고 얻어진 RNA를 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 얻는다.
그런 다음, M1을 함유하는 pFastBac 형질전환체를 SF9 세포 내로 형질 감염시켜 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 제조한다.
그런 다음 RSV-F VLP를 생성하기 위하여, Sf9 곤충 세포를 RSV-F 및 M1을 발현하는 재조합 rBV로 공동-감염시킨다(도 1의 ⑤). Sf9 세포 배양 상청액을 감염 후 수확한 다음 원심분리 및 정제하여 RSV-F VLP를 얻을 수 있다(도 1의 ⑥).
RSV-pre F 항원의 유전자는 도 2에서 보듯이, RSV-pre F 유전자를 증폭하는 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 상기 RSV-F 항원의 유전자를 제조하는 방법과 동일한 공정으로 제조될 수 있다.
또한, RSV-G 항원의 유전자는 도 3에서 보듯이, RSV-G 유전자를 증폭하는 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 상기 RSV-F 항원의 유전자를 제조하는 방법과 동일한 공정으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 RSV 검출 키트는 RSV-F VLP, RSV-preF VLP 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 포함한다.
상기 RSV 검출 키트에 포함되는 RSV-F VLP, RSV-preF VLP 및 RSV-G VLP, 및 그 제조 방법에 대해서는 상기한 RSV 검출 방법에서 상세히 기술한 바와 같다.
상기 RSV 검출 키트의 검사 시료는 RSV에 감염되었는지 여부를 검사하는 대상 개체의 혈청일 수 있다. 상기 혈청은 5 ~ 100배로 희석하는 것이 바람직하고, 35 ~ 45배로 희석하는 것이 더욱 바람직하고 40배로 희석하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 RSV 검출 키트는 2차 항체를 포함할 수 있다.
이러한 RSV 검출 키트는 RSV VLP 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
제조예 1: RSV-F VLP의 제조
인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 유전자는 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에 형질감염시킨 뒤, 세포를 분쇄하여 바이러스를 수득하고 얻어진 RNA를 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 얻었으며, RSV-F 항원의 유전자는 RSV 감염된 Hep2 세포로부터 RNA를 수득한 뒤, 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 얻었다. 이들 얻어진 유전자를 pFastBac 벡터에 삽입하여 dh5a 세포에 클로닝하였으며, 이후에 얻어진 유전자를 dh10bac 벡터에 다시 클로닝하였다. dh10bac 벡터의 유전자를 곤충 세포인 sf9 세포에 삽입하여 목적하는 유전자 항원의 단백질을 수득하였다. RSV-F 항원 단백질의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAA GAATTC ACCATGGAGGAGTTGCTAATCCTCAA-3'(서열번호 5)) 및 역방향 프라이머(5'-TTA CTCGAG TTAGTTACTAAATGCAATATTATT-3'(서열번호 6))를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다.
인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 유전자는 정방향 프라이머(5'- AAAGGATCCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3'(서열번호 7)) 및 역방향 프라이머(5'-TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3'(서열번호 8))를 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.
상기 각 유전자는 제한 효소 부위 (Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입되었으며, Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 RSV-F 항원 단백질 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다. 도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(RSV-F, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다.
그 후, M1을 함유하는 pFastBac 형질전환체를 cellfectin II(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 SF9 세포 내로 형질 감염시켰다.
Bac-to-Bac 발현 시스템(Invitrogen)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 RSV-F 및 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBVs)를 제조하였다.
RSV-F VLP를 생성하기 위하여, Sf9 곤충 세포를 RSV-F 및 M1을 발현하는 재조합 rBV로 공동-감염시켰다. Sf9 세포 배양 상청액을 감염 후 3일째에 수확하고, 이어서 6000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 30,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 펠렛화시켰다. VLP는 수크로오스 구배를 통해 정제되었다. VLP 펠렛은 사용시까지 인산염-완충 식염수(PBS)에서 재현탁시켰다. RSV-F 및 M1 단백질은 웨스턴블롯 및 투과 전자현미경(TEM)(Tecnai G2 spirit, FEI, Hillsboro, OR, USA)에 의해 특성화되었다. 50 및 10 μg의 RSV-F VLP를 SDS-PAGE를 위해 로딩하고 웨스턴블롯으로 시각화하였다. 웨스턴블롯에 의해 RSV-F 및 M1 단백질을 검출하기 위하여, 인플루엔자 바이러스 항-M1 단클론 항체 (Abcam, Cambridge, UK) 또는 RSV-F-특이적 다클론 항체를 사용하였다. RSV-F-특이적 다클론 항체는 RSV에 감염된 마우스로부터 수득하였다. 간단하게, 안와정맥총 천자(retro-orbital plexus puncture)를 통해 마우스로부터 채취한 말초 혈액을 7000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하고, 결과물인 다클론 항체를 사용시까지 -20 ℃에서 보관하였다. VLP의 형태(morphology)는 TEM 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, RSV-F 단백질 및 M1을 함유하는 RSV-F VLP가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다.
