JP6325553B2 - エールリヒア抗体の検出のためのペプチド、デバイス、および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年10月11日に出願された米国仮出願第61/712,578号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。配列表のコンピューター可読形式コピー(ファイル名:ABAX_040_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日2013年10月10日、ファイルサイズ62キロバイト)。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、H、N、S、またはAを除く任意のアミノ酸であり、X28は、A、S、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X29は、D、P、N、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X30は、A、E、D、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X31は、D、N、V、またはHを除く任意のアミノ酸であり、X32は、FまたはTを除く任意のアミノ酸であり、X33は、N、F、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X34は、N、T、またはDを除く任意のアミノ酸であり、X35は、K、V、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X36は、G、P、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X37は、Y、N、またはTを除く任意のアミノ酸であり、X38は、S、Y、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X39は、FまたはSを除く任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、SおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、H、N、S、またはAを除く任意のアミノ酸であり、X28は、A、S、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X29は、D、P、N、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X30は、A、E、D、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X31は、D、N、V、またはRを除く任意のアミノ酸であり、X32は、FまたはTを除く任意のアミノ酸であり、X33は、N、F、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X34は、N、T、またはDを除く任意のアミノ酸であり、X35は、K、V、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X36は、G、P、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X37は、Y、N、またはTを除く任意のアミノ酸であり、X38は、S、Y、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X39は、FまたはSを除く任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39は、任意のアミノ酸であり、X41は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X44は、任意のアミノ酸であり、X48は、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X49は、任意のアミノ酸であり、X56は、任意のアミノ酸であり、X58は、任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X40は、任意のアミノ酸であり、X45は、任意のアミノ酸であり、X50は、任意のアミノ酸であり、X57は、任意のアミノ酸であり、X59は、任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39は、任意のアミノ酸であり、X44は、任意のアミノ酸であり、X49は、任意のアミノ酸であり、X56は、任意のアミノ酸であり、X58は、任意のアミノ酸である。
3つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団であって、前記集団内の各ペプチドが以下を含む、単離ペプチドの集団:
(i)
の配列もしくはその断片であって、
式中、X 2 が、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 5 が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 8 が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 10 が、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 11 が、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 12 が、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 13 が、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 18 が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 20 が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 22 が、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 23 が、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 24 が、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 25 が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 26 が、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 39 が、任意のアミノ酸であり、X 44 が、任意のアミノ酸であり、X 49 が、任意のアミノ酸であり、X 56 が、任意のアミノ酸であり、X 58 が、任意のアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、または
(ii)
の配列もしくはその断片であって、
式中、X 2 が、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 5 が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 8 が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 10 が、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 11 が、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 12 が、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 13 が、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 18 が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 20 が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 22 が、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 23 が、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 24 が、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 25 が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 26 が、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 39 が、任意のアミノ酸であり、X 41 が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 44 が、任意のアミノ酸であり、X 48 が、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 49 が、任意のアミノ酸であり、X 56 が、任意のアミノ酸であり、X 58 が、任意のアミノ酸である、前記配列もしくはその断片。
