KR101862137B1

KR101862137B1 - 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101862137B1
Application number: KR1020160176967A
Authority: KR
Inventors: 전복실; 김아라
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2018-05-31

Abstract

본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자에 관한 것으로, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자를 제공한다.

Description

호흡기 세포융합 바이러스 유사입자, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법{RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS-LIKE PARTICLE, EXPRESSION VECTOR AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 구조 단백질로서 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV)는 파라믹소바이러스(paramyxovirus)의 패밀리에 속하는 감기 바이러스이다.

호흡기 세포융합 바이러스는 독성이 높고 쉽게 전파될 수 있으며, 2세 미만의 아동에서 하기도 감염의 가장 흔한 원인이다. 미국에서 해마다 RSV 감염에 의한 약 90,000건의 병원 입원 및 4,500건 사망이 보고된 바 있다.

호흡기 세포융합 바이러스는 감염된 사람 또는 오염된 개체와 호흡기 비말(respiratory droplet) 및 밀접한 접촉에 의해 확산된다.

유아는 첫 6개월에 심각한 RSV 질병의 위험에 노출되어 있으며, 입원은 2-3개월령에 최고조에 있다. 조산 및 심폐 질병은 심각한 RSV 질병에 대한 위험 요소이다.

유아의 RSV 감염은 대부분의 다른 호흡기 바이러스에 대한 면역에 비해 부분적인 보호 면역을 유도한다.

첫해 RSV에 감염된 대부분의 환자는 크게 치명적이지 않음에도 불구하고, 재감염은 주로 상기도 증상(upper respiratory tract symptoms)과 함께 평생 지속되기도 한다.

RSV 세기관지염(bronchiolitis) 에 대한 치료는 주로 호흡기 지원(respiratory support) 및 수화(hydration)로 이루어진다. 특이적인 항 바이러스 요법은 추천되지 않는다. 중성화 단일클론 항체 팔리비주맙(Palivizumab)은 심각한 감염에 대하여 위험성이 높은 유아의 예방을 위하여 사용되나 보편적인 사용에 있어서 과도하게 비싸고 비실용적이다.

1960년대에 백신 실험에서 유아 및 어린이는 포르말린-비활성화된 전체 비리온 RSV 제조(FIRSV) 또는 동등한 파라믹소바이러스(paramyxovirus) 제조(FIPIV)로 면역화된 바 있다.

FI-PIV로 면역화되고 다음 RSV 시즌에 RSV에 의해 감염된 사람들의 5%가 입원하였다. FI-RSV로 면역화된 후 RSV로 감염된 환자의 80%는 입원하였고, 2명의 어린이가 사망하였다. 백신 접종에 의한 RSV 감염의 증진은 RSV 백신의 개발에 있어 특이적인 문제이다(Curr Opin Virol. 2013 Jun; 3(3):332-42.).

RSV의 위험성에도 불구하고, RSV에 대한 효과적인 치료 방법이나 백신은 아직까지 개발되지 아니하였으며, 이를 해결하기 위한 다양한 노력이 이루어지고 있다.

한편, 실제 바이러스 구조와 형태학적으로 유사한 바이러스 유사입자(이하, 'VLP'라 함)는 여러 바이러스에 대한 백신 항원으로 제안되어 왔다(Roldao A, Mellado MC, Castilho LR, Carrondo MJ, Alves PM: Expert review of vaccines 2010, 9:1149-1176;Kang SM, Kim MC, Compans RW: Expert review of vaccines 2012, 11:995-1007;Kushnir N, Streatfield SJ, Yusibov V: Vaccine 2012, 31:58-83).

바이러스 유사입자는 면역원 조성물에 사용하기 위한 항원으로서 최근 많은 주목을 받고 있다. 바이러스 유사입자는 야생형 바이러스와 유사한 형태로서, 하나 이상의 표면 단백질을 함유하여 체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 바이러스 유사입자는 야생형 바이러스와 달리 유전물질이 결여되어 있으므로 면역 체계를 활성화시킬 수 있음에도 불구하고 비감염성이므로 매우 안전하다.

본 발명자들은 호흡기 세포융합 바이러스에 직접적으로 작용하는 종래의 치료제와는 달리 체내 면역 반응을 유도하여 안전하고 내성의 문제가 없으며 RSV 감염에 대한 예방 및 치료 효과가 우수한 신규한 형태의 바이러스 유사입자를 개발하고자 하였다.

