KR102165100B1 - 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질을 발현하는 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질 4 및 곤봉체 단백질 13 중 적어도 하나를 포함하는 표면 항원 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질을 발현하는 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물 {VIRUS-LIKE PARTICLES EXPRESSING TOXOPLASMA GONDII RHOPTRY PROTEIN, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISIMG THE SAME}

본 발명은 바이러스-유사 입자(virus-like particles; VLP)에 관한 것으로, 상세하게는 구조 단백질로서 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하고, 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질 4 및 곤봉체 단백질 13 중 적어도 하나를 포함하는 표면 항원 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 인간 및 온혈 동물에 톡소플라즈마증(toxoplasmosis)을 유발하는 원충기생충이다. 톡소포자충 감염증은 톡소포자충 난포낭(oocyst), 느린분열소체(bradyzoite) 및 빠른분열소체(tachyzoite)로 오염된 날고기 또는 물을 섭취함으로써 발생한다. 임산부가 톡소포자충에 감염된 경우, 톡소포자충의 영양형(trophozoite)은 태반을 거쳐 태아에게 감염될 수 있어, 초기의 태아는 유산 또는 사산에 이를 수 있으며, 중후기의 태아는 정상적 분만이 이루어지더라도 시력 손상, 수두증, 정신박약 등의 선천적 기형이 야기될 수 있다. 또한, 톡소포자충 감염증은 후천성 면역 결핍증(AIDS) 환자와 같은 면역력이 약화된 환자에서 톡소플라즈마 뇌염을 발생시키고 생존율을 떨어뜨린다. 전 세계 인구의 약 3분의 1이 톡소포자충에 감염된 것으로 나타났으며, 미국에서는 6세 이상 인구의 11%가 톡소포자충에 감염된 것으로 추산되고, 국내에서도 그룹에 따라 2 내지 25%의 감염율을 보이고 있는 것으로 보고된다.

톡소포자충 감염증은 보통 스피라마이신(spiramycin) 또는 피리메타민(pyrimethamine)을 단독으로 투여하거나, 말라리아의 예방약으로 개발된 피리메타민과 설파(sulfa)제를 병용 투여함으로써 치료한다. 그러나, 스피라마이신은 약효가 크지 않아 예방용으로 쓰이고 있으며, 피리메타민은 임신 중에는 치료 효과가 잘 나타나지 않는다. 또한, 피리메타민과 설파메톡사졸(sulfamethoxazole) 등의 설파제를 병용 투여시 골수 억제를 일으켜 혈소판 수를 감소시킬 수 있으며, 엽산의 병용 투여로 인해 알러지 반응, 신장 장애, 혈액 장애, 오심(惡心), 구토 등의 부작용을 유발할 수 있다. 더욱이, 현재 가장 널리 사용되는 항톡소포자충제인 피리메타민이나 설파디아진(sulfadiazine)은 톡소포자충의 내약성 증가로 인하여 치료 효과가 점차 감소하고 있어, 톡소포자충 감염증에 대한 효과적인 인간 백신이 개발되어 있지 않은 실정이다.

톡소포자충에 대한 DNA, 아단위 또는 단백질 백신이 연구된 바 있으나, 이들은 성공하지 못하였다. DNA 백신을 이용한 면역화는 낮은 면역원성을 보인 한편, 아쥬반트 IL-18을 포함하는 DNA 백신은 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하여 제한적인 보호를 유도할 수 있었다. 따라서, 톡소포자충 감염증에 대해 매우 효과적인 신규한 백신을 발견하는 것은 연구자들에게 여전히 큰 과제로 남아있으므로, 대안적인 방법을 사용하여 톡소포자충 감염증으로부터 개체를 보호할 수 있는 효과적인 백신의 개발이 필수적이다.

한편, 실제 바이러스 구조와 형태학적으로 유사한 바이러스-유사 입자는 여러 바이러스에 대한 백신 항원으로 제안되어 왔다(Roldao A, Mellado MC, Castilho LR, Carrondo MJ, Alves PM: Expert review of vaccines 2010, 9:1149-1176;Kang SM, Kim MC, Compans RW: Expert review of vaccines 2012, 11:995-1007;Kushnir N, Streatfield SJ, Yusibov V: Vaccine 2012, 31:58-83).

바이러스-유사 입자는 단백질 아단위(subunit) 백신에 비하여 면역원성이 높고 아쥬반트 없이도 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 것으로 잘 알려져 있어, 다양한 감염증의 보호에 기여할 수 있다. 바이러스-유사 입자는 야생형 바이러스와 유사한 형태를 가지며, 하나 이상의 표면 항원 단백질을 함유하여 체내 면역 반응을 유도할 수 있는 동시에, 야생형 바이러스와 달리 바이러스성 유전 물질이 결여되어 있으므로 체내 면역 체계를 활성화시킬 수 있음에도 비감염성이므로 안전성이 높다.

본 발명자들은 톡소포자충에 직접적으로 작용하는 종래의 치료제와는 달리 체내 면역 반응을 유도하여 안전하고 내성의 문제가 없으며 톡소포자충 감염증에 대한 예방 및 치료 효과가 우수한 신규한 형태의 바이러스-유사 입자를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 톡소포자충에 대한 체내 면역 반응을 유도할 수 있는 신규한 형태의 바이러스-유사 입자, 즉 구조 단백질로서 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하고, 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질 4 및 곤봉체 단백질 13 중 적어도 하나를 포함하는 표면 항원 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 바이러스-유사 입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein 1; M1); 및 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질 4(Rhoptry protein 4; ROP4) 및 곤봉체 단백질 13(Rhoptry protein 13; ROP13) 중 적어도 하나를 포함하는 표면 항원 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자가 제공된다.

일 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

일 실시양태에 있어서, 상기 표면 항원 단백질은 곤봉체 단백질 4(ROP4) 또는 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 포함하고, 상기 곤봉체 단백질 4(ROP4)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 곤봉체 단백질 13(ROP13)은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된다.

일 실시양태에 있어서, 상기 표면 항원 단백질은 곤봉체 단백질 4(ROP4) 및 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 포함하고, 상기 곤봉체 단백질 4(ROP4)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 곤봉체 단백질 13(ROP13)은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 바이러스-유사 입자를 유효 성분으로 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

일 실시양태에 있어서, 상기 약학적 조성물은 대상자에게 비강 내 투여된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 코딩하는 서열번호 4의 핵산 서열; 및 곤봉체 단백질 4(ROP4)를 코딩하는 서열번호 5의 핵산 서열 및 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 코딩하는 서열번호 6의 핵산 서열 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 바이러스-유사 입자 제조용 발현 벡터가 제공된다.