[本発明1002]
X 39 が、Kである、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1003]
X 44 が、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 49 が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1004]
X 56 が、KおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X 58 が、EおよびTからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1005]
前記断片が、配列番号3または配列番号72からの少なくとも20個、25個、30個、35個、または40個の連続したアミノ酸を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1006]
前記断片が、配列番号3または配列番号72のアミノ酸33〜71を含む、本発明1005の単離ペプチドの集団。
[本発明1007]
各単離ペプチドが、天然OMP−1配列であるかまたは非OMP−1エールリヒア抗原である付加的N末端ペプチド配列を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1008]
各単離ペプチドが、天然OMP−1配列であるかまたは非OMP−1エールリヒア抗原である付加的C末端ペプチド配列を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1009]
各単離ペプチドが、少なくとも70個、75個、80個、または85個のアミノ酸を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1010]
前記単離ペプチドのうちの1つ以上が、リガンドに共役されているか、またはビオチン化されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1011]
前記単離ペプチドのうちの1つ以上が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、酵素、または金属ナノ粒子もしくはナノシェルに共役されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1012]
任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1013]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1014]
エールリヒア種からの1つ以上の抗原ペプチドをさらに含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1015]
前記1つ以上の抗原ペプチドが、
の配列またはその断片を有し、式中、X 7 が、任意のアミノ酸であり、X 12 が、任意のアミノ酸であり、X 17 が、任意のアミノ酸であり、X 24 が、任意のアミノ酸であり、X 26 が、任意のアミノ酸である、本発明1014の単離ペプチドの集団。
[本発明1016]
配列番号71のX 7 が、Kである、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1017]
配列番号71のX 12 が、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、配列番号71のX 17 が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1018]
配列番号71のX 24 が、KおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、配列番号71のX 26 が、EおよびTからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1019]
試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出するための方法であって、
試料を、本発明1001の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、方法。
[本発明1020]
前記エールリヒア抗原が、エールリヒア・シャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)、エールリヒア・エウィンギ(Ehrlichia ewingii)、エールリヒア・カニス(Ehrlichia canis)、またはエールリヒア・ムリス(Ehrlichia muris)種に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記単離ペプチドの集団が、任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記検出するステップが、(i)ELISAアッセイを行うこと、(ii)ラテラルフローアッセイを行うこと、(iii)凝集アッセイを行うこと、(iv)ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、(v)波長シフトアッセイを行うこと、または(vi)試料を分析用または遠心分離用ローターに供することを含む、本発明1019の方法。
[本発明1024]
前記試料が、ヒト、イヌ、またはネコ対象に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1025]
前記試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、組織抽出物、尿、または唾液試料である、本発明1019の方法。
[本発明1026]
複数の抗体−ペプチド複合体の形成が検出され、かつ前記複合体の形成が、複数のエールリヒア種からのエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、本発明1019の方法。
[本発明1027]
対象における単球および/または顆粒球エールリヒア症を診断するための方法であって、
前記対象からの試料を、本発明1001の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、対象が前記単球および/または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。
[本発明1028]
本発明1001の単離ペプチドの集団と、前記集団内の1つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合することができる標識試薬とを含む、キット。
[本発明1029]
前記単離ペプチドの集団が、任意に金属ナノ層を介して固体支持体に付着しているかまたはその表面に固定化されている、本発明1028のキット。
[本発明1030]
前記固体支持体が、複数のビーズ、管もしくはウェル、ラテラルフローアッセイデバイス、または分析用もしくは遠心分離用ローターである、本発明1028のキット。
[本発明1031]
前記標識試薬が、検出可能な標識に共役された抗ヒト、抗イヌ、もしくは抗ネコIgG抗体または抗ヒト、抗イヌ、もしくは抗ネコIgM抗体である、本発明1028のキット。
[本発明1032]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1031のキット。
[本発明1033]
前記標識試薬が、検出可能な標識に共役された、プロテインA、プロテインG、および/またはプロテインA/G融合タンパク質である、本発明1028のキット。
[本発明1034]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1033のキット。
本発明の付加的態様および実施形態は、続く詳細な説明から明らかとなるであろう。
本明細書において使用されるとき、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
本発明は、エールリヒアOMP−1タンパク質の断片中の特定の配列変異体が、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリスを含むさまざまなエールリヒア種に対する抗体反応の強固な検出を提供するという発見に部分的に基づいている。したがって、一態様において、本発明は、エールリヒア抗原を認識する抗体に結合することができるペプチドを提供する。
