WO2022158705A1 - 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022158705A1
WO2022158705A1 PCT/KR2021/018383 KR2021018383W WO2022158705A1 WO 2022158705 A1 WO2022158705 A1 WO 2022158705A1 KR 2021018383 W KR2021018383 W KR 2021018383W WO 2022158705 A1 WO2022158705 A1 WO 2022158705A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
toxoplasmosis
influenza virus
vlps
protein
virus
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/018383
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박현우
장영
Original Assignee
주식회사 헬스파크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 헬스파크 filed Critical 주식회사 헬스파크
Priority to JP2023544409A priority Critical patent/JP2024509043A/ja
Priority to AU2021421855A priority patent/AU2021421855A1/en
Priority to EP21921464.0A priority patent/EP4283296A1/en
Priority to US18/262,327 priority patent/US20240085420A1/en
Publication of WO2022158705A1 publication Critical patent/WO2022158705A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/45—Toxoplasma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • G01N2333/45—Toxoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention provides a composition and kit for diagnosing Toxoplasmosis and / or influenza virus comprising virus-like particles comprising toxoplasmosis protein and influenza virus protein, and toxoplasmosis and / or influenza virus infection using the same. it's about how
  • Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that causes Toxoplasmosis in humans and animals (Astrid M. Tenter et al.). Toxoplasmosis is mainly oocyst (oocyst), vegetative (tachyzoit, tachyzoit), infectious (bradyzoit, bradyzoit), schizont (schizont) and reproductive matrix (gametocyte, arachnoid) There are five stages of development.
  • Toxoplasma gondii is infected by ingesting water or vegetables contaminated by oocysts in cat feces, which are the definitive hosts, or feeds on Toxoplasmosis present as cysts in meat such as pigs, sheep, and cattle, which are intermediate hosts. can be infected when It is estimated that more than a third of the world's population is infected with Toxoplasmosis, and it is reported that the infection rate is 2 to 25% depending on the group in Korea.
  • Toxoplasmosis when Toxoplasmosis infects a mother, its trophozoite can infect the fetus via the placenta. Infection with Toxoplasmosis can lead to miscarriage or stillbirth in the early fetus, and congenital anomalies such as visual impairment, hydrocephalus, and mental retardation in the mid-late fetus despite a normal delivery.
  • Toxoplasmosis infecting healthy individuals can cause diseases such as lymphadenitis, retinal choroiditis, and encephalomyelitis by destroying immune system cells and reticuloendothelial cells. It can cause meningitis or retinal choroiditis.
  • influenza is one of the major causes of human death due to respiratory viruses. Common symptoms include fever, sore throat, shortness of breath and muscle pain, among others. Influenza viruses during the flu season are highly contagious, infecting 10% to 20% of the world's population and causing 250,000 to 500,000 deaths annually. What these diseases have in common is that the symptoms of other diseases have similar symptoms. Therefore, to reduce confusion with other diseases, immunological methods such as latex agglutination test, enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay, ELISA, nested PCR, real-time PCR and Various diagnostic methods such as the same DNA detection method are used.
  • Non-Patent Document 1 Astrid M. Tenter et al., "Toxoplasma gondii: from animals to humans", Int J Parasitol. 2000 Nov; 30(12-13), 1217-1258
  • the present inventors studied to develop a method capable of diagnosing Toxoplasmosis with high sensitivity as well as simultaneously diagnosing influenza virus, but also rapid and economical.
  • a diagnostic method including a composition for diagnosing VLP type according to the present invention was completed by confirming that the diagnostic kit has superior immunological specificity and sensitivity compared to antigen lysate antigen and antigen protein.
  • a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis provides a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and/or influenza virus comprising virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1 (M1).
  • M1 influenza virus matrix protein 1
  • a toxoplasmosis and/or influenza virus multiple diagnosis kit comprising the composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and/or influenza virus.
  • a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis and contacting a biological sample isolated from an individual with a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and/or influenza virus comprising virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1; and detecting an antibody that binds to a virus-like particle; provides a method for providing information necessary for multiple diagnosis of Toxoplasmosis and/or influenza virus infection, including.
  • the diagnostic composition comprising virus-like particles containing Toxoplasmosis antigen protein and influenza virus M1 protein according to the present invention can react with autoantibodies present in the serum of an individual infected with Toxoplasmosis with high specificity and sensitivity. In addition, it can react with autoantibodies present in individuals infected with influenza virus. Accordingly, the virus-like particles may be usefully used for diagnosing Toxoplasmosis and/or influenza virus.
  • AMA1, ROP4 or ROP18 VLPs Virus-like particles
  • rBV recombinant baculovirus
  • FIG. 2 is a time series showing the in vivo test process for obtaining the infected serum from the mouse in one embodiment of the present specification.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method for diagnosing using ELISA using the VLP prepared in an embodiment of the present specification.
  • Figure 4 shows naive mouse serum, P. berghei ANKA (protozoal malaria) or T. gondii (toxoplasma gondii) ME49-infected mouse serum coated with TLA (RH Tachyzoite lysate antigen), AMA1-M1-VLPs and AMA1 protein, respectively.
  • TLA RH Tachyzoite lysate antigen
  • AMA1-M1-VLPs AMA1 protein
  • FIG. 5 shows the sensitivity of AMA1-M1-VLPs to the infected serum by contacting the serum of mice infected with T. gondii ME49 to an immune plate coated with TLA, AMA1-M1-VLPs and AMA1 proteins, respectively.
  • FIG. 6 shows the sensitivity of AMA1-M1-VLPs to infected sera by contacting human sera infected with T. gondii ME49 to an immune plate coated with TLA, AMA1-M1-VLPs and AMA1 proteins, respectively.
  • Figure 7 shows the ROP4-M1-VLPs against infected sera by contacting naive mouse sera, P. berghei ANKA or T. gondii ME49-infected mouse sera with immune plates coated with TLA, ROP4-M1-VLPs and ROP4 proteins, respectively. specificity was confirmed.
  • FIG. 8 shows the sensitivity of ROP4-M1-VLPs to infected sera by contacting T. gondii ME49-infected mouse sera with immune plates coated with TLA, ROP4-M1-VLPs and ROP4 proteins, respectively.
  • FIG. 9 shows the sensitivity of ROP4-M1-VLPs to infected sera by contacting human sera infected with T. gondii ME49 to an immune plate coated with TLA, ROP4-M1-VLPs and ROP4 proteins, respectively.
  • Figure 10 shows the ROP18-M1-VLPs against infected sera by contacting naive mouse sera, P. berghei ANKA or T. gondii ME49-infected mouse sera with TLA, ROP18-M1-VLPs and ROP18 protein-coated immunoplates, respectively. specificity was confirmed.
  • FIG. 11 shows the sensitivity of ROP18-M1-VLPs to infected sera by contacting T. gondii ME49-infected mouse sera with immune plates coated with TLA, ROP18-M1-VLPs and ROP18 proteins, respectively.
  • FIG. 12 shows the sensitivity of ROP18-M1-VLPs to infected sera by contacting human sera infected with T. gondii ME49 to an immune plate coated with TLA, ROP18-M1-VLPs and ROP18 protein, respectively.
  • FIG. 13 shows Naive mouse sera, T. gondii ME49-infected mouse sera, and influenza M1 VLPs inoculated with 10 ⁇ g of TLA, AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs coated immunoplates, respectively. It shows the results of contacting the serum of the mouse and the serum of the mouse inoculated with NA (neuraminidase) VLPs 10 ⁇ g, respectively. As a result, it was confirmed that multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus is possible with AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs.
  • One aspect of the present invention is a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis; And it provides a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and/or influenza virus, comprising a virus-like particle (VLP) comprising influenza virus matrix protein 1 (M1).
  • VLP virus-like particle
  • M1 influenza virus matrix protein 1
  • the composition may be a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus at the same time.
  • virus-like particle refers to a non-infectious viral subunit with or without a viral protein.
  • the virus-like particle may be completely devoid of a DNA or RNA genome.
  • the virus-like particle may be prepared by a genetic engineering method, and includes an influenza virus-derived matrix protein (M1) as a core protein.
  • M1 influenza virus-derived matrix protein
  • the virus-like particle of the present invention can be produced by a genetic engineering method without a separate causative agent, that is, Toxoplasmosis.
  • influenza virus matrix protein 1 is a structural protein of the influenza virus, and a matrix protein that forms a coat inside the fat layer, which is the envelope of the influenza virus. it means.
  • the influenza virus consists of subtypes designated A, B and C.
  • the influenza virus is surrounded by a layer of matrix protein (M1) that acts as a linker between the core and the viral envelope, and the M1 protein can be widely used as a structural protein in the development of influenza virus-like particles.