일 실시양태에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자 제조용 발현 벡터는 상기 곤봉체 단백질 4(ROP4)를 코딩하는 서열번호 5의 핵산 서열 및 상기 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 코딩하는 서열번호 6의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사 입자를 발현시키는 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 톡소포자충 감염에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고 마우스 체내 톡소포자충 낭포(cyst)의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 톡소포자충에 대하여 현저하게 높은 수준의 면역성을 제공할 수 있다.

본 발명의 톡소포자충으로부터 유래한 2 이상의 단백질을 동시 발현하는 바이러스-유사 입자는 특히 우수한 톡소포자충-특이적 항체 반응을 유도할 수 있고, 개체 내 항염증성 사이토카인의 생성을 촉진하여 염증 반응을 감소시키며, 또한 개체 내 톡소포자충 낭포의 크기 및 수를 현저히 감소시켜 개체의 생존율 및 체중 유지에 기여함으로써 상기 개체를 효과적으로 보호할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구 범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 M1 단백질과 함께 ROP4 및 ROP13 중 적어도 하나를 포함하는 VLP를 웨스턴블롯으로 분석한 결과 및 투과 전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다: (A) ROP4 VLP; (B) ROP13 VLP; (C) ROP(4+13) VLP.
도 2는 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 면역화 및 챌린지 감염 후 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응의 수준을 나타낸 것이다: (A) IgG; (B) IgG1; (C) IgG2a; (D) IgG2b; (E) IgA.
도 3은 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지 감염 후 점막 샘플 내 IgG 및 IgA 항체 반응의 수준을 나타낸 것이다: (A) 질 내 IgG; (B) 질 내 IgA; (C) 소변 내 IgG; (D) 소변 내 IgA; (E) 대변 내 IgG; (F) 대변 내 IgA; (G) 장 내 IgG; (H) 장 내 IgA.
도 4는 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지-감염 후 항체 분비 세포 반응 및 사이토카인 수준을 나타낸 것이다: (A) 비장 내 IgG 항체 분비 세포; (B) 비장 내 IgA 항체 분비 세포; (C) 비장 내 IFN-γ; (D) 비장 내 IL-6.
도 5는 챌린지 감염 후 30일 째의 마우스의 비장 및 MLN 세포 내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 및 배중심(germinal center) B 세포의 게이팅 전략을 나타낸 것이다: (A) 비장 세포 내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 게이팅 전략; (B) MLN 세포 내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 게이팅 전략; (C) 비장 세포 내 배중심 B 세포 게이팅 전략; (D) MLN 세포 내 배중심 B 세포 게이팅 전략.
도 6은 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지 감염 후 30일 째의 비장 및 MLN 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다: (A) 비장 및 MLN의 CD4⁺ T 세포 반응; (B) 비장 및 MLN의 CD8⁺ T 세포 반응; (C) 비장 및 MLN의 배중심 B 세포 반응.
도 7은 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지 감염 후 30일 째의 뇌 조직의 낭포 크기 및 낭포 수를 나타낸 것이다: (A) 낭포 크기; (B) 낭포 수.
도 8은 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지 감염 후 60일 동안 체중 및 생존율을 모니터닝한 결과를 나타낸 것이다: (A) 체중; (B) 생존율.
도 9는 대조군(Na

ve), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 프라임 면역화, 부스트 면역화, 챌린지 감염 후 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응의 수준을 나타낸 것이다: (A) IgG; (B) IgG1; (C) IgG2a; (D) IgA.
도 10은 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 챌린지 감염 후 대변 샘플 내 IgG 및 IgA 항체 반응의 수준을 나타낸 것이다: (A) 대변 내 IgG; (B) 대변 내 IgA.
도 11은 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 챌린지-감염 후 항체 분비 세포 반응 수준을 나타낸 것이다: (A) 비장 내 IgG 항체 분비 세포; (B) 비장 내 IgA 항체 분비 세포.
도 12는 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 챌린지 감염 후 30일 째의 비장 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다: (A) 비장의 CD4⁺ T 세포 반응; (B) 비장의 CD8⁺ T 세포 반응; (C) 비장의 배중심 B 세포 반응.
도 13은 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 챌린지 감염 후 30일 째의 뇌 조직의 낭포 크기 및 낭포 수를 나타낸 것이다: (A) 낭포 크기; (B) 낭포 수.
도 14는 대조군(Na

ve), 제2 톡소포자충 VLP를 IN 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IN)), 제2 톡소포자충 VLP를 IM 경로로 주입한 군(ROP13 VLP(IM))의 챌린지 감염 후 60일 동안 체중 및 생존율을 모니터닝한 결과를 나타낸 것이다: (A) 체중; (B) 생존율.
도 15는 대조군(Na

ve), 감염 대조군(Na

ve+Cha), 제1 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP4 VLP), 제2 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP13 VLP), 제1 및 제2 톡소포자충 VLP를 함께 주입한 군(ROP4+ROP13 VLP), 제3 톡소포자충 VLP를 주입한 군(ROP(4+13) VLP)의 챌린지-감염 후 염증성 사이토카인 수준을 나타낸 것이다: (A) 뇌 내 IFN-γ; (B) 뇌 내 IL-6.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1); 및 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질 4(ROP4) 및 곤봉체 단백질 13(ROP13) 중 적어도 하나를 포함하는 표면 항원 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자가 제공된다.

본 발명의 “바이러스-유사 입자(VLP)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 아단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스-유사 입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여될 수 있다.

특히, 본 발명의 일 실시양태에 따른 바이러스-유사 입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 구조 단백질(core protein)로서 인플루엔자 바이러스 유래의 매트릭스 단백질(M1)을 포함할 수 있다. 본 발명의 바이러스-유사 입자는 별도의 원인 감염체, 즉 톡소포자충 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 높은 생산성 및 경제성이 구현될 수 있다.

본 발명의 “인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)”은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질 단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C로 명명된 서브타입으로 구성된다. 상기 인플루엔자 바이러스는 코어와 바이러스 외피 간의 연결체로 작용하는 매트릭스 단백질(M1)의 층으로 둘러 쌓여 외형을 이루며, 상기 M1 단백질은 인플루엔자 바이러스-유사 입자의 개발에 있어서 구조 단백질로서 널리 사용될 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 구조 단백질로서 포함할 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1) 표면에는 톡소포자충에서 유래한 하나 이상의 표면 항원 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 표면에 톡소포자충에서 유래한 표면 항원 단백질을 포함하고 있으므로 특정 개체에 유입되었을 때 톡소포자충에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 상기 개체에게 톡소포자충에 대한 면역력을 부여할 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 구조 단백질 및 표면 항원 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상청액으로 배출될 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 개체 내에서 항원으로 작용하며 수지상 세포(dendritic cells)와 같은 항원 제시 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 제시할 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자는 톡소포자충에서 유래한 표면 항원 단백질을 포함하고 있으나 그 외에 유전 물질은 포함하지 않으므로 증식이 불가능하고 독성이 없어 안전하므로 톡소포자충에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이러스-유사 입자의 표면에 도입된 항원 단백질은 순수하게 분리된 재조합 단백질에 비해 높은 항원성을 가지며 효과적인 중화항체를 형성할 수 있다.