본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 신규한 형태의 바이러스 유사입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1); 및 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위;를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV) 유사입자가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 항원 결정 부위는 상기 호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역의 펩타이드일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 항원 결정 부위가 2회 이상 반복 연결될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 암호화하는 핵산 서열; 및 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위를 암호화하는 핵산 서열;을 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자 제조용 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스 유사입자를 발현시키는 단계;를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 따르면, 상기 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자는 전통적인 백신과 달리 원인 감염체 없이 개발할 수 있으며, 비선택적인 항체 생성을 유도하지 않는다.

또한, 상기 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자는 체내 면역 체계를 활성화시켜 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 예방 및 치료 효과를 제공할 수 있으므로, 내성을 유발하지 않고 생체 안전성이 높다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 유사입자를 묘사한 것이다. (A)는 바이러스 유사입자를 도식화한 것이다. (B)는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 유사입자를 전자현미경으로 관찰한 것이다. (C)는 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 것이다. SDS-PAGE를 위해 40μg, 10μg, 4μg의 바이러스 유사입자를 각각 로딩하였으며, 프로브(probe)로서 항-호흡기 세포융합 바이러스 다클론 항체 및 항-M1 단일클론 항체를 사용하였다.
도 2는 면역 반응 유도 및 감염(challenge infection)에 따른 기억 B 세포의 생성 정도를 비교한 것이다.
도 3은 면역 반응 유도 및 감염(challenge infection)에 따른 백혈구 수치의 변화를 비교한 것이다.
도 4는 면역 반응 유도 및 감염(challenge infection)에 따른 체내 RSV의 농도를 비교한 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

본 발명의 일 측면은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1) 및 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus) 바이러스 유사입자를 제공한다.

상기 “바이러스 유사입자(Virus-Like Particle, VLP)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스 유사 입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여되어 있거나, 바이러스성 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자는 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수도 있다.

특히, 상기 바이러스 유사입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 인플루엔자 바이러스 유래의 매트릭스 단백질 1(M1)을 구조 단백질로서 포함할 수 있다. 상기 바이러스 유사입자는 별도의 원인 감염체, 즉 호흡기 세포융합 바이러스 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 생산성 및 경제성이 우수하다.

상기 “인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1”은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질단백질(matrix protein)을 의미한다. 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C로 명명된 서브타입으로 구성된다. 상기 인플루엔자 바이러스는 코어와 바이러스 외피 간의 연결체로 작용하는 매트릭스 단백질 1(M1)의 층으로 둘러 쌓여 외형을 이루며, 상기 매트릭스 단백질 1은 인플루엔자 바이러스 유사입자의 개발에 있어서 구조 단백질로서 널리 사용된다.

상기 바이러스 유사입자는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 구조 단백질로서 포함할 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1 표면에는 호흡기 세포융합 바이러스에서 유래한 항원 결정 부위를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 바이러스 유사입자는 표면에 호흡기 세포융합 바이러스에서 유래한 항원 결정 부위를 포함하고 있으므로 특정 개체에 유입되었을 때 호흡기 세포융합 바이러스에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 상기 바이러스 유사입자는 상기 개체에게 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 면역력을 부여할 수 있다.

상기 바이러스 유사입자는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스 유사 입자는 상기 구조 단백질 및 항원 인식 부위를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질 전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상층액으로 배출될 수 있다. 이 때, 상기 바이러스 유사입자에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있으므로 개체 내에서 특정 바이러스에 대한 목적하는 면역반응을 유도할 수 있다.

상기 바이러스 유사입자는 개체 내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원 표지 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지할 수 있다. 상기 바이러스 유사입자는 호흡기 세포융합 바이러스에서 유래한 항원 결정 부위를 포함하고 있으나 그 외에 유전 물질은 포함하지 않으므로 증식이 불가능하고 독성이 없어 안전하므로 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 상기 바이러스 유사입자의 표면에 도입된 항원 결정 부위는 순수하게 분리된 재조합 단백질에 비해 높은 항원성을 가지며 효과적인 중화항체를 형성할 수 있다.

상기 “항원 결정 부위(epitope)”는 각각의 항체 또는 T 세포 수용체에 의한 인식의 기본 요소 또는 최소 단위이며, 상기 항체 또는 T 세포 수용체가 결합하는 특정 도메인, 영역 또는 분자 구조를 의미한다. 상기 항원 결정 부위는 호흡기 세포융합 바이러스에서 유래할 수 있으며, 상기 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 면역 활성을 유도할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다.

상기 항원 결정 부위는 호흡기 세포융합 바이러스에서 유래한 막 관통 표면 단백질인 G 단백질 또는 F 단백질일 수 있고, 바람직하게는 G 단백질 일 수 있다.