の配列、またはその断片を含み、さらに指定がない限り、本明細書全体にわたって使用される配列番号1は、以下の特徴を有する:X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、H、N、S、またはAを除く任意のアミノ酸であり、X28は、A、S、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X29は、D、P、N、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X30は、A、E、D、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X31は、D、N、V、またはHを除く任意のアミノ酸であり、X32は、FまたはTを除く任意のアミノ酸であり、X33は、N、F、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X34は、N、T、またはDを除く任意のアミノ酸であり、X35は、K、V、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X36は、G、P、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X37は、Y、N、またはTを除く任意のアミノ酸であり、X38は、S、Y、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X39は、FまたはSを除く任意のアミノ酸である。
からなる群から選択される配列を有する。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、SおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、H、N、S、またはAを除く任意のアミノ酸であり、X28は、A、S、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X29は、D、P、N、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X30は、A、E、D、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X31は、D、N、V、またはRを除く任意のアミノ酸であり、X32は、FまたはTを除く任意のアミノ酸であり、X33は、N、F、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X34は、N、T、またはDを除く任意のアミノ酸であり、X35は、K、V、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X36は、G、P、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X37は、Y、N、またはTを除く任意のアミノ酸であり、X38は、S、Y、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X39は、FまたはSを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号83の配列を含み、式中、X27〜X39は、
からなる群から選択される配列を有する。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39は、任意のアミノ酸であり、X41は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X44は、任意のアミノ酸であり、X48は、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X49は、任意のアミノ酸であり、X56は、任意のアミノ酸であり、X58は、任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X40は、任意のアミノ酸であり、X45は、任意のアミノ酸であり、X50は、任意のアミノ酸であり、X57は、任意のアミノ酸であり、X59は、任意のアミノ酸である。
の配列、またはその断片を含み、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39は、任意のアミノ酸であり、X44は、任意のアミノ酸であり、X49は、任意のアミノ酸であり、X56は、任意のアミノ酸であり、X58は、任意のアミノ酸である。特定の一実施形態において、配列番号72の配列を含むペプチドは、複数の種(例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス)からのエールリヒア抗原に対する抗体の検出を同時に可能にする。
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X4は、EおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、PおよびSからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、AおよびSからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、PおよびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、SおよびNからなる群から選択されるアミノ酸である。
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、S、V、およびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、Y、F、およびWからなる群から選択されるアミノ酸であり、X16は、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X19は、WおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27〜X39のそれぞれは、任意のアミノ酸である。特定の実施形態において、X27〜X39は、
からなる群から選択される配列を有する。
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X3は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X19は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X21は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X28は、H、N、S、またはAを除く任意のアミノ酸であり、X29は、A、S、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X30は、D、P、N、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X31は、A、E、D、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X32は、D、N、V、またはHを除く任意のアミノ酸であり、X33は、FまたはTを除く任意のアミノ酸であり、X34は、N、F、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X35は、N、T、またはDを除く任意のアミノ酸であり、X36は、K、V、またはPを除く任意のアミノ酸であり、X37は、G、P、またはSを除く任意のアミノ酸であり、X38は、Y、N、またはTを除く任意のアミノ酸であり、X39は、S、Y、またはIを除く任意のアミノ酸であり、X40は、FまたはSを除く任意のアミノ酸である。さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X3は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X6は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X9は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X14は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X19は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X21は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X40は、任意のアミノ酸であり、X42は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X45は、任意のアミノ酸であり、X49は、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X50は、任意のアミノ酸であり、X57は、任意のアミノ酸であり、X59は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X3は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X6は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X9は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X14は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X19は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X21は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X27は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X40は、任意のアミノ酸であり、X45は、任意のアミノ酸であり、X50は、任意のアミノ酸であり、X57は、任意のアミノ酸であり、X59は、任意のアミノ酸である。