제조예 2: RSV-pre F VLP의 제조
RSV-F 대신 RSV-preF 유전자를 벡터에 도입하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 RSV-pre F VLP를 제조하였다. 단, RSV-pre F의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAA TTAAGC TATTGGAGGAGGTTCTAATCGGTCAA-3'(서열번호 9)) 및 역방향 프라이머(5'-TTA CTGATT TAGGATTAATGCAATATATTTCGA-3'(서열번호 10))를 이용하여 증폭하였으며, 제한 효소 부위 (BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입하여 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 RSV-pre F 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다. 도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(RSV-pre F, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다. 웨스턴블롯 및 TEM 분석 결과, RSV-pre F 단백질 및 M1을 함유하는 RSV-pre F VLP가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다.
제조예 3: RSV-G VLP의 제조
RSV-F 대신 RSV-G 유전자를 벡터에 도입하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 RSV-G VLP를 얻었다. 단, RSV-G의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAA GAATTC ACCATGTCCAAAAACAAGGACCAAC-3'(서열번호 11)) 및 역방향 프라이머(5'-TTA CTCGAG TACTGGCGTGGTGTGTTG-3'(서열번호 12))를 이용하여 증폭하였으며, 제한 효소 부위 (BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입하여 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 RSV-G 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다. 도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(RSV-G:, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다. 웨스턴블롯 및 TEM 분석 결과, RSV-G 단백질 및 M1을 함유하는 RSV-G VLP가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다.
실험예: ELSIA법에 의한 RSV 검출 방법
도 3은 본 실험예의 공정을 단계별로 개략적으로 나타낸 도면이다.
7 주령의 BALB/c 암컷 마우스를 KOATECH (Pyeongtaek, Korea)으로부터 구입하여 동물모델로서 사용하였다. 확실한 양성 혈청을 수득하기 위하여, RSV A2 균주 2.4 x 107 PFU를 4주 간격으로 2번 비강감염시켰다. 2차 감염 4주 후 감염된 마우스로부터 안와채혈하였으며, 수득한 피를 상온에 30분 방치 후 6,000 rpm, 10분 원심분리하여 혈청을 수득하였다.
RSV 코팅 항원은 상기 실시예 1 내지 3에서 얻은 RSV-F VLP, RSV-pre F VLP, RSV-G VLP를 코팅 완충액으로 하여 5ug/ml로 만들고, 100 ul/웰로 96 웰 플레이트에 분주하였다. 이 플레이트를 랩에 싸서 4℃에서 하룻밤 또는 37℃에서 2 시간동안 반응시켰다. 반응시킨 96 웰 플레이트를 꺼내 PBST로 2번 정도 세척하였다. 0.2% 젤라틴을 200ul/웰로 첨가하고 37℃ 인큐베이터에서 1 시간 30 분 내지 2 시간동안 반응시켰다.
대조군으로는 정상대조군(na
Figure pat00005
ve)과 양성 대조군(positive control)을 사용하였다. 양성 대조군은 기생충, 톡소, 바이러스를 2, 3번 접종하여 뽑은 샘플을 남은 시간 동안 냉장 보관하고 시간에 맞춰 실험하였다.
한편, 상기 채취한 마우스 혈청을 연속 희석시키고 (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400), 100㎕의 각 희석물을 배양 전에 37℃에서 1 시간 동안 각 ELISA 플레이트 웰에 첨가하였다.
그 후, 100㎕의 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 2차 항체 (PBST에서 1:2000으로 희석된 IgG, IgG1a, IgG1b, IgG2, IgA, IgM)를 100 ul/웰씩 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 1 시간 30분 내지 2시간동안 배양하였다. ELISA 판독기 (EZ Read 400, Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 450 nm 또는 492 nm에서의 흡광도(OD)를 측정하였다.