  • the virus-like particle of the present specification includes influenza virus matrix protein 1 (M1) as a structural protein, and in one embodiment, M1 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the M1 may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the Toxoplasmosis-derived surface antigen protein may be used in the present invention without being particularly limited in its type as long as it is a protein capable of inducing immune activity against Toxoplasmosis.
  • the surface antigen protein of the present specification is SAG1 (membrane-associated surface antigen), SAG2, GRA1 (secreted dense-granule protein), GRA2, GRA4, GRA7, MIC1 (Microneme protein), MIC2, MIC4 derived from Toxoplasmosis.
  • the AMA1 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the ROP4 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the ROP18 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • AMA1 may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • ROP4 may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • ROP18 may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the antigen protein introduced to the surface of the virus-like particle has high antigenicity compared to the purely isolated recombinant protein, so it can form an effective neutralizing antibody, and it can be used as a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus. .
  • the ratio of Toxoplasmosis-derived surface antigen protein and influenza virus matrix protein 1 may be present in a ratio of 5:1 to 1:5. It may also be present in a ratio of 3:1, 1:1 or 1:3. Preferably, the ratio may be 3:1.
  • the virus-like particles may be prepared using a vector containing a gene encoding a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis and a vector containing a gene encoding influenza virus matrix protein 1. Specifically, the virus-like particles co-infect a host cell with a recombinant baculovirus containing a gene encoding a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis and a recombinant baculovirus containing a gene encoding influenza virus matrix protein 1 It may be manufactured by
  • the host cell may be an insect cell.
  • insect cell any cell developed or commercially available as a host system for gene expression may be used, for example, Spodoptera frugiperda insect cells SF21, SF9, Trichoplusia ni, anti Carsa gemmitalis, Bombyx mori, Estigmene acrea, Heliothis virescens, Leucania separata, Limantria dispa (Lymantria dispar), Malacasoma disstria (Mammestra brassicae), Manduca sexta (Manduca sexta), Plutella zylostella (Plutella zylostella), Stodoptera exigua ( Spodoptera exigua) and Spodoptera littorlis (Spodoptera littorlis) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • SF9 cells were used.
  • a recombinant baculovirus containing a gene encoding a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis and a recombinant baculovirus containing a gene encoding an influenza virus matrix protein 1 were infected in a 3:1 ratio to produce virus-like particles can be produced.
  • the Toxoplasmosis-derived surface antigen protein; and virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1 have very good specificity and sensitivity. Thus, it can be used to detect autoantibodies produced in individuals infected with Toxoplasmosis and/or influenza virus.
  • the VLPs may be utilized to determine the presence of an anti-AMA1 antibody, an anti-ROP4 antibody, or an anti-ROP18 antibody produced in an individual upon infection with Toxoplasmosis.
  • it can be utilized to determine the presence or absence of anti-M1 antibody produced in an individual upon infection with influenza virus.
  • the VLPs can more efficiently diagnose whether toxoplasmosis and influenza virus infection in an individual infected with both toxoplasmosis and influenza virus simultaneously.
  • the VLPs of the present invention exhibit a significant antigen-antibody reaction not only with the serum from Toxoplasmosis-infected mice, but also with the serum from mice infected with influenza virus. It was confirmed that it can be usefully used for multiple diagnosis of influenza virus at the same time.
  • Another aspect of the present invention provides a multiple diagnostic kit for toxoplasmosis and/or influenza virus comprising the composition for diagnosing toxoplasmosis and/or influenza virus.
  • the diagnostic kit includes: Toxoplasmosis-derived surface antigen protein; and virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1 (M1).
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit used for multiplex diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus at the same time.
  • the composition for diagnosing toxoplasmosis and/or influenza virus, the toxoplasmosis-derived surface antigen protein, the influenza virus matrix protein, and the virus-like particle are as described above.
  • AMA1-M1-VLPs which are VLPs expressing Toxoplasmosis AMA1 protein, ROP4-M1-VLPs which are VLPs expressing Toxoplasmosis ROP4 protein, and ROP18-M1-VLPs which are VLPs expressing Toxoplasmosis ROP18 protein are used. So you can make a kit. In this case, the VLPs may be present in the detection unit of the diagnostic kit.
  • the term “detection unit” refers to a portion comprising a support on which a VLP composition containing a Toxoplasmosis surface antigen protein is immobilized, and at least one of an antibody against Toxoplasmosis and an antibody against influenza virus and the VLP composition is specific It means a place that reacts hostilely.
  • Toxoplasmosis and/or influenza virus multiple diagnostic composition of the detection unit is coated on the support (eg, nitrocellulose membrane) of the detection unit using a dispensing device, and the biological sample isolated from the subject is contacted with the toxoplasmosis. Diagnosis may be performed or multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus may be performed.
  • the diagnostic kit includes an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kit, a RIA (Radioimmnoassay) kit, a Sandwich assay kit, a Western Blot kit, an Immunoblot assay kit and an immunohistochemical staining ( Immnohistochemical staining) may be at least one selected from the group consisting of kits, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit detects the presence or absence of an IgG antibody, IgA or IgM antibody in a biological sample isolated from an individual to diagnose whether toxoplasmosis and influenza virus infection individually or simultaneously, and in the process, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), Sandwich assay, Western Blot, Immunoblot assay and immunohistochemical staining method selected from the group consisting of It may be performed including at least one, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis; and contacting a biological sample isolated from an individual with a composition for multiple diagnosis of toxoplasmosis and/or influenza virus comprising virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1; and detecting an antibody that binds to a virus-like particle; provides a method of providing information necessary for multiple diagnosis of Toxoplasmosis and/or influenza virus infection, including.
  • the composition for diagnosing toxoplasmosis and/or influenza virus, the toxoplasmosis-derived surface antigen protein, the influenza virus matrix protein, and the virus-like particle are as described above.
  • the term "biological sample isolated from a subject” is preferably a body fluid secreted outside the body, and includes blood, serum, plasma, urine, tears, saliva, milk, and the like, and more preferably the subject. It may be blood obtained from, but is not limited thereto.
  • the subject may be a mammal such as a dog, a cat, or a human, preferably a human.
  • the step of detecting the antibody binding to the virus-like particle is ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), sandwich assay (Sandwich assay), Western blot (Western Blot), immunoblot analysis (Immunoblot assay) and It may include at least one selected from the group consisting of immunohistochemical staining.
  • the method of detecting the antibody binding to the virus-like particle may be a method of detecting an antigen-antibody reactant or a labeling factor.
  • a method known to those skilled in the art may be used depending on the type of the antigen-antibody reactant or labeling factor, and specifically, the naked eye, detection equipment, detection reagent, etc. may be used.
  • a confocal laser scanner may be used as the detection equipment, and the detection reagent is a predetermined predetermined that enables the presence of an analyte to be tested to be externally identified through the naked eye or other instruments. It may include a labeled reagent, an auxiliary specific binding member, and/or a component of a signaling system. Labeled detection reagents are well known to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains.
  • labels include catalysts, enzymes (eg, phosphatase, peroxidase, etc., and more specifically, basic phosphatase and mutton peroxidase used together in combination with an enzyme substrate), enzyme substrates (eg, For example, nitroblue tetrazolium, 3,5',5,5'-tetranitrobenzidine, 4-methoxy-1-naphthol, 4-chloro-1-naphthol, 5-bromo-4-chloro-3- Indolyl phosphate, dioxetane as a chemiluminescent enzyme substrate, and derivatives and analogs thereof), fluorescent compounds (eg, fluorescein, phycobiliprotein, rhodamine, and derivatives thereof) and analogs), chemiluminescent compounds, metal sols, dye sols, particulate latex, color indicators, color matter contained in liposomes, carbon sols and and non-metal sols such as selenium, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention the steps of contacting the biological sample isolated from the subject to the composition for diagnosis of toxoplasmosis and / or influenza virus; and detecting an antibody that binds to a virus-like particle; provides a method for multiple diagnosis of Toxoplasmosis and/or influenza virus infection, including.
  • Another aspect of the present invention is a surface antigen protein derived from Toxoplasmosis; and virus-like particles comprising influenza virus matrix protein 1 (M1) for diagnostic use of toxoplasmosis and/or influenza virus infection.
  • the use may be a use for diagnosing toxoplasmosis or multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus at the same time.
  • RNA was obtained from Toxoplasmosis RH samples. Thereafter, the extracted antigen RNA was subjected to RT-PCR to obtain cDNA derived from Toxoplasmosis. Thereafter, dsDNA was obtained based on the obtained cDNA.
  • primers for amplifying AMA1, ROP4 and ROP18 were designed and ordered. Distilled water was added to a mixture of 0.25 ⁇ l of PCR enzyme TaKaRa Ex Taq TM , 5 ⁇ l of 10X Ex Taq buffer, 4 ⁇ l of dNTP mixture, 1 ⁇ l of template, 2 ⁇ l of forward primer, and 2 ⁇ l of reverse primer so that the total volume was 50 ⁇ l. Thereafter, PCR was performed for 30 to 40 cycles at 98° C. for 10 seconds, 55° C. for 30 seconds, and at 72° C. for 1 minute.