본 발명의 “표면 항원 단백질”은 각각의 항체 또는 T 세포 수용체에 의한 인식의 기본 요소 또는 최소 단위이며, 상기 항체 또는 T 세포 수용체가 결합하는 특정 도메인, 영역 또는 분자 구조를 의미한다. 본 발명의 표면 항원 단백질은 톡소포자충에서 유래할 수 있으며, 톡소포자충에 대한 면역 활성을 유도할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다.

일 실시양태에 있어서, 본 발명의 표면 항원 단백질은 톡소포자충에서 유래한 SAG1(Membrane-associated surface antigen), SAG2, GRA1(secreted dense-granule protein), GRA2, GRA4, GRA7, MIC1(Microneme protein), MIC2, MIC4, MIC6, MIC7, MIC8, MIC9, MIC10, MIC11, ROP1, ROP2, ROP3, ROP4, ROP5, ROP6, ROP7, ROP8, ROP9, ROP10, ROP11, ROP12, ROP13, ROP14, ROP15, ROP16, ROP17, ROP18, M2AP(MIC2 associated protein), AMA1(Plasmodium apical membrane antigen 1), 및 BAG1 등 다양한 종류의 단백질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 ROP4 및 ROP13 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 표면 항원 단백질은 ROP4 및 ROP13을 동시에 포함할 수 있다.

본 발명의 “곤봉체 단백질(Rhoptry protein)”은 톡소포자충에서 유래한 단백질로서, 활성 기생충의 숙주 세포 내로의 침투에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들은 곤봉체 단백질인 ROP4 및 ROP13 중 적어도 하나, 바람직하게는 ROP4 및 ROP13을 모두 포함하는 바이러스-유사 입자 백신이 감염에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고 마우스 체내 기생충의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)과 융합된 형태로서 개체 내에 유입될 때 톡소포자충에 대한 높은 수준의 면역성을 제공할 수 있음을 확인하였다.

일 실시양태에 있어서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 곤봉체 단백질 4(ROP4)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 곤봉체 단백질 13(ROP13)은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 서열번호 1 내지 3은 공지된 서열로서, 하기와 같이 표시된다.

<서열번호 1> 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 아미노산 서열(GenBank Accession No. ABO21712.1)

<서열번호 2> 곤봉체 단백질 ROP4의 아미노산 서열(GenBank Accession No. ABU24469.1)

<서열번호 3> 곤봉체 단백질 ROP13의 아미노산 서열(GenBank Accession No. AFH54214.1)

또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, 곤봉체 단백질 4(ROP4)는 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, 곤봉체 단백질 13(ROP13)은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 서열번호 4 내지 6은 공지된 서열로서, 하기와 같이 표시된다.

<서열번호 4> 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 코딩하는 핵산 서열(GenBank Accession No. EF467824)

<서열번호 5> 곤봉체 단백질 ROP4를 코딩하는 핵산 서열(GenBank Accession No. EU047558.1)

<서열번호 6> 곤봉체 단백질 ROP13을 코딩하는 핵산 서열(GenBank Accession No. JN051278.1)

본 발명의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1); 곤봉체 단백질 4(ROP4) 및 곤봉체 단백질 13(ROP13)은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1); 곤봉체 단백질 4(ROP4) 또는 곤봉체 단백질 13(ROP13)과의 구조적, 기능적 상동성으로 인해 톡소포자충에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사 입자로서의 활성을 의미한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 바이러스-유사 입자를 유효 성분으로 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 톡소포자충 감염증은 톡소포자충의 감염에 의해 일어날 수 있는 모든 질환 및 증상을 포함한다. 톡소포자충은 체내 다양한 부위, 예를 들어 림프선, 뇌, 폐, 심근, 비장, 골수, 신장, 부신, 신경계 등에 기생할 수 있으며, 빠른분열소체(tachyzoite)는 망상내피계와 순환계 내피세포 속에서 활발히 분열 및 증식하여 조직을 괴사시킬 수 있다. 또한, 감염 부위에 따라 다양한 질병 및 증상을 일으킬 수 있는데, 예를 들어 림프선염, 망막맥락막염, 뇌수막염, 뇌척수염, 간염, 근육염, 심근염, 폐렴, 세뇨관 질환 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 바이러스-유사 입자를 유효 성분으로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태, 이의 배양액 또는 이의 농축액 등 바이러스-유사 입자의 분리 정제된 다양한 형태로 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2 보조제를 더 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 “의학적으로 허용 가능한 담체”는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 내 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 대상자에게 비강 내 투여된다.

구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 톡소포자충 감염증의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으나, 예를 들면, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 코딩하는 서열번호 4의 핵산 서열; 및 곤봉체 단백질 4(ROP4)를 코딩하는 서열번호 5의 핵산 서열 및 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 코딩하는 서열번호 6의 핵산 서열 중 적어도 하나의 핵산서열을 포함하는 바이러스-유사 입자 제조용 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 발현 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 발현 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1a-c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GALccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 상기 바이러스-유사 입자를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.

본 발명의 바이러스-유사 입자를 코딩하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 바이러스-유사 입자를 코딩하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 숙주 세포는 바이러스에 의해 감염될 수 있고 바이러스-유사 입자에 의해 면역될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 본 발명의 숙주 세포는 형질전환에 의해 대사 조작될 수 있다.

일 실시양태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는 미생물, 동물 세포, 식물 세포, 동물에서 유래한 배양 세포, 또는 식물에서 유래한 배양 세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 공학적 방법에 의해 형질전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며 바람직하게는 곤충 세포일 수 있다. 상기 곤충 세포는 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발되거나 시판되는 모든 세포가 사용될 수 있으며, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 곤충 세포(Spodoptera frugiperda) SF21, SF9, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 안티카르사 겜미탈리스(Anticarsa gemmitalis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae), 만두카 섹스타(Manduca sexta), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 목적하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.

상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다.

생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.

따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 숙주 세포는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.

예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포 내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다. 상기 "변형된 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하도록 유전적으로 설계된 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형된 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 부모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.

한편, 상기 “형질전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질전환하고자 하는 세포가 원핵 세포인 경우에는, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

형질전환하고자 하는 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질 감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

효모와 같은 진균의 형질전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사 입자를 발현시키는 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 형질전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질전환에 의해 상기 바이러스-유사 입자를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 본 발명의 바이러스-유사 입자 단백질을 수득할 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다.

특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다.

공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다.

