MX2007016189A - Ortologos de proteinas inmunoreactivas de ehrlichia canis y e. chaffeensis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones inmunorreactivas gp36 para E. canis y composiciones inmunorreactivas gp 47 para E. chaffeensis; en particular, se describen los epitopes para E. canis gp36 y E. chaffeensis gp 47; en ciertas modalidades, las composiciones inmunorreactivas comprenden repeticiones en tandem que tienen porciones carbohidratos.

Description

ORTÓLOGOS DE PROTEÍNAS INMUNORREACTIVAS DE EHRLICHIA CANIS Y E. CHAFFEENSIS La presente invención reclama prioridad a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número de serie 60/691 ,058, presentada en junio 16 de 2005, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere por lo menos a los campos de biología molecular, biología celular, patología y medicina, incluyendo medicina veterinaria. En aspectos específicos, la presente invención se refiere a proteínas gp47 y gp36 inmunorreactivas en Ehrlichia chaffeensis y E. canis, respectivamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las Ehrlichias son bacterias Gram negativas obligadamente intracelulares transmitidas por ácaros, que residen principalmente dentro de vacuolas citoplásmícas (endosomas primarios) de fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos y neutrófilos. E. canis causa la ehrlichiosis monocítíca canina (CME), una enfermedad sería y a veces fatal globalmente distribuida (Troy y Forrester, 1990). E. chaffeensis causa la ehrlichiosis monocitotrópica humana (HME) en los Estados Unidos, una enfermedad emergente que pone en riesgo la vida en humanos, y causa también ehrlichiosís leve a severa en caninos (Breitschwerdt et al., 1998). La importancia de E. canis como un patógeno veterinario en conjunto con la identificación reciente de E. chaffeensis como la causa de una zoonosis emergente llevada por ácaros, ha destacado la necesidad de vacunas y diagnósticos mejorados para ehrlichiosis veterinarias y humanas, y de esta manera la necesidad de identificación de proteínas inmunorreactivas. Un pequeño subgrupo de proteínas expresadas por E canis y E. chaffeensis reacciona fuertemente con anticuerpos, y se considera son proteínas ¡nmunorreactivas importantes (Chen et ai, 1997; Chen et al., 1994; McBride er al., 2003). Varias de estas proteínas han sido caracterizadas molecularmente, incluyendo una familia de proteínas de genes múltiples de 200, 140/120 y 28 kDa (McBride et ai, 2000a; Ohashi et al,. 2001 ; Ohashi et al., 1998a; Ohashi et al., 1998b; Reddy et al., 1998; Yu et al., 1997; Yu et al., 2000a; Yu et al., 2000b), de las cuales todas son glucoproteínas (McBride et al., 2003; McBride et ai, 2000; Singu et ai, 2005). Hasta recientemente, se pensaba que las bacterias son incapaces de realizar la glucosilación de proteínas, pero recientemente se han identificado numerosas glucoproteínas en varias bacterias patógenas (tanto intracelulares como extracelulares), incluyendo Ehrlichia (Benz y Schmidt, 2002; McB de et ai, 2003; Schmidt et ai, 2003; Upreti et ai, 2003). Las glucoproteínas en bacterias patógenas que han sido caracterizadas funcionalmente incluyen adhesinas, toxinas y proteínas implicadas en estabilidad estructural o movilidad (Upreti et ai, 2003). Algunas glucoproteínas de bacterias son altamente inmunógenas, destacando una función potencial en el desarrollo de inmunidad protectora (Benz y Schmidt, 2002). Varias glucoproteínas se han identificado en Ehriichia spp., incluyendo proteínas expuestas en la superficie. gp120 de E. chaffeensis y gp140 de E canis son ortólogos de proteínas de superficie inmunorreactivas mayores que tienen unidades de repetición con alto contenido de serina y treonina, y están implicadas en la unión de Ehriichia a la célula hospedera (Popov et ai, 2000). Los ortólogos gp200 son las proteínas ¡nmunorreactívas mayores más grandes de Ehriichia spp., y se encuentran principalmente en el citoplasma de Ehriichia (McBride et ai, 2003). La familia de proteínas de genes múltiples p28/p30 comprende los constituyentes mayores de la membrana exterior, y se piensa desempeñan una función en la diversidad antigénica de superficie y quizá la evasión inmune (Ohashi et al., 1998; Reddy et ai, 1998; Yu ?t ai, 2000). Se ha reportado glucosilación y fosforilación de las proteínas p28/p30 en E chaffeensis (Singu et ai, 2005). Por lo menos cierta protección en ratones se ha observado después de la inmunización con p28/p30 recombinante (Ohashi etal., 1998). Se ha reportado la expresión diferencial de antígenos de Ehriichia en ácaros y células de mamífero (Singu et ai, 2005). Es probable que los antígenos de Ehriichia expresados en el acaro o expresados poco después de la inoculación en el hospedero, sean reconocidos primero por la respuesta inmune del hospedero. La cinética de la respuesta de los anticuerpos que se desarrolla a las proteínas inmunorreactivas mayores de E. canis, se ha investigado en perros infectados experimentalmente (McBride et al., 2003). Se encontró que dos proteínas, de aproximadamente 19 y 37 kDa, inducen la respuesta de anticuerpos de fase aguda más temprana, mientras que la respuesta de anticuerpos a las proteínas de la membrana exterior mayores p28/p30, así como otras, se desarrolló dos semanas después. Un total de ocho proteínas ¡nmunorreactivas mayores fueron reconocidas por anticuerpos en sueros convalecientes, seis semanas después de la inoculación (McBride et al., 2003). La presente invención satisface una necesidad en la técnica, proveyendo composiciones y métodos novedosos relacionados con infecciones por Ehriichia en mamíferos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La ehrlichiosis monocítica canina es una enfermedad llevada por ácaros globalmente distribuida, causada por la bacteria intracelular obligada E. canis, y es un modelo útil para entender los mecanismos inmune y patogénico de E. chaffeensis, el agente causal de la ehrlichiosís monocitotrópica humana. En general, la presente invención se refiere a composiciones inmunógenas de Ehriichia, incluyendo antígenos inmunoprotectores como vacunas para enfermedades por Ehriichia, tales como vacunas subunitarias, por ejemplo. La composición inmunógena puede usarse para cualquier mamífero incluyendo, por ejemplo, humanos, perros, gatos, caballos, cerdos, cabras u ovejas. En particular, la presente invención se refiere a la identificación del tercer par de ortólogos de glucoproteínas inmunorreactivas mayores molecularmente y antigénicamente divergente de E. canis (36 kD) y E. chaffeensis (47 kD). Estas glucoproteínas tienen unidades de repetición en tándem que comprenden epítopes de células B mayores con determinantes de carbohidratos, que contribuyen sustancíaimente a la inmunorreactividad de estas proteínas. En ciertos aspectos de la invención, se observó expresión diferencial de estas glucoproteínas sólo en las formas morfológicas de núcleo denso de la bacteria, y gp36 y gp47 son expuestas en la superficie y secretadas extracelularmente. Específicamente, un polinucleótido que codifica para una proteína de 36 kDa inmunorreactiva mayor de E. canis, se identificó mediante una identificación de colección genómica. La proteína recombínante reaccionó fuertemente con suero de perro inmune, migró por más tiempo de lo predicho por SDS-PAGE, y se detectaron carbohidratos, demostrando que la proteína fue glucosilada. El ortólogo gp47 de E. chaffeensis se descubrió buscando la secuencia de su genoma mediante BLAST, y la proteína recombinante exhibió características similares. La microscopía inmunoelectrónica determinó que gp36 de E canis y gp47 de E. chaffeensis, fueron expresadas sobre la superfície de las formas de núcleo denso infecciosas de las bacterias, pero no las formas retículadas metabólicamente activas. El polinucleótido que codifica para gp36 de E. canis contiene seis repeticiones en tándem que codifican para nueve aminoácidos, y por lo menos algunas de las serinas y treonínas en las repeticiones en tándem son sitios de glucosilación, en modalidades específicas de la invención. Una unidad de repetición individual expresada como una proteína de fusión, fue suficiente para la glucosilación y el reconocimiento por suero de perro inmune. En modalidades específicas de esta invención, estas modificaciones dan soporte a la función e inmunogenicídad de las proteínas. Mediante ELISA, por ejemplo, el péptido sintético de la repetición de 9 partes sin modificación post-traducción, no fue reconocido por antisuero contra E. canis, y el tratamiento de la proteína de fusión con peryodato para modificar las estructuras de los carbohidratos, redujo significativamente la unión a los anticuerpos. De esta manera, en modalidades de la invención, se identificaron ortólogos de proteínas inmunorreactivas mayores novedosos de E. canis y E. chaffeensis, que son glucoproteínas expresadas diferencialmente con repeticiones en tándem. La región de repetición de gp36 de E canis de nueve aminoácidos es un epítope de anticuerpos que requiere carbohidratos para reconocimiento, en aspectos particulares de la invención. La presente invención provee la primera demostración de dependencia de la glucosilación para el reconocimiento de anticuerpos de una proteína de Ehriichia, y de que la bacteria E. coli puede modificar proteínas en una forma similar a Ehriichia.