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、EおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸である。
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X2は、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10は、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11は、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22は、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23は、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24は、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25は、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸である。他の実施形態において、断片は、配列番号3または配列番号72のアミノ酸33〜71を含み得る。故に、一実施形態において、本発明のペプチドは、
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、X7は、任意のアミノ酸であり、X9は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12は、任意のアミノ酸であり、X16は、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X17は、任意のアミノ酸であり、X24は、任意のアミノ酸であり、X26は、任意のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドは、
の配列を含み、式中、X8は、任意のアミノ酸であり、X10は、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13は、任意のアミノ酸であり、X17は、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18は、任意のアミノ酸であり、X25は、任意のアミノ酸であり、X27は、任意のアミノ酸である。さらに別の実施形態において、本発明のペプチドは、
の配列を含み、式中、X7は、任意のアミノ酸であり、X12は、任意のアミノ酸であり、X17は、任意のアミノ酸であり、X24は、任意のアミノ酸であり、X26は、任意のアミノ酸である。
の配列またはその断片を有する1つ以上の抗原性エールリヒアペプチドを含み、式中、X7は、任意のアミノ酸であり、X12は、任意のアミノ酸であり、X17は、任意のアミノ酸であり、X24は、任意のアミノ酸であり、X26は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、X7は、Kである。他の実施形態において、X12は、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、X17は、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに他の実施形態において、X24は、KおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26は、EおよびTからなる群から選択されるアミノ酸である。
別の態様において、本発明は、試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明のペプチドと接触させることと、該ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、該複合体の形成は、該試料における、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体の存在を示す。いくつかの実施形態において、エールリヒア抗原は、感染性エールリヒア種に由来する。特定の実施形態において、エールリヒア抗原は、病原性エールリヒア種、例えば、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、エールリヒア・ムリス、またはエールリヒア・カニスに由来する。単球および/または顆粒球エールリヒア症に関与した他のエールリヒア種は、それらが本発明のペプチドと特異的に反応することができる抗体を誘導するならば、本発明の方法を使用して検出することもできる。故に、本明細書において使用されるとき、「病原性エールリヒア」という用語は、単球および/または顆粒球エールリヒア症を引き起こす、任意のかかるエールリヒア種を指す。特定の実施形態において、これらの方法は、試料中の複数の種(例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス)からのエールリヒア抗原に対する抗体の検出を同時に提供する。
なおも別の態様において、本発明はキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、本発明のペプチドを含む。特定の実施形態において、キットは、本発明の2つ、3つ、4つ、もしくはそれ以上の異なるペプチド、または本発明のペプチドの混合物もしくは集団を含む。ペプチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号70、配列番号72、配列番号83、配列番号85の配列、またはその断片を含むことができる。特定の実施形態において、ペプチドは、固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。いくつかの実施形態において、ペプチドは、金属ナノ層(例えば、カドミウム、亜鉛、水銀、金、銀、銅、または白金ナノ層)を介して固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ(例えば、コロイド粒子、もしくは金属ナノ粒子、もしくはナノシェル)、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、管もしくはウェル(例えばプレート内)、またはセンサー(例えば、電気化学、光学、もしくは光電子工学センサー)である。
3つの異なるペプチドの集団を、標準合成手順を使用して合成した。第1のペプチドの集団内の各ペプチド(ECHEW1)は、配列番号72の配列を含有していた。第1のペプチドの集団は、複数のエールリヒア種(例えば、カニス、シャフェンシス、およびエウィンギ)によって誘発された抗体に特異的に結合する。第2のペプチドの集団内の各ペプチド(EE12EW1)は、配列番号3の配列を含有していた。第2のペプチドの集団は、主にエールリヒア・カニスおよびエールリヒア・シャフェンシスによって誘発された抗体に特異的に結合し、エールリヒア・エウィンギに対していくらかの交差反応性を有する。第3のペプチドの集団内の各ペプチド(EE13)は、配列番号71の配列を含有していた。第3のペプチドの集団は、主にエールリヒア・エウィンギによって誘発された抗体に特異的に結合し、エールリヒア・カニスおよびエールリヒア・シャフェンシスに対していくらかの交差反応性を有する。
1これらの試料は、ペプチドのECHEW1(配列番号72)およびEE12EW1(配列番号3)集団を用いたELISAアッセイにおいて陽性の試験結果を示し、IFAでエールリヒア・カニスに対してより高い力価を有した。
2これらの試料は、ペプチドのECHEW1(配列番号72)およびEE12EW1(配列番号3)集団を用いたELISAアッセイにおいて陽性の試験結果を示し、IFAでエールリヒア・シャフェンシスに対してより高い力価を有した。
3これらの試料は、ペプチドのECHEW1(配列番号72)およびEE13(配列番号71)集団を用いたELISAアッセイにおいて陽性の試験結果を示した。
4これらの試料中のエールリヒア種を、IFAまたはSNAPアッセイによって確定することはできなかったが、試料は、ECHEW1(配列番号72)を用いたELISAアッセイにおいて陽性の試験結果を示した。