다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실시예 1 : 제1 톡소포자충 VLP의 제조

인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 유전자는 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에 형질감염시킨 뒤, 세포를 분쇄하여 바이러스를 수득하고 얻어진 RNA를 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 얻었으며, 톡소포자충 곤봉체 단백질 4 (ROP4) 및 톡소포자충 곤봉체 단백질 13 (ROP13)의 유전자는 톡소포자충의 RH strain을 갈아 RNA를 수득한 뒤, 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 얻었다. 이들 얻어진 유전자를 pFastBac 벡터에 삽입하여 dh5a 세포에 클로닝하였으며, 이후에 얻어진 유전자를 dh10bac 벡터에 다시 클로닝하였다. dh10bac 벡터의 유전자를 곤충 세포인 sf9 세포에 삽입하여 목적하는 유전자 항원의 단백질을 수득하였다.

톡소포자충 곤봉체 단백질 4 (ROP4)의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAAGCATGCACCATGGGGCACCCTACCTCTTT-3'(서열번호 7)) 및 역방향 프라이머(5'-TTAGGTACCTCACGTTTCCGGTGGTGGCAT-3'(서열번호 8))를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다.

인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAAGGATCCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3'(서열번호 9)) 및 역방향 프라이머(5'-TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3'(서열번호 10))를 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.

상기 각 유전자는 제한 효소 부위 (Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입되었으며, Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 ROP4 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다.

도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(ROP4: EU047558.1, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다.

그 후, ROP4 및 M1을 함유하는 pFastBac 형질전환체를 cellfectin II(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 SF9 세포 내로 형질 감염시켰다. Bac-to-Bac 발현 시스템(Invitrogen)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 ROP4 및 M1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBVs)를 제조하였다.

제1 톡소포자충 VLP를 생성하기 위하여, Sf9 곤충 세포를 ROP4 및 M1을 발현하는 재조합 rBV로 공동-감염시켰다. Sf9 세포 배양 상청액을 감염 후 3일째에 수확하고, 이어서 6000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 30,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 펠렛화시켰다. VLP는 수크로오스 구배를 통해 정제되었다. VLP 펠렛은 사용시까지 인산염-완충 식염수(PBS)에서 재현탁시켰다.

톡소포자충 ROP4 및 M1 단백질은 웨스턴블롯 및 투과 전자현미경(TEM)(Tecnai G2 spirit, FEI, Hillsboro, OR, USA)에 의해 특성화되었다. 50 및 10 μg의 제1 톡소포자충 VLP를 SDS-PAGE를 위해 로딩하고 웨스턴블롯으로 시각화하였다. 웨스턴블롯에 의해 ROP4 및 M1 단백질을 검출하기 위하여, 인플루엔자 바이러스 항-M1 단클론 항체(Abcam, Cambridge, UK) 또는 톡소포자충-특이적 다클론 항체를 사용하였다. 톡소포자충-특이적 다클론 항체는 톡소포자충 ME49에 감염된 마우스로부터 수득하였다. 간단하게, 안와정맥총 천자(retro-orbital plexus puncture)를 통해 마우스로부터 채취한 말초 혈액을 7000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하고, 결과물인 다클론 항체를 사용시까지 -20 ℃에서 보관하였다. VLP의 형태(morphology)는 TEM 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, ROP4 단백질 및 M1을 함유하는 제1 톡소포자충 VLP(ROP4 VLP)가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다(도 1A).

실시예 2 : 제2 톡소포자충 VLP의 제조

제2 톡소포자충 VLP(ROP13 VLP)는 ROP4 대신 ROP13 유전자를 벡터에 도입하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 단, 톡소포자충 곤봉체 단백질 13 (ROP13)의 유전자는 정방향 프라이머(5'-AAAGGATCCACCATGAAGAGAACAGAGCTTTG-3'(서열번호 11)) 및 역방향 프라이머(5'-TTACTCGAGTCACAATAGCCTCAAGGAATT-3'(서열번호 12))를 이용하여 증폭하였으며, 제한 효소 부위 (BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입하여 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 ROP13 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다.

도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(ROP13: JN051278.1, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다.

웨스턴블롯 및 TEM 분석 결과, ROP13 단백질 및 M1을 함유하는 제2 톡소포자충 VLP(ROP13 VLP)가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다(도 1B).

실시예 3 : 제3 톡소포자충 VLP의 제조

제3 톡소포자충 VLP(ROP(4+13) VLP)는 ROP4 대신 ROP4 및 ROP13 유전자를 함께 벡터에 도입하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 단, 제한 효소 부위 (Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I)를 갖는 pFastBac 벡터에 도입하여 Sph I/Kpn I 및 BamH I/Xho I 제한 효소로 커팅하여 ROP4, ROP13 및 M1 유전자의 도입 여부를 확인하였다.

도입된 유전자의 핵산 서열은 DNA sequencing(Eurofins MWG Operon)에 의해 공지된 서열(ROP4: EU047558.1, ROP13: JN051278.1, M1: EF467824)과 동일한 것으로 확인되었다.

웨스턴블롯 및 TEM 분석 결과, ROP4, ROP13 단백질 및 M1을 함유하는 제3 톡소포자충 VLP(ROP(4+13) VLP)가 검출되었으며, 표면에 스파이크가 형성된 구형 VLP의 성공적인 형성도 TEM 분석으로 검증되었다(도 1C).

실시예 4 : 제1 톡소포자충 VLP 및 제2 톡소포자충 VLP의 혼합물

실시예 1의 ROP4 단백질 및 M1을 함유하는 제1 톡소포자충 VLP(ROP4 VLP)와 실시예 2의 ROP13 단백질 및 M1을 함유하는 제2 톡소포자충 VLP(ROP13 VLP)를 1:1로 혼합하여 ROP4+ROP13 VLP를 제조하였다.

실시예 1 내지 4에서 제조된 구체적인 VLP는 다음과 같다.

실시예	명칭	약어	포함된 표면 항원 단백질
실시예 1	제1 톡소포자충 VLP	ROP4 VLP	ROP4
실시예 2	제2 톡소포자충 VLP	ROP13 VLP	ROP13
실시예 3	제3 톡소포자충 VLP	ROP(4+13) VLP	ROP4 및 ROP13
실시예 4	제1 톡소포자충 VLP 및 제2 톡소포자충 VLP의 혼합물	ROP4+ROP13 VLP	ROP4 및 ROP13

실험예 1 : 동물모델에서의 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응 시험

7 주령의 BALB/c 암컷 마우스를 KOATECH (Pyeongtaek, Korea)으로부터 구입하여 동물모델로서 사용하였다. 톡소포자충 RH 및 ME49는 복강 내 주사에 의해 마우스 내 유지되었다. 톡소포자충 RH는 감염 후 5일째에 복막액으로부터 채취되었으며, 톡소포자충 ME49 낭포는 감염 후 30일째에 마우스의 뇌로부터 채취되었다. Sf9 곤충 세포를 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하는데 사용하였고, 톡소포자충 VLP를 스피너 플라스크 내 SF900-II 무혈청 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 27℃, 135 rpm으로 배양하였다.