Además, residuos ácidos en la región de repetición afectaron también la movilidad, un consenso que, en aspectos específicos de la invención, se refiere a estas proteínas que son modificadas en sitios de "Yin-Yang" con fosforilación además de glucosilación. Recientemente se describió que la proteína tipo mucina de E. ruminantium actúa como una adhesina para células de ácaros. En modalidades específicas, las modificaciones posttraducción contribuyen a la inmunogenicídad de la proteína, así como función de adhesina, haciendo que las proteínas tipo mucina sean útiles para vacunas subunitarias de Ehriichia. El tratamiento de la proteína de fusión con peryodato para modificar las estructuras de los carbohidratos, redujo la unión a los anticuerpos, demostrando dependencia parcial de la glucosilación para reconocimiento. En aspectos específicos de la presente invención, existen composiciones de polipéptidos de Ehriichia (o composiciones de polinucleótídos que codifican para la totalidad de las mismas o parte de las mismas), con una o más de las siguientes características: 1) comprenden una o más porciones de carbohidrato, que en modalidades específicas comprenden parte de un determinante de epítope; 2) comprenden de aproximadamente cuatro a aproximadamente dieciséis repeticiones en tándem, aunque menos o más que esta escala pueden estar presentes; 3) comprenden una o más porciones, tales como un epítope, que son inmunógenamente específicas de especie; 4) son liberadas extracelularmente, tal como mediante secreción; 5) comprenden epítopes de células B mayores; 6) son expuestas en la superficie; 7) están asociadas con las formas de núcleo denso infecciosas de Ehriichia, tal como sobre la superficie, por ejemplo; 8) están asociadas con membranas de mórulas (los organismos de Ehriichia forman microcolonias dentro de vacuolas celulares (mórulas) que albergan muchos organismos de Ehriichia individuales) que comprenden formas de núcleo denso; 9) comprenden actividad de factor de virulencia; y 10) comprenden actividad de adhesina. En otros aspectos, las composiciones de polipéptídos recombinantes de la presente invención son capaces de ser glucosiladas en una célula a la cual no son reactivas, tales como una célula de E. coli, por ejemplo. El polipéptido recombínante puede usarse entonces como una composición inmunógena que ¡ncluye, por ejemplo, una vacuna. En modalidades particulares de la invención, existen composiciones inmunógenas de E canis que comprenden una secuencia de aminoácidos que es ¡nmunógena, y en otras modalidades particulares, la inmunogenicidad se caracteriza porque es por lo menos parte de un epítope. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos comprende por lo menos parte de una composición de vacuna contra un organismo de Ehriichia, tal como E. canis. En modalidades específicas, la secuencia de aminoácidos comprende serinas, treoninas u, opcionalmente, alanina, prolina, valina y/o ácido glutámíco; en otras modalidades, la secuencia de aminoácidos es glucosilada. En otras modalidades específicas, la secuencia de aminoácidos comprende parte o la totalidad del siguiente ejemplo de secuencia: TEDSVSAPA (SEQ ID NO: 22). En otras modalidades, la composición ¡nmunógena de E. canis comprende parte o la totalidad del ejemplo de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, o mezclas de las mismas. En otras modalidades, la composición inmunógena de E. canis es codificada por parte o la totalidad de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34, por ejemplo. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos está comprendida en un excipiente farmacéuticamente aceptable, que en algunos aspectos de la invención comprende un adyuvante. En modalidades particulares de la invención, existen composiciones inmunógenas de E. chaffeensis que comprenden una secuencia de aminoácidos que es inmunógena, y en otras modalidades particulares, la inmunogenicídad se caracteriza porque es por lo menos parte de un epítope. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos comprende por lo menos parte de una vacuna contra un organismo de Ehriichia, tal como E. chaffeensis. En modalidades específicas, la secuencia de aminoácidos comprende serinas, treoninas u, opcionalmente, alanina, prolina, valina y/o ácido glutámico; en otras modalidades, la secuencia de aminoácidos es glucosilada. En otras modalidades específicas, la secuencia de aminoácidos comprende parte o la totalidad de las siguientes secuencias, o una mezcla de las mismas: ASVSEGDAVVNAVSQETPA (SEQ ID NO: 23); y EGNASEPVVSQEAAPVSESGDAANPVSSSENAS (SEQ ID NO: 24); estos ejemplos de secuencias se identificaron en diferentes cepas de E. chaffeensis. Otras secuencias de E chaffeensis pueden identificarse siguiendo la secuenciación de gp47 en otras cepas; otras cepas de E chaffeensis se ponen a prueba, incluyendo 91 HE17, Jax, St. Vincent, Sapulpa y V1 -V8, por ejemplo. En otras modalidades, la composición inmunógena de E chaffeensis comprende parte o la totalidad de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , o mezclas de las mismas. En otras modalidades, las composiciones inmunógenas de E. chaffeensis son codificadas por parte o la totalidad de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36, por ejemplo. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos está comprendida en un excipiente farmacéuticamente aceptable, que en algunos aspectos de la invención comprende un adyuvante. En ciertas modalidades de la presente invención, existen composiciones gp36 inmunógenas de E canis, y secuencias particulares de las composiciones gp36 pueden impartir inmunogenícidad; por ejemplo, una región de la composición gp36 puede comprender un epítope. En modalidades particulares, uno o más epítopes en una composición gp36 se localiza en el extremo C-terminal de un polipéptido gp36. En algunos aspectos de la invención, diferentes cepas múltiples de E. canis comprenden composiciones gp36 inmunógenas, y existe identidad de secuencia significativa entre las cepas en regiones de las composiciones gp36 que comprenden el epítope (tal como más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 98%, por ejemplo). Sin embargo, en algunas modalidades, puede haber identidad de secuencia significativa entre las cepas en regiones de las composiciones gp36 que no comprenden el epítope. En aspectos particulares de la invención, existe una composición gp36 que es ¡nmunógena para más de una cepa de E. canis incluyendo, por ejemplo, North Carolina (Jake), Okiahoma y North Carolina (Demon) Otras cepas de E. canis que pueden comprender una composición inmunógena gp36, incluyen North Carolina (DJ), North Carolina (Fuzzy), Louisíana, Florida, y en aspectos particulares, el epítope de las otras cepas es SEQ ID NO: 22, aunque pueden identificarse también otros epítopes. En modalidades en donde se identifica un epítope de gp36 alternativo de E. canis para SEQ ID NO: 22, puede proveerse una composición inmunógena que comprenda una mezcla de epítopes de gp36 de E. canis, tal como una mezcla que incluya SEQ ID NO: 22, por ejemplo. En ciertas modalidades de la presente invención, existen composiciones gp47 inmunógenas de E. chaffeensis, y secuencias particulares de las composiciones gp47 pueden impartir su inmunogenicidad; por ejemplo, una región de la composición gp47 puede comprender un epítope. En modalidades particulares, uno o más epítopes en una composición gp47 se localizan en el extremo C-terminal de un polípéptido gp47. En algunos aspectos de la invención, diferentes cepas múltiples de E. chaffeensis comprenden composiciones gp47 inmunógenas, y existe identidad de secuencia significativa entre las cepas en regiones de las composiciones gp47 que comprendan el epítope (tal como más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 98%, por ejemplo). Sin embargo, en algunas modalidades, puede haber identidad de secuencia significativa entre las cepas en regiones de las composiciones gp47 que no comprendan el epítope. En otras modalidades, puede no haber identidad de secuencia significativa entre las diferentes cepas en regiones de las composiciones gp47 que comprendan un epítope. De esta manera, puede proveerse una composición inmunógena que comprenda una mezcla de epítopes gp47 de E. chaffeensis, tal como una mezcla que incluya SEQ ID NO: 23 y/o SEQ ID NO: 24, por ejemplo. Sin embargo, en aspectos particulares de la invención, existe una composición gp47 que es ¡nmunógena para más de una cepa de E. chaffeensis. En ciertas modalidades de la invención, las composiciones inmunógenas de E. canis y E. chaffeensis comprenden una o más porciones de carbohidrato. En aspectos particulares, las porciones de carbohidrato facilitan la naturaleza ¡nmunógena de la composición. En modalidades específicas, la porción de carbohidrato se requiere para inmunogenicidad, mientras que en modalidades alternativas, la porción de carbohidrato intensifica la inmunogenicidad. La porción de carbohidrato puede ser de cualquier tipo, en tanto sea adecuada para permitir o intensificar la inmunogenicídad. La identidad de una porción de carbohidrato puede determinarse mediante cualquier medio adecuado en la técnica, aunque en aspectos particulares, puede usarse una enzima que digiera carbohidratos particulares de polipéptidos o péptidos, seguido de análisis del carbohidrato digerido, por ejemplo, con espectroscopia de masa. En otros medios, el carbohidrato es removido y puesto a prueba con una variedad de lectinas, las cuales se sabe se unen a azúcares específicos. En modalidades específicas de la invención, una o más porciones de carbohidrato en la glucoproteína se identifican mediante métodos adecuados en la técnica, por ejemplo, cromatografía de gases/espectrometría de masa. En una modalidad de la invención, existe una glucoproteína gp36 ¡nmunógena de E. canis. En otra modalidad de la invención, existe una glucoproteína gp47 inmunógena de E chaffeensis. En otra modalidad de la invención, existe una composición de E. canis que comprende SEQ ID NO: 22. En aspectos específicos de la invención, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Puede definirse además que la composición comprende una o más porciones de carbohidrato, tal como comprendiendo parte o la totalidad de un epítope, y/o como una vacuna, tal como una vacuna subunitaria. En otra modalidad de la invención, existe una composición de E. chaffeensis que comprende SEQ ID NO: 23. En una modalidad específica, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Puede definirse además que la composición comprende una o más porciones de carbohidrato, tal como comprendiendo parte o la totalidad de un epítope, y/o como una vacuna, tal como una vacuna subunitaria. En otra modalidad de la invención, existe una composición de E. chaffeensis que comprende SEQ ID NO: 24. En una modalidad específica, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Puede definirse además que la composición comprende una o más porciones de carbohidrato, tal como comprendiendo parte o la totalidad de un epítope, y/o como una vacuna, tal como una vacuna subunitaria. En otra modalidad de la invención, existe una composición de E. canis que comprende un polipéptido codificado por cuando menos parte del polinucleótído de SEQ ID NO: 32; una composición de E. canis que comprende un polipéptido codificado por cuando menos parte del polinucleótido de SEQ ID NO: 33; una composición de E. canis que comprende un polipéptído codificado por cuando menos parte del polinucleótido de SEQ ID NO: 32; una composición de E. chaffeensis que comprende un polipéptído codificado por cuando menos parte del polinucleótido de SEQ ID NO: 35; o una composición de E. chaffeensis que comprende un polipéptído codificado por cuando menos parte del polinucleótido de SEQ ID NO: 36. En una modalidad específica, existe un polinucleótido aislado que codifica para SEQ ID NO: 22, un polinucleótido aislado que codifica para SEQ ID NO: 23, y un polinucleótido aislado que codifica para SEQ ID NO: 24, un polinucleótído aislado de SEQ ID NO: 32, un polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 33, un polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 34, un polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 35, y/o un polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 36. En modalidades particulares, existe un polinucleótido aislado, que comprende: a) un polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 37; o b) un polinucleótído que es por lo menos aproximadamente 90% idéntico al polinucleótido de a), y que codifica para un polipéptido gp36 inmunorreactivo de E. canis. En una modalidad específica, el polinucleótido se define además como SEQ ID NO: 32. En otra modalidad de la invención, existe un polinucleótido aislado que comprende: a) un polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 38; o b) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 90% idéntico al polinucleótido de a), y que codifica para un polipéptido gp36 inmunorreactívo de E. canis. En una modalidad específica, el polinucleótido se define además como SEQ ID NO: 33. En otros aspectos de la invención, existe un polinucleótido aislado que comprende: a) un polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 39; o b) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 90% idéntico al polinucleótido de a), y que codifica para un polipéptido gp36 inmunorreactivo de E. canis. En una modalidad específica, el polinucleótido se define además como SEQ ID NO: 34. En otra modalidad particular, existe un polinucleótido aislado que comprende: a) un polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 40; o b) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 90% idéntico al polinucleótído de a), y que codifica para un polipéptido gp47 inmunorreactivo de E chaffeensis. En una modalidad específica, el polinucleótido se define además como SEQ ID NO: 35. En otra modalidad particular, existe un polinucleótido aislado que comprende: a) un polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 41 ; o b) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 90% idéntico al polínucleótido de a), y que codifica para un polipéptido gp47 inmunorreactivo de E. chaffeensis. En una modalidad específica, el polinucleótído se define además como SEQ ID NO: 36. Los polinucleótidos de la invención pueden estar comprendidos en un vector, tal como un vector viral o un vector no viral. Un ejemplo de vector viral incluye un vector adenoviral, un vector retrovíral, un vector lentiviral, un vector adenoasociado, un vector de virus del herpes, o un vector de virus de la vaccinia. En una modalidad específica, el vector no viral es un plásmido. Los polinucleótídos pueden estar comprendidos en liposomas y/o con los mismos. En un aspecto específico, los vectores comprenden un promotor enlazado operablemente al polinucleótido, tal como uno operable en un procarionte, un eucarionte, o ambos, por ejemplo. Los polinucleótidos pueden estar comprendidos en un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad de la invención, existe un polipéptido aislado, que comprende: a) SEQ ID NO: 22; o b) un polípéptido gp36 que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico a SEQ ID NO: 22, y que comprende actividad inmunógena. En una modalidad específica, el polipéptido está comprendido en un excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o puede definirse además que está comprendido en una composición farmacéutica adecuada como una vacuna. En otro aspecto de la invención, existen anticuerpos aislados que se unen a uno o más polipéptidos de la invención. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, o fragmentos de anticuerpo, por ejemplo. En otra modalidad de la invención, existe un polipéptido aislado, que comprende: a) SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24; o b) un polipéptido gp47 que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico a SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y que comprende actividad inmunógena. El polipéptido puede estar comprendido en un excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o puede definirse además que está comprendido en una composición farmacéutica adecuada como una vacuna. I En otra modalidad de la invención, existe un método para proveer resistencia a la infección por E. canis y E. chaffeensis en un individuo, que comprende el paso de suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva 1 de un anticuerpo de gp36 o gp47 respectivo de la invención al individuo. 1 En otra modalidad, existe un método para inducir una respuesta i inmune en un individuo, que comprende el paso de suministrar al individuo 1 una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido gp36 o gp47 de la i invención. En otra modalidad de la presente invención, existe un método para i i inhibir o prevenir la infección por E canis en un sujeto, que comprende los i pasos de: identificar un sujeto antes de la exposición o que se sospecha está expuesto a E. canis o infectado con la misma; y administrar un polipéptido de la invención en una cantidad efectiva para inhibir la infección por E. canis. En un aspecto de la presente invención, existe un método para inhibir o prevenir la infección por E chaffeensis en un sujeto, que comprende los pasos de: identificar un sujeto antes de la exposición o que se sospecha está expuesto a E. chaffeensis o infectado con la misma; y administrar un polipéptido de la invención en una cantidad efectiva para inhibir la infección por E. chaffeensis. En otros aspectos de la invención, existe un método para identificar una infección por E. canis en un individuo, que comprende los pasos de: proveer una muestra del individuo; y poner a prueba la muestra para un anticuerpo de la invención. En otro aspecto de la invención, existe un método para identificar una infección por E chaffeensis en un individuo, que comprende los pasos de: proveer una muestra del individuo; y poner a prueba la muestra para un anticuerpo de la invención. En una modalidad de la invención, existe una composición aislada que comprende una glucoproteína gp36 o gp47 de Ehriichia, que comprende: a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 ; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69; o (c) una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a una o más secuencias en (a) o (b). La composición puede definirse además como una secuencia que es por lo menos aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a una o más secuencias en (a) o (b). Puede definirse además que la composición comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 y, opcionalmente, comprende además SEQ ID NO: 22. Puede definirse además también que la composición comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69 y, opcionalmente, comprende además una o más de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 51. Puede definirse además que la composición está comprendida en un excipiente farmacéuticamente aceptable, como comprendiendo dos o más porciones de carbohidrato, y/o como estando 1 comprendida en una composición farmacéutica adecuada como una vacuna.

' En algunos aspectos de la invención, la composición puede ser 1 codificada por un polinucleótido que comprende: (a) un polinucleótido ' seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60; (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68; (c) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y que codifica para un polipéptido gp36 o gp47 inmunorreactivo de E canis; o (d) un polinucleótído que hibrida con uno o más polinucleótidos de (a), (b) o (c) bajo condiciones severas. En modalidades específicas de la invención, el polinucleótido de (c) es por lo menos aproximadamente 70% idéntico, por lo menos aproximadamente 75% idéntico, por lo menos aproximadamente 80% idéntico, por lo menos aproximadamente 85% idéntico, por lo menos aproximadamente 90% idéntico, o por lo menos aproximadamente 95% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y codifica para un polipéptido gp36 o gp47 inmunorreactívo de E canis.