  • a PCR amplification product obtained by diluting a DNA marker and a loading dye (6x) on an agarose gel was loaded onto the gel. Thereafter, the PCR amplification product was confirmed using UV light or the like. Then, the DNA encoding the antigen was extracted from the gel in which the desired gene was located.
  • the gene of AMA1 used 5'-AAAGAATTCACCATGGGGCTCGTGGGCGTACA-3' (SEQ ID NO: 11) as a forward primer and 5'-TTACTCGAGCTAGTAATCCCCCTCGACCA-3' (SEQ ID NO: 12) as a reverse primer
  • the ROP4 gene was 5' as a forward primer -AAAGCATGCACCATGGGGCACCCTACCTCTTT-3' (SEQ ID NO: 13) and 5'-TTAGGTACCTCACGTTTCCGGTGGTGGCAT-3' (SEQ ID NO: 14) were used as a reverse primer
  • the gene of ROP18 was 5'-AAAGGATCCACCATGTTTTCGGTACAGCGGCC-3' (SEQ ID NO: 15) as a forward primer and 5'-TTATCTAGATTATTCTGTGTGGAGATGTTC-3' (SEQ ID NO: 16) was used as a reverse primer.
  • DNAs of AMA1, ROP4 and ROP18 which are Toxoplasmosis antigens extracted in Preparation Example 1.2, were loaded into a TA vector. Thereafter, the TA vector loaded with the antigen gene was transformed into E. coli cells and then cultured. After culturing the transformed E. coli cells, genes encoding AMA1, ROP4 and ROP18 were obtained therefrom.
  • the AMA1, ROP4 and ROP18 antigen genes obtained in Preparation Example 1.3 were loaded into pFast-Bac vectors, respectively.
  • the pFast-Bac vector loaded with the antigen gene was transformed into DH10B cells. Transformed cells were cultured to obtain a large amount of pFast-Bac vector loaded with the antigen gene.
  • the pFast-Bac vector loaded with DNA of AMA1, ROP4 and ROP18 was transfected into SF9 cells using cellfectin II (Invitrogen, USA).
  • Recombinant baculovirus (rBV) expressing AMA1, ROP4 and ROP18 was prepared through the Bac-to-Bac expression system (Invitrogen) according to the manufacturer's manual.
  • rBV expressing influenza virus M1 was prepared in the same manner as above. At this time, the gene of M1 was amplified through RT-PCR using forward primer 5'-AAAGGATCCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3' (SEQ ID NO: 9) and reverse primer 5'-TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3' (SEQ ID NO: 10).
  • AMA1 rBV and M1 rBV prepared in Preparation Example 1 were co-infected with SF9 cells. At this time, the ratio of M1 rBV to AMA1 antigen rBV was 1:3 for infection. Thereafter, the infected SF9 cells were cultured, and harvesting was performed when the SF9 cell death rate reached 30% to 40%. Specifically, the cultured cells and the culture medium were centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes to collect the supernatant, and then pelleted by centrifugation at 30,000 rpm and 4°C for 30 minutes. VLPs were purified through a sucrose gradient.
  • VLPs were resuspended in phosphate-buffered saline (PBS) until use.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the VLPs expressing the AMA1 antigen and the M1 antigen were named AMA1-M1-VLPs.
  • An example of a process for preparing AMA1-M1-VLP is shown in FIG. 1A.
  • Toxoplasma gondii (ME49 strain) was orally infected with 300 cyst/mouse (hd) to 7-week-old female BALB/c mice. Serum was obtained. An exemplary sequence for the in-vivo process is shown in FIG. 2 . In addition, after infecting the mice with the malaria parasite ( P. berghei ANKA) 0.5% (0.5 ⁇ 10 4 ), serum was collected from the infected mice.
  • Example 1 In order to check whether the AMA1-M1-VLPs of the present invention obtained in Example 1 can actually diagnose Toxoplasmosis-infected individuals, AMA1-M1 using serum from Toxoplasmosis-infected mice and human patients - It was confirmed by ELISA whether the VLPs reacted with the Toxoplasmosis specific antibody in the serum (Experimental Examples 1.1 to 1.3).
  • TLA Tachyzoite lysate antigen obtained in Example 1 were each coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml.
  • the TLA refers to a lysate antigen of a tachyzoite state in the life cycle of Toxoplasmosis RH.
  • ELISA was performed by diluting 14 mouse sera infected with P. berghei ANKA and 14 mouse sera infected with T. gondii (Toxoplasma gondii) ME49 300 cysts 100-fold ( FIG. 3 ). Serum from mice not infected with the parasite malaria or Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • TLA and AMA1 protein antigens did not respond to any sera.
  • AMA1-M1-VLPs showed little reaction with naive sera and sera infected with protozoa, and showed high reactivity only with sera infected with Toxoplasmosis. It was confirmed that there is specificity between the IgG antibodies (FIG. 4).
  • Example 1.1 in addition to confirming that AMA-M1-VLPs specifically bind to Toxoplasmosis specific IgG antibody, the serum containing the IgG antibody was treated at various concentrations to confirm the sensitivity of these reactions.
  • the same experiment as Example 1.1 was performed.
  • AMA1-M1-VLPs obtained in Example 1, AMA1 protein, and TLA (RH Tachyzoite lysate antigen) were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Thereafter, ELISA was performed by diluting 14 T. gondii ME49 300 cysts-infected mouse serum 100-fold, 300-fold, and 900-fold, respectively ( FIG. 3 ). Serum from mice not infected with Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • AMA1-M1-VLPs showed the highest specificity to mouse serum containing Toxoplasmosis-specific IgG, and among them, it was confirmed that the sensitivity was highest to serum at a concentration 100-fold diluted. (FIG. 5).
  • AMA1-M1-VLPs obtained in Example 1 AMA1 protein, and TLA (RH Tachyzoite lysate antigen) were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Thereafter, ELISA was performed by diluting 10 sera of T. gondii -infected patients 100-fold, 300-fold, and 900-fold, respectively (FIG. 3). Serum from mice not infected with Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • AMA1-M1-VLPs showed the highest specificity to human serum containing Toxoplasmosis specific IgG, and among them, the highest sensitivity to serum diluted 100 times. was confirmed (FIG. 6).
  • Example 2 in order to determine whether the ROP4-M1-VLPs of the present invention obtained in Example 2 can actually diagnose an individual infected with Toxoplasmosis, serum of mice and human patients infected with Toxoplasmosis. Using, it was confirmed through ELISA whether ROP4-M1-VLPs react with Toxoplasmosis specific antibody in serum (Experimental Examples 2.1 to 2.3).
  • ROP4-M1-VLPs, ROP4 protein and RH Tachyzoite lysate antigen (TLA) obtained in Example 2 were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Then, ELISA was performed by diluting 14 mouse sera infected with P. berghei ANKA and 14 mouse sera infected with T. gondii (Toxoplasma gondii) ME49 300 cysts 100-fold ( FIG. 3 ). Serum from mice not infected with the parasite malaria or Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • TLA and AMA1 protein antigens did not respond to any sera.
  • ROP4-M1-VLPs showed little reaction with naive sera and sera infected with protozoa, and showed high reactivity only with sera infected with Toxoplasmosis. It was confirmed that there is specificity between the IgG antibodies (FIG. 7).
  • Example 2.1 in addition to confirming that ROP4-M1-VLPs specifically bind to Toxoplasmosis specific IgG antibody, in order to confirm the sensitivity of these reactions, the serum containing the IgG antibody was treated at various concentrations.
  • the same experiment as Example 2.1 was performed.
  • ROP4-M1-VLPs, ROP4 protein and RH Tachyzoite lysate antigen (TLA) obtained in Example 2 were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Thereafter, ELISA was performed by diluting 14 T. gondii ME49 300 cysts-infected mouse serum 100-fold, 300-fold, and 900-fold, respectively (FIG. 3). Serum from mice not infected with Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • ROP4-M1-VLPs showed the highest specificity to mouse serum containing Toxoplasmosis-specific IgG, and among them, it was confirmed that the highest sensitivity to a 100-fold diluted concentration ( Fig. 8).
  • AMA1-M1-VLPs showed the highest specificity to human serum containing Toxoplasmosis specific IgG, and among them, the highest sensitivity to serum diluted 100 times. was confirmed (FIG. 9).
  • Example 3 As in Experimental Example 1, in order to confirm whether the ROP18-M1-VLPs of the present invention obtained in Example 3 can actually diagnose an individual infected with Toxoplasmosis, serum of mice and human patients infected with Toxoplasmosis. Using, it was confirmed through ELISA whether ROP18-M1-VLPs react with Toxoplasmosis specific antibody in serum (Experimental Examples 3.1 to 3.3).