상기 “G 단백질”은 글리코실화(glycosylation)되고 부착 단백질로서 기능하는 표면 단백질이다. 상기 G 단백질은 F 단백질과 대조적으로, RSV A2 균주의 G 단백질의 아미노산 잔기 153 내지 184, 또는 다른 균주에서의 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 중심 보존 도메인(CCD)을 제외하고, 균주들에 걸쳐 가변적이다. 중심 보존 도메인 및 인접 영역은 강성이며 O-글리코실화된 뮤신-유사 영역에 의해 결합된다. 중심 보존 도메인의 N-말단 절반은 700개 초과의 균주 간에 보존되는 작은 영역을 포함한다. C-말단 절반은 1-4, 2-3 토폴로지에서 연결된 4개의 보존된 시스테인을 함유하며, 시스틴 누스(cystine noose)로 접힌다.

상기 G 단백질에 대해 유도된 항체를 사용하는 수동면역이 일반적으로 균주들 간의 서열 보존의 결여로 인하여 실행 가능하지 않은 것으로 보고된 바 있으며, RSV G 단백질에 결합하는 중화 모노클로날 항체가 알려져 있다.

상기 F 및 G 단백질과 모노클로날 항체의 혼합물의 중화 능력이 보고된 바 있으며(J. Virol. (1988) 62: 4232-4238), 그 중 하나는 RSV G 단백질(131-2G)에 결합한다. 상기 항체의 항원 부위는 선행 문헌에서 정의된 바 있다(Virol. (1995) 209: 70-79).

상기 항체는 RSV의 주요 균주를 나타내는 RSV 그룹 A 및 B 둘 모두에 결합하는 것으로 관찰되었다. 또한, RSV A2의 G 단백질 내의 보존된 모티프와 면역 반응성이며, RSV A 및 B 하위유형에 대하여 중화 활성을 갖는 항체, 예를 들어, 3D3 및 3G12가 개시된 바 있다(WO 2009/055711). 상기 항체는 중심 보존 도메인 내의 선형 에피토프를 인식하는 것으로 확인되었으나, In vivo 상 항체 유도 효과가 직접적으로 시험되지 않았다.

본 발명자들은 면역 반응을 효과적으로 유도하는 항원 결정 부위로서 상기 G 단백질의 일부 아미노산 영역을 선별하였으며, 상기 아미노산 영역의 펩타이드에 의한 효율적인 항체 유도 효과를 확인 하였다.

상기 호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질의 서열정보는 미국국립생물정보센터(ncbi)에서 확인 가능하며, 예컨대 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 항원 결정 부위는 상기 호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역의 펩타이드일 수 있고, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명자들은 상기 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역을 핵심 탠덤 부위로서 선별하였으며, 상기 펩타이드를 반복 연결시킴으로써 항체 유도 효과가 현저히 증대될 수 있음을 확인하였다. 이 때, 상기 핵심 탠덤은 소정의 링커(Linker) 서열에 의해 반복 연결될 수 있다.

상기 G 단백질 핵심 탠덤은 구조적 특성에 의해 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체의 생성을 효과적으로 유도하므로, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1과 융합된 형태로서 개체 내에 유입될 때 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 높은 수준의 면역성을 제공할 수 있다.

상기 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위 또는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 단백질에 대한 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1의 구조적, 기능적 상동성으로 인해 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스 유사입자로서의 활성을 의미한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 상기 바이러스 유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2 보조제를 더 포함할 수도 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 “의학적으로 허용 가능한 담체”는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제가 함께 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등이 함께 사용될 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 잇다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 사용될 수 있다. 비수용성제제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 암호화하는 핵산 서열 및 호흡기 세포융합 바이러스 유래의 항원 결정 부위를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자 제조용 발현 벡터가 제공된다.

상기 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.

상기 발현 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1a-c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPink^TM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.

상기 바이러스 유사입자를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 바이러스 유사입자를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

한편, 상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포(host cell)는 바이러스에 의해 감염될 수 있고 바이러스 유사 입자에 의해 면역될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다.

이 때, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

상기 숙주 세포는 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며 바람직하게는 곤충 세포일 수 있다. 상기 곤충 세포는 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발되거나 시판되는 모든 세포가 사용될 수 있으며, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 곤충세포(Spodoptera frugiperda) SF21, SF9, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 안티카르사 겜미탈리스(Anticarsa gemmitalis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae), 만두카 섹스타(Manduca sexta), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.

