JP2024509043A - トキソプラズマタンパク質およびインフルエンザウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子およびこれを用いた診断方法 - Google Patents

トキソプラズマタンパク質およびインフルエンザウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子およびこれを用いた診断方法 Download PDF

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Abstract

【課題】【解決手段】本発明は、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ表面抗原タンパク質が含まれたＶＬＰおよびインフルエンザウイルスＭ１タンパク質を含むウイルス－様粒子（ＶＬＰｓ）を含むトキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物を提供する。一具体例として、前記ＶＬＰｓは、ＴｇＡＭＡ１ ＶＬＰ、ＴｇＲＯＰ４ ＶＬＰ、およびＴｇＲＯＰ１８で構成された群から少なくとも１つのタンパク質を含む。前記多重診断用組成物は、トキソプラズマに感染した個体およびインフルエンザウイルスに感染した個体から分離された生物学的試料と高い感受度と特異性によって反応し得る。したがって、前記多重診断用組成物は、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断キットに活用され得る。【選択図】図１３

Description

本発明は、トキソプラズマタンパク質およびインフルエンザウイルスタンパク質を含むウイルス－様粒子を含むトキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスを診断するための組成物、キット、およびこれを用いたトキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス感染の有無を診断するための方法に関する。
トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）は、細胞内寄生虫であって、ヒトおよび動物に対するトキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）を引き起こす原因の原虫である（Ａｓｔｒｉｄ Ｍ． Ｔｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）。トキソプラズマは、大きく接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ、オーシスト）、急増虫体（ｔａｃｈｙｚｏｉｔ、タキゾイト）、緩増虫体（ｂｒａｄｙｚｏｉｔ、ブラディゾイト）、分裂体（ｓｃｈｉｚｏｎｔ、シゾント）、および生殖母体（ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ、ガメトサイト）段階の５種類の発育段階を経る。トキソプラズマは、固有宿主であるネコの糞便の接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ）によって汚染された水または野菜を摂取することによって感染するか、中間宿主であるブタ、ヒツジ、ウシなどの肉類にシスト（ｃｙｓｔ）として存在するトキソプラズマを摂食するときに感染し得る。全世界人口の約３分の１以上がトキソプラズマに感染したものと推定され、国内においてもグループによって２ないし２５％の感染率を示すものとして報告されている。
特に、トキソプラズマが産婦を感染させたとき、その栄養型（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）は胎盤を経て胎児を感染させ得る。トキソプラズマの感染によって初期の胎児は流産または死産に至ることがあり、中後期の胎児は正常的分娩にもかかわらず、視力損傷、水頭症、精神薄弱などの先天的奇形が引き起こされ得る。また、健康な個体を感染させたトキソプラズマは、免疫系細胞、網状内皮系細胞などを破壊させるため、リンパ節炎、網膜脈絡膜炎、脳脊髄炎などの疾病を誘発し得、宿主の免疫不全時に脳において増殖したシストが活性化されるため、髄膜炎または網膜脈絡膜炎を引き起こし得る。
一方、インフルエンザは、呼吸器ウイルスによるヒトの死亡において、主要な原因中の１つである。一般的な症状は、特に発熱、咽喉痛、呼吸困難、および筋肉痛を含む。インフルエンザシーズンのインフルエンザウイルスは、強い伝染性によって世界人口の１０％～２０％を感染させ、死亡者だけでも年間２５０，０００人～５００，０００人に達する。これらの疾病の共通点は、他の疾病と類似した症状を有しているという点である。したがって、他の疾病との混同を減らすために、ラテックス凝集テスト（Ｌａｔｅｘ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）、抗血清診断法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的方法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲのようなＤＮＡ検出方法など、多様な診断方法が使用されている。
しかし、従来の診断方法は診断までの迅速性に劣るか、高価な装備使用による低い経済性、または低い感受性の問題があるため、迅速性、経済性、感受性が高い新たな診断方法が必要な状況である。
［先行技術文献］
［非特許文献］
（非特許文献１）Ａｓｔｒｉｄ Ｍ．Ｔｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ：ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ」，Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０００ Ｎｏｖ；３０（１２－１３），１２１７－１２５８
これに関して、本発明者は、トキソプラズマを高い感受性で診断できるだけでなく、インフルエンザウイルスを同時に診断することができつつ、迅速性および経済性が高い方法を開発するために研究した結果、本発明に係るＶＬＰ形態の診断用組成物を含む診断方法および診断キットが、抗原溶解物（ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）および抗原タンパク質に比べて免疫学的特異性および感受性がより優れていることを確認することによって、本発明を完成した。
前記目的を達成するために、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と、を含むウイルス－様粒子を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物を提供する。
本発明の他の側面として、前記トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス多重診断キットを提供する。
本発明の他の側面として、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１と、を含むウイルス－様粒子を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物に個体から分離された生物学的試料を接触させる段階と、ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する段階と、を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスの感染を多重診断するために必要な情報を提供する方法を提供する。
本発明に係るトキソプラズマ抗原タンパク質およびインフルエンザウイルスＭ１タンパク質が含まれたウイルス－様粒子を含む診断用組成物は、高い特異性および感受性によってトキソプラズマに感染した個体の血清に存在する自己抗体と反応することができる。それだけでなく、インフルエンザウイルスに感染した個体に存在する自己抗体と反応することができる。したがって、前記ウイルス－様粒子は、トキソプラズマ診断および／またはインフルエンザウイルス診断に有用に使用され得る。