  • ROP18-M1-VLPs, ROP18 protein and RH Tachyzoite lysate antigen (TLA) obtained in Example 3 were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Then, ELISA was performed by diluting 14 mouse sera infected with P. berghei ANKA and 14 mouse sera infected with T. gondii (Toxoplasma gondii) ME49 300 cysts 100-fold ( FIG. 3 ). Serum from mice not infected with protozoan malaria or Toxoplasmosis was used as a control (naive).
  • TLA and AMA1 protein antigens did not react to any sera.
  • ROP18-M1-VLPs showed little reaction with naive sera and sera infected with protozoal malaria, and showed high reactivity only with sera infected with Toxoplasmosis. It was confirmed that there is specificity between the IgG antibodies (FIG. 10).
  • Example 3.1 in addition to confirming that ROP18-M1-VLPs specifically bind to Toxoplasmosis specific IgG antibody, in order to confirm the sensitivity of these reactions, the serum containing the IgG antibody was treated at various concentrations.
  • the same experiment as Example 3.1 was performed.
  • ROP18-M1-VLPs, ROP18 protein and RH Tachyzoite lysate antigen (TLA) obtained in Example 3 were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. Thereafter, ELISA was performed by diluting 14 T. gondii ME49 300 cysts-infected mouse serum 100-fold, 300-fold, and 900-fold, respectively ( FIG. 3 ). Serum from mice not infected with Toxoplasmosis was used as a control (Naive).
  • ROP18-M1-VLPs showed the highest specificity to mouse serum containing Toxoplasmosis specific IgG, and among them, it was confirmed that the highest sensitivity to serum diluted 100-fold. (FIG. 11).
  • AMA1-M1-VLPs showed the highest specificity to human serum containing Toxoplasmosis-specific IgG, and among them, the highest sensitivity to serum diluted 100-fold. was confirmed (FIG. 12).
  • AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs, ROP18-M1-VLPs and TLA RVT Tachyzoite lysate antigen obtained in Examples 1 to 3 were coated on a 96-well immunoplate at a concentration of 4 ⁇ g/ml, respectively. did.
  • ELISA was performed by 100-fold dilution of naive mouse serum, T. gondii ME49 300 cysts-infected mouse serum, influenza M1 VLPs inoculated with 10 ⁇ g, and NA (neuraminidase) VLPs inoculated with 10 ⁇ g serum. proceeded.
  • NA VLPs were prepared by amplifying the cDNA of NA in influenza virus A/PR/8/34 (H1N1), and preparing T. gondii VLPs by the same method.
  • AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs were coated with the AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs-coated immunoplates by measuring a value of 0.2 or more for the serum of mice inoculated with influenza M1 VLPs or NA VLPs 10 ⁇ g at the same time. It was confirmed that multiple diagnosis of toxoplasmosis and influenza virus is possible (FIG. 13).
  • AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs were highly sensitive to anti-AMA1 antibodies, anti-ROP4 antibodies and/or anti-ROP18 antibodies present in the sera of Toxoplasmosis-infected individuals. It was confirmed that it can be detected not only with the specificity of the virus, but also with the anti-M1 antibody present in the serum of an individual infected with influenza virus or with high sensitivity and specificity.
  • the AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs and ROP18-M1-VLPs of the present application may be used as a composition for simultaneously diagnosing an individual infected with Toxoplasmosis and/or an individual infected with an influenza virus.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 T. gondii 표면 항원 단백질이 포함된 VLP 및 인플루엔자 바이러스 M1 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자(VLPs)를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다. 일 구체예로 상기 VLPs는 TgAMA1 VLP, TgROP4 VLP 및 TgROP18로 구성된 군으로부터 적어도 하나의 단백질을 포함한다. 상기 다중 진단용 조성물은 톡소포자충에 감염된 개체 및 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 높은 민감도와 특이성으로 반응할 수 있다. 따라서, 상기 다중 진단용 조성물은 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단 키트에 활용될 수 있다.

Description

톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법
본 발명은 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스를 진단하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.
톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 세포 내 기생충으로서 인간 및 동물에 대한 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis)을 야기하는 원인 원충이다(Astrid M. Tenter et al.). 톡소포자충은 크게 난포낭(oocyst, 오시스트), 영양형(tachyzoit, 타키조이트), 감염형(bradyzoit, 브래디조이트), 분열체(schizont, 시존트) 및 생식모체(gametocyte, 거미토사이트) 단계의 5가지 발육 단계를 거친다. 톡소포자충은 종숙주인 고양이 분변의 난포낭(oocyst)에 의해 오염된 물 또는 야채를 섭취함으로써 감염되거나, 중간숙주인 돼지, 양, 소 등의 육류에 씨스트(cyst)로 존재하는 톡소포자충을 섭식할 때 감염될 수 있다. 전 세계 인구의 약 3분의 1 이상이 톡소포자충에 감염된 것으로 추정되며, 국내에서도 그룹에 따라 2 내지 25%의 감염율을 나타내는 것으로 보고되고 있다.
특히, 톡소포자충이 산모를 감염시켰을 때 그 영양형(trophozoite)은 태반을 거쳐 태아를 감염시킬 수 있다. 톡소포자충의 감염에 의해 초기의 태아는 유산 또는 사산에 이를 수 있으며, 중후기의 태아는 정상적 분만에도 불구하고 시력 손상, 수두증, 정신박약 등의 선천적 기형이 야기될 수 있다. 또한, 건강한 개체를 감염시킨 톡소포자충은 면역계 세포, 망상내피계 세포 등을 파괴시켜 림프선염, 망막맥락막염, 뇌척수염 등의 질병을 유발할 수 있으며, 숙주의 면역부전시 뇌에서 증식된 씨스트가 활성화 되어 뇌수막염 또는 망막맥락막염을 일으킬 수 있다.
한편, 인플루엔자는 호흡기 바이러스로 인한 인간의 사망에 있어서 주요한 원인중 하나이다. 일반적인 증상은 특히 발열, 인후통, 숨가쁨 및 근육통을 포함한다. 독감 시즌의 인플루엔자 바이러스는 강한 전염성으로 인해 세계 인구의 10% ~ 20%를 감염시키고 사망자만 연간 250,000명 ~ 500,000명에 이른다. 이들 질병의 공통점은 다른 질병의 증상이 유사한 증상을 가지고 있다는 점이다. 따라서, 다른 질병과의 혼동을 줄이기 위해 라텍스 응집 테스트(Latex Agglutination Test), 항혈청진단법(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay, ELISA)과 같은 면역학적 방법, Nested PCR, real-time PCR과 같은 DNA 검출 방법 등 다양한 진단 방법이 사용되고 있다.
그러나, 종래의 진단 방법은 진단까지 신속성이 떨어지거나, 고가의 장비 사용으로 인한 낮은 경제성 또는 낮은 민감성의 문제가 있기 때문에, 신속성, 경제성 및 민감성이 높은 새로운 진단 방법이 필요한 상황이다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Astrid M. Tenter et al., "Toxoplasma gondii: from animals to humans", Int J Parasitol. 2000 Nov; 30(12-13), 1217-1258
이에 본 발명자들은 톡소포자충을 높은 민감성으로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단할 수 있으면서도 신속성 및 경제성이 높은 방법을 개발하기 위해 연구한 결과, 본 발명에 따른 VLP 형태 진단용 조성물을 포함한 진단 방법 및 진단 키트가 항원 용해물(lysate antigen) 및 항원 단백질에 비해 면역학적 특이성 및 민감성이 더 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면으로, 상기 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면으로, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물에 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스의 감염을 다중 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 톡소포자충 항원 단백질 및 인플루엔자 바이러스 M1 단백질이 포함된 바이러스-유사 입자를 포함하는 진단용 조성물은 높은 특이성 및 민감성으로 톡소포자충에 감염된 개체의 혈청에 존재하는 자가 항체와 반응할 수 있다. 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체에 존재하는 자가 항체와 반응할 수 있다. 따라서, 상기 바이러스-유사 입자는 톡소포자충 진단 및/또는 인플루엔자 바이러스 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 AMA1, ROP4 또는 ROP18 유전자를 포함한 rBV(재조합 배큘로 바이러스) 및 인플루엔자 M1 유전자를 포함한 rBV를 SF9 곤충 세포에 형질 감염시켜 AMA1, ROP4 또는 ROP18 VLPs(Virus-like particles)를 수득하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 명세서의 일 실시예에서 마우스로부터 감염 혈청을 수득하는 In vivo 시험 과정을 시계열적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 명세서의 일 실시예에서 제작한 VLP를 이용하여 ELISA를 이용하여 진단하는 방법에 관한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 Naive 마우스 혈청, P. berghei ANKA(말라리아 원충) 또는 T. gondii(톡소포자충) ME49로 감염된 마우스의 혈청을 각각 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen), AMA1-M1-VLPs 및 AMA1 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 AMA1-M1-VLPs의 특이성을 확인한 것이다.