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 100μg/100μL을 그룹당 10 마리의 마우스에 접종 후 유도되는 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응을 시험하였다.

톡소포자충-특이적 항체 수준 (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgA)을 톡소포자충 RH 코팅 항원 (4μg/mL)을 사용하는 효소-결합 면역흡착분석법(ELISA)으로 측정하였다. 톡소포자충 RH 코팅 항원은 PBS 내에 톡소포자충 RH의 빠른분열소체(tachyzoites)를 초음파 처리하여 제조하였다. 비강 내 프라임(prime) (d = 0 주) 및 부스트(boost) (d = 4 주) 면역화 및 톡소포자충 ME49의 챌린지 감염 (d = 8 주) 후 4 주 째에 안와정맥총 천자로 면역 혈청을 채취하였다. 채취한 마우스 혈청을 연속 희석시키고 (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400), 100㎕의 각 희석물을 배양 전에 37℃에서 1 시간 동안 각 ELISA 플레이트 웰에 첨가하였다. 그 후, 100㎕의 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 2차 항체 (PBST에서 1:2000으로 희석된 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgA)를 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. ELISA 판독기 (EZ Read 400, Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도(OD)를 판독하였다. 모든 항체는 Southern Biotech (Birmingham, AL, USA)에서 구입하였다.

마우스를 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP4+ROP13 VLP, 및 ROP(4+13) VLP로 면역화시킨 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 모든 VLP-면역화된 마우스는 대조군 마우스(Na

ve)에 비하여 항체 반응의 수준이 더 높았다. 그 중에서도, ROP(4+13) VLP 면역화는 ROP4+ROP13 VLP 면역화에 비하여도 유의하게 높은 수준의 혈청 IgG, IgG1, IgG2a, 및 IgA를 유도하였으며, 이로부터 ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스는 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응을 가장 효과적으로 유도함을 알 수 있었다 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).

실험예 2 : 동물모델에서의 점막 내 톡소포자충-특이적 항체 반응 시험

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 10μg/100μL을 그룹당 10 마리의 마우스에 접종 후 유도되는 점막 내 톡소포자충-특이적 항체 반응을 시험하였다.

실험예 1의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 30 일 째에 마우스의 샘플을 수집하였다. 마우스의 비장을 채취 및 균질화하여 비장 세포를 세포 여과기에 통과시키고 적혈구를 제거하였다. 장간막에서 MLN을 채취하고 PBS에서 MLN을 절단하여 세포를 수득하였다. 점막 샘플 채취를 위하여, 위 바로 아래의 십이지장의 5 cm 및 10 조각의 대변을 수집하였다. 질 분비물은 200 ㎕의 PBS로 마우스 질을 반복 세척함으로써 수집하였다. 수집된 장, 대변 및 질 분비물을 37℃에서 1 시간 동안 배양하고, 1000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취득하여 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 모든 샘플은 효소-결합 면역흡착분석법(ELISA)에 의한 톡소포자충-특이적 면역글로불린 G (IgG) 및 IgA 항체 반응의 검출을 위하여 사용되었다.

챌린지 감염 후 마우스의 질 분비물, 소변, 장 및 대변에서 비강 내 면역화로 유발된 IgG 및 IgA 항체 반응을 평가한 결과, ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스에서 현저히 높은 수준의 톡소포자충-특이적 IgG 항체가 관찰되었으며(도 3A, C, E, G), ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스의 IgA 항체 반응 또한 다른 유형의 VLP로 면역화된 마우스 그룹에 비하여 유의하게 높은 반응을 나타내었다(도 3B, D, F, H) (* p <0.05, *** p <0.001). 이들 결과로부터, 점막 면역은 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP4+ROP13 VLP, 및 ROP(4+13) VLP에 의한 비강 내(IN) 면역화에 의해 성공적으로 유도되었고, 그 중에서도 ROP(4+13) VLP로 면역화한 경우 점막 면역이 가장 활성화되었음을 알 수 있었다.

실험예 3 : 동물모델에서의 사이토카인 생성 및 항체 분비 세포(ASC) 반응 시험

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 100μg/100μL을 그룹당 10 마리의 마우스에 접종 후 유도되는 사이토카인 생성 및 항체 분비 세포(ASC) 반응을 시험하였다.

실험예 1의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생된 마우스 (n = 5)의 비장으로부터 단리된 비장 세포 (1x10⁶ 세포/웰)를 톡소포자충 RH 항원 (4μg/mL)이 코팅된 96 웰 세포 배양 플레이트에서, 37℃에서 4 일 동안 배양하였다. 4 일 후, 플레이트의 웰에서 비장 세포를 제거하고, 플레이트를 HRP-컨쥬게이트된 마우스 IgG 및 IgA 항체와 반응시켰다. 사이토카인은 톡소포자충 RH (4μg/mL)로 자극한 비장 세포 배양물의 상청액에서 측정하였다. IL-6 및 IFN-γ의 사이토카인 농도를 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 정량화하였다.

톡소포자충 ME49로의 챌린지 감염 후 4 주 째에 비장 세포로부터의 항체 분비를 측정한 결과, ROP(4+13) VLP로의 면역화는, 다른 유형의 VLP로 면역화한 경우 모두에 비하여 톡소포자충 IgG (도 4A) 및 IgA (도 4B) 항체 수준이 유의하게 높았다. 또한, 톡소포자충 RH 자극으로 비장 세포 배양물 상청액에서 분비된 IFN-γ및 IL-6 사이토카인을 측정하여 세포성 면역 반응의 수준을 확인한 결과, 다른 유형의 VLP 면역화에 비하여 ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스의 비장 세포로부터 IFN-γ(도 4C) 및 IL-6 (도 4D) 사이토카인의 수준이 가장 높았다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 이로부터, 톡소포자충 VLP는 항체 분비 세포 반응 및 사이토카인을 가장 효과적으로 유도함을 알 수 있었으며, 그 중에서도, ROP(4+13) VLP의 효능이 가장 우수하다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4 : 동물모델에서의 세포성 면역 반응 시험

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 100μg/100μL을 그룹당 10 마리의 마우스에 접종 후 유도되는 세포성 면역 반응을 시험하였다.