ＡＭＡ１、ＲＯＰ４、またはＲＯＰ１８遺伝子を含むｒＢＶ（組換えバキュロウイルス）、およびインフルエンザＭ１遺伝子を含むｒＢＶをＳＦ９昆虫細胞にトランスフェクションさせてＡＭＡ１、ＲＯＰ４、またはＲＯＰ１８ ＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を収得する過程を図式化したものである。 本明細書の一実施例において、マウスから感染血清を収得するＩｎｖｉｖｏ試験過程を時系列的に示したものである。 本明細書の一実施例において製作したＶＬＰをＥＬＩＳＡを用いて診断する方法に関する模式図を示したものである。 Ｎａｉｖｅマウス血清、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（マラリア原虫）またはＴ．ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ）ＭＥ４９に感染したマウスの血清をそれぞれＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＡＭＡ１タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓの特異性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウスの血清をそれぞれＴＬＡ、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＡＭＡ１タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したヒト血清をそれぞれＴＬＡ、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＡＭＡ１タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 Ｎａｉｖｅマウス血清、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ、またはＴ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウス血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ４タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓの特異性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウス血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ４タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したヒト血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ４タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 Ｎａｉｖｅマウス血清、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡまたはＴ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウス血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓの特異性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウス血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したヒト血清をそれぞれＴＬＡ、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８タンパク質がコーティングされた免疫プレートに接触させることによって、感染血清に対するＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓの感受性を確認したものである。 ＴＬＡ、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓがそれぞれコーティングされた免疫プレートにＮａｉｖｅマウス血清、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９に感染したマウス血清、インフルエンザＭ１ ＶＬＰｓ １０μｇを接種したマウスの血清、およびＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）ＶＬＰｓ １０μｇを接種したマウスの血清をそれぞれ接触させた結果を示したものである。その結果、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓにトキソプラズマ症およびインフルエンザウイルスの多重診断が可能であることを確認した。
本発明の一側面は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と、を含むウイルス－様粒子（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ）を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物を提供する。
前記組成物は、トキソプラズマ症およびインフルエンザウイルスを同時に多重診断するための用途である組成物であり得る。
本明細書において使用された用語、「ウイルス－様粒子」（ＶＬＰ）または「ウイルス－様粒子ら」（ＶＬＰｓ）は、ウイルス性タンパク質を伴うか、伴わない非感染性ウイルス性サブユニットを意味する。例えば、前記ウイルス－様粒子は、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムが完全に欠如したものであり得る。一具体例において、ウイルス－様粒子は、遺伝子工学的な方法によって製造され得、構造タンパク質（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）としてインフルエンザウイルス由来のマトリックスタンパク質（Ｍ１）を含む。本発明のウイルス－様粒子は、別途の原因感染体、即ち、トキソプラズマがなくても遺伝工学的な方法によって製造され得る。
本明細書において使用された用語、「インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１」（Ｍ１）は、インフルエンザウイルスの構造タンパク質であって、インフルエンザウイルスの外皮（ｅｎｖｅｌｏｐ）である脂肪層内側にコート（ｃｏａｔ）を形成する基質タンパク質（ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。前記インフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ、およびＣと命名されたサブタイプとして構成される。前記インフルエンザウイルスは、コアとウイルス外皮間の連結体として作用するマトリックスタンパク質（Ｍ１）の層で覆われて外形を成し、前記Ｍ１タンパク質は、インフルエンザウイルス－様粒子の開発において、構造タンパク質として広く使用され得る。本明細書のウイルス－様粒子は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を構造タンパク質として含み、一実施例として、前記Ｍ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し得る。また、前記Ｍ１は、配列番号５の核酸配列によってコーディングされ得る。
前記トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質は、トキソプラズマに対する免疫活性を誘導できるタンパク質であれば、特段その種類に制限されず本発明に用いられ得る。