도 5는 T. gondii ME49로 감염된 마우스의 혈청을 각각 TLA, AMA1-M1-VLPs 및 AMA1 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 AMA1-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 6은 T. gondii ME49로 감염된 인간 혈청을 각각 TLA, AMA1-M1-VLPs 및 AMA1 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 AMA1-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 7은 Naive 마우스 혈청, P. berghei ANKA 또는 T. gondii ME49로 감염된 마우스 혈청을 각각 TLA, ROP4-M1-VLPs 및 ROP4 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP4-M1-VLPs의 특이성을 확인한 것이다.
도 8은 T. gondii ME49로 감염된 마우스 혈청을 각각 TLA, ROP4-M1-VLPs 및 ROP4 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP4-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 9는 T. gondii ME49로 감염된 인간 혈청을 각각 TLA, ROP4-M1-VLPs 및 ROP4 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP4-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 10은 Naive 마우스 혈청, P. berghei ANKA 또는 T. gondii ME49로 감염된 마우스 혈청을 각각 TLA, ROP18-M1-VLPs 및 ROP18 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP18-M1-VLPs의 특이성을 확인한 것이다.
도 11은 T. gondii ME49로 감염된 마우스 혈청을 각각 TLA, ROP18-M1-VLPs 및 ROP18 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP18-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 12는 T. gondii ME49로 감염된 인간 혈청을 각각 TLA, ROP18-M1-VLPs 및 ROP18 단백질이 코팅된 면역플레이트에 접촉시킴으로써 감염 혈청에 대한 ROP18-M1-VLPs의 민감성을 확인한 것이다.
도 13은 TLA, AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs가 각각 코팅된 면역플레이트에서 Naive 마우스 혈청, T. gondii ME49로 감염된 마우스 혈청, 인플루엔자 M1 VLPs 10 ㎍을 접종한 마우스의 혈청 및 NA(neuraminidase) VLPs 10 ㎍을 접종한 마우스의 혈청을 각각 접촉시킨 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs로 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스의 다중 진단이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 일 측면은, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 바이러스-유사 입자(Virus-like particle, VLP)를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스를 동시에 다중 진단하기 위한 용도인 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "바이러스-유사 입자"(VLP) 또는 "바이러스-유사 입자들"(VLPs)은 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 아단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스-유사 입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 바이러스-유사 입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 구조 단백질(core protein)로서 인플루엔자 바이러스 유래의 매트릭스 단백질(M1)을 포함한다. 본 발명의 바이러스-유사 입자는 별도의 원인 감염체, 즉 톡소포자충 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1"(M1)은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질 단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C로 명명된 서브타입으로 구성된다. 상기 인플루엔자 바이러스는 코어와 바이러스 외피 간의 연결체로 작용하는 매트릭스 단백질(M1)의 층으로 둘러싸여 외형을 이루며, 상기 M1 단백질은 인플루엔자 바이러스-유사 입자의 개발에 있어서 구조 단백질로서 널리 사용될 수 있다. 본 명세서의 바이러스-유사 입자는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 구조 단백질로서 포함하며, 일 실시예로 상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 M1은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질은 톡소포자충에 대한 면역 활성을 유도할 수 있는 단백질이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않고 본 발명에 이용될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서의 표면 항원 단백질은 톡소포자충에서 유래한 SAG1(Membrane-associated surface antigen), SAG2, GRA1(secreted dense-granule protein), GRA2, GRA4, GRA7, MIC1(Microneme protein), MIC2, MIC4, MIC6, MIC7, MIC8, MIC9, MIC10, MIC11, ROP1, ROP2, ROP3, ROP4, ROP5, ROP6, ROP7, ROP8, ROP9, ROP10, ROP11, ROP12, ROP13, ROP14, ROP15, ROP16, ROP17, ROP18, M2AP(MIC2 associated protein), AMA1(Plasmodium apical membrane antigen 1) 및 BAG1 등 다양한 종류의 단백질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 AMA1, ROP4 및 ROP18 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
이때, 상기 AMA1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 ROP4는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 ROP18은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 AMA1은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, ROP4는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, ROP18은 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
여기서 바이러스-유사 입자의 표면에 도입된 항원 단백질은 순수하게 분리된 재조합 단백질에 비해 높은 항원성을 가지므로 효과적인 중화항체를 형성할 수 있고, 이에 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물로 활용할 수 있다.
상기 바이러스-유사 입자에서 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1의 비율은 5:1 내지 1:5의 비율로 존재할 수 있다. 또한, 3:1, 1:1 또는 1:3의 비율로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 비율은 3:1일 수 있다.
상기 바이러스-유사 입자는 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스-유사 입자는 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 숙주세포에 공동 감염시켜 제조된 것일 수 있다.
이때, 숙주세포는 곤충세포를 이용할 수 있다. 상기 곤충 세포는 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발되거나 시판되는 모든 세포가 사용될 수 있으며, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 곤충 세포(Spodoptera frugiperda) SF21, SF9, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 안티카르사 겜미탈리스(Anticarsa gemmitalis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae), 만두카 섹스타(Manduca sexta), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서 SF9 세포를 이용하였다.
또한, 공동 감염시에 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스와 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러는 3:1로 감염시켜 바이러스-유사 입자를 제조할 수 있다.
특히, 상기 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하는 바이러스-유사 입자는 특이성 및 민감성이 매우 우수하다. 따라서, 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체내에 생성된 자가 항체를 검출하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 톡소포자충의 감염시에 개체내에 생성되는 항-AMA1 항체, 항-ROP4 항체 또는 항-ROP18 항체의 존재 여부를 판단하는데, 상기 VLPs가 활용될 수 있다. 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스에 감염시에 개체내에 생성되는 항-M1 항체의 존재 여부를 판단하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실험예에서는 톡소포자충이 감염된 마우스 및 인간 환자로부터 수득한 혈청과 상기 VLPs를 이용해 ELISA를 수행하였을 때 높은 민감성을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 VLPs는 말라리아 원충(P. berghei ANKA)이 감염된 마우스의 혈청이나 Naive 마우스의 혈청에 대해서는 유의미한 항체 반응을 보이지 않았으므로, 톡소포자충에 감염된 개체를 진단하기 위해 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 동일한 ELISA 실험을 수행했음에도, TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)나 AMA1, ROP4, ROP18과 같은 단백질에 대해서는 톡소포자충 감염 마우스 유래 혈청이라도 상기 VLPs에 비해 항체 반응이 거의 나타나지 않았으므로, 톡소포자충 유래의 단백질이나 톡소포자충의 용해물을 이용하는 경우보다도, 본 발명의 VLPs가 톡소포자충 감염을 민감하게 진단하는 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.
더욱이, 상기 VLPs는 톡소포자충 및 인플루엔자 바이러스가 동시에 감염된 개체에서는 더욱 효율적으로 톡소포자충 및 인플루엔자 바이러스의 감염 여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실험예에서는 톡소포자충이 감염된 마우스 유래 혈청뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스가 감염된 마우스 유래의 혈청에 대해서도 본 발명의 VLPs가 유의미한 항원-항체 반응을 나타냄을 확인하였고, 따라서 상기 VLPs는 톡소포자충과 인플루엔자 바이러스를 동시에 다중 진단하기 위한 용도로도 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단 키트를 제공한다. 상기 진단 키트는, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함할 수 있다.
또한, 상기 진단 키트는 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스를 동시에 다중 진단하기 위한 용도인 진단 키트일 수 있다.
이때, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 및 바이러스-유사 입자는 상술한 바와 같다. 일 구체예로 톡소포자충 AMA1 단백질을 발현하는 VLPs인 AMA1-M1-VLPs, 톡소포자충 ROP4 단백질을 발현하는 VLPs인 ROP4-M1-VLPs, 톡소포자충 ROP18 단백질을 발현하는 VLPs인 ROP18-M1-VLPs를 이용하여 키트를 제작할 수 있다. 이때, 상기 VLPs는 진단 키트의 검출부에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "검출부"는 톡소포자충 표면 항원 단백질이 포함된 VLP 조성물이 고정화된 지지체를 포함하는 부분으로서, 톡소포자충에 대한 항체 및 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 중 적어도 1개와 상기 VLP 조성물이 특이적으로 반응하는 장소를 의미한다.
상기 검출부의 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물은 디스펜싱 기구를 사용하여 검출부의 지지체(예컨대, 니트로 셀룰로오스 막)에 코팅하며, 해당 부분에 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시킴으로서 톡소포자충의 진단이 수행되거나 톡소포자충 및 인플루엔자 바이러스 다중 진단이 수행될 수 있다.