RSV-F VLP의 민감도 확인
RSV 항원, RSV-F VLP, RSV-F 단백질을 각각 4ug/ml의 농도로 96 웰 면역플레이트(immunoplate)에 코팅하여, RSV A2 4x106 PFU 감염 마우스 혈청 14개를 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다. 도 5는 마우스 혈청에 대한 RSV-F VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 3가지의 코팅한 항원 중에서 RSV-F VLP 항원에서 RSV 특이적 IgG 항체가 높게 측정되었다. (*** P < 0.001)
RSV-pre F VLP의 민감도 확인
RSV 항원, RSV-pre F VLP, RSV-pre F 단백질을 각각 4ug/ml 의 농도로 96 웰well 면역 플레이트에 코팅하여, RSV A2 4x106 PFU 감염 마우스 혈청 14개를 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다. 도 6은 마우스 혈청에 대한 RSV-preF VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 3가지의 코팅한 항원 중에서 RSV pre-F VLPs 항원에서 RSV 특이적 IgG 항체가 높게 측정되었음. (*** P < 0.001)
RSV-G VLP의 민감도 확인
RSV 항원, RSV-G VLP, RSV-G 단백질을 각각 4ug/ml의 농도로 96 웰 면역플레이트에 코팅하여, RSV A2 4x106 PFU 감염 마우스 혈청 14개를 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다. 도 7은 마우스 혈청에 대한 RSV-G VLP의 IgG 항체의 민감도를 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 3가지의 코팅한 항원 중에서 RSV-G VLP 항원에서 RSV 특이적 IgG 항체가 높게 측정되었다. (*** P < 0.001)
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Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-F protein <400> 2 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ile Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Val Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 3 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-preF protein <400> 3 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn Lys Ala Lys Lys Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 4 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-G protein <400> 4 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln 290 295 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-F forward primer <400> 5 aaagaattca ccatggagga gttgctaatc ctcaa 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-F reverse primer <400> 6 ttactcgagt tagttactaa atgcaatatt att 33 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 forward primer <400> 7 aaaggatcca ccatgagtct tctaaccgag gt 32 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 reverse primer <400> 8 ttactcgagt tactctagct ctatgttgac 30 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-pre F forward primer <400> 9 aaattaagct attggaggag gttctaatcg gtcaa 35 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-pre F reverse primer <400> 10 ttactgattt aggattaatg caatatattt cga 33 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-G forward primer <400> 11 aaagaattca ccatgtccaa aaacaaggac caac 34 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSV-G reverse primer <400> 12 ttactcgagt actggcgtgg tgtgttg 27

Claims (11)

  1. RSV-F VLP, RSV-preF VLP, 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 시료내에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 검출하는 단계를 포함하는 RSV 검출방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분 석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 RSV 검출 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 시료는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 감염된 개체의 혈청인 것인 RSV 검출 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 RSV-F VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-F 항원 단백질을 포함하는 것인 RSV 검출 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 RSV-preF VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-preF 항원 단백질을 포함하는 것인 RSV 검출 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 RSV-G VLP는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 및 RSV-G 항원 단백질을 포함하는 것인 RSV 검출 방법.
  7. 청구항 4 내지 6중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 하기 서열번호 1을 갖는 것인 및 RSV 검출 방법:
    <서열번호 1>
    Figure pat00006
  8. 청구항 4에 있어서,
    상기 RSV-F 단백질은 하기 서열번호 2를 갖는 것인 RSV 검출 방법:
    <서열번호 2>
    Figure pat00007
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 RSV-preF 단백질은 하기 서열번호 3을 갖는 것인 RSV 검출 방법:
    <서열번호 3>
    Figure pat00008
  10. 청구항 6에 있어서,
    상기 RSV-G 단백질은 하기 서열번호 4를 갖는 것인 RSV 검출 방법:
    <서열번호 4>
    Figure pat00009
  11. RSV-F VLP, RSV-preF VLP 및 RSV-G VLP 중에서 선택된 1종 이상의 VLP를 포함하는 RSV 검출 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116676428A (zh) * 2023-07-27 2023-09-01 广东省林业科学研究院 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的荧光定量pcr引物及方法

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