具体的には、本明細書の表面抗原タンパク質は、トキソプラズマに由来するＳＡＧ１（Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＡＧ２、ＧＲＡ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｄｅｎｓｅ－ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＲＡ２、ＧＲＡ４、ＧＲＡ７、ＭＩＣ１（Ｍｉｃｒｏｎｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＩＣ２、ＭＩＣ４、ＭＩＣ６、ＭＩＣ７、ＭＩＣ８、ＭＩＣ９、ＭＩＣ１０、ＭＩＣ１１、ＲＯＰ１、ＲＯＰ２、ＲＯＰ３、ＲＯＰ４、ＲＯＰ５、ＲＯＰ６、ＲＯＰ７、ＲＯＰ８、ＲＯＰ９、ＲＯＰ１０、ＲＯＰ１１、ＲＯＰ１２、ＲＯＰ１３、ＲＯＰ１４、ＲＯＰ１５、ＲＯＰ１６、ＲＯＰ１７、ＲＯＰ１８、Ｍ２ＡＰ（ＭＩＣ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＭＡ１（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ １）、およびＢＡＧ１などの多様な種類のタンパク質を含むことができ、好ましくはＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８のうち少なくとも１つを含むことができる。
このとき、前記ＡＭＡ１は、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。また、前記ＲＯＰ４は、配列番号３のアミノ酸配列を有し得る。また、前記ＲＯＰ１８は、配列番号４のアミノ酸配列を有し得る。
また、前記ＡＭＡ１は配列番号６の核酸配列によってコーディングされ得、ＲＯＰ４は配列番号７の核酸配列によってコーディングされ得、ＲＯＰ１８は配列番号８の核酸配列によってコーディングされ得る。
ここで、ウイルス－様粒子の表面に導入された抗原タンパク質は、純粋に分離された組換えタンパク質に比べて高い抗原性を有するため、効果的な中和抗体を形成することができ、これによってトキソプラズマ症およびインフルエンザウイルス多重診断用組成物として活用することができる。
前記ウイルス－様粒子において、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質およびインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１の比率は、５：１ないし１：５の比率で存在し得る。また、３：１、１：１、または１：３の比率で存在し得る。好ましくは、前記比率は、３：１であり得る。
前記ウイルス－様粒子は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質をコーディングする遺伝子を含むベクターおよびインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１をコーディングする遺伝子を含むベクターを用いて製造されたものであり得る。具体的には、前記ウイルス－様粒子は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスおよびインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを宿主細胞に共同感染させて製造されたものであり得る。
このとき、宿主細胞は、昆虫細胞を用いることができる。前記昆虫細胞は、遺伝子発現のための宿主システムとして開発または市販されるすべての細胞が使用され得、例えば、ツマジロクサヨトウ昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＳＦ２１、ＳＦ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓａ ｇｅｍｍｉｔａｌｉｓ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、キシタゴマダラヒトリ（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ ｓｅｐａｒａｔａ）、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、テンマクケムシ（Ｍａｌａｃａｓｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、タバコ角虫（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｚｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、およびエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒｌｉｓ）からなる群から１つ以上選択され得るが、これに限定されるものではない。一実施例において、ＳＦ９細胞を用いた。
また、共同感染時にトキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスとインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、３：１で感染させてウイルス－様粒子を製造することができる。
特に、前記トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１と、を含むウイルス－様粒子は、特異性および感受性が非常に優れる。したがって、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスに感染した個体内に生成された自己抗体を検出することに使用され得る。
例えば、トキソプラズマの感染時に、個体内に生成される抗－ＡＭＡ１抗体、抗－ＲＯＰ４抗体、または抗－ＲＯＰ１８抗体の存在の有無を判断することに、前記ＶＬＰｓが活用され得る。それだけでなく、インフルエンザウイルスへの感染時に、個体内に生成される抗－Ｍ１抗体の存在の有無を判断することに活用され得る。
本発明の具体的な実験例においては、トキソプラズマに感染したマウスおよびヒト患者から収得した血清と前記ＶＬＰｓを用いてＥＬＩＳＡを遂行した時に、高い感受性を示すことを確認した。前記ＶＬＰｓは、マラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ）に感染したマウスの血清やＮａｉｖｅマウスの血清に対しては有意な抗体反応を示さなかったため、トキソプラズマに感染した個体を診断するために用いられ得ることを確認することができた。また、同一のＥＬＩＳＡ実験を遂行したにもかかわらず、ＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）やＡＭＡ１、ＲＯＰ４、ＲＯＰ１８のようなタンパク質に対しては、トキソプラズマ感染マウス由来の血清であっても、前記ＶＬＰｓに比べて抗体反応がほとんど現れなかったため、トキソプラズマ由来のタンパク質やトキソプラズマの溶解物を用いる場合よりも、本発明のＶＬＰｓがトキソプラズマの感染を敏感に診断する効果がより優れることを確認することができた。
さらに、前記ＶＬＰｓは、トキソプラズマおよびインフルエンザウイルスが同時に感染した個体においては、より効率的にトキソプラズマおよびインフルエンザウイルスの感染の有無を診断することができる。
本発明の具体的な実験例においては、トキソプラズマに感染したマウス由来の血清だけでなく、インフルエンザウイルスが感染したマウス由来の血清に対しても本発明のＶＬＰｓが有意な抗原－抗体反応を示すことを確認し、よって、前記ＶＬＰｓは、トキソプラズマとインフルエンザウイルスを同時に多重診断するための用途にも有用に用いられ得ることを確認することができた。
本発明のさらに他の側面は、前記トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス診断用組成物を含むトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断キットを提供する。前記診断キットは、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と、を含むウイルス－様粒子を含むことができる。
また、前記診断キットは、トキソプラズマ症およびインフルエンザウイルスを同時に多重診断するための用途である診断キットであり得る。