상기 진단 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, RIA(Radioimmnoassay) 키트, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 키트, 웨스턴 블롯(Western Blot) 키트, 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 키트 및 면역조직화학염색(Immnohistochemical staining) 키트로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 진단 키트는 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 IgG 항체, IgA 또는 IgM 항체의 존재 여부를 탐지하여 톡소포자충 및 인플루엔자 바이러스 감염여부를 개별적으로 또는 동시에 진단할 수 있으며, 그 과정에서 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물에 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염을 다중 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이때, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 및 바이러스-유사 입자는 상술한 바와 같다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "개체로부터 분리된 생물학적 시료"는 바람직하게는 체외로 분비되는 체액으로서, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 눈물, 침, 젖 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 개체부터 수득한 혈액일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 이때, 개체는 개, 고양이, 또는 인간과 같은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게 인간일 수 있다.
상기 바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 단계는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 방법은, 항원-항체 반응물 또는 표지인자를 검출하는 방법일 수 있다. 상기 항원-항체 반응물 또는 표지인자의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출장비로는 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)을 이용할 수 있으며, 상기 검출시약은 검사하고자 하는 표지인자(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스퍼타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들어, 플로우레세인(fluorescein), 피코빌리프로틴(phycobiliprotein), 로다민(rhodamine) 등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물에 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염을 다중 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 바이러스-유사 입자의 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단 용도를 제공한다. 구체적으로, 상기 용도는 톡소포자충증을 진단하거나 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스를 동시에 다중 진단하기 위한 용도일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
I. 톡소포자충 항원 및 인플루엔자 항원을 포함한 VLP의 제조
제조예 1. 톡소포자충 항원을 발현하는 배큘로바이러스 제조
제조예 1.1. 톡소포자충 cDNA 수득
톡소포자충 RH로부터 AMA1, ROP4 및 ROP18을 코딩하는 RNA를 추출하기 위해, 톡소포자충 RH 샘플에서 RNA를 수득하였다. 이 후, 추출된 항원 RNA를 RT-PCR을 수행하여 톡소포자충 유래의 cDNA를 수득하였다. 그 후, 수득된 cDNA를 기반으로 dsDNA를 수득하였다.
제조예 1.2. 항원 cDNA 수득
목적 유전자에 대한 PCR을 수행하기 위해, AMA1, ROP4 및 ROP18를 증폭하기 위한 프라이머를 디자인 및 주문하였다. PCR용 효소 TaKaRa Ex TaqTM 0.25 ㎕, 10X Ex Taq 버퍼 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 템플릿 1 ㎕, 정방향 프라이머 2 ㎕, 및 역방향 프라이머 2 ㎕의 혼합물에 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 넣었다. 그 후, PCR을 98℃에서 10초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 조건으로 30 ~ 40 사이클 수행하였다. 이후, 아가로오스 겔에 DNA 마커 및 로딩 염료(loading dye)(6x)를 희석한 PCR 증폭 산물을 겔에 로딩하였다. 그 후, UV 등을 이용하여 PCR 증폭 산물을 확인하였다. 그 후, 원하는 유전자가 위치한 겔에서 항원을 코딩하는 DNA를 추출하였다.
상기에서 AMA1의 유전자는 정방향 프라이머로 5'-AAAGAATTCACCATGGGGCTCGTGGGCGTACA-3'(서열번호 11) 및 역방향 프라이머로 5'-TTACTCGAGCTAGTAATCCCCCTCGACCA-3'(서열번호 12)을 이용하였고, ROP4의 유전자는 정방향 프라이머로 5'-AAAGCATGCACCATGGGGCACCCTACCTCTTT-3'(서열번호 13) 및 역방향 프라이머로 5'-TTAGGTACCTCACGTTTCCGGTGGTGGCAT-3'(서열번호 14)을 이용하였고, ROP18의 유전자는 정방향 프라이머로 5'-AAAGGATCCACCATGTTTTCGGTACAGCGGCC-3'(서열번호 15) 및 역방향 프라이머로 5'-TTATCTAGATTATTCTGTGTGGAGATGTTC-3'(서열번호 16)을 이용하였다.
제조예 1.3. 항원 유전자 증폭
제조예 1.2에서 추출한 톡소포자충 항원인 AMA1, ROP4 및 ROP18의 DNA를 TA 벡터에 적재시켰다. 그 후, 항원 유전자가 적재된 TA 벡터를 대장균 세포에 형질전환시킨 후 이를 배양하였다. 형질전환된 대장균 세포를 배양한 후, 이로부터 AMA1, ROP4 및 ROP18을 코딩하는 유전자를 수득하였다.
제조예 1.4. 항원 유전자가 적재된 pFast-Bac 플라스미드 제조
제조예 1.3에서 수득한 AMA1, ROP4 및 ROP18 항원 유전자를 pFast-Bac 벡터에 각각 적재시켰다. 항원 유전자가 적재된 pFast-Bac 벡터를 DH10B 세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 배양하여 항원 유전자가 적재된 pFast-Bac 벡터를 다량 수득하였다.
제조예 1.5. 톡소포자충 항원을 발현하는 배큘로바이러스 제조
AMA1, ROP4 및 ROP18의 DNA가 적재된 pFast-Bac 벡터를 cellfectin II(Invitrogen,USA)를 사용하여 SF9 세포 내로 형질감염시켰다. Bac-to-Bac 발현 시스템(Invitrogen)을 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 AMA1, ROP4 및 ROP18을 발현하는 재조합 배큘로바이러스(rBV)를 제조하였다.
또한, 인플루엔자 바이러스 M1을 발현하는 rBV를 상기와 동일한 방법으로 제조하였다. 이때, M1의 유전자는 정방향 프라이머 5'-AAAGGATCCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3'(서열번호 9) 및 역방향 프라이머 5'-TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3'(서열번호 10)을 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.
실시예 1. 톡소포자충 항원 및 인플루엔자 항원을 포함한 VLP 제조: AMA1-M1-VLPs
AMA1 및 M1 단백질을 포함하는 제1 톡소포자충 VLP를 제조하기 위하여, 제조예 1을 통해 제조한 AMA1 rBV 및 M1 rBV를 SF9 세포에 공동 감염시켰다. 이때 M1 rBV와 AMA1 항원 rBV의 비율은 1:3으로 하여 감염시켰다. 이 후, 감염시킨 SF9 세포를 배양하고, SF9 세포 사멸율이 30% ~ 40%가 되었을 때 하베스트를 수행하였다. 구체적으로 배양한 세포 및 배양액을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 상청액을 모은 후에, 30,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하여 펠렛화하였다. VLPs는 수크로오스 구배를 통해 정제하였다. 또한, VLPs는 사용시까지 인산염-완충 식염수(PBS)에서 재현탁시켰다. 이렇게 AMA1 항원 및 M1 항원을 발현하는 VLP를 AMA1-M1-VLPs라 명명하였다. AMA1-M1-VLP를 제조하는 과정에 대한 예시를 도 1a에 도시하였다.
실시예 2. 톡소포자충 항원 및 인플루엔자 항원을 포함한 VLP 제조: ROP4-M1-VLPs
또한, ROP4 및 M1 단백질을 포함하는 제2 톡소포자충 VLP를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 SF9에 제조예 1을 통해 제조한 ROP4 rBV 및 M1 rBV를 공동 감염시켜 ROP4-M1-VLPs를 수득하였다(도 1b).
실시예 3. 톡소포자충 항원 및 인플루엔자 항원을 포함한 VLP 제조: ROP18-M1-VLPs
또한, ROP18 및 M1 단백질을 포함하는 제3 톡소포자충 VLP를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 SF9에 제조예 1을 통해 제조한 ROP18 rBV 및 M1 rBV를 공동 감염시켜 ROP18-M1-VLPs를 수득하였다(도 1c).
II. VLPs를 이용한 톡소포자충 및 인플루엔자 진단
제조예 2. 톡소포자충 및 말라리아 감염 마우스로부터 혈청 채취
톡소포자충(ME49 strain)의 씨스트(cyst)를 300 cyst/마리(hd)로 7주령의 female BALB/c 마우스에 경구 감염(oral infection)시켰으며, 안와정맥총에서 채혈 후 원심분리하는 방식으로 감염 혈청을 수득하였다. 상기 in-vivo 과정에 대한 예시적인 순서는 도 2에 나타내었다. 또한, 말라리아 원충(P. berghei ANKA) 0.5%(0.5 Х 104)를 마우스에 감염시킨 후, 감염된 마우스로부터 혈청을 수거하였다.
실험예 1. AMA1-M1-VLPs와 IgG 항체 반응 시험
실시예 1을 통해 수득한 본 발명의 AMA1-M1-VLPs가 실제로 톡소포자충이 감염된 개체를 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 톡소포자충이 감염된 마우스 및 인간 환자의 혈청을 이용하여, AMA1-M1-VLPs가 혈청 내 톡소포자충 특이 항체와 반응하는지 여부를 ELISA를 통해 확인하였다(실험예 1.1 내지 1.3).