En otra modalidad de la invención, existe un polínucleótido de Ehriichia aislado, que comprende: a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60; (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68; (c) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico, por lo menos aproximadamente 75% idéntico, por lo menos aproximadamente 80% idéntico, por lo menos aproximadamente 85% idéntico, por lo menos aproximadamente 90% idéntico, o por lo menos aproximadamente 95% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y que codifica para un polipéptido gp36 o gp47 inmunorreactívo de E. canis; o (d) un polinucleótido que hibrida con uno o más polinucleótidos de (a), (b) o (c) bajo condiciones severas. El polinucleótido puede estar comprendido en un vector, tal como un vector viral o un vector no viral, en donde el vector viral puede ser un vector adenoviral, un vector retroviral, un vector lentiviral, un vector adenoasociado, un vector de virus del herpes o un vector de virus de la vaccinia, y en donde el vector no viral puede ser un plásmido. En otros aspectos de la invención, el vector comprende un promotor enlazado operablemente al polinucleótido, en donde el promotor es operable en un procarionte, un eucarionte, o ambos. El polinucleótido de la invención puede estar comprendido en un liposoma, y/o puede estar comprendido en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En ciertos aspectos de la invención, existe un anticuerpo aislado que reacciona inmunológícamente con un polipéptído de la invención, y el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, puede estar comprendido en un antisuero policlonal, o puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo. En otras modalidades de la invención, existe un método para inducir una respuesta inmune en un individuo, que comprende el paso de suministrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención. En otras modalidades de la invención, existe un método para inhibir la infección por E. canis o E. chaffeensis en un sujeto, que comprende los pasos de: identificar un sujeto antes de la exposición o que se sospecha está expuesto a E. canis o E. chaffeensis o infectado con las mismas; y administrar el polipéptido de la invención en una cantidad efectiva para inhibir la infección por E. canis o E chaffeensis. En otras modalidades de la invención, existe un método para identificar una infección por E canis o E. chaffeensis en un individuo, que comprende los pasos de: proveer una muestra del individuo, y poner a prueba la muestra para un anticuerpo de la invención. Lo anterior ha esbozado más bien ampliamente las características y ventajas técnicas de la presente invención, de modo que la descripción detallada de la invención que sigue, pueda entenderse mejor.

Otras características y ventajas de la invención se describirán después, y forman la materia de las reivindicaciones de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que la concepción y la modalidad específica descritas, pueden usarse fácilmente como una base para modificar o diseñar otras estructuras para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente invención. Los expertos en la técnica deben comprender también que dichas construcciones equivalentes no se apartan del espíritu y alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones anexas. Las características novedosas que se cree son características de la invención, en cuanto a su organización y método de operación, junto con otros objetivos y ventajas, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción cuando se considere en conjunto con las figuras acompañantes. Sin embargo, se entenderá expresamente que cada una de las figuras se provee sólo para el propósito de ilustración y descripción, y no se pretende que sean una definición de los límites de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para un entendimiento más completo de la presente invención, se hace ahora referencia a las siguientes descripciones, tomadas en conjunto con los dibujos acompañantes. La figura 1 ilustra la organización genética de los ortólogos "tipo mucina" conocidos de E. canis y E. chaffeensis. Las barras blancas representan las regiones de repetición en tándem, y las barras grises representan la longitud (en pares de bases) de regiones hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' de las repeticiones en tándem. Las cepas de E. canis ilustradas incluyen Jake (Ja), Okiahoma (Ok) y Demon (Dem), y las cepas de E. chaffeensis incluyen Arkansas (Ark) y Sapulpa (Sap). Las figuras 2A-2B proveen detección de inmunorreactividad y carbohidratos de gp36 y gp47 recombínantes. En la figura 2A, western immunoblot de gp36 recombinante que reaccionó con suero de perro anti-E. canis (campo 1 ), y detección de carbohidratos (campo 2). En la figura 2B, western immunoblot de gp47 recombínante que reaccionó con suero de perro anti-E. chaffeensis (campo 1), y detección de carbohidratos (campo 2). Las figuras 3A-3B muestran immunoblots del lisado de E. canis o E. chaffeensis con diferentes composiciones. En la figura 3A, existe western immunoblot del lisado de E. canis con gp36 con gp36 anti-recombinante (campo 1 ) y suero de perro anti-E. canis (campo 2). En la figura 3B, existe reactividad del lisado de E chaffeensis con suero de pacientes con HME (campos 1 -10), gp47 de E. chaffeensis anti-recombinante, y suero de perro anti-E. chaffeensis. La fígura 4 muestra la cinética de las respuestas de anticuerpos a gp36 de E. canis (días 0, 14 y 56) de 15 perros (campos 1 -15) infectados experimentalmente con E canis. Las figuras 5A-5C proveen western immunoblot del control de tiorredoxina (figuras 5A, 5B, 5C, campo 1 ) y la proteína de fusión de la repetición individual de gp36 de E. canis (9 aminoácidos) (figuras 5A, 5B, campo 2) sondeada con anti-tiorredoxina (figura 5A) y suero de perro anti-E. canis (fígura 5B). Western immunoblot de la proteína de fusión de la repetición individual de gp47 de E. chaffeensis (19 aminoácidos) (figura 5C, campo 2) sondeada con suero de perro anti-E. chaffeensis (figura 5C). Las figuras 6A-6B muestran que el western immunoblot de gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis reaccionó con anticuerpos homólogos y heterólogos. gp36 de E canis nativa (campo 1 ), proteína recombínante de la repetición individual de gp36 (campo 2), gp47 de E. chaffeensis nativa (campo 3) y proteína recombínante de la repetición individual de gp47, reaccionaron con anticuerpo de gp36 anti-recombinante (figura 6A) y de gp47 anti-recombinante (figura 6B). Las figuras 7A-7C muestran la contribución de los glucanos a la reactividad de los anticuerpos de gp36 de la cepa Jake de E. canis y gp47 de E. chaffeensis, según se determinó mediante ELISA. La fígura 7A muestra las reactividades de los anticuerpos de gp36 de E canis recombinante tratada con peryodato y sin tratar, con suero de perro anti-E. canis (# 2995). La fígura 7B muestra las ¡nmunorreactividades de los péptidos de fusión de la repetición de gp36 de E. canis recombinante que contienen 9 partes, 12 partes y 18 partes, en comparación con aquellas de péptidos sintéticos aglucosilados. La figura 7C muestra las ¡nmunorreactividades del péptido de fusión de la repetición de gp47 de E. chaffeensis recombinante (19 partes) y el péptido sintético aglucosilado, con suero de perro anti-E. chaffeensis (# 2495). DO, densidad óptica.

Las figuras 8A-8B muestran una micrografía electrónica marcada con immunogold de gp36 de E. canis y gp47 de E chaffeensis. En la figura 8A, existe localización de gp36 en mórulas que contienen las formas morfológicas reticulada (R) o de núcleo denso (DC) de E canis. En la figura 8B, existe localización de gp47 en mórulas que contienen las formas morfológicas retículada (R) o de núcleo denso (DC) de E. chaffeensis. Las figuras 9A-9B muestran proteínas ¡nmunorreactivas secretadas de E canis y E chaffeensis. En la figura 9A, existe western immunoblot de sobrenadantes concentrados de células DH82 infectadas con E. canis, con suero de perro anti-E. canis (campo 1 ) y gp36 de E canis anti-recombinante (campo 2). En la figura 9B, existe western ¡mmunoblot de sobrenadantes de células DH82 infectadas con E chaffeensis, con suero de perro anti-E. chaffeensis (campo 1 ) y con gp47 de E. chaffeensis anti-recombinante (campo 2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones De conformidad con la convención de leyes de patente de larga duración, los términos "un" y "una" cuando se usan en la presente especificación de acuerdo con el término que comprenden, incluyendo las reivindicaciones, denotan "uno" o "más". Algunas modalidades de la invención pueden consistir de, o consisten esencialmente de, uno o más elementos, pasos de método y/o métodos de la invención. Se contempla que cualquier método o composición que se describe en la presente, pueda implementarse con respecto a cualquier otro método o composición que se describe en la presente. El término "adhesina", como se usa en la presente, se refiere a una composición que media la adhesión de una bacteria a una superficie, tal como para desempeñar una función en patogénesis. En aspectos específicos de la invención, las adhesinas son antígenos de superficie de las bacterias, que existen con frecuencia en la forma de proyecciones filamentosas (pelos o fimbrias, por ejemplo), y se unen a receptores específicos de la célula, tales como aquellos en la membrana de las células epiteliales. El término "carbohidrato", como se usa en la presente, se refiere a una composición que comprende carbono, hidrógeno y oxígeno, en particular a la relación de 2H:1C:10. El término incluye azúcares, almidones y celulosas, por ejemplo. El término "epítope", como se usa en la presente, se refiere a un sitio de una composición a la cual se une un anticuerpo específico. El término "glucano", que puede ser referido también como un "polisacárido", como se usa en la presente, se refiere a un carbohidrato que puede ser descompuesto por hidrólisis en dos o más monosacáridos. En otras palabras, puede ser referido como una cadena de azúcares simples (derivados de aldehido o cetona de un alcohol políhídrico).

El término "inmunógeno", como se usa en la presente, se refiere a una composición que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la misma. El término "respuesta inmune", como se usa en la presente, se refiere a la reacción del sistema inmune a la presencia de un antígeno, produciendo anticuerpos para el antígeno. En otras modalidades específicas, puede desarrollarse inmunidad al antígeno al nivel celular, por el cuerpo como un todo, puede desarrollarse hipersensíbilidad al antígeno, y/o puede desarrollarse tolerancia, tal como por desafío subsiguiente. En modalidades específicas, una respuesta inmune entraña linfocitos que identifican una molécula antigénica como extraña, y que inducen la formación de anticuerpos y linfocitos capaces de reaccionar con la misma, y hacerla que sea menos nociva. El término "inmunorreactiva", como se usa en la presente, se refiere a una composición que es reactiva con anticuerpos de los sueros de un individuo. En modalidades específicas, una composición es inmunorreactiva si un anticuerpo la reconoce, tal como uniéndose a la misma. El término "mucína", como se usa en la presente, se refiere a una o más glucoproteínas altamente glucosiladas con N-acetilgalactosamina (GalNAc). El término "ortólogo", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótído de una especie que corresponde a un polinucleótído en otra especie; los dos polinucleótídos se relacionan a través de una especie ancestral común (un polinucleótído homólogo). Sin embargo, el polinucleótido de una especie ha evolucionado para llegar a ser diferente del polínucleótido de la otra especie. El término "vacuna subunitaria", como se usa en la presente, se refiere a una vacuna en donde se usa un polipéptido o fragmento del mismo, opuestamente a un organismo entero. El término "vacuna", como se usa en la presente, se refiere a una composición que provee inmunidad a un individuo tras desafío. El término "factor de virulencia", como se usa en la presente, se refiere a uno o más productos génicos que permiten que un microorganismo se establezca por sí mismo sobre o dentro de una especie hospedera particular, e intensifica su patogenicidad. Ejemplos de factores de virulencia incluyen, por ejemplo, proteínas de la superfície de la célula que medían la unión bacteriana, carbohidratos y proteínas de la superficie de la célula que protegen a una bacteria, toxinas bacterianas y enzimas hidrolíticas que pueden contribuir a la patogenicídad de la bacteria. La práctica de la presente invención usará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, etc., que estén dentro de la aptitud de la técnica. Dichas técnicas se explican enteramente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatís, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed., 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed., 1987), la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller y M. P.

Calos eds. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (D. M.

Weír y C. C. Blackwell, eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G.

Siedman, J. A. Smith y K. Struhl, eds., 1987), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M.

Shevach y W. Strober, eds., 1991 ); ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY; así como monografías en revistas tales como ADVANCES IN IMMUNOLOGY. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones mencionadas en la presente, tanto anteriormente como más adelante, se incorporan en la presente como referencia.