二重抗原サンドウィッチ形式のラテラルフローイムノアッセイを、複数種からのエールリヒア抗原に特異的な抗体の存在を検出するように構築した。配列番号72によって定義されたペプチドの集団をBSAに連結し、得られた複合体を、試験共役体(金ナノ粒子で標識されたペプチド)としても、捕捉体(デバイスの試験ラインで固定化された)としても使用した。試験ラインにおいて産生されたシグナルは、標識ペプチド共役体に付加されたプロテインAおよびプロテインG−金共役体によって強化された。デバイスは、図5に表される。
間接蛍光抗体試験は、本発明の1つ以上のペプチドでコーティングされたラテックスビーズを使用して構築される。特定の実施形態において、配列番号71、配列番号72、配列番号3、または配列番号5によって定義されたペプチドを使用する。本発明のペプチドを、チオ−エーテル化学作用を使用して、マレイミド誘導体化ラテックスビーズの表面にコーティングする。代替として、本発明のペプチドは、チオ−エーテル化学作用または同様の化学作用を介してBSAに共役されてよく、ラテックスビーズ表面に受動的に吸収される。次に、かかるビーズの集団を、既知の技術を使用してガラススライドの表面上に固定化する。
Claims (13)
- 3つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団であって、前記集団内の各ペプチドが以下を含む、単離ペプチドの集団:
(i)
の配列であって、
式中、X2が、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10が、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11が、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12が、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13が、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22が、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23が、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24が、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26が、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39が、任意のアミノ酸であり、X44が、任意のアミノ酸であり、X49が、任意のアミノ酸であり、X56が、任意のアミノ酸であり、且つX58が、任意のアミノ酸である、前記配列、
(ii)
の配列であって、
式中、X2が、AおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X5が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸であり、X8が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X10が、TおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X11が、GおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X12が、LおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X13が、YおよびFからなる群から選択されるアミノ酸であり、X18が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X20が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X22が、SおよびVからなる群から選択されるアミノ酸であり、X23が、A、S、およびTからなる群から選択されるアミノ酸であり、X24が、AおよびIからなる群から選択されるアミノ酸であり、X25が、TおよびPからなる群から選択されるアミノ酸であり、X26が、S、N、およびKからなる群から選択されるアミノ酸であり、X39が、任意のアミノ酸であり、X41が、DおよびNからなる群から選択されるアミノ酸であり、X44が、任意のアミノ酸であり、X48が、VおよびAからなる群から選択されるアミノ酸であり、X49が、任意のアミノ酸であり、X56が、任意のアミノ酸であり、且つX58が、任意のアミノ酸である、前記配列、または
(iii)
の配列であって、
式中、X 7 が、任意のアミノ酸であり、X 12 が、任意のアミノ酸であり、X 17 が、任意のアミノ酸であり、X 24 が、任意のアミノ酸であり、且つX 26 が、任意のアミノ酸である、前記配列。 - (i)配列番号3または72のX39が、Kである;
(ii)配列番号3または72のX44が、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つX49が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸である;または
(iii)配列番号3または72のX56が、KおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つX58が、EおよびTからなる群から選択されるアミノ酸である、
請求項1に記載の単離ペプチドの集団。 - 各単離ペプチドが、天然OMP−1配列であるかまたは非OMP−1エールリヒア抗原である付加的N末端またはC末端ペプチド配列を含む、請求項1に記載の単離ペプチドの集団。
- 前記単離ペプチドのうちの1つ以上が、
(i)リガンドに共役されているか、またはビオチン化されている;または
(ii)アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、酵素、または金属ナノ粒子もしくはナノシェルに共役されている、
請求項1に記載の単離ペプチドの集団。 - 任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、請求項1に記載の単離ペプチドの集団。
- 前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、請求項1に記載の単離ペプチドの集団。
- エールリヒア種からの1つ以上の抗原ペプチドをさらに含む、請求項1に記載の単離ペプチドの集団。
- (i)配列番号71のX7が、Kである;
(ii)配列番号71のX12が、KおよびRからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つ配列番号71のX17が、EおよびDからなる群から選択されるアミノ酸である;または
(iii)配列番号71のX24が、KおよびQからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つ配列番号71のX26が、EおよびTからなる群から選択されるアミノ酸である、
請求項1に記載の単離ペプチドの集団。 - 試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出するための方法であって、
試料を、請求項1に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、方法。 - 前記エールリヒア抗原が、エールリヒア・シャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)、エールリヒア・エウィンギ(Ehrlichia ewingii)、エールリヒア・カニス(Ehrlichia canis)、またはエールリヒア・ムリス(Ehrlichia muris)種に由来する、請求項9に記載の方法。
- 対象における単球および/または顆粒球エールリヒア症を検査するための方法であって、
前記対象からの試料を、請求項1に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、前記対象が前記単球および/または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。 - 請求項1に記載の単離ペプチドの集団と、前記集団内の1つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合することができる標識試薬とを含む、キット。
- 非ヒト対象における単球および/または顆粒球エールリヒア症を診断するための方法であって、
前記対象からの試料を、請求項1に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、前記対象が前記単球および/または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。
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