このとき、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス診断用組成物、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質、およびウイルス－様粒子は、前述の通りである。一具体例としては、トキソプラズマＡＭＡ１タンパク質を発現するＶＬＰｓであるＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、トキソプラズマＲＯＰ４タンパク質を発現するＶＬＰｓであるＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、トキソプラズマＲＯＰ１８タンパク質を発現するＶＬＰｓであるＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓを用いてキットを製作することができる。このとき、前記ＶＬＰｓは、診断キットの検出部に存在し得る。
本明細書において使用された用語、「検出部」は、トキソプラズマ表面抗原タンパク質が含まれたＶＬＰ組成物が固定化された支持体を含む部分であって、トキソプラズマに対する抗体およびインフルエンザウイルスに対する抗体のうち少なくとも１つと前記ＶＬＰ組成物が特異的に反応する場所を意味する。
前記検出部のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物は、ディスペンサー器具を使用して検出部の支持体（例えば、ニトロセルロース膜）にコーティングし、該当部分に個体から分離された生物学的試料を接触させることによって、トキソプラズマの診断が遂行されるか、トキソプラズマおよびインフルエンザウイルス多重診断が遂行され得る。
前記診断キットは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）キット、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）キット、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）キット、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）キット、および免疫組織化学染色（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）キットで構成された群から選択される少なくとも１つであり得るが、これに限定されるものではない。
一具体例におて、前記診断キットは、個体から分離された生物学的試料のＩｇＧ抗体、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体の存在の有無を探知して、トキソプラズマおよびインフルエンザウイルス感染の有無を個別または同時に診断することができ、その過程において、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）、および免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）で構成された群から選択される少なくとも１つを含んで遂行され得るが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の側面は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１と、を含むウイルス－様粒子を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物に個体から分離された生物学的試料を接触させる段階と、ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する段階と、を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス感染を多重診断するために必要な情報を提供する方法を提供する。
このとき、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス診断用組成物、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質、およびウイルス－様粒子は、前述の通りである。また、本明細書において使用された用語、「個体から分離された生物学的試料」は、好ましくは体外に分泌される体液であって、血液、血清、血漿、尿、涙、唾液、乳汁などを含み、より好ましくは個体から収得した血液であり得るが、これに限定されない。このとき、個体は、イヌ、ネコ、またはヒトのような哺乳動物であり得、好ましくはヒトであり得る。
前記ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する段階は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）、および免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）で構成された群から選択される少なくとも１つを含むことができる。
前記ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する方法は、抗原－抗体反応物または標識因子を検出する方法であり得る。前記抗原－抗体反応物または標識因子の種類によって、当業者に公知された方法を用いることができ、具体的には、肉眼、検出装備、検出試薬などを用いることができる。前記検出装備としては、共焦点レーザースキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）を用いることができ、前記検出試薬は、検査をしようとする標識因子（ａｎａｌｙｔｅ）の存在を肉眼またはその他の器具を通じて外部からの識別が可能なようにする所定の標識試薬（ｌａｂｅｌｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ）、補助的特異結合部材、および／または信号発生システムの構成成分を含むことができる。標識の検出試薬は、既に本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によく知られている。
このような標識の形態は、触媒、酵素（例えば、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどであって、より具体的な例としては、酵素基質と組み合わせて共に使用される塩基性ホスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼなど）、酵素基質（例えば、ニトロブルーテトラゾリウム、３，５’、５，５’－テトラニトロベンジジン、４－メトキシ－１－ナフトール、４－クロロ－１－ナフトール、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドールホスフェート、化学発光酵素基質としてはジオキセタン、および誘導体とこれらの類似体）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコビリタンパク質（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などとこれらの誘導体および類似体）、化学発光化合物、金属ゾル（Ｍｅｔａｌ ｓｏｌ）、染料ゾル（Ｄｙｅ ｓｏｌ）、微粒子ラテックス（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｌａｔｅｘ）、カラーインジケータ（Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、リポソームに含まれた着色物質（Ｃｏｌｏｒ ｍａｔｔｅｒ）、カーボンゾル、セレニウムのような非金属ゾルなどがあるが、これに限定されない。
本発明のさらに他の側面は、前記トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス診断用組成物に個体から分離された生物学的試料を接触させる段階と、ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する段階と、を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス感染を多重診断する方法を提供する。