II. La presente invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos relacionados con proteínas de Ehriichia spp., y los polínucleótidos que las codifican. En aspectos particulares de la invención, existen ortólogos de proteínas inmunorreactivas mayores diferencialmente expresadas y secretadas de E canis y E chaffeensis, que inducen respuestas de anticuerpos tempranas a epítopes en repeticiones en tándem glucosiladas. Específicamente, la presente invención se refiere a una o más glucoproteínas de Ehriichia spp., en modalidades específicas. En otras modalidades, la presente invención se refiere a una glucoproteína de Ehriichia spp., es decir, una proteína gp36. En otras modalidades, la proteína gp36 es de E canis. En otras modalidades, la presente invención se refiere a una glucoproteína de Ehriichia spp., es decir, una proteína gp47. En otras modalidades, la proteína gp47 es de E chaffeensis. En aspectos específicos de la invención, dos proteínas inmunorreactivas mayores de E. canis, de 36 kDa y 19 kDa, inducen la respuesta de anticuerpos detectable más temprana durante la fase aguda de la ehrlichiosis monocítíca canina. Se identificaron genes que codifican para la proteína de 36 kDa inmunorreactiva mayor de E. canis y un ortólogo correspondiente de E. chaffeensis (47 kDa), y se determinaron su inmunorreactividad y expresión. Consistente con otras proteínas inmunorreactivas de Ehriichia, se detectaron carbohidratos en gp36 y gp47 recombinantes, y sus masas fueron sustancialmente más grandes que lo predicho (26.7 y 32.9 kDa, respectivamente). gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis tienen cada una unidades de repetición en tándem carboxi-terminales (aproximadamente cuatro a dieciséis repeticiones) que variaron en número y secuencias de aminoácidos entre diferentes aislados. Se identificaron epítopes de anticuerpos específicos de especie en la repetición no homologa C-terminal que comprende las regiones de gp36 y gp47, y unidades de repetición individuales recombinantes de ambas fueron reconocidas por anticuerpos. Sin embargo, una unidad de repetición de péptido sintético homólogo de gp36 de E. canis no fue inmunorreactiva, y el tratamiento del péptido recombinante inmunorreactivo con peryodato redujo sustancialmente la reactividad de los anticuerpos, demostrando que los glucanos son determinantes de epítope importantes que están estructuralmente conservados en las proteínas recombinantes expresadas en E. coli. gp36 de E canis y gp47 de E. chaffeensis fueron expresadas diferencíalmente sólo en la superficie de Ehriichia de núcleo denso. Además, se detectaron gp36 y gp47 en los sobrenadantes libres de Ehriichia, indicando que estas proteínas son liberadas extracelularmente durante la infección. Esta invención se refiere a estas glucoproteínas recién identificadas como composiciones inmunógenas, tales como vacunas, incluyendo vacunas subunítarias, o antígenos de inmunodiagnóstico, por ejemplo. Algunas modalidades de la presente invención están dirigidas hacia un método para inhibir la infección por E canis en un sujeto, que comprende los pasos de identificar un sujeto antes de la exposición o que se sospecha está expuesto a E. canis o infectado con la misma; y administrar una composición que comprenda un antígeno de 36 kDa de E. canis en una cantidad efectiva para inhibir la infección por E canis. La inhibición puede ocurrir a través de cualquier medio tal como, por ejemplo, la estimulación de las respuestas humoral o inmune celular del sujeto, o por otros medios tales como la inhibición de la función normal del antígeno de 36 kDa, o incluso la competencia con el antígeno para la interacción con algún agente en el cuerpo del sujeto, o una combinación de las mismas, por ejemplo. Algunas modalidades de la presente invención están dirigidas hacia un método para inhibir la infección por E. chaffeensis en un sujeto, que comprende los pasos de identificar un sujeto antes de la exposición o que se sospecha está expuesto a E. chaffeensis o infectado con la misma; y administrar una composición que comprenda un antígeno de 47 kDa de E. chaffeensis en una cantidad efectiva para inhibir la infección por E. chaffeensis. La inhibición puede ocurrir a través de cualquier medio tal como, por ejemplo, la estimulación de las respuestas humoral o inmune celular del sujeto, o por otros medios tales como la inhibición de la función normal del antígeno de 47 kDa, o incluso la competencia con el antígeno para interacción con algún agente en el cuerpo del sujeto, o una combinación de las mismas, por ejemplo. La presente invención está dirigida también hacia un método de terapia dirigida a un individuo, que comprende el paso de administrar un compuesto a un individuo, en donde el compuesto tiene una porción de determinación del blanco y una porción terapéutica, y en donde la porción de determinación del blanco es específica para la proteína gp36. En ciertos aspectos, la porción de determinación del blanco es un anticuerpo específico para gp36 o un ligando o un dominio de unión al ligando que se une a gp36. Asimismo, la porción terapéutica puede comprender un radioisótopo, una toxina, un agente químíoterapéutico, un estimulante inmune, un agente citotóxico o un antibiótico, por ejemplo. La presente invención está dirigida también hacía un método de terapia dirigida a un individuo, que comprende el paso de administrar un compuesto a un individuo, en donde el compuesto tiene una porción de determinación del blanco y una porción terapéutica, y en donde la porción de determinación del blanco es específica para la proteína gp47. En ciertos aspectos, la porción de determinación del blanco es un anticuerpo específico para gp47 o un ligando o un dominio de unión al ligando que se une a gp47. Asimismo, la porción terapéutica puede comprender un radioisótopo, una toxina, un agente quimioterapéutico, un estimulante inmune, un agente cítotóxico o un antibiótico, por ejemplo. Otras modalidades de la presente invención se refieren al diagnóstico de infección por Ehriichia en un mamífero, poniendo a prueba una muestra del mamífero, tal como suero o sangre, por ejemplo, para anticuerpos para una composición gp36 (para E. canis) o para una composición gp47 (para E. chaffeensis).

III. Composiciones de aminoácidos de qp36 de E canis y gp47 de E chaffeensis La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende gp36 de E canis, gp47 de E. chaffeensis, o una mezcla de las mismas. Por razones de brevedad, la siguiente sección se referirá a cualquier composición de aminoácidos de gp36 de E canis y/o gp47 de E chaffeensis de la presente invención, incluyendo polípéptidos y péptidos. En modalidades particulares, existe una secuencia de aminoácidos en donde el polipéptido puede ser una proteína recombínante, o puede ser aislada y/o purificada de la naturaleza, por ejemplo. En aspectos particulares, la secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico. El polipéptido es útil como un antígeno, en modalidades específicas. La presente invención está dirigida también hacia un método para producir la proteína recombínante, que comprende los pasos de obtener un vector que comprenda una construcción de expresión que comprenda una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos enlazada operativamente a un promotor; transfectar el vector en una célula; y cultivar la célula bajo condiciones efectivas para la construcción de expresión. La secuencia de aminoácidos puede generarse en forma sintética, en modalidades alternativas. Por una "proteína sustancialmente pura" se entiende una proteína que ha sido separada de por lo menos algunos de los componentes que la acompañan en forma natural. Una composición inmunorreactiva sustancialmente pura puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural; por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica para una composición inmunorreactiva; o sintetizando químicamente la proteína, por ejemplo. Por consiguiente, proteínas sustancíaimente puras incluyen proteínas procarióticas sintetizadas en E. coli, otros procariontes, o cualquier otro organismo en el cual no ocurren en forma natural. De esta manera, en ciertas modalidades, la presente invención se refiere a composiciones novedosas que comprenden por lo menos una molécula proteinácea. Como se usa en la presente, el término una "molécula proteinácea", "composición proteinácea", "compuesto proteináceo", "cadena proteinácea" o "material proteináceo" se refiere en general, pero no está limitado a, una proteína mayor de aproximadamente 200 aminoácidos o la secuencia endógena de longitud completa traducida de un gen; un polipéptido mayor de aproximadamente 100 aminoácidos; y/o un péptido de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos. Todos los términos de "proteináceo" descritos anteriormente, pueden usarse recíprocamente en la presente. En ciertas modalidades, el tamaño de la molécula proteinácea (por lo menos una) puede comprender, pero no está limitado a, aproximadamente 1 , aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11 , aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21 , aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31 , aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41 , aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51 , aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61 , aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71 , aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81 , aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91 , aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 525, aproximadamente 550, aproximadamente 575, aproximadamente 600, aproximadamente 625, aproximadamente 650, aproximadamente 675, aproximadamente 700, aproximadamente 725, aproximadamente 750, aproximadamente 775, aproximadamente 800, aproximadamente 825, aproximadamente 850, aproximadamente 875, aproximadamente 900, aproximadamente 925, aproximadamente 950, aproximadamente 975, aproximadamente 1000, aproximadamente 1100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400, aproximadamente 1500, aproximadamente 1750, aproximadamente 2000, aproximadamente 2250, aproximadamente 2500 o más residuos de aminoácido, y cualquier escala derivable en el mismo. Como se usa en la presente, una "molécula de aminoácido" se refiere a cualquier polipéptido, derivado de polipéptido o mimético de polipéptido, como sería conocido por los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, los residuos de la molécula proteinácea son secuenciales, sin ninguna molécula no de aminoácido interrumpiendo la secuencia de los residuos de la molécula de aminoácido. En otras modalidades, la secuencia puede comprender una o más porciones de molécula no de aminoácido. En modalidades particulares, la secuencia de residuos de la molécula proteinácea puede ser interrumpida por una o más porciones de molécula no de aminoácido. Por consiguiente, el término "composición proteinácea" abarca secuencias de moléculas de aminoácidos que comprenden por lo menos uno de los 20 aminoácidos comunes en proteínas sintetizadas en forma natural, o por lo menos un aminoácido modificado o inusual que ¡ncluye, pero no está limitado a, los que se muestran en el cuadro 1 siguiente.

CUADRO 1 Aminoácidos modificados e inusuales En ciertas modalidades, la composición proteinácea comprende por lo menos una proteína, polipéptido o péptido. En otras modalidades, la composición proteinácea comprende una proteína, polipéptido o péptido biocompatible. Como se usa en la presente, el término "biocompatible" se refiere a una sustancia que no produce efectos adversos significativos cuando se aplica o se administra a un organismo determinado de conformidad con los métodos y las cantidades que se describen en la presente. Dichos efectos adversos o no deseables, son aquellos tales como toxicidad significativa o reacciones ¡nmunológicas adversas. Pueden obtenerse composiciones proteináceas medíante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas estándar de biología molecular, el aislamiento de compuestos proteináceos de fuentes naturales, o la síntesis química de materiales proteináceos, por ejemplo. Las secuencias de nucleótido y proteína, polipéptido y péptido para varios genes se han descrito previamente, y pueden encontrarse en bases de datos computadas conocidas por los expertos en la técnica. Dos de dichas bases de datos son las bases de datos GenBank y GenPept del National Center for Bíotechnology Information, por ejemplo. Las regiones codificantes para estos genes conocidos pueden ser amplificadas y expresadas usando las técnicas descritas en la presente o como serían conocidas por los expertos en la materia. En forma alternativa, varias preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos son conocidas por los expertos en la técnica.

En ciertas modalidades, un compuesto proteináceo puede ser purificado. En general, el término "purificado" se referirá a una composición específica, o composición de proteína, polípéptido o péptido que ha sido sometida a fraccionamiento para remover varias otras proteínas, polipéptidos o péptidos, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad, según puede evaluarse, por ejemplo, mediante las pruebas de proteínas, como sería conocido por los expertos en la técnica para la proteína, polipéptido o péptido específico o deseado. Ejemplos de actividades que pueden evaluarse para retención en la composición proteinácea purificada, son actividad de unión a hierro e inmunorreactívidad. En modalidades específicas de la presente invención, un polípéptído es marcado, y cualquier marca detectable es adecuada en la invención. La marca puede ser unida al polipéptido en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal, o en una cadena lateral de un residuo de aminoácido. Pueden usarse una o más marcas. Ejemplos de marcas incluyen marcas radiactivas, marcas fluorescentes, marcas colorimétricas, etc. En modalidades específicas, la marca es unida covalentemente al polipéptido.

IV. Composiciones de ácido nucleico de gp36 de E canis y qp47 de E chaffeensis Ciertas modalidades de la presente invención se refieren a un ácido nucleico de gp36 de E canis y/o un ácido nucleico de gp47 de E. chaffeensis. Por razones de brevedad, la siguiente sección se referirá a cualquier composición de ácido nucleico de gp36 de E canis y/o gp47 de E chaffeensis de la presente invención. En ciertos aspectos, un ácido nucleico comprende un ácido nucleico de tipo silvestre o un ácido nucleico mutante. En aspectos particulares, un ácido nucleico codifica para un ácido nucleico transcrito, o comprende el mismo. En otros aspectos, un ácido nucleico comprende un segmento de ácido nucleico, o un equivalente biológicamente funcional del mismo. En aspectos particulares, un ácido nucleico codifica para una proteína, polipéptido o péptido. El término "ácido nucleico" es bien conocido en la técnica y puede usarse recíprocamente en la presente con el término "polinucleótido". Un "ácido nucleico", como se usa en la presente, se referirá en general a una molécula (es decir, una cadena) de ADN, ARN, o un derivado o análogo de la misma, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina de ocurrencia natural presente en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótído", cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico". El término "oligonucleótido" se refiere a una molécula entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término "polinucleótido" se refiere a por lo menos una molécula mayor de aproximadamente 100 nucleobases de longitud.

Estas definiciones se refieren en general a una molécula de cadena sencilla, pero en modalidades específicas, abarcará también una ¡ cadena adicional que es parcialmente, sustancialmente o completamente I , complementaria a la molécula de cadena sencilla. De esta manera, un ácido nucleico puede abarcar una molécula de doble cadena o una molécula de i triple cadena que comprende una o más cadenas complementarias o i "complementos" de una secuencia particular que comprende una molécula.

Como se usa en la presente, un ácido nucleico de cadena sencilla puede denotarse mediante el prefijo "ss", un ácido nucleico de doble cadena por el prefijo "ds", y un ácido nucleico de triple cadena por el prefijo "ts". I A. Nucleobases Como se usa en la presente, una "nucleobase" se refiere a una 1 base heterocíclica tal como, por ejemplo, una nucleobase de ocurrencia natural (es decir, una A, T, G, C o U) presente en por lo menos un ácido nucleico de ocurrencia natural (es decir, ADN o ARN), y derivados y análogos de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural de dicha nucleobase. Una • nucleobase puede formar en general uno o más enlaces de hidrógeno ("se une" o "hibrida") con por lo menos una nucleobase de ocurrencia natural, de forma que pueda sustituir el apareamiento de nucleobases de ocurrencia natural (por ejemplo, la formación de enlaces de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U).

Las nucleobases de "purina" y/o "pirimidina" abarcan nucleobases de purina y/o pirimídina de ocurrencia natural, y también derivados y análogos de las mismas que incluyen, pero no están limitadas a, aquellas de una purina o pirimidina sustituida por una o más de una porción alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, flúor, cloro, bromo o yodo), tiol o alquiltiol. Porciones alquilo preferidas (por ejemplo, alquilo, carboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1 , aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos no limitativos de una purina o pírimidina incluyen una deazapurina, una 2,6-díaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hípoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8-aminoguanína, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilcitosina, un 5-bromouracílo, un 5-etiluracilo, un 5-yodouracilo, un 5-clorouracilo, un 5-propiluracílo, un tiouracílo, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-dimetiladenina, una azaadenina, una 8-bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6-amínohexil/citosina), y similares. Una nucleobase puede estar comprendida en un nucleósído o nucleótido, usando cualquier método de síntesis química o natural descrito en la presente o conocido por los expertos en la técnica.