상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.

따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 숙주 세포는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.

예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포 내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다. 상기 "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.

한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스 유사입자를 발현시키는 단계;를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자의 제조 방법을 제공한다.

상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 바이러스 유사입자 단백질을 수득할 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 제조할 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O₂, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예컨대, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적절히 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 1 : 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자 제조 준비

호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질(서열번호 3)의 1 내지 260번째 아미노산 영역을 암호화하는 제1 핵심 탠덤은 정방향 프라이머(5'-AAAGAATTCATGTCCAAAAACAAGGACCAAC-3') 및 역방향 프라이머(5'-TTAGTCGACGGCGGCTGTGAGTTCTGGATTTCC-3')를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다.

또한, 호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질(서열번호 3)의 150 내지 260번째 아미노산 영역을 암호화하는 제2 핵심 탠덤은 정방향 프라이머(5'-AAAGTCGACGGCGGCCAACGCCAAAACAAACCA-3') 및 역방향 프라이머(5'-TTATCTAGAGGCGGCTGTGAGTTCTGGATTTCC-3')를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였으며, 상기 핵심 탠덤 서열을 4X Gly linker로 연결하여 반복 구성하였다.

인플루엔자 매트릭스 단백질 1(M1) 유전자는 정방향 프라이머(5'- AAAGAATTCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3') 및 역방향 프라이머(5'- TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3')를 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.

상기 증폭된 각 유전자는 pFastBac 벡터에 도입하였으며, 제한 효소로 커팅하여 상기 핵산 서열의 도입 여부를 확인하였다. 도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA 염기서열결정 결정법(Eurofins MWG Operon)에 의해 확인되었다.

G 단백질 핵심 탠덤 및 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBVs)를 제조하기 위한 DNA 형질 감염은 cellfectin Ⅱ(Invitrogen) 및 SF9 세포에 의해 이루어졌으며, G 단백질 및 M1을 포함하는 pFastBac 벡터를 이용한 형질 전환은 white/blue 스크리닝에 의해 수행되었다. 바큘로바이러스는 Bac-to-Bac 발현 시스템(Invitrogen)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 제조되었다.

제조예 2 : 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자 제조 및 확인

호흡기 세포융합 바이러스 유사입자는 G 단백질 핵심 탠덤 및 M1을 발현하는 재조합 rBVs에 의해 공동-감염된 SF9 곤충 세포에서 생산하였다.

G 단백질 핵심 탠덤을 1회 반복 연결한 펩타이드를 발현하는 바이러스 유사입자를 V5로 명명하였으며, 반복 연결하지 않은 핵심 탠덤을 포함하는 바이러스 유사입자를 V1으로 명명하였다.

감염 3일차에 세포 배양 상청액을 분리하였으며, 30분간 원심분리(6000rpm, 4℃)하여 세포를 제거하였다. 상청액 내의 바이러스 유사입자는 고속원심분리(30분, 45,000ⅹg)에 의해 펠렛화 되었다.

펠렛화된 침전물은 4℃에서 인산완충식염수(PBS)에 하룻밤 동안 재현탁 되었고, 불연속 수크로오스 구배(20-30-60%)를 통해 4℃, 45,000ⅹg 에서 1시간 동안 수확되고 정제되었다. 단백질 농도는 QuantiPro BCA Assay Kit(Sigma-Aldrich)에 의해 결정되었다.

바이러스 유사입자는 웨스턴 블랏 및 전자현미경법에 의해 확인되었다. 웨스턴 블랏 분석에서, 항체는 호흡기 세포융합 바이러스 RSV A2 균주에 의해 감염된 마우스에서 수집되었다. M1 단백질의 함량은 항-M1 항체에 의해 결정되었다. 전자현미경법 및 사이즈 측정을 위해, 바이러스 유사입자는 매질 염색되었으며, 투과전자현미경(TEM)에 의해 관찰되었다.

바이러스 유사입자를 생산하는 SF9 세포는 대조군인 정상 세포보다 큰 것으로 확인되었다. 전자현미경에 의해 바이러스 유사입자의 크기 및 형태는 표면에 핵심 탠덤 반복 부위를 포함하는 비정형의 구형태로 관찰되었다(도 1B).

G 단백질 핵심 탠덤 및 M1의 바이러스 유사입자로 도입되었는지 확인하기 위하여, 항-선모충 다클론 항체 및 항-M1 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 1C).

결과적으로 G 단백질 핵심 탠덤 및 M1을 발현하는 rBVs 에 의해 감염된 SF9 세포는 비리온과 형태 및 크기가 유사한 입자를 생성하는 것으로 확인되었다.