本発明のさらに他の側面は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と、を含むウイルス－様粒子のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス感染の診断用途を提供する。具体的には、前記用途は、トキソプラズマ症を診断するか、トキソプラズマ症およびインフルエンザウイルスを同時に多重診断するための用途であり得る。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明することにする。これらの実施例は、ひとえに本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明なことである。
Ｉ．トキソプラズマ抗原およびインフルエンザ抗原を含むＶＬＰの製造
製造例１．トキソプラズマ抗原を発現するバキュロウイルスの製造
製造例１．１．トキソプラズマｃＤＮＡの収得
トキソプラズマＲＨからＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８をコーディングするＲＮＡを抽出するために、トキソプラズマＲＨサンプルからＲＮＡを収得した。その後、抽出された抗原ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲを遂行して、トキソプラズマ由来のｃＤＮＡを収得した。その後、収得されたｃＤＮＡに基づいてｄｓＤＮＡを収得した。
製造例１．２．抗原ｃＤＮＡの収得
目的遺伝子に対するＰＣＲを遂行するために、ＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８を増幅するためのプライマーをデザインおよび注文した。ＰＣＲ用酵素ＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ ０．２５μＬ、１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ バッファー５μＬ、ｄＮＴＰ混合物４μＬ、テンプレート１μＬ、フォワードプライマー２μＬ、およびリバースプライマー２μＬの混合物に総体積が５０μＬになるよう蒸留水を入れた。その後、ＰＣＲを９８℃において１０秒、５５℃において３０秒、７２℃において１分の条件で３０～４０サイクルを遂行した。その後、アガロースゲルにＤＮＡマーカーおよびローディング染料（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）（６ｘ）を希釈したＰＣＲ増幅産物をゲルにローディングした。その後、ＵＶなどを用いてＰＣＲ増幅産物を確認した。その後、所望の遺伝子が位置するゲルから抗原をコーディングするＤＮＡを抽出した。
前記において、ＡＭＡ１の遺伝子は、フォワードプライマーとして５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡ－３’（配列番号１１）およびリバースプライマーとして５’－ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＧＡＣＣＡ－３’（配列番号１２）を用い、ＲＯＰ４の遺伝子は、フォワードプライマーとして５’－ＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＣＴＴＴ－３’（配列番号１３）およびリバースプライマーとして５’－ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＧＴＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴ－３’（配列番号１４）を用い、ＲＯＰ１８の遺伝子は、フォワードプライマーとして５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＣ－３’（配列番号１５）およびリバースプライマーとして５’－ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１６）を用いた。
製造例１．３．抗原遺伝子の増幅
製造例１．２において抽出したトキソプラズマ抗原であるＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８のＤＮＡをＴＡベクターに積載させた。その後、抗原遺伝子が積載されたＴＡベクターを大腸菌細胞に形質転換させた後、これを培養した。形質転換された大腸菌細胞を培養した後、これからＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８をコーディングする遺伝子を収得した。
製造例１．４．抗原遺伝子が積載されたｐＦａｓｔ－Ｂａｃプラスミドの製造
製造例１．３において収得したＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８抗原遺伝子をｐＦａｓｔ－Ｂａｃベクターにそれぞれ積載させた。抗原遺伝子が積載されたｐＦａｓｔ－ＢａｃベクターをＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換させた。形質転換された細胞を培養して抗原遺伝子が積載されたｐＦａｓｔ－Ｂａｃベクターを多量に収得した。
製造例１．５．トキソプラズマ抗原を発現するバキュロウイルスの製造
ＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８のＤＮＡが積載されたｐＦａｓｔ－Ｂａｃベクターをｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用してＳＦ９細胞内に形質感染させた。Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて製造会社のマニュアルにしたがいＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を製造した。
また、インフルエンザウイルスＭ１を発現するｒＢＶを前記と同一の方法で製造した。このとき、Ｍ１の遺伝子は、フォワードプライマー５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴ－３’（配列番号９）およびリバースプライマー５’－ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣ－３’（配列番号１０）を用いてＲＴ－ＰＣＲを通じて増幅した。
実施例１．トキソプラズマ抗原およびインフルエンザ抗原を含むＶＬＰの製造：ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ
ＡＭＡ１およびＭ１タンパク質を含む第１トキソプラズマＶＬＰを製造するために、製造例１を通じて製造したＡＭＡ１ ｒＢＶおよびＭ１ ｒＢＶをＳＦ９細胞に共同感染させた。このとき、Ｍ１ ｒＢＶとＡＭＡ１抗原 ｒＢＶの比率は、１：３として感染させた。その後、感染させたＳＦ９細胞を培養し、ＳＦ９細胞の死滅率が３０％～４０％になったときにハーベストを遂行した。具体的には、培養した細胞および培養液を６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清液を集めた後、３０，０００ｒｐｍ、４℃において３０分間遠心分離してペレット化した。ＶＬＰｓは、スクロース勾配を通じて精製した。また、ＶＬＰｓは、使用時までリン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁させた。このように、ＡＭＡ１抗原およびＭ１抗原を発現するＶＬＰをＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓと命名した。ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰを製造する過程に関する例示を図１ａに図示した。
実施例２．トキソプラズマ抗原およびインフルエンザ抗原を含むＶＬＰの製造：ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ
また、ＲＯＰ４およびＭ１タンパク質を含む第２トキソプラズマＶＬＰを製造するために、前記実施例１と同様の方法でＳＦ９に製造例１を通じて製造したＲＯＰ４ ｒＢＶおよびＭ１ ｒＢＶを共同感染させてＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓを収得した（図１ｂ）。
実施例３．トキソプラズマ抗原およびインフルエンザ抗原を含むＶＬＰの製造：ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ
また、ＲＯＰ１８およびＭ１タンパク質を含む第３トキソプラズマＶＬＰを製造するために、前記実施例１と同様の方法でＳＦ９に製造例１を通じて製造したＲＯＰ１８ ｒＢＶおよびＭ１ ｒＢＶを共同感染させてＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓを収得した（図１ｃ）。
ＩＩ．ＶＬＰｓを用いたトキソプラズマおよびインフルエンザの診断
製造例２．トキソプラズマおよびマラリア感染マウスから血清を採取
トキソプラズマ（ＭＥ４９ ｓｔｒａｉｎ）のシスト（ｃｙｓｔ）３００ｃｙｓｔ／匹（ｈｄ）を７週齢のｆｅｍａｌｅ ＢＡＬＢ／Ｃマウスに経口感染（ｏｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させ、眼窩静脈叢から採血後に遠心分離する方式で感染血清を収得した。前記ｉｎ－ｖｉｖｏ過程に対する例示的な順序は図２に示した。また、マラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ）０．５％（０．５×１０４）をマウスに感染させた後、感染したマウスから血清を収集した。
実験例１．ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応試験
実施例１を通じて収得した本発明のＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓが、実際にトキソプラズマに感染した個体を診断できるか否かを確認するために、トキソプラズマに感染したマウスおよびヒト患者の血清を用いて、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓが血清内のトキソプラズマ特異抗体と反応するか否かをＥＬＩＳＡを通じて確認した（実験例１．１ないし１．３）。
実験例１．１．マウス血清におけるＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の特異性試験
実施例１において収得したＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＡＭＡ１タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。前記ＴＬＡは、トキソプラズマＲＨの生活史のうち急増中体（ｔａｃｈｙｚｏｉｔ）状態であるものの溶解物抗原を意味する。その後、マラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ）を感染させたマウス血清１４個、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ）ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個を１００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。マラリア原虫やトキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、３種類のコーティングした抗原中においてＴＬＡおよびＡＭＡ１タンパク質抗原は、どの血清にも反応しなかった。これとは異なり、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓは、Ｎａｉｖｅ血清およびマラリア原虫を感染させた血清とはほとんど反応せずに、トキソプラズマを感染させた血清に対してのみ高い反応性を示し、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓと血清内のトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体間の特異性があることを確認した（図４）。
実験例１．２．マウス血清におけるＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
前記実験例１．１において、ＡＭＡ－Ｍ１－ＶＬＰｓがトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体と特異的に結合することを確認したことに加え、これらの反応の感受性を確認するために、前記ＩｇＧ抗体が含まれた血清を多様な濃度で処理して実験例１．１と同一の実験を遂行した。実施例１において収得したＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＡＭＡ１タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、実験例１．１と同様に、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたマウス血清に対する特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度の血清に対して最も感受性が高いことを確認した（図５）。
実験例１．３．ヒト血清におけるＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
トキソプラズマに感染したヒトの血清に対する抗体反応の感受性を確認するために、前記実験例１．１および１．２と類似した方法で実験を遂行した。実施例１において収得したＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＡＭＡ１タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに感染した患者の血清１０個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、マウス血清を用いた実験と同様に、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたヒト血清に対しても特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度の血清に対して最も感受性が高いことを確認した（図６）。
実験例２．ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応試験
実験例１と同様に、実施例２を通じて収得した本発明のＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓが、実際にトキソプラズマに感染した個体を診断できるか否かを確認するために、トキソプラズマに感染したマウスおよびヒト患者の血清を用いて、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓが血清内のトキソプラズマ特異抗体と反応するか否かをＥＬＩＳＡを通じて確認した（実験例２．１ないし２．３）。
実験例２．１．マウス血清におけるＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の特異性試験
実施例２において収得したＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、マラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ）を感染させたマウス血清１４個、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ）ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個を１００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。マラリア原虫やトキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、３種類のコーティングした抗原中においてＴＬＡおよびＡＭＡ１タンパク質抗原は、どの血清にも反応しなかった。これとは異なり、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓは、Ｎａｉｖｅ血清およびマラリア原虫を感染させた血清とはほとんど反応せずに、トキソプラズマを感染させた血清に対してのみ高い反応性を示し、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓと血清内のトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体間の特異性があることを確認した（図７）。