실험예 1의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생된 마우스 (n = 5)로부터 비장 세포 및 장간막 림프절 (MLN)을 채취하였다. 채취된 세포를 Fc 수용체 블록킹 후 염색 완충액(2 % 소 혈청 알부민 및 0.1 % 소듐 아자이드 0.1M PBS)에서 형광-표지된 항 마우스 CD3-PE-Cy7, CD4-FITC, CD8-PE, B220-FITC, 및 GL7-PE (BD, San Diego, CA, USA) 항체로 염색하였다. 유세포 분석은, Accuri C6 (BD, San Diego, CA, USA)을 사용하여 세포 집단을 획득하고, Accuri C6 소프트웨어 (1.0.264.21, BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

유세포 분석의 데이터 분석은 근본적으로 게이팅(gating) 원리에 기초하며, 게이트(gate) 및 영역(region)은 공통의 특성, 일반적으로 전방 산란, 측방 산란 및 마커 발현을 갖는 세포 집단 주위에 위치하여, 이들 관심 대상 집단을 조사 및 정량화한다. 도 5에는 비장 및 MLN 세포 내 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 및 배중심 B 세포의 게이팅 전략을 나타내었다. VLP 면역화에 의해 유도된 T 및 B 세포 반응을 유세포 분석으로 측정한 결과, ROP(4+13) VLP 면역화는 ROP4+ROP13 VLP에 비하여 비장 및 MLN 모두에서 CD4⁺ T 세포 반응의 높은 수준을 나타내었다 (도 6A). 또한, ROP(4+13) VLP 면역화는 CD8⁺ T 세포 및 배중심 B 세포의 활성화 수준을 증가시켰다(도 6B 및 C). MLN이 비장에 비하여 더 많은 양의 배중심 B 세포 반응을 나타냈다는 것이 특징적이다 (도 6C) (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 이로부터, ROP(4+13) VLP로 면역화하는 경우 T 및 B 세포 반응이 보다 효과적으로 유도된다는 것을 알 수 있었다.

실험예 5 : 감염에 따른 동물모델의 낭포 크기와 수, 생존율, 및 체중 변화 시험

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 100μg/μL로 면역화된 그룹당 10 마리의 마우스의 감염 후 낭포 크기와 수 (n = 5), 생존율과 체중 변화 (n = 5)를 관찰하였다. 이는 톡소포자충 VLP 백신의 효능을 입증하는 가장 좋은 방법이다.

실험예 1의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생된 마우스 (n = 5)의 뇌에서 톡소포자충 ME49 낭포를 단리하였다. 뇌 조직을 400 ㎕ PBS에 시린지로 균질화하였다. 45 % Percoll 용액으로 균질액을 혼합한 후, 샘플을 스윙-버킷 로터를 사용하여 12,100 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 뇌 균질액을 원심분리 후 다음의 3 개 층으로 세분하였다: 톡소포자충 ME49 낭포, RBC, 및 뇌 조직. 톡소포자충 ME49 낭포 층을 조심스럽게 수집하고, 반복적인 PBS 세척으로 6000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하였다. 수집된 낭포 5 ㎕를 슬라이드 유리에 배치하고, 낭포를 현미경 (Leica DMi8, Leica, Wetzlar, Germany)으로 5 개의 영역하에서 계수하였다.

감염된 마우스 뇌의 낭포 크기와 수의 변화를 평가한 결과, 도 7A, B에 나타낸 바와 같이, ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스는 감염 대조군(Na

ve+Cha)에 비하여 낭포 크기 및 낭포 수가 현저히 감소하였다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 또한, 챌린지 감염 후 마우스의 체중(A) 및 생존율(B)의 변화를 관찰하기 위해 60 일 동안 모니터링한 결과, 도 8A에서 볼 수 있듯이, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 35 일 째에, 감염 대조군 마우스는 급속한 체중 감소를 보인 반면, ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스는 단지 2%의 가장 적은 체중 감소만을 나타내었다. 결과적으로, 도 8B에 도시된 바와 같이, 감염 대조군의 35 일 째의 생존율이 0%인 것과 대조적으로, 모든 면역화된 마우스는 살아남았다. 이들 결과는, ROP(4+13) VLP로 마우스를 면역화하는 경우 톡소포자충 ME49 침입을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한다.

실험예 6 : 동물모델에서의 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응 시험

실시예 2의 ROP13 VLP (100μg/μL)를 그룹당 6 마리의 마우스에 비강 내(IN) 또는 근육 내(IM) 경로로 접종 후 유도되는 혈청 내 톡소포자충-특이적 항체 반응을 시험하였다.

프라임(d = 0 주) 및 부스트(d = 4 주) 면역화 및 챌린지 감염 (d = 8 주) 후 30일 째에 안와정맥총 천자로 마우스의 혈액을 채취하였다. 혈청을 단리한 후, 효소-결합 면역흡착분석법(ELISA)으로 IgG, IgG1, IgG2a, 및 IgA를 측정하는 데 사용하였다. 평평한 96-웰 면역플레이트를 4℃에서 밤새 100㎕의 탄산염 완충액 중의 4μg/mL의 톡소포자충 (RH) 항원으로 코팅하였다. PBST에서 희석된 혈청 샘플(1:50, 1:150, 및 1:450)을 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, PBST에서 1:2000으로 희석된 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG, IgG1, IgG2a, IgA (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)를 각 웰에 접종하고, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. H₂O₂가 포함된 기질 완충액에 용해된 O-페닐렌디아민 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 비색 변화를 평가하였다. 1 M의 H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중단시키고, ELISA 판독기 (EZ Read 400, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

마우스를 IN 또는 IM 경로로 프라임 및 부스트 ROP13 VLP 면역화시키고, 챌린지 감염시킨 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, IN 경로로 VLP-면역화된 마우스의 항체 반응 수준이 가장 높았으며, IN 경로의 ROP13 VLP 면역화는 IM 경로의 ROP13 VLP 면역화에 비하여 더 높은 수준의 혈청 IgG, IgG1, IgG2a, 및 IgA를 유도하였다 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).

실험예 7 : 동물모델에서의 대변 내 톡소포자충-특이적 항체 반응 시험

실시예 2의 ROP13 VLP (100μg/100μL)를 그룹당 6 마리의 마우스에 비강 내(IN) 또는 근육 내(IM) 경로로 접종 후 유도되는 대변 내 톡소포자충-특이적 항체 반응을 시험하였다.

실험예 6의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 챌린지 감염 후 30 일 째에 마우스의 대변 샘플을 수집하였다. 대변을 PBS로 균질화하고, 13500 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 수득한 상청액을 사용하여 IgG 및 IgA 항체 반응을 실험예 1과 동일하게 ELISA로 측정하였다.

챌린지 감염 후 마우스의 대변에서 IN 또는 IM ROP13 VLP 면역화로 유발된 톡소포자충-특이적 IgG 및 IgA 항체 반응을 평가한 결과, ROP13 VLP로 IN 경로로 면역화된 마우스에서 유의하게 높은 수준의 톡소포자충-특이적 IgG 및 IgA 항체가 관찰되었다(도 10A, B) (* p <0.05, ** p <0.01). 이로부터, VLP에 의한 IM 면역화에 비하여 IN 면역화시 면역 반응이 성공적으로 유도되었음을 알 수 있었다.

실험예 8 : 동물모델에서의 항체 분비 세포(ASC) 반응 시험

실시예 2의 ROP13 VLP (100μg/100μL)를 그룹당 6 마리의 마우스에 비강 내(IN) 또는 근육 내(IM) 경로로 접종 후 유도되는 항체 분비 세포(ASC) 반응을 시험하였다.