실험예 1 : 동물모델에서의 면역 유도 반응 시험

제조예 2의 바이러스 유사입자를 생쥐에 접종 후 유도되는 면역 반응을 확인하였다.

상기 바이러스 유사입자 백신 접종(Intranasal route) 후 생쥐로부터 정해진 시기에 혈액을 수집하였다. 상기 바이러스 유사입자 접종 후 세포융합 바이러스 A2를 감염시킨 쥐를 4일 후 희생시켰다.

희생된 쥐의 비장에서 세포를 분리하여 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 면역반응을 확인하였다.

세포융합 바이러스 A2(RSV)에 의한 감염 후 비장 세포에서 기억 B 세포(Memory B cell)를 분석한 결과, 상기 바이러스 유사입자 접종에 따라 기억 B 세포가 증가하였다(도 2).

특히, 상기 바이러스 유사입자(V1)와 비교하여 핵심 탠덤을 1회 반복한 바이러스 유사입자(V5)가 접종된 실험군에서 면역 반응이 현저히 높은 수준으로 측정되었다.

상기 결과는 상기 바이러스 유사입자가 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 높은 면역성을 제공하고, 생체 내에서 항체 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 시사한다.

실험예 2 : 방어적 면역 효과 시험

제조예 2의 바이러스 유사입자를 생쥐에 접종한 후 유도되는 방어적 면역 효과를 확인하였다.

상기 바이러스 유사입자 접종 후 호흡기 세포융합 바이러스 A2를 감염시킨 쥐의 폐에서 H&E 염색을 통해 백혈구 수치(eosinophil score)를 측정하였다. 상기 바이러스 유사입자를 접종한 실험 군에서 백혈구 수치가 낮은 수준으로 측정되었으며, 특히 핵심 탠덤을 1회 반복한 바이러스 유사입자(V5) 접종군의 백혈구 수치는 핵심 탠덤을 반복시키지 않은 바이러스 유사입자(V1) 및 FI-RSV 접종군과 비교하여 낮은 수준이었다(도 3A).

한편, 감염 후 희생시킨 쥐의 폐 세포를 분리하여 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 백혈구를 분석한 결과, 핵심 탠덤을 1회 반복한 바이러스 유사입자(V5) 접종군에서 백혈구 수치가 가장 낮은 것으로 분석되었다(도 3B).

또한, 상기 희생시킨 쥐를 희생시킨 후 폐의 바이러스 농도(titer)를 측정한 결과 바이러스 유사입자 접종군에서 바이러스 농도가 낮은 수준으로 측정되었으며, 핵심 탠덤을 1회 반복한 바이러스 유사입자(V5) 접종군에서 바이러스가 현저히 낮은 수준으로 측정되었다(도 4).

상기 결과는 상기 바이러스 유사입자가 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 방어적 면역 효과를 유도할 수 있으며, 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 백신으로 사용될 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KYUNG HEE UNIVERSITY <120> A RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS-LIKE PARTICLE, EXPRESSION VECTOR AND METHOD FOR PREPARING THE SAME <130> 16PP11844 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human respiratory syncytial virus G PROTEIN(150-260aa) <400> 1 Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe 1 5 10 15 Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr 20 25 30 Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys 35 40 45 Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr Thr Lys Lys 50 55 60 Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu Ala Pro Thr Thr Lys 65 70 75 80 Pro Thr Glu Glu Arg Thr Ile Asn Thr Thr Lys Thr Asn Ile Ile Thr 85 90 95 Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro Glu Leu Thr Ser 100 105 110 <210> 2 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus matrix protein M1 <400> 2 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human respiratory syncytial virus G protein <400> 3 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Ala Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Arg Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Glu Leu Thr Ser 260

Claims

인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein; M1); 및
호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역의 펩타이드로서 서열번호 1의 펩타이드;를 포함하되,
상기 서열번호 1의 펩타이드가 1회 반복 연결된 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV) 유사입자.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 바이러스 유사입자.
제1항 또는 제4항의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 암호화하는 핵산 서열; 및
호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질의 150 내지 260번째 아미노산 영역의 펩타이드로서 서열번호 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;을 포함하되,
상기 서열번호 1의 펩타이드가 1회 반복 연결된 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자 제조용 발현 벡터.
삭제
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제6항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
제9항에 있어서,
미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인 숙주 세포.
제6항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및
상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스 유사입자를 발현시키는 단계;를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 유사입자의 제조 방법.