実験例２．２．マウス血清におけるＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
前記実験例２．１において、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓがトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体と特異的に結合することを確認したことに加え、これらの反応の感受性を確認するために、前記ＩｇＧ抗体が含まれた血清を多様な濃度で処理して実験例２．１と同一の実験を遂行した。実施例２において収得したＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、実験例２．１と同様に、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたマウス血清に対する特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度に対して最も感受性が高いことを確認した（図８）。
実験例２．３．ヒト血清におけるＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
トキソプラズマに感染したヒトの血清に対する抗体反応の感受性を確認するために、前記実験例２．１および２．２と類似した方法で実験を遂行した。実施例２において収得したＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに感染した患者の血清１０個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、マウス血清を用いた実験と同様に、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたヒト血清に対しても特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度の血清に対して最も感受性が高いことを確認した（図９）。
実験例３．ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応試験
実験例１と同様に、実施例３を通じて収得した本発明のＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓが、実際にトキソプラズマに感染した個体を診断できるか否かを確認するために、トキソプラズマに感染したマウスおよびヒト患者の血清を用いて、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓが血清内のトキソプラズマ特異抗体と反応するか否かをＥＬＩＳＡを通じて確認した（実験例３．１ないし３．３）。
実験例３．１．マウス血清におけるＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の特異性試験
実施例３において収得したＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ１８タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、マラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ）を感染させたマウス血清１４個、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ）ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個を１００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。マラリア原虫やトキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。その結果、３種類のコーティングした抗原中においてＴＬＡおよびＡＭＡ１タンパク質抗原は、どの血清にも反応しなかった。これとは異なり、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓは、Ｎａｉｖｅ血清およびマラリア原虫を感染させた血清とはほとんど反応せずに、トキソプラズマを感染させた血清に対してのみ高い反応性を示し、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓと血清内のトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体間の特異性があることを確認した（図１０）。
実験例３．２．マウス血清におけるＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
前記実験例３．１において、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓがトキソプラズマ特異ＩｇＧ抗体と特異的に結合することを確認したことに加え、これらの反応の感受性を確認するために、前記ＩｇＧ抗体が含まれた血清を多様な濃度で処理して実験例３．１と同一の実験を遂行した。実施例３において収得したＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ１８タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清１４個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、実験例３．１と同様に、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたマウス血清に対する特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度の血清に対して最も感受性が高いことを確認した（図１１）。
実験例３．３．ヒト血清におけるＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓとＩｇＧ抗体反応の感受性試験
トキソプラズマに感染したヒトの血清に対する抗体反応の感受性を確認するために、前記実験例３．１および３．２と類似した方法で実験を遂行した。実施例３において収得したＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ１８タンパク質、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。その後、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに感染した患者の血清１０個をそれぞれ１００倍、３００倍、９００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた（図３）。トキソプラズマを感染させていないマウスの血清を対照群（Ｎａｉｖｅ）として用いた。
その結果、マウス血清を用いた実験と同様に、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマ特異ＩｇＧが含まれたヒト血清に対しても特異性が最も高いものとして示され、その中でも１００倍に希釈した濃度の血清に対して最も感受性が高いことを確認した（図１２）。
実験例４．ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓを用いたトキソプラズマおよびインフルエンザの同時診断