B. Nucleósidos Como se usa en la presente, un "nucleósído" se refiere a una unidad química individual que comprende una nucleobase unida covalentemente a una porción de enlazador de nucleobases. Un ejemplo no limitativo de una "porción de enlazador de nucleobases", es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un "azúcar de 5 carbonos") que incluye, pero no está limitado a, una desoxírribosa, una ribosa, una arabinosa, o un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Ejemplos no limitativos de un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos, incluyen una 2'-fluoro-2'-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en donde un carbono es sustituido por un átomo de oxígeno en el anillo del azúcar. Diferentes tipos de uniones covalentes de una nucleobase con una porción de enlazador de nucleobases se conocen en la técnica. A manera de ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) o una nucleobase de 7-deazapurina, típicamente une covalentemente la posición 9 de una purina o una 7-deazapurina con la posición V de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitativo, un nucleósido que comprende una nucleobase de pirimídina (es decir, C, T o U) típicamente une covalentemente una posición 1 de una pirimidina con una posición 1' de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).

C. Nucleótidos Como se usa en la presente, un "nucleótido" se refiere a un [ nucleósido que comprende además una "porción de estructura de base". En general, una porción de estructura de base une covalentemente un nucleótido con otra molécula que comprenda un nucleótido, o con otro nucleótido, para formar un ácido nucleico. La "porción de estructura de base" en nucleótidos de ocurrencia natural comprende típicamente una porción de fósforo, la cual se une covalentemente a un azúcar de 5 carbonos. La unión de la porción de i estructura de base ocurre típicamente en la posición 3' o 5' del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, otros tipos de unión se conocen en la técnica, en particular cuando un nucleótído comprende derivados o análogos de un azúcar de 5 carbonos de ocurrencia natural o porción de fósforo.

D. Análogos de ácido nucleico Un ácido nucleico puede comprender o puede estar compuesto enteramente de, un derivado o análogo de una nucleobase, una porción de enlazador de nucleobases y/o porción de estructura de base que puede estar presente en un ácido nucleico de ocurrencia natural. Como se usa en la presente, un "derivado" se refiere a una forma químicamente modificada o alterada de una molécula de ocurrencia natural, mientras que los términos "mimético" o "análogo" se refieren a una molécula que puede asemejar o no estructuralmente una molécula o porción de ocurrencia natural, pero posee funciones similares. Como se usa en la presente, una "porción" se refiere en general a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura molecular o química más grande. Análogos o derivados de nucleobase, nucleósido y nucleótido son bien conocidos en la técnica, y se han descrito (véase, por ejemplo, Scheit, 1980, cita incorporada en la presente como referencia). Ejemplos no limitativos adicionales de nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos que comprenden azúcar de 5 carbonos y/o derivados o análogos de porción de estructura de base, incluyen aquellos en la patente de E.U.A. No. 5,681 ,947, que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forman hélices triples con ADNds y/o previenen la expresión del mismo; las patentes de E.U.A. 5,652,099 y 5,763,167, que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos fluorescentes de nucleósidos presentes en ADN o ARN, en particular para su uso como sondas de ácidos nucleicos fluorescentes; la patente de E.U.A. 5,614,617, que describe análogos de oligonucleó.tidos con sustituciones en anillos de pirimidina que poseen estabilidad mejorada a las nucleasas; las patentes de E.U.A. 5,670,663, 5,872,232 y 5,859,221 , que describen análogos de olígonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (es decir, porciones de 2'-desoxifuranosilo modificadas) usadas en la detección de ácidos nucleicos; la patente de E.U.A. 5,446,137, que describe oligonucleótidos que comprenden por lo menos una porción de azúcar de 5 carbonos sustituida en la posición 4' con un sustituyente menos hidrógeno que puede usarse en pruebas de hibridación; la patente de E.U.A. 5,886,165, que describe oligonucleótidos con desoxirribonucleótidos con enlaces ¡ntemucleótido 3'-5' y ribonucleótidos con enlaces internucleótido 2'-5'; la patente de E.U.A. 5,741 ,606, que describe un enlace internucleótido modificado en donde un oxígeno en la posición 3' del enlace internucleótído es reemplazado por un carbono para mejorar la resistencia de los ácidos nucleicos a las nucleasas; la patente de E.U.A. 5,672,697, que describe oligonucleótídos que contienen uno o más enlaces internucleótido de fosfonato de metileno 5' que mejoran la resistencia a nucleasas; las patentes de E.U.A. 5,466,786 y 5,792,847, que describen el enlace de una porción sustituyente que puede comprender un fármaco o marca para el carbono 2' de un oligonucleótido que provee estabilidad mejorada a las nucleasas y la capacidad para suministrar fármacos o porciones de detección; la patente de E.U.A. 5,223,618, que describe análogos de oligonucleótídos con un enlace de estructura de base de 2 o 3 carbonos que une la posición 4' y la posición 3' de la porción de azúcar de 5 carbonos adyacente para captación celular mejorada, resistencia a nucleasas e hibridación con ARN objetivo; la patente de E.U.A. 5,470,967, que describe oligonucleótidos que comprenden por lo menos un enlace internucleótido de sulfamato o sulfamida, que son útiles como sonda de hibridación de ácidos nucleicos; las patentes de E.U.A. 5,378,825, 5,777,092, 5,623,070, 5,610,289 y 5,602,240, que describen oligonucleótidos con una porción de enlazador de tres o cuatro átomos que reemplaza a la porción de estructura de base de fosfodiéster usada para resistencia mejorada a nucleasas, captación celular y regulación de la expresión del ARN; la patente de E.U.A. 5,858,988, que describe agentes de vehículo hidrofóbicos unidos a la posición 2'-0 de oligonucleótidos para permeabilidad y estabilidad mejoradas de la membrana; la patente de E.U.A. 5,214,136, que describe oligonucleótidos conjugados con antraquinona en el extremo 5' que poseen hibridación mejorada con ADN o ARN y estabilidad mejorada a nucleasas; la patente de E.U.A. 5,700,922, que describe quimeras de PNA-DNA-PNA, en donde el ADN comprende nucleótidos de 2'-desoxí-eritropentofuranos¡lo para mejores resistencia a nucleasas, afinidad de unión y capacidad para activar ribonucleasa H; y la patente de E.U.A. No. 5,708,154, que describe ARN enlazado a un ADN para formar un híbrido de ADN-ARN.

E. Ácidos nucleicos aue contienen poliéteres v péptidos En ciertas modalidades, se contempla que un ácido nucleico que comprende un derivado o análogo de un nucleósido o nucleótido, pueda usarse en los métodos y las composiciones de la invención. Un ejemplo no limitativo es un "ácido nucleico que contiene poliéteres", descrito en la patente de E.U.A. No. de serie 5,908,845, incorporada en la presente como referencia.

En un ácido nucleico que contiene poliéteres, una o más nucleobases están enlazadas a átomos de carbono quirales en una estructura de base de poliéter. Otro ejemplo no limitativo es un "ácido nucleico que contiene péptidos", conocido también como "PNA", "análogo de ácido nucleico basado en péptidos" o "PENAM", descrito en la patente de E.U.A. Nos. de serie 5,786,461 , 5891 ,625, 5,773,571 , 5,766,855, 5,736,336, 5,719,262, 5,714,331 y 5,539,082 y en el documento WO 92/20702, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Los ácidos nucleicos que contienen péptidos tienen en general mejores carácter específico de secuencia, propiedades de unión y resistencia a la degradación enzimática, en comparación con moléculas tales como ADN y ARN (Egholm er ai, 1993; documento del PCT/EP/01219). Un ácido nucleico que contiene péptidos comprende en general uno o más nucleótidos o nucleósidos que comprenden una porción de nucleobase, una porción de enlazador de nucleobases que no sea un azúcar de 5 carbonos, y/o una porción de estructura de base que no sea una porción de estructura de base de fosfato. Ejemplos de porciones de enlazador de nucleobases descritos para PNAs, incluyen átomos de nitrógeno aza y ligaduras de amido y/o ureido (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,539,082). Ejemplos de porciones de estructura de base descritas para PNAs, incluyen una porción de estructura de base de aminoetílglicína, poliamida, polietilo, politioamida, polisulfinamida o polisulfonamida. En ciertas modalidades, un análogo de ácido nucleico tal como un ácido nucleico que contiene péptidos puede usarse para inhibir la amplificación del ácido nucleico, tal como en PCR, para reducir falsos positivos y discriminar entre mutantes de bases individuales, como se describe en la patente de E.U.A: No. de serie 5,891 ,625. Otras modificaciones y usos de análogos de ácidos nucleicos se conocen en la técnica, y son abarcados por el polinucleótido gp36. En un ejemplo no limitativo, la patente de E.U.A. No. 5,786,461 describe PNAs con cadenas laterales de aminoácidos unidas a la estructura de base del PNA que mejoran la solubilidad de la molécula. En otro ejemplo, la propiedad de captación celular de los PNAs se incrementa por la unión de un grupo lipofílico. La solicitud de E.U.A. No. de serie 117,363 describe varias porciones de alquilamino usadas para mejorar la captación celular de un PNA. Otro ejemplo se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,766,855, 5,719,262, 5,714,331 y 5,736,336, que describen PNAs que comprenden nucleobases de ocurrencia natural y de ocurrencia no natural y cadenas laterales de alquílamina que proveen mejoras en carácter específico de secuencia, solubilidad y/o afinidad de unión, respecto a un ácido nucleico de ocurrencia natural.

F. Preparación de ácidos nucleicos Un ácido nucleico puede obtenerse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia tal como, por ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Ejemplos no limitativos de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético), incluyen un ácido nucleico obtenido mediante síntesis químicamente in vitro usando química de fosfotriéster, fosfita o fosforamidita y técnicas de fase sólida, tal como se describe en el documento EP 266,032, incorporado en la presente como referencia, o por medio de intermediarios de fosfonato ácido de desoxinucleósido, como se describe en Froehler et ai, 1986 y en la patente de E.U.A. No. de serie 5,705,629, cada uno incorporado en la presente como referencia. En los métodos de la presente invención, pueden usarse uno o más oligonucleótídos. Varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótídos se han descrito, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 4,659,774, 4,816,571 , 5,141 ,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146 y 5,602,244, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Un ejemplo no limitativo de un ácido nucleico producido enzimáticamente, incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR™ (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 4,683,202 y la patente de E.U.A. 4,682,195, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia), o la síntesis de un oligonucleótido como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,645,897, incorporada en la presente como referencia. Un ejemplo no limitativo de un ácido nucleico producido biológicamente, incluye un ácido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una célula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias (véase, por ejemplo, Sambrook er ai, 1989, cita incorporada en la presente como referencia).

G. Purificación de ácidos nucleicos Un ácido nucleico puede purificarse sobre geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación de cloruro de cesio, o mediante cualquier otro medio conocido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et ai, 1989, cita incorporada en la presente como referencia). En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN o ADN) que ha sido aislada libre, o de otra manera está libre, del volumen de los ácidos nucleicos genómicos y transcritos totales de una o más células. En ciertas modalidades, el término "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que ha sido aislado libre, o está de otra manera libre, de componentes globales o celulares o componentes de reacción in vitro tales como, por ejemplo, macromoléculas tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas, y similares.

H. Segmentos de ácido nucleico En ciertas modalidades, el ácido nucleico es un segmento de ácido nucleico. Como se usa en la presente, el término "segmento de ácido nucleico" significa fragmentos más pequeños de un ácido nucleico tales como un ejemplo no limitativo, aquellos que codifican para sólo parte de la secuencia de péptidos o polipéptidos. De esta manera, un "segmento de ácido nucleico" puede comprender cualquier parte de una secuencia de genes, o de aproximadamente 2 nucleótidos a la longitud completa de la región que codifica para el péptido o polipéptido. Varios segmentos de ácido nucleico pueden diseñarse con base en una secuencia de ácido nucleico particular, y pueden ser de cualquier longitud. Mediante la asignación de valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer residuo es 1 , el segundo residuo es 2, etc., puede generarse un algoritmo que define todos los segmentos de ácido nucleico: n a n + y en donde n es un entero de 1 al último número de la secuencia, e y es la longitud del segmento de ácido nucleico menos uno, en donde n + y no excede el último número de la secuencia. De esta manera, para 10 partes, los segmentos de ácido nucleico corresponden a las bases 1 a 10, 2 a 11 , 3 a 12..., etc. Para 15 partes, los segmentos de ácido nucleico corresponden a las bases 1 a 15, 2 a 16, 3 a 17..., etc. Para 20 partes, los segmentos de ácido nucleico corresponden a las bases 1 a 20, 2 a 21 , 3 a 22..., etc. En ciertas modalidades, el segmento de ácido nucleico puede ser una sonda o iniciador. Como se usa en la presente, una "sonda" se refiere en general a un ácido nucleico usado en una composición o método de detección. Como se usa en la presente, un "iniciador" se refiere en general a un ácido nucleico usado en una composición o método de extensión o amplificación.