실험예 6의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생된 마우스 (n = 3)의 비장으로부터 단리된 비장 세포 (1x10⁶ 세포/웰)를 4μg/mL의 톡소포자충 RH 항원으로 코팅된 플레이트에서 5 % CO₂와 함께 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. 3 일 후, 플레이트를 IgG 및 IgA (PBST에서 1:2000으로 희석됨)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양하여, 분비되는 항체의 양을 측정하였다.

톡소포자충으로의 챌린지 감염 후 4 주 째에 비장 세포로부터의 항체 분비를 측정한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, IN 경로의 ROP13 VLP 면역화는, IM 경로의 ROP13 VLP 면역화에 비하여 ASC에서의 IgG (도 11A) 및 IgA (도 11B)의 수준이 유의하게 높았다(* p <0.05, ** p <0.01). 이로부터, 톡소포자충 VLP는 IM 경로에 비하여 IN 경로로 면역화시, 항체 분비 세포 반응을 효과적으로 유도한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 9 : 동물모델에서의 세포성 면역 반응 시험

실시예 2의 ROP13 VLP (100μg/100μL)를 그룹당 6 마리의 마우스에 비강 내(IN) 또는 근육 내(IM) 경로로 접종 후 유도되는 세포성 면역 반응을 시험하였다.

CD4⁺, CD8⁺ T 세포 및 배중심 B 세포 집단을 측정하기 위하여, 각 튜브에 실험예 8에서 단리한 비장 세포 (1x10⁶ 세포)를 첨가하였다. 세포를 PBS에서 1200 RPM으로 5 분 동안 원심분리하여 세척하였다. 펠렛화된 비장 세포를 염색 완충액에 재현탁하고, Fc 블록킹과 함께 4℃에서 30 분 동안 배양하였다. 표면 마커를 세포 표현형에 특이적인 형광-컨쥬게이트된 항체 (CD3e-PE-Cy7, CD4-FITC, CD8-PE, CD45-FITC, GL7-PE) (BD Biosciences, USA)로 염색하였다. 세포를 수득하고, BD Accuri C6 유세포 분석계 및 C6 분석 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

면역화된 마우스의 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포 및 배중심 B 세포 반응을 관찰한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, IN 경로의 ROP13 VLP 면역화는, IM 경로의 ROP13 VLP 면역화에 비하여 유의하게 높은 CD4⁺ T 세포 (17.8 %, 도 12A), CD8⁺ T 세포 (8.7 %, 도 12B), 및 배중심 B 세포 (5.2 %, 도 12C) 집단을 나타냈다(* p <0.05). 이로부터, 톡소포자충 VLP로 면역화하는 경우 IM 경로에 비하여 IN 경로로 면역화시, T 및 B 세포 반응이 보다 효과적으로 유도된다는 것을 알 수 있었다.

실험예 10 : 감염에 따른 동물모델의 낭포 크기와 수, 생존율, 및 체중 변화 시험

실시예 2의 ROP13 VLP (100μg/μL)로 면역화된 그룹당 6 마리의 마우스의 감염 후 낭포 크기와 수 (n = 3), 생존율과 체중 변화 (n = 3)를 관찰하였다.

실험예 6의 면역화 및 챌린지 감염된 마우스 모델에 대하여, 톡소포자충 ME49 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생된 마우스 (n = 3)로부터 뇌 조직을 채취하고, 시린지를 사용하여 400 ㎕ PBS에서 균질화하였다. 균질화된 용액을 45 % Percoll에 재현탁한 후, 4℃12100 RPM에서 20 분 동안 원심분리하였다. 그 후, 낭포 층을 조심스럽게 수집하여 PBS로 6000 RPM에서 20 분 동안 세척하였다. 수집된 낭포 5 ㎕를 현미경 (Leica DMi8, Leica, Wetzlar, Germany)으로 5 개의 영역하에서 5 회 반복하여 계수하였다. 나머지 마우스 (n = 3)는 60 일 동안 모니터링하여 체중 변화 및 생존율을 측정하였다.

그 결과, IN 또는 IM 경로로의 ROP13 VLP 면역화는 모두 톡소포자충 ME49 감염에 대한 보호를 유도하였다. IN 경로의 면역화 및 IM 경로의 면역화에서 모두 낭포 크기및 낭포 수가 현저하게 감소하였으나, 그 중 IN 경로의 면역화가 더 우수한 보호 효과를 나타내었다 (낭포 크기: 28 ㎛; 낭포 수: 372) (도 13A, B) (* p <0.05, ** p <0.01). 또한, 체중 변화와 생존율을 측정한 결과, 도 14A에서와 같이, IN 경로의 면역화 (9%)는 IM 경로의 면역화 (13%)에 비하여 체중 감소가 적었다. 감염 대조군(Na

ve+Cha)과 달리, IN 및 IM 경로의 면역화로부터 모든 마우스가 생존하였으며 (도 14B), 결과적으로, IM 경로에 비하여 IN 경로의 ROP13 VLP 면역화가 더 우수한 보호 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

실험예 11 : 동물모델에서의 염증 반응 시험

실시예 1 내지 4의 ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP 각 100μg/100μL을 그룹당 10마리의 마우스에 접종한 후, 면역화된 마우스의 감염 후 염증 반응이 억제되는 정도를 확인하였다.

이를 위하여, ROP4 VLP, ROP13 VLP, ROP(4+13) VLP, 및 ROP4+ROP13 VLP를 실험예 1과 같이 마우스에 근육 내(IM) 투여하여 프라임(d = 0 주) 및 부스트(d = 4 주) 면역화시켰으며, 마리 당 톡소포자충 ME49 450 cyst의 구강 내 챌린지 감염 (d = 8 주)으로 마우스에 염증 반응을 유도하였다. 염증 반응이 유도된 마우스 (n = 5)를 챌린지 감염 후 4 주 째에 희생시켜 뇌를 분쇄하고, 8000 RPM에서 5 분 동안 원심분리한 후, 분리한 상청액에서 염증성 사이토카인(IFN-γ 및 IL-6)의 농도를 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, ROP(4+13) VLP로 면역화된 마우스의 뇌 세포에서 가장 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ(도 15A) 및 IL-6 (도 15B)이 측정되었으며, 특히 ROP4+ROP13 VLP로 면역화된 경우에 비하여 유의하게 낮은 수준 및 감염 대조군(Na