実施例１ないし実施例３において収得したＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＴＬＡ（ＲＨ Ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）をそれぞれ４μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェル免疫プレートにコーティングした。
その後、Ｎａｉｖｅマウス血清、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＭＥ４９ ３００ｃｙｓｔｓを感染させたマウス血清、インフルエンザＭ１ ＶＬＰｓ １０μｇを接種したマウスの血清、およびＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ） ＶＬＰｓ １０μｇを接種したマウスの血清を１００倍に希釈してＥＬＩＳＡを進めた。
ここで、ＮＡ ＶＬＰｓは、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）においてＮＡのｃＤＮＡを増幅させ、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ ＶＬＰｓを製造する方法と同一の方法で製造した。
その結果、前記４種類の抗原がコーティングされた免疫プレートのうち、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓがコーティングされた免疫プレートにおいて４９２ｎｍでＯＤ値を測定したときに、トキソプラズマを感染させたマウス血清において有意に高いＩｇＧ抗体反応が示された。それだけでなく、同時にインフルエンザＭ１ ＶＬＰｓまたはＮＡ ＶＬＰｓ １０μｇを接種したマウスの血清に対しても、０．２以上の値を測定することにより、前記ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓがコーティングされた免疫プレートでトキソプラズマ症およびインフルエンザウイルスの多重診断が可能であることを確認した（図１３）。
結論的には、ＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマに感染した個体の血清に存在する抗－ＡＭＡ１抗体、抗－ＲＯＰ４抗体、および／または抗－ＲＯＰ１８抗体を高い感受度と特異性によって検出可能なだけでなく、インフルエンザウイルスに感染した個体の血清に存在する抗－Ｍ１抗体または高い感受度と特異性によって検出可能なことを確認した。したがって、本願のＡＭＡ１－Ｍ１－ＶＬＰｓ、ＲＯＰ４－Ｍ１－ＶＬＰｓ、およびＲＯＰ１８－Ｍ１－ＶＬＰｓは、トキソプラズマに感染した個体および／またはインフルエンザウイルスに感染した個体を同時に診断するための組成物として使用され得る。

Claims (12)

  1. トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と、を含むウイルス－様粒子を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  2. 前記トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質は、ＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８で構成された群から選択された少なくとも１つである、請求項１に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  3. 前記Ｍ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  4. 前記ＡＭＡ１は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、
    前記ＲＯＰ４は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、
    前記ＲＯＰ１８は、配列番号４のアミノ酸配列を有するものである、請求項２に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  5. ウイルス－様粒子において、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質およびインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１の比率は３：１である、請求項１に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  6. 前記ウイルス－様粒子は、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスおよびインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを共同感染させて製造されたものである、請求項１に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  7. 共同感染時に、トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスとインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１をコーディングする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを、３：１で感染させることを特徴とする、請求項５に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  8. トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスに感染した個体の自己抗体の水準を診断することを特徴とする、請求項１に記載のトキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物。
  9. 請求項１ないし請求項８のうちいずれか１項の組成物を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルス多重診断キット。
  10. 前記診断キットは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）キット、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）キット、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）キット、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）キット、および免疫組織化学染色（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）キットで構成された群から選択されるいずれか１つである、請求項９に記載のトキソプラズマおよびインフルエンザウイルス多重診断キット。
  11. トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質と、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１と、を含むウイルス－様粒子を含む、トキソプラズマ症および／またはインフルエンザウイルス多重診断用組成物に個体から分離された生物学的試料を接触させる段階と、
    ウイルス－様粒子に結合する抗体を検出する段階と、を含む、トキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスの感染を多重診断するために必要な情報を提供する方法。
  12. 前記トキソプラズマ由来の表面抗原タンパク質は、ＡＭＡ１、ＲＯＰ４、およびＲＯＰ１８で構成された群から選択されたいずれか１つである、請求項１１に記載のトキソプラズマおよび／またはインフルエンザウイルスの感染を多重診断するために必要な情報を提供する方法。
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