실험예 1.1. 마우스 혈청에서 AMA1-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 특이성 시험
실시예 1에서 수득한 AMA1-M1-VLPs, AMA1 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96 웰 면역플레이트에 코팅하였다. 상기 TLA는 톡소포자충 RH의 생활사 중 영양형(tachyzoite) 상태인 것의 용해물 항원을 의미한다. 이후, 말라리아 원충(P. berghei ANKA)을 감염시킨 마우스 혈청 14개, T. gondii(톡소포자충) ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 100배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 말라리아 원충이나 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 3가지의 코팅한 항원 중에서 TLA 및 AMA1 단백질 항원은 어느 혈청에도 반응하지 않았다. 이와는 달리, AMA1-M1-VLPs는 Naive 혈청 및 말라리아 원충을 감염시킨 혈청과는 거의 반응하지 않으면서, 톡소포자충을 감염시킨 혈청에 대해서만 높은 반응성을 나타내, AMA1-M1-VLPs와 혈청 내 톡소포자충 특이 IgG 항체간의 특이성이 있음을 확인하였다(도 4).
실험예 1.2. 마우스 혈청에서 AMA1-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
상기 실험예 1.1에서, AMA-M1-VLPs가 톡소포자충 특이 IgG 항체와 특이적으로 결합함을 확인한 것에 더하여, 이들 반응의 민감성을 확인하기 위해 상기 IgG 항체가 포함된 혈청을 다양한 농도로 처리하여 실험예 1.1과 동일한 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 수득한 AMA1-M1-VLPs, AMA1 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 실험예 1.1과 마찬가지로 AMA1-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 마우스 혈청에 대한 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도의 혈청에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 5).
실험예 1.3. 인간 혈청에서 AMA1-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
톡소포자충이 감염된 인간의 혈청에 대한 항체 반응의 민감성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 1.1 및 1.2와 유사한 방법으로 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 수득한 AMA1-M1-VLPs, AMA1 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii가 감염된 환자의 혈청 10개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 마우스 혈청을 이용한 실험과 마찬가지로 AMA1-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 인간 혈청에 대해서도 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도의 혈청에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 6).
실험예 2. ROP4-M1-VLPs와 IgG 항체 반응 시험
실험예 1과 마찬가지로, 실시예 2를 통해 수득한 본 발명의 ROP4-M1-VLPs가 실제로 톡소포자충이 감염된 개체를 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 톡소포자충이 감염된 마우스 및 인간 환자의 혈청을 이용하여, ROP4-M1-VLPs가 혈청 내 톡소포자충 특이 항체와 반응하는지 여부를 ELISA를 통해 확인하였다(실험예 2.1 내지 2.3).
실험예 2.1. 마우스 혈청에서 ROP4-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 특이성 시험
실시예 2에서 수득한 ROP4-M1-VLPs, ROP4 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, 말라리아 원충(P. berghei ANKA)을 감염시킨 마우스 혈청 14개, T. gondii(톡소포자충) ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 100배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 말라리아 원충이나 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 3가지의 코팅한 항원 중에서 TLA 및 AMA1 단백질 항원은 어느 혈청에도 반응하지 않았다. 이와는 달리, ROP4-M1-VLPs는 Naive 혈청 및 말라리아 원충을 감염시킨 혈청과는 거의 반응하지 않으면서, 톡소포자충을 감염시킨 혈청에 대해서만 높은 반응성을 나타내, ROP4-M1-VLPs와 혈청 내 톡소포자충 특이 IgG 항체간의 특이성이 있음을 확인하였다(도 7).
실험예 2.2. 마우스 혈청에서 ROP4-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
상기 실험예 2.1에서, ROP4-M1-VLPs가 톡소포자충 특이 IgG 항체와 특이적으로 결합함을 확인한 것에 더하여, 이들 반응의 민감성을 확인하기 위해 상기 IgG 항체가 포함된 혈청을 다양한 농도로 처리하여 실험예 2.1과 동일한 실험을 수행하였다. 실시예 2에서 수득한 ROP4-M1-VLPs, ROP4 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 실험예 2.1과 마찬가지로 ROP4-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 마우스 혈청에 대한 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 8).
실험예 2.3. 인간 혈청에서 ROP4-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
톡소포자충이 감염된 인간의 혈청에 대한 항체 반응의 민감성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 2.1 및 2.2와 유사한 방법으로 실험을 수행하였다. 실시예 2에서 수득한 ROP4-M1-VLPs, ROP4 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii가 감염된 환자의 혈청 10개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 마우스 혈청을 이용한 실험과 마찬가지로 AMA1-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 인간 혈청에 대해서도 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도의 혈청에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 9).
실험예 3. ROP18-M1-VLPs와 IgG 항체 반응 시험
실험예 1과 마찬가지로, 실시예 3을 통해 수득한 본 발명의 ROP18-M1-VLPs가 실제로 톡소포자충이 감염된 개체를 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 톡소포자충이 감염된 마우스 및 인간 환자의 혈청을 이용하여, ROP18-M1-VLPs가 혈청 내 톡소포자충 특이 항체와 반응하는지 여부를 ELISA를 통해 확인하였다(실험예 3.1 내지 3.3).
실험예 3.1. 마우스 혈청에서 ROP18-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 특이성 시험
실시예 3에서 수득한 ROP18-M1-VLPs, ROP18 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, 말라리아 원충(P. berghei ANKA)을 감염시킨 마우스 혈청 14개, T. gondii(톡소포자충) ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 100배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 말라리아 원충이나 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.그 결과, 3가지의 코팅한 항원 중에서 TLA 및 AMA1 단백질 항원은 어느 혈청에도 반응하지 않았다. 이와는 달리, ROP18-M1-VLPs는 Naive 혈청 및 말라리아 원충을 감염시킨 혈청과는 거의 반응하지 않으면서, 톡소포자충을 감염시킨 혈청에 대해서만 높은 반응성을 나타내, ROP18-M1-VLPs와 혈청 내 톡소포자충 특이 IgG 항체간의 특이성이 있음을 확인하였다(도 10).
실험예 3.2. 마우스 혈청에서 ROP18-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
상기 실험예 3.1에서, ROP18-M1-VLPs가 톡소포자충 특이 IgG 항체와 특이적으로 결합함을 확인한 것에 더하여, 이들 반응의 민감성을 확인하기 위해 상기 IgG 항체가 포함된 혈청을 다양한 농도로 처리하여 실험예 3.1과 동일한 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 수득한 ROP18-M1-VLPs, ROP18 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청 14개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 실험예 3.1과 마찬가지로 ROP18-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 마우스 혈청에 대한 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도의 혈청에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 11).
실험예 3.3. 인간 혈청에서 ROP18-M1-VLPs와 IgG 항체 반응의 민감성 시험
톡소포자충이 감염된 인간의 혈청에 대한 항체 반응의 민감성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 3.1 및 3.2와 유사한 방법으로 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 수득한 ROP18-M1-VLPs, ROP18 단백질 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다. 이후, T. gondii가 감염된 환자의 혈청 10개를 각각 100배, 300배, 900배 희석하여 ELISA를 진행하였다(도 3). 톡소포자충을 감염시키지 않은 마우스의 혈청을 대조군(Naive)으로 이용하였다.
그 결과, 마우스 혈청을 이용한 실험과 마찬가지로 AMA1-M1-VLPs는 톡소포자충 특이 IgG가 포함된 인간 혈청에 대해서도 특이성이 가장 높은 것으로 나타났고, 그 중에서도 100배 희석한 농도의 혈청에 대해서 가장 민감성이 높음을 확인하였다(도 12).
실험예 4. AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs, ROP18-M1-VLPs를 이용한 톡소포자충 및 인플루엔자 동시 진단
실시예 1 내지 실시예 3에서 수득한 AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs, ROP18-M1-VLPs 및 TLA(RH Tachyzoite lysate antigen)를 각각 4 ㎍/㎖의 농도로 96웰 면역플레이트에 코팅하였다.
이후, Naive 마우스 혈청, T. gondii ME49 300 cysts를 감염시킨 마우스 혈청, 인플루엔자 M1 VLPs 10 ㎍을 접종한 마우스의 혈청 및 NA(neuraminidase) VLPs 10 ㎍을 접종한 마우스의 혈청을 100배 희석하여 ELISA를 진행하였다.