ve+Cha)에 비하여 현저히 낮은 수준을 나타냈다(* P <0.05, *** P <0.001). 이로부터, 톡소포자충 ROP(4+13) VLP는 염증성 사이토카인의 분비를 효과적으로 억제하여 우수한 염증 반응 억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> health park co., ltd. <120> VIRUS-LIKE PARTICLES EXPRESSING TOXOPLASMA GONDII RHOPTRY PROTEIN, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISIMG THE SAME <130> KPCA191143 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 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Gly Phe Arg Arg 100 105 110 Leu Leu Arg Arg Leu Arg Phe Trp Arg Arg Gly Ser Thr Arg Gly Ser 115 120 125 Asp Asp Ala Ala Glu Val Ser Arg Arg Thr Arg Val Pro Leu His Thr 130 135 140 Arg Leu Leu Gln His Leu Arg Arg Val Ala Arg Ile Ile Arg His Gly 145 150 155 160 Val Ser Ala Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gly Arg Val Arg Gln Val Glu 165 170 175 Ala Glu Arg Pro Gln Pro Val Phe Thr Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu 180 185 190 Glu Thr Asn Ser Leu Tyr Tyr Arg Asp Lys Val Pro Gly Gln Gly Ile 195 200 205 Ile Gln Glu Ile Leu Arg Gln Lys Pro Gly Ile Ala His His Pro Glu 210 215 220 Ser Phe Ser Val Val Ala Ala Asp Glu Arg Val Ser Arg Thr Leu Trp 225 230 235 240 Ala Glu Gly Gly Val Val Arg Val Ala Ser Glu Leu Gly Gln Pro Gly 245 250 255 Arg Val Leu Val Arg Gly Arg Arg Ile Gly Leu Phe Arg Pro Gly Met 260 265 270 Gln Phe Glu Ala Thr Asp Gln Ala Thr Gly Glu Pro Met Thr Ala Leu 275 280 285 Val Gly His Thr Val Leu Glu Ala Thr Ala Arg Asp Val Asp Ser Met 290 295 300 Arg Asn Glu Gly Leu Ala Val Gly Leu Phe Gln Lys Val Lys Asn Pro 305 310 315 320 Tyr Leu Ala Asn Arg Tyr Leu Arg Phe Leu Ala Pro Phe Asp Leu Val 325 330 335 Thr Ile Pro <210> 3 <211> 400 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 3 Met Lys Arg Thr Glu Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ala Val Gly Ala 1 5 10 15 Phe Ala Phe Thr Ser Pro Asn Ala Val Ala Lys Ser Phe Glu Arg Asn 20 25 30 Leu Gly His Leu Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ser Ser Pro Leu Asn Ser 35 40 45 Asp Val Glu Leu Gly Arg Ser Thr Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ser Phe 50 55 60 Thr Glu Gly Thr Asn Glu Thr Asn Pro Pro Thr Ser Arg Pro Pro Gly 65 70 75 80 Trp Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Leu His Arg Arg Val Val Ala Arg Arg 85 90 95 Glu Glu His Lys Lys Arg Gln Glu Glu Trp Glu Gln Arg Lys Ala Ser 100 105 110 Arg Arg Ser Ala Leu Thr Pro Ser Ala Pro Asp Pro Asp Gly Asp Gly 115 120 125 Asp Pro Ala Thr Ser Leu Pro Ser Gln Arg Arg Leu Leu Asp Arg Cys 130 135 140 Leu Gln Gln Phe Arg Glu Gln Leu Val Asp Leu Glu Asn Leu Cys Lys 145 150 155 160 Gly Ser Pro Glu Pro Asp Asp Cys Arg Ser Thr Val Gln Glu Ile Leu 165 170 175 Ala Asn Gln Ser Phe Gly Ala Leu His Thr Thr Val Ile Ser Phe Ser 180 185 190 Ile Phe Val Asn Arg Asp Pro Arg Arg Leu Ser Phe Pro Val Leu Asp 195 200 205 Ala Thr Asp Leu Arg Leu Thr Val Lys Leu Lys His Leu Leu Asp Arg 210 215 220 Ile Pro Gly Cys Ala Ala Leu Ser Leu Pro Val Tyr Ile Gly Leu Val 225 230 235 240 Ser Ser Asp Val Phe Lys Ser Glu Glu Phe Thr Arg Lys Val Asn Arg 245 250 255 Cys Ser Glu Asp Phe Gly Arg Ser Ala Arg Glu Glu Pro Ser Lys Ala 260 265 270 Gly Arg Ala Ala Ala Ala Val Ile Arg Phe Met Gly Leu Thr Pro Glu 275 280 285 Arg Gln Thr Phe Tyr Gln Pro Phe Val Phe Val Thr Thr Gln Ala Ala 290 295 300 Met Leu Leu Ser Met Val Leu Lys His Pro Phe Leu Ser Ile Leu Val 305 310 315 320 Asn Met Ala Cys Val Ala Gly Ser Leu Cys Arg Lys Gly Ile Arg Glu 325 330 335 Val Leu Leu Arg Ala Leu Arg Glu Ala Asp Phe Gln Thr Glu Gly Val 340 345 350 Pro Leu Asp Ser Ala Pro Gln Glu Leu Val Asp His Leu Lys Val Tyr 355 360 365 Leu Lys Leu Leu Phe Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Leu Arg Arg Gln Ala 370 375 380 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tctaaccgag gt 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 reverse primer <400> 10 ttactcgagt tactctagct ctatgttgac 30 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP13 forward primer <400> 11 aaaggatcca ccatgaagag aacagagctt tg 32 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP13 reverse primer <400> 12 ttactcgagt cacaatagcc tcaaggaatt 30

Claims (10)

1. 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein 1; M1); 및
   톡소포자충 유래의, GenBank 수탁번호 제ABU24469.1호의 아미노산 서열(서열번호 2)로 구성되는 곤봉체 단백질 4(Rhoptry protein 4; ROP4) 및 GenBank 수탁번호 제AFH54214.1호의 아미노산 서열(서열번호 3)로 구성되는 곤봉체 단백질 13(Rhoptry protein 13; ROP13)을 포함하는 표면 항원 단백질
   을 포함하는, 바이러스-유사 입자.
2. 제1항에 있어서,
   상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)은 GenBank 수탁번호 제ABO21712.1호의 아미노산 서열(서열번호 1)로 구성되는 바이러스-유사 입자.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 따른 바이러스-유사 입자를 유효 성분으로 포함하는 톡소포자충 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   대상자에게 비강 내 투여되는 약학적 조성물.
7. 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 코딩하는 GenBank 수탁번호 제EF467824호의 핵산 서열(서열번호 4); 및
   곤봉체 단백질 4(ROP4)를 코딩하는 GenBank 수탁번호 제EU047558.1호의 핵산 서열(서열번호 5) 및 곤봉체 단백질 13(ROP13)을 코딩하는 GenBank 수탁번호 제JN051278.1호의 핵산 서열(서열번호 6)
   을 포함하는, 바이러스-유사 입자 제조용 발현 벡터.
8. 삭제
9. 제7항에 따른 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포.
10. 제7항에 따른 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 숙주 세포를 배양하여 바이러스-유사 입자를 발현시키는 단계
    를 포함하는, 바이러스-유사 입자의 제조 방법.
    

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