I. Complementos de ácido nucleico La presente invención abarca también un ácido nucleico que sea complementario a uno o más de otros ácidos nucleicos. En modalidades específicas, por ejemplo, un ácido nucleico se usa para propósitos antisentído o de ARNsi, tal como para inhibir por lo menos parcialmente la expresión de un polinucleótido.

En modalidades particulares, la invención abarca un ácido nucleico o un segmento de ácido nucleico complementario a la secuencia expuesta en la presente, por ejemplo. Un ácido nucleico es el "complemento" de otro ácido nucleico o es "complementario" al mismo, cuando es capaz de exhibir apareamiento de bases con otro ácido nucleico de acuerdo a las reglas de complementariedad de unión estándar de Watson-Crick y Hoogsteen, o inversa de Hoogsteen. Como se usa en la presente, el término "otro ácido nucleico" puede referirse a una molécula separada o una secuencia separada espacial de la misma molécula. Como se usa en la presente, el término "complementario" o "complemento" se refiere también a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleobases consecutivas o nucleobases semiconsecutivas (por ejemplo, una o más porciones de nucleobases no están presentes en la molécula) capaz de hibridar con otra cadena o dúplex de ácido nucleico, incluso si menos que todas las nucleobases no muestran apareamiento de bases con una nucleobase contraparte. En ciertas modalidades, un ácido nucleico "complementario" comprende una secuencia en la cual aproximadamente 70%, aproximadamente 71%, aproximadamente 72%, aproximadamente 73%, aproximadamente 74%, aproximadamente 75%, aproximadamente 76%, aproximadamente 77%, aproximadamente 78%, aproximadamente 79%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81 %, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% a aproximadamente 100%, y cualquier escala derivable en la misma, de la secuencia de nucleobases, es capaz de exhibir apareamiento de bases con una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla o de doble cadena durante la hibridación. En ciertas modalidades, el término "complementario" se refiere a un ácido nucleico que puede hibridar con otra cadena o dúplex de ácido nucleico en condiciones severas, como lo entenderían los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, un ácido nucleico "parcialmente complementario" comprende una secuencia que puede hibridar en condiciones de baja severidad con un ácido nucleico de cadena sencilla o de doble cadena, o contiene una secuencia en la cual menos de aproximadamente 70% de la secuencia de nucleobases es capaz de exhibir apareamiento de bases con una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla o de doble cadena durante la hibridación.

J. Hibridación Como se usa en la presente, se entiende que el término "hibridación", "hibrida" o "capaz de hibridar" significa la formación de una molécula de doble cadena o de triple cadena, o una molécula con naturaleza de doble cadena o triple cadena parcial. El término "unir", como se usa en la presente, es sinónimo de "hibridar". El término "hibridación", "hibrida" o "capaz de hibridar", abarca los términos "condiciones severas" o de "alta severidad", y ¡ los términos "baja severidad" o "condiciones de baja severidad". I Como se usa en la presente, "condiciones severas" o de "alta I severidad", son aquellas condiciones que permiten la hibridación entre o 1 dentro de una o más cadenas de ácido nucleico que contienen secuencias I complementarias, pero excluyen la hibridación de secuencias aleatorias. Las 1 condiciones severas toleran poco no apareamiento, sí lo hay, entre un ácido nucleico y una cadena objetivo. Dichas condiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica, y se prefieren para aplicaciones que requieren alta I 1 selectividad. Aplicaciones no limitativas incluyen el aislamiento de un ácido nucleico, tal como un gen o un segmento de ácido nucleico del mismo, o la 1 detección de por lo menos un transcrito de ARN mensajero específico o un segmento de ácido nucleico del mismo, y similares. Condiciones severas pueden comprender condiciones de baja I concentración de sales y/o condiciones de alta temperatura, tales como las 1 provistas por NaCI a aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M, por ejemplo, a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C o, por ejemplo, en donde dichas condiciones severas sean hibridación a 50-65°C., 5X SSPC, formamida a 50%; lavado a 50-65°C, 5X SSPC; o lavado i a 60°C, 0.5X SSC, SDS a 0.1 %. Se entiende que la temperatura y la concentración iónica de una severidad deseada son determinadas en parte por la longitud de los ácidos nucleicos particulares, la longitud y el contenido de nucleobases de las secuencias objetivo, la composición de cargas de los ácidos nucleicos, y la presencia o concentración de formamida, cloruro de tetrametilamonío u otros solventes en una mezcla de hibridación. Se entiende también que estas escalas, composiciones y condiciones para la hibridación, se mencionan sólo a manera de ejemplos no limitativos, y que la severidad deseada para una reacción de hibridación particular es determinada con frecuencia empíricamente por comparación con uno o más controles positivos o negativos. Dependiendo de la aplicación prevista, se prefiere usar condiciones variables de hibridación para lograr grados variables de selectividad de un ácido nucleico hacia una secuencia objetivo. En un ejemplo no limitativo, la identificación o el aislamiento de un ácido nucleico objetivo relacionado que no hibrida con un ácido nucleico bajo condiciones severas, pueden lograrse mediante hibridación a baja temperatura y/o alta concentración iónica. Dichas condiciones se denominan de "baja severidad" o "condiciones de baja severidad", y ejemplos no limitativos de baja severidad incluyen hibridación realizada con NaCI a aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M a una escala de temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C. De hecho, está dentro de la aptitud del experto en la técnica modificar además las condiciones de baja o alta severidad para adecuarlas a una aplicación particular.

V. Sistemas de expresión basados en ácido nucleico En modalidades particulares, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de Ehriichia inmunorreactívo, e incluye también suministrar el polinucleótido que codifica para el polipéptido, o producto codificado del mismo, a un individuo que necesita del mismo, tal como un individuo infectado con Ehriichia y/o un individuo susceptible a ser infectado con Ehriichia. Por razones de brevedad, la siguiente sección se referirá a cualquier composición de ácido nucleico de gp36 de E. canis y/o gp47 de E. chaffeensis, y/o sistema de expresión basado en ácido nucleico de la presente invención. La presente invención está dirigida hacia una secuencia de ADN sustancialmente pura y/o aislada que codifica para una composición inmunorreactiva de Ehriichia. En general, la proteína codificada comprende una secuencia N-terminal, la cual puede ser digerida después de modificación post-traducción, resultando en la producción de una proteína madura. Es bien sabido en la técnica que debido a la degeneración del código genético (es decir, para la mayoría de los aminoácidos, más de un triplete de nucleótidos (codón) codifica para un aminoácido individual), diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar para un aminoácido particular, o polipéptido. De esta manera, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención incluyen cualquiera de los ejemplos de secuencias provistos, o una variante degenerada de dicha secuencia, por ejemplo. En aspectos particulares de la invención, una variante degenerada comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia de la invención, pero que retiene aún una o más propiedades de una secuencia de la invención. Como se usa en la presente, el término "ADN sustancialmente puro" significa ADN que no forma parte de un ambiente en el cual el ADN ocurre en forma natural, en virtud de separación (purificación parcial o total) de algunas de las moléculas o la totalidad de las mismas de ese ambiente, o en virtud de alteración de secuencias que flanquean el ADN reclamado. Por lo tanto, el término ¡ncluye, por ejemplo, un ADN recombinante que es incorporado en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procarionte o eucarionte; o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADNc o de ADN genómico producido mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) o digestión por endonucleasa de restricción), independiente de otras secuencias. Incluye también un ADN recombinante, que forma parte de un gen híbrido que codifica para una secuencia de polipéptidos adicional, por ejemplo, una proteína de fusión. La presente invención está dirigida además a un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una composición inmunorreactiva de Ehriichia, y capaz de expresar el polínucleótido cuando el vector es introducido en una célula. En modalidades específicas, el vector comprende en enlace operable, los siguientes: a) un origen de replicación; b) un promotor; y c) una secuencia de ADN que codifica para la proteína.

Como se usa en la presente, el término "vector" puede definirse como una construcción de ácido nucleico replicable, por ejemplo, un plásmido o ácido nucleico viral. Pueden usarse vectores para amplificar y/o expresar un ácido nucleico que codifique para una composición inmunorreactiva de Ehriichia. Un vector de expresión es una construcción replicable, en la cual una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, es enlazada operablemente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión del polipéptído en una célula. La necesidad de dichas secuencias de control variará, dependiendo de la célula seleccionada y el método de transformación elegido. En general, las secuencias de control incluyen un intensificador y/o promotor de transcripción, sitios de unión ribosomales de ARN mensajero adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción, por ejemplo. Métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que comprendan señales de control adecuadas de la transcripción y traducción. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et ai, 1989, Molecular Cloníng: A Laboratory Manual (2a. ed.), Cold Spring Harbor Press, N. Y. Se define que una secuencia de polinucleótidos que será expresada, y sus secuencias de control de la transcripción están "enlazadas operablemente", si las secuencias de control de la transcripción controlan efectivamente la transcripción de la secuencia de polinucleótidos. Los vectores de la invención incluyen, pero no están limitados a, vectores de plásmido y vectores virales. Vectores virales preferidos de la invención, son aquellos derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus SV40 o virus del herpes, por ejemplo. En general, los vectores de expresión comprenden secuencias de promotor que facilitan la transcripción eficiente del polinucleótido que será expresado, y se usan con relación a una célula hospedera. Como se usa en la presente, se entiende que el término "hospedero" ¡ncluye no sólo procariontes, sino también eucariontes, tales como células de levadura, células vegetales y células animales. Un polinucleótido recombinante que codifica para una composición inmunorreactiva de Ehriichia de la presente invención, puede usarse para transformar un hospedero usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la materia. Hospederos procarióticos pueden incluir E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Hospederos eucarióticos incluyen levaduras, tales como Pichia pastoris, células de mamífero y células de insecto. La siguiente descripción se refiere a ejemplos de elementos, reactivos y métodos para el suministro de polinucleótídos y ácidos nucleicos de un polinucleótido de Ehriichia.

A. Vectores El término "vector" se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la cual una secuencia de ácido nucleico puede ser insertada para introducción en una célula en donde pueda ser replicada. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo cual significa que es extraña para la célula en la cual el vector está siendo introducido, o que la secuencia es homologa a una secuencia en la célula, pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera en la cual la secuencia no se encuentra habitualmente. Vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófago, virus de animales y virus de plantas) y cromosomas artificiales i (por ejemplo, YACs). El experto en la técnica estaría bien capacitado para construir un vector a través de técnicas recombinantes estándar (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1988, y Ausubel et al., 1994, citas incorporadas en la 1 presente como referencia). El término "vector de expresión" se refiere a cualquier tipo de construcción genética que comprenda un ácido nucleico que codifique para un i ARN capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN son entonces traducidas en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no son traducidas, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentído o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante enlazada operablemente en una célula hospedera particular. Además de secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen también otras funciones, y se describen más adelante. 1. Promotores e intensificadores Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico, en la cual el inicio y la velocidad de la transcripción son controlados. Puede contener elementos genéticos en los cuales moléculas y proteínas reguladoras pueden unirse, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las frases "posicionado operativamente", "enlazado operativamente", "bajo control" y "bajo el control de la transcripción", significan que un promotor está en una posición y/u orientación funcional correcta con relación a una secuencia de ácido nucleico, para controlar el inicio y/o la expresión de esa secuencia por medio de la transcripción. Un promotor comprende en general una secuencia que funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido de ésta es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA tales como, por ejemplo, el promotor para el gen de desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos del SV40, un elemento discreto que cubre el sitio de inicio mismo ayuda a fijar el sitio de inicio. Otros elementos de promotor regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Típicamente, estos se localizan en la región 30 110 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio, aunque se ha mostrado que muchos promotores contienen también elementos funcionales hacia el extremo 3' del sitio de inicio. Para poner una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, debe posicíonarse el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura de la transcripción "corriente abajo" (es decir, hacia el extremo 3') del promotor elegido. El promotor "hacia el extremo 5' " estimula la transcripción del ADN, y promueve la expresión del ARN codificado. El espaciamiento entre los elementos de promotor con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor es preservada cuando los elementos son invertidos o movidos respecto a algún otro. En el promotor tk, el espaciamiento entre los elementos de promotor puede incrementarse hasta 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece ser que los elementos individuales pueden funcionar cooperativamente o independientemente para activar la transcripción. Un promotor puede usarse o no en conjunto con un "intensíficador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción cis implicada en la activación de una secuencia de ácido nucleico por medio de la transcripción. Un promotor puede ser uno asociado naturalmente con una secuencia de ácido nucleico, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' localizadas hacia el extremo 5' del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor puede ser referido como "endógeno". En forma similar, un intensificador puede ser uno asociado en forma natural con una secuencia de ácido nucleico, localizada hacia el extremo 3' o el extremo 5' de esa secuencia. En forma alternativa, ciertas ventajas se lograrán poniendo el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su ambiente natural. Un intensificador recombinante o heterólogo se refiere también a un intensificador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su ambiente natural. Dichos promotores o intensificadores pueden incluir promotores o intensificadores de otros genes, y promotores o intensificadores aislados de cualquier otro virus, o célula procariótica o eucariótica, y promotores o intensificadores no de "ocurrencia natural", es decir, conteniendo diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción, y/o mutaciones que alteran la expresión. Por ejemplo, los promotores que se usan más comúnmente en la construcción de ADN recombinante, incluyen los sistemas de promotor de beta lactamasa (penicílinasa), lactosa y triptófano (trp). Además de que se producen secuencias de ácido nucleico de promotores e intensificadores mediante tecnología de síntesis, pueden producirse secuencias usando tecnología de amplificación de ácido nucleico y/o de clonación recombinante, incluyendo PCR™, con relación a las composiciones descritas en la presente (véase las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,202 y 5,928,906, cada una incorporada en la presente como referencia). Además, se contempla que pueden usarse también secuencias de control que dirijan la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de organelos no nucleares, tales como mitocondrias, cloroplastos, y similares.

Naturalmente, será importante usar un promotor y/o intensifícador que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en la célula, organelo, tipo de célula, tejido, órgano u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de biología molecular, conocen en general el uso de promotores, ¡ntensificadores, y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (véase, por ejemplo, Sambrook et ai, 1989, cita incorporada en la presente como referencia). Los promotores usados pueden ser constitutivos, específicos de tejidos, inducibles y/o útiles bajo las condiciones adecuadas, para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. El promotor puede ser uno adecuado para su uso en una célula procariótica, una célula eucariótica, o ambas. Además, cualquier combinación de promotor/intensíficador (tal como, por ejemplo, la base de datos de promotores eucarióticos EPDB) podría usarse también para dirigir la expresión. El uso de un sistema de expresión citoplásmíco T3, T7 o SP6, es una modalidad posible. 2. Señales de inicio v sitios internos de unión del ribosoma Una señal de inicio específica puede requerirse también para la traducción eficiente de las secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proveer secuencias de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. El experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente éste, y de proveer las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar "en el marco" con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada, para asegurar la traducción de la inserción entera. Las señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficiencia de la expresión puede intensificarse por la inclusión de elementos intensificadores de la transcripción adecuados. En ciertas modalidades de la invención, se hace uso de elementos de sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) para crear mensajes policistrónicos o de genes múltiples. Los elementos de IRES son capaces de evitar el modelo de exploración del ribosoma de la traducción dependiente de Cap metilada 5', y de comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito elementos de IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (virus de la poliomielitis y encefalomiocarditis), así como un IRES de un mensaje en mamíferos (Macejak y Sarnow, 1991 ). Los elementos de IRES pueden estar enlazados a marcos de lectura abiertos heterólogos. Marcos de lectura abiertos múltiples, pueden ser transcritos en conjunto, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento de IRES, cada marco de lectura abierto es accesible para los ribosomas para traducción eficiente. Genes múltiples pueden ser expresados eficientemente usando un promotor/intensíficador individual que transcribe un mensaje individual (véase las patentes de E.U.A. Nos. 5,925,565 y 5,935,819, cada una incorporada en la presente como referencia). 3. Sitios de clonación múltiple Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene sitios de enzima de restricción múltiples, cualquiera de los cuales puede usarse en conjunto con tecnología recombinante estándar, para digerir el vector (véase, por ejemplo, Carbonelli et al., 1999, Levenson et ai, 1998, y Cocea, 1997, citas incorporadas en la presente como referencia). El término "digestión por enzima de restricción" se refiere a la digestión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona sólo en sitios específicos en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles comercialmente. El uso de dichas enzimas es entendido ampliamente por los expertos en la técnica. Con frecuencia, un vector es linealizado o fragmentado usando una enzima de restricción, que corta dentro del MCS, para permitir que secuencias exógenas sean ligadas al vector. El término "ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden ser contiguos o no entre sí. Técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligación, son bien conocidas por los expertos en la técnica de tecnología recombínante. 4. Sitios de empalme La mayoría de las moléculas de ARN eucarióticas transcritas, sufrirán empalme de ARN para remover intrones de los transcritos primarios. Vectores que contengan secuencias eucarióticas genómicas pueden requerir sitios de empalme de donador y/o aceptor para asegurar el procesamiento adecuado del transcrito para la expresión de proteínas (véase, por ejemplo, Chandler et al., 1997, cita incorporada en la presente como referencia). 5. Señales de terminación Los vectores o construcciones de la presente invención comprenderán en general por lo menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador", comprende las secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. De esta manera, en ciertas modalidades, se contempla una señal de terminación que termina la producción de un transcrito de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para lograr niveles de mensaje deseables. En sistemas eucarióticos, la región del terminador puede comprender también secuencias de ADN específicas que permiten la digestión específica de sitio del nuevo transcrito, para exponer un sitio de poliadenilación. Esto señaliza una polímerasa endógena especializada que añade un tramo de aproximadamente 200 residuos de A (poliA) al extremo 3' del transcrito. Moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA, parecen ser más estables y son traducidas más eficientemente. De esta manera, en otras modalidades que implican eucariontes, se prefiere que el terminador comprenda una señal para la digestión del ARN, y se prefiere más que la señal del termínador promueva la poliadenílación del mensaje. Los elementos del sitio del terminador y/o de poliadenilación pueden servir para mejorar los niveles de mensaje, y para reducir al mínimo la lectura a través del cassette en otras secuencias. Terminadores contemplados para su uso en la invención, incluyen cualquier termínador de la transcripción conocido descrito en la presente, o conocido por los expertos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes tales como, por ejemplo, el terminador de la hormona del crecimiento de bovino, o secuencias de terminación virales tales como, por ejemplo, el terminador del SV40. En ciertas modalidades, la señal de terminación puede carecer de una secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de la secuencia. 6. Señales de poliadenilación En expresión, en particular expresión eucariótica, se incluirá típicamente una señal de poliadenilación que efectúe la poliadenilación adecuada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y puede usarse cualquiera de dichas secuencias. Modalidades preferidas incluyen la señal de poliadenilación del SV40 o la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento de bovino, conveniente y conocida por funcionar bien en varias células objetivo. La poliadenilación puede incrementar la estabilidad del transcrito, o puede facilitar el transporte citoplásmíco. 7. Orígenes de replicación Para propagar un vector en una célula hospedera, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (denominados con frecuencia "ori"), que es una secuencia de ácido nucleico específica en la cual se inicia la replicación. En forma alternativa, puede usarse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula hospedera es una levadura. 8. Marcadores seleccionables e identificables En ciertas modalidades de la invención, células que contengan una construcción de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo, incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, permitiendo la identificación fácil de las células que contienen al vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es uno que confiera una propiedad que permita la selección. Un marcador seleccionable positivo es uno en el cual la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en el cual su presencia previene su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.

Usualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos facilita la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol, son marcadores seleccionables útiles. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes con base en la implementación de condiciones, se contemplan también otros tipos de marcadores que incluyen marcadores identificables tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. En forma alternativa, pueden usarse enzimas identificables, tales como timidina cinasa (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del virus del herpes simple. El experto en la técnica sabría también cómo usar marcadores inmunológicos, posiblemente en conjunto con el análisis por FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, en tanto sea capaz de ser expresado simultáneamente con el ácido nucleico que codifique para un producto génico. Otros ejemplos de marcadores seleccionables e identifícables son bien conocidos por los expertos en la técnica. 9. Vectores de plásmido En ciertas modalidades, un vector de plásmido se contempla para su uso para transformar una célula hospedera. En general, vectores de plásmido que contengan secuencias de control y de replicones que se derivan de especies compatibles con la célula hospedera, se usan con relación a estos hospederos. El vector posee comúnmente un sitio de replicación, así como secuencias de marcación que son capaces de proveer selección fenotípíca en células transformadas. En un ejemplo no limitativo, E. coli es transformada con frecuencia usando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E coli. pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclína, y provee de esta manera un medio fácil para la identificación de células transformadas. El plásmido pBR, u otro fago o plásmido microbiano debe contener también, o debe ser modificado para que contenga, por ejemplo, promotores que puedan ser usados por el organismo microbiano para la expresión de sus propias proteínas. Además, vectores de fago que contengan secuencias de control y de replicones que sean compatibles con el microorganismo hospedero, pueden usarse como vectores transformantes con relación a estos hospederos. Por ejemplo, el fago lambda GEMTM 11 puede usarse para obtener un vector de fago recombinante que puede usarse para transformar células hospederas tales como, por ejemplo, LE392 de E coli. Otros vectores de plásmido útiles incluyen vectores pIN (Inouye et a , 1985); y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles de glutatión S transferasa (GST) para posterior purificación y separación o digestión. Otras proteínas de fusión adecuadas son aquellas con beta-galactosidasa, ubiquitina, y similares. Células hospederas bacterianas, por ejemplo, E. coli, que comprenden el vector de expresión, son desarrolladas en cualquiera de muchos medios adecuados, por ejemplo, LB. Puede inducirse la expresión de la proteína recombinante en ciertos vectores, como lo entenderían los expertos en la técnica, poniendo en contacto una célula hospedera con un agente específico para ciertos promotores, por ejemplo, añadiendo IPTG al medio, o cambiando la incubación a una mayor temperatura. Después del cultivo de las bacterias por otro período, generalmente entre 2 y 24 horas, las células se colectan mediante centrifugación, y se lavan para remover medios residuales. 10. Vectores virales La capacidad de ciertos virus para infectar células o entrar a las células por medio de endocitosis mediada por receptores, y de integrarse en el genoma de la célula hospedera y expresar genes virales establemente y eficientemente, los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños en células (por ejemplo, células de mamífero). Los componentes de la presente invención pueden comprender un vector viral que codifica para una o más composiciones u otros componentes tales como, por ejemplo, un inmunomodulador o adyuvante. Ejemplos no limitativos de vectores virales que pueden usarse para suministrar un ácido nucleico de la presente invención, se describe más adelante. a. Vectores adenovirales Un método particular para el suministro del ácido nucleico, implica el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque los vectores de adenovirus son conocidos por tener una baja capacidad de integración en el ADN genómico, esta característica es compensada por la alta eficiencia de la transferencia de genes producida por estos vectores. Se entiende que el término "vector de expresión de adenovirus" incluye aquellas construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) sustentar el empacamiento de la construcción, y (b) expresar finalmente una construcción específica de tejido o célula que ha sido clonada en la misma. El conocimiento de la organización genética del adenovírus, un virus de ADN de doble cadena lineal de 36 kb, permite la sustitución de grandes piezas de ADN adenovíral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). b. Vectores de AAV El ácido nucleico puede introducirse en la célula usando transfección asistida por adenovirus. Se han reportado eficiencias de transfección incrementadas en sistemas de células, usando sistemas acoplados a adenovirus (Kelleher y Vos, 1994; Cotten et ai, 1992; Curiel, 1994). El virus adenoasociado (AAV) es un sistema de vector atractivo para su uso en las composiciones de la presente invención, ya que tiene una alta frecuencia de integración y puede infectar a células que no están en división, haciendo de esta manera que sea útil para el suministro de genes en células de mamífero, por ejemplo, en cultivo de tejidos (Muzyczka, 1992) o in vivo. El AAV tiene un amplío rango de hospederos para infecciosidad (Tratschin et ai, 1984; Laughiin et ai, 1986; Lebkowski et ai, 1988; McLaughlin et al., 1988).

Detalles acerca de la generación y el uso de vectores rAAV se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,139,941 y 4,797,368, cada una incorporada en la presente como referencia. c. Vectores retrovirales ! Los retrovirus son útiles como vectores de suministro debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del hospedero, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro [ de especies y tipos de células, y de ser empacados en líneas de células especiales (Miller, 1992). Para construir un vector retroviral, un ácido nucleico (por ejemplo, uno que codifique para una composición de interés) es insertado en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales, para producir un virus que es de replicacíón defectuosa. Para producir viriones, se construye una línea de células de empacamiento que contenga los genes gag, pol y env, pero sin los componentes de empacamiento y de LTR (Mann et ai, 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con las secuencias de empacamiento y de LTR retrovirales es introducido en una línea de células especial (por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empacamiento permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante sea empacado en partículas virales, las cuales son secretadas entonces en el medio de cultivo (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et ai, 1983). El medio que contiene a los retrovirus recombinantes es entonces colectado, opcionalmente concentrado, y usado para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células hospederas (Paskind er a/., 1975). Los lentívirus son retrovirus complejos que, además de los genes I i retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naldini et al., 1996; Zufferey et ai, 1997; Blomer I et ai, 1997; patentes de E.U.A. Nos. 6,013,516 y 5,994,136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de la inmunodefíciencia humana VIH- 1 , VIH-2, y el virus de la inmunodeficiencia simiana SIV. Se han generado vectores lentivirales atenuando por multiplicación los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef son deletados, haciendo que el vector sea biológicamente seguro. Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar a células que no están en división, y pueden usarse para la transferencia de genes in vivo y ex vivo y la expresión de secuencias de ácido nucleico. Por I ejemplo, lentivirus recombinantes capaces de infectar a una célula que no está en división, en donde una célula hospedera adecuada es transfectada con dos o más vectores que poseen las funciones de empacamiento, a saber, gag, pol y env, así como rev y tat, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,994,136, incorporada en la presente como referencia. Puede elegirse como objetivo el virus recombinante, por ligamiento de la proteína de la cubierta con un anticuerpo o un ligando particular para la determinación del blanco hacia un receptor de un tipo de célula particular. Mediante la inserción de una secuencia (incluyendo una región reguladora) de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifique para el ligando para un receptor en una célula objetivo específica, por ejemplo, el vector es ahora específico del objetivo. d. Otros vectores virales Otros vectores virales pueden usarse como construcciones de vacuna en la presente invención. Pueden usarse vectores derivados de virus, tales como virus de la vaccinía (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et ai, 1988), virus Sindbis, citomegalovírus y virus del herpes simple.

Ofrecen varias características atractivas para varias células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et ai, 1988; Horwich et ai, 1990). e. Suministro usando virus modificados Un ácido nucleico que será suministrado puede ser alojado dentro de un virus infeccioso que no haya sido diseñado para expresar un ligando de unión específico. La partícula viral se unirá de esta manera específicamente a los receptores cognados de la célula objetivo, y suministrará los contenidos hacia la célula. Un procedimiento novedoso diseñado para permitir la determinación del blanco específica de vectores retrovirales, se desarrolló con base en la modificación química de un retrovirus por la adición química de residuos de lactosa a la cubierta viral. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos por medio de receptores de sialoglucoproteína. Se diseñó otro procedimiento para la determinación del blanco de retrovirus recombinantes en los cuales se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de la cubierta retroviral y contra un receptor de células específico. Los anticuerpos fueron acoplados por medio de los componentes de biotina, usando estreptavidina (Roux et a , 1989). Mediante el uso de anticuerpos contra los antígenos clase I y clase II del complejo mayor de hístocompatibilidad, demostraron la infección de una variedad de células humanas que poseían esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989). 1 1. Suministro de vectores y transformación de células Se cree que métodos adecuados para el suministro de ácidos nucleicos de Ehriichia para la transformación de un organelo, una célula, un tejido o un organismo para su uso con la presente invención, incluyen virtualmente cualquier método por el cual un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) pueda ser introducido en un organelo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente o como sería conocido por los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, suministro directo de ADN tal como mediante transfección ex vivo (Wilson et ai, 1989, Nabel et ai, 1989), mediante inyección (patentes de E.U.A. Nos. 5,994,624, 5,981 ,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859, cada una incorporada en la presente como referencia), incluyendo microínyección (Harían y Weíntraub, 1985; patente de E.U.A. No. 5,789,215, incorporada en la presente como referencia); mediante electroporación (patente de E.U.A. No. 5,384,253, incorporada en la presente como referencia; Tur-Kaspa et ai, 1986; Potter et ai, 1984); mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et ai, 1990); mediante el uso de DEAE-dextrán, seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); mediante carga sónica directa (Fechheimer et ai, 1987); mediante transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et ai, 1979; Nicolau et ai, 1987; Wong et ai, 1980; Kaneda et ai, 1989; Kato et ai, 1991 ) y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); mediante bombardeo de mícroproyectiles (solicitud del PCT Nos. WO 94/09699 y 95/06128; patentes de E.U.A. Nos. 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880, cada una incorporada en la presente como referencia); mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et ai, 1990; patentes de E.U.A. Nos. 5,302,523 y 5,464,765, cada una incorporada en la presente como referencia); mediante transformación mediada por Agrobacterium (patentes de E.U.A. Nos. 5,591 ,616 y 5,563,055, cada una incorporada en la presente como referencia); mediante transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh er ai, 1993; patentes de E.U.A. Nos. 4,684,611 y 4,952,500, cada una incorporada en la presente como referencia); mediante captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et ai, 1985), y cualquier combinación de dichos métodos. A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, organelos, células, tejidos u organismos pueden ser transformados establemente o transitoriamente. a. Transformación ex vivo Métodos para transfectar células y tejidos vasculares removidos de un organismo en un ambiente ex vivo, son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, células endoteliales de canino han sido alteradas genéticamente mediante la transferencia de genes retrovirales in vitro, y trasplantadas en un canino (Wilson et ai, 1989). En otro ejemplo, células endotelíales de cerdo enano de Yucatán fueron transfectadas mediante retrovirus in vitro, y trasplantadas en una arteria usando un catéter de doble globo (Nabel er a , 1989). De esta manera, se contempla que células o tejidos pueden ser removidos y transfectados ex vivo usando los ácidos nucleicos de la presente invención. En aspectos particulares, las células o los tejidos trasplantados pueden introducirse en un organismo. En modalidades preferidas, un ácido nucleico es expresado en las células o los tejidos trasplantados. b. Invección En ciertas modalidades, un ácido nucleico puede ser suministrado hacia un organelo, una célula, un tejido o un organismo por ' medio de una o más inyecciones (es decir, inyección con una aguja) tal como, por ejemplo, subcutáneamente, intradérmicamente, intramuscularmente, intravenosamente, intraperitonealmente, etc. Métodos para la inyección de vacunas son bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, inyección de una composición que comprenda una solución salina). Otras modalidades de la presente invención incluyen la introducción de un ácido i nucleico mediante microinyeccíón directa. Se ha usado microinyeccíón directa para introducir construcciones de ácido nucleico en oocitos de Xenopus (Harland y Weintraub, 1985). La cantidad de la composición usada puede variar, dependiendo de la naturaleza del antígeno, así como el organelo, célula, tejido u organismo usado. c. Electroporación En ciertas modalidades de la presente invención, un ácido nucleico es introducido en un organelo, una célula, un tejido o un organismo, por medio de electroporacíón. La electroporación implica la exposición de una suspensión de células y ADN a una descarga eléctrica de alto voltaje. En algunas variantes de este método, se usan ciertas enzimas que degradan la pared celular, tales como enzimas que degradan la pectina, para hacer que las células receptoras objetivo sean más susceptibles a la transformación mediante electroporación que las células no tratadas (véase patente de E.U.A. No. 5,384,253, incorporada en la presente como referencia). En forma alternativa, puede hacerse que las células receptoras sean más susceptibles a la transformación, mediante la provocación de lesión mecánica. La transfección de células eucarióticas usando electroporación ha sido bastante exitosa. Se han transfectado pre-linfocitos B de ratón con genes de ¡nmunoglobulina kappa humana (Potter er ai, 1984), y se han transfectado hepatocitos de rata con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Tur Kaspa er ai, 1986) de esta forma. Para efectuar la transformación mediante electroporacíón en células tales como, por ejemplo, células vegetales, pueden usarse tejidos friables, tales como un cultivo en suspensión de células o callos embrionarios, o en forma alternativa, pueden transformarse embriones inmaduros u otro tejido organizado directamente. En esta técnica, se degradarían parcialmente las paredes celulares de las células elegidas exponiéndolas a enzimas que degradan la pectina (pectoliasas), o por provocación de lesión mecánica en una forma controlada. Ejemplos de algunas especies que han sido transformadas mediante la electroporacíón de células intactas, incluyen maíz (patente de E.U.A. No. 5,384,253; Rhodes et al., 1995; D'Halluin et ai, 1992), trigo (Zhou et al., 1993), tomate (Hou y Lin, 1996), soya (Christou et ai, 1987) y tabaco (Lee et al., 1989). Pueden usarse también protoplastos para la transformación de células vegetales por electroporación (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). Por ejemplo, la generación de plantas de soya transgénicas mediante la electroporación de protoplastos derivados de cotiledones, es descrita por Dhír y Widholm en la solicitud de patente internacional No. WO 9217598, incorporada en la presente como referencia. Otros ejemplos de especies para las cuales se ha descrito la transformación de protoplastos, incluyen cebada (Lazerri, 1995), sorgo (Battraw et ai, 1991 ), maíz (Bhattacharjee et ai, 1997), trigo (He et al., 1994) y tomate (Tsukada, 1989). d. Fosfato de calcio En otras modalidades de la presente invención, un ácido nucleico es introducido en las células usando precipitación con fosfato de calcio. Células KB humanas han sido transfectadas con ADN de adenovirus 5 (Graham y Van Der Eb, 1973) usando esta técnica. También de esta forma, células L(A9) de ratón, C127 de ratón, CHO, CV1 , BHK, NIH3T3 y HeLa, fueron transfectadas con un gen marcador de neomicína (Chen y Okayama, 1987), y hepatocitos de rata fueron transfectados con una variedad de genes marcadores (Rippe etal., 1990). e. DEAE-dextrán En otra modalidad, un ácido nucleico es suministrado en una célula usando DEAE-dextrán, seguido de polietilenglicol. De esta forma, plásmidos reporteros fueron introducidos en células de eritroleucemía y mieloma de ratón (Gopal, 1985). f. Carga de sonicación Otras modalidades de la presente invención incluyen la introducción de un ácido nucleico mediante carga sónica directa. Se han transfectado fibroblastos LTK con el gen de timídina cinasa, mediante carga de sonicación (Fechheimer etal., 1987).

G. Transfección mediada por liposomas En otra modalidad de la invención, un ácido nucleico de Ehriichia puede estar comprendido con un complejo de lípídos tal como, por ejemplo, comprendido en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamínares tienen capas de lípidos múltiples separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípídos en un exceso de solución acuosa. Los componentes de lípidos sufren auto-reordenamiento antes de la formación de estructuras cerradas, y atrapan agua y solutos dísueltos entre las bicapas de lípidos (Ghosh y Bachhawat, 1991 ). Contemplado también es un ácido nucleico combinado con Lipofectamine (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen). El suministro de ácidos nucleicos mediado por liposomas y la expresión de ADN extraño in vitro, han sido muy exitosos (Nicoiau y Sene, 1982; Fraley et ai, 1979; Nicoiau et ai, 1987). Se ha demostrado también la viabilidad del suministro mediado por liposomas y la expresión de ADN extraño en embriones de pollo cultivados, células HeLa y células de hepatoma (Wong etai, 1980). En ciertas modalidades de la invención, un liposoma puede combinarse con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha mostrado que esto facilita la fusión con la membrana de la célula, y promueve la entrada de ADN encapsulado en líposomas, en la célula (Kaneda et ai, 1989). En otras modalidades, un liposoma puede combinarse o usarse en conjunto con proteínas cromosómicas no histónicas nucleares (HMG 1 ) (Kato et ai, 1991 ). En otras modalidades, un liposoma puede combinarse o usarse en conjunto con HVJ y HMG 1. En otras modalidades, un vehículo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma. h. Transfección mediada por receptores Aún más, un ácido nucleico puede ser suministrado hacia una célula objetivo por medio de vehículos de suministro mediados por receptores. Estos sacan ventaja de la captación selectiva de macromoléculas mediante la endocitosis mediada por receptores que estará ocurriendo en una célula objetivo. En vista de la distribución de varios receptores específica del tipo de célula, este método de suministro añade otro grado de carácter específico a la presente invención. Ciertos vehículos de determinación del blanco de genes mediada por receptores, comprenden un ligando específico de receptores de la célula y un agente de unión a ácido nucleico. Otros comprenden un ligando específico de receptores de la célula al cual el ácido nucleico que se suministrará ha sido unido operativamente. Varios ligandos se han usado para la transferencia de genes mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wagner et ai, 1990; Perales et ai, 1994; Myers, documento EPO 0273085), que establecen la operabilidad de la técnica. Se ha descrito el suministro específico en el contexto de otro tipo de células de mamífero (Wu y Wu, 1993; cita incorporada en la presente como referencia). En ciertos aspectos de la presente invención, se elegirá un i ligando que corresponda a un receptor expresado específicamente en la población de células objetivo. i En otras modalidades, un componente de vehículo de suministro de ácidos nucleicos de un vehículo de determinación del blanco de ácidos nucleicos específico de las células, puede comprender un ligando de unión específico en combinación con un liposoma. Los ácidos nucleicos que se suministrarán son alojados dentro del liposoma, y el ligando de unión específico es incorporado funcionalmente en la membrana del liposoma. El liposoma se unirá de esta manera específicamente a los receptores de una célula objetivo, y suministrará el contenido a una célula. Se ha mostrado que dichos sistemas son funcionales usando sistemas en los cuales, por ejemplo, se usa el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el suministro mediado por receptores de un ácido nucleico a células que exhiben sobrerregulacíón del receptor del EGF. En otras modalidades, el componente de vehículo de suministro de ácido nucleico de un vehículo de suministro elegido como objetivo puede ser un liposoma mismo, el cual comprenderá de preferencia uno o más lípidos o glucoproteínas que dirigen la unión específica de células. Por ejemplo, se ha incorporado en liposomas una lactosil ceramida, un asialoganglíósido terminal de lactosa, y se ha observado un incremento en la captación del gen de insulina por hepatocitos (Nícolau et ai, 1987). Se contempla que las construcciones transformantes específicas de tejidos de la presente invención, puedan suministrarse específicamente en una célula objetivo en una forma similar. i. Bombardeo de microproyectiles Pueden usarse técnicas de bombardeo de microproyectiles para introducir un ácido nucleico en por lo menos un organelo, célula, tejido u organismo (véase patente de E.U.A. No. 5,550,318; patente de E.U.A. No.

I ' 5,538,880; patente de E.U.A. No. 5,610,042; y solicitud del PCT WO 94/09699; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia). Este método depende de la capacidad para acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad, permitiéndoles que perforen las membranas celulares y entren a las células sin destruirlas (Klein et ai, 1987). Existe una amplia variedad de técnicas de bombardeo de microproyectíles conocidas en la materia, muchas de las cuales son aplicables a la invención. i Puede usarse el bombardeo de microproyectiles para transformar varias células, tejidos u organismos tales como, por ejemplo, cualquier especie de planta. Ejemplos de especies que han sido transformadas mediante el