여기서, NA VLPs는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)에서 NA의 cDNA를 증폭시켜, T. gondii VLPs를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
그 결과, 상기 4가지의 항원이 코팅된 면역플레이트 중 AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs가 코팅된 면역플레이트에서 492 ㎚로 OD값을 측정했을 때 톡소포자충을 감염시킨 마우스 혈청에서 유의미하게 높은 IgG 항체 반응이 나타났다. 뿐만 아니라, 동시에 인플루엔자 M1 VLPs 또는 NA VLPs 10 ㎍을 접종한 마우스의 혈청에 대해서도 0.2 이상의 값을 측정함으로써 상기 AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs가 코팅된 면역플레이트로 톡소포자충증 및 인플루엔자 바이러스의 다중 진단이 가능함을 확인하였다(도 13).
결론적으로, AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs는 톡소포자충에 감염된 개체의 혈청에 존재하는 항-AMA1 항체, 항-ROP4 항체 및/또는 항-ROP18 항체를 높은 민감도와 특이성으로 검출 가능할 뿐 아니라, 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체의 혈청에 존재하는 항-M1 항체 또는 높은 민감도와 특이성으로 검출 가능함을 확인하였다. 따라서, 본원의 AMA1-M1-VLPs, ROP4-M1-VLPs 및 ROP18-M1-VLPs는 톡소포자충에 감염된 개체 및/또는 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체를 동시에 진단하기 위한 조성물로 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질은 AMA1, ROP4 및 ROP18로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것인, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 M1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것인, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 AMA1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 ROP4는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 ROP18은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    바이러스-유사 입자에서 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1의 비율은 3:1인 것인, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스-유사 입자는 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 공동 감염시켜 제조된 것인, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    공동 감염시에 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스와 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러는 3:1로 감염시키는 것을 특징으로 하는, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스의 감염된 개체의 자가 항체의 수준을 진단하는 것을 특징으로 하는, 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 진단 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, RIA(Radioimmnoassay) 키트, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 키트, 웨스턴 블롯(Western Blot) 키트, 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 키트 및 면역조직화학염색(Immnohistochemical staining) 키트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 톡소포자충 및 인플루엔자 바이러스 다중 진단 키트.
  11. 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질; 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 포함하는 바이러스-유사 입자를 포함하는 톡소포자충증 및/또는 인플루엔자 바이러스 다중 진단용 조성물에 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및
    바이러스-유사 입자에 결합하는 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스의 감염을 다중 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 톡소포자충 유래의 표면 항원 단백질은 AMA1, ROP4, ROP18로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 톡소포자충 및/또는 인플루엔자 바이러스의 감염을 다중 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
PCT/KR2021/018383 2021-01-22 2021-12-06 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법 WO2022158705A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023544409A JP2024509043A (ja) 2021-01-22 2021-12-06 トキソプラズマタンパク質およびインフルエンザウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子およびこれを用いた診断方法
AU2021421855A AU2021421855A1 (en) 2021-01-22 2021-12-06 Virus-like particle comprising toxoplasma gondii protein and influenza virus protein, and diagnostic method using same
EP21921464.0A EP4283296A1 (en) 2021-01-22 2021-12-06 Virus-like particle comprising toxoplasma gondii protein and influenza virus protein, and diagnostic method using same
US18/262,327 US20240085420A1 (en) 2021-01-22 2021-12-06 Virus-like particle comprising toxoplasma gondii protein and influenza virus protein, and diagnostic method using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0009692 2021-01-22
KR1020210009692A KR102508574B1 (ko) 2021-01-22 2021-01-22 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022158705A1 true WO2022158705A1 (ko) 2022-07-28

Family

ID=82549514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/018383 WO2022158705A1 (ko) 2021-01-22 2021-12-06 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240085420A1 (ko)
EP (1) EP4283296A1 (ko)
JP (1) JP2024509043A (ko)
KR (1) KR102508574B1 (ko)
AU (1) AU2021421855A1 (ko)
WO (1) WO2022158705A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120018783A (ko) * 2009-05-01 2012-03-05 레드바이오텍 아게 다중 유전자 벡터에 의해 암호화된 재조합 바이러스-유사 입자
KR20190005066A (ko) * 2017-07-05 2019-01-15 경희대학교 산학협력단 톡소포자충 바이러스-유사입자, 이를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법
KR102165100B1 (ko) * 2019-09-27 2020-10-14 주식회사 헬스파크 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질을 발현하는 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20200397887A1 (en) * 2015-06-25 2020-12-24 Technovax, Inc. Flavivirus and alphavirus virus-like particles (vlps)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101881014B1 (ko) * 2016-04-15 2018-07-23 경희대학교 산학협력단 톡소포자충 바이러스-유사입자, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120018783A (ko) * 2009-05-01 2012-03-05 레드바이오텍 아게 다중 유전자 벡터에 의해 암호화된 재조합 바이러스-유사 입자
US20200397887A1 (en) * 2015-06-25 2020-12-24 Technovax, Inc. Flavivirus and alphavirus virus-like particles (vlps)
KR20190005066A (ko) * 2017-07-05 2019-01-15 경희대학교 산학협력단 톡소포자충 바이러스-유사입자, 이를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법
KR102165100B1 (ko) * 2019-09-27 2020-10-14 주식회사 헬스파크 톡소포자충 유래의 곤봉체 단백질을 발현하는 바이러스-유사 입자, 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASTRID M. TENTER ET AL.: "Toxoplasma gondii: from animals to humans", INT J PARASITOL, vol. 30, pages 1217 - 1258
LEE SU-HWA, LEE DONG-HUN, PIAO YING, MOON EUN-KYUNG, QUAN FU-SHI: "Influenza M1 Virus-Like Particles Consisting of Toxoplasma gondii Rhoptry Protein 4", KOREAN JOURNAL OF PARASITOLOGY., SEOUL., KR, vol. 55, no. 2, 1 April 2017 (2017-04-01), KR , pages 143 - 148, XP055952703, ISSN: 0023-4001, DOI: 10.3347/kjp.2017.55.2.143 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024509043A (ja) 2024-02-29
KR102508574B1 (ko) 2023-03-10
EP4283296A1 (en) 2023-11-29
KR20220106589A (ko) 2022-07-29
US20240085420A1 (en) 2024-03-14
AU2021421855A1 (en) 2023-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015053455A1 (ko) 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트
FUKUMOTO et al. Development of a polymerase chain reaction method for diagnosing Babesia gibsoni infection in dogs
da Silva et al. Diagnosis of human visceral leishmaniasis by PCR using blood samples spotted on filter paper
Munch et al. The significance of Epstein—Barr virus seropositivity in multiple sclerosis patients?
Guan et al. The development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of Babesia spp. infective to sheep and goats in China
CN110568178B (zh) 一种寨卡病毒ns1抗原及其在制备荧光免疫层析试剂中的应用
Zoth et al. Multiple recombinant ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus antibodies in cattle sera
CA3185631A1 (en) Kits and methods for the enrichment and detection of rna viruses of the coronaviridae family
Lopez et al. High-throughput identification of T-lymphocyte antigens from Anaplasma marginale expressed using in vitro transcription and translation
Seitzer et al. From molecule to diagnostic tool: Theileria annulata surface protein TaSP
WO2021221493A1 (ko) 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체와 항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 진단 키트
WO2022158705A1 (ko) 톡소포자충 단백질 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 및 이를 이용한 진단 방법
KR101317417B1 (ko) 돼지열병바이러스의 탐지용 항원, 이를 이용한 항체 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트
WO2017095135A1 (ko) 쯔쯔가무시병 조기진단을 위한 igm, igg 항체 검출 진단키트 및 이의 제조방법
Manosroi et al. Early diagnosis of scrub typhus in Thailand from clinical specimens by nested polymerase chain reaction
Chomel et al. Comparison between three rapid methods for direct diagnosis of influenza and the conventional isolation procedure
WO2018124659A1 (ko) 서울바이러스와 푸말라바이러스 유래의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 한탄바이러스 유래의 재조합 당단백질을 포함하는 신증후군출혈열 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트
US9658227B2 (en) Recombinant GRA antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis
WO2020174690A1 (ja) バベシア原虫の表面抗原タンパク質、バベシア原虫に対する抗体の検出方法、バベシア症の診断方法
WO2020027617A1 (ko) 쯔쯔가무시균 유래 외막 소포체를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
Takakura et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of hantavirus antibody of rats using a recombinant of nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli
JPH11346768A (ja) イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有する蛋白質及び抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬
Reck et al. Evaluation of buffered Trypanosoma evansi antigen and rapid serum agglutination test (BA/Te) for the detection of anti-T. evansi antibodies in horses in Brazil
KR102622780B1 (ko) 톡소포자충 정점막 항원 1을 포함하는 바이러스-유사입자의 톡소포자충증 혈청 진단 용도
WO2022196849A1 (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21921464

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18262327

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023544409

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021421855

Country of ref document: AU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021921464

Country of ref document: EP

Effective date: 20230822

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021421855

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20211206

Kind code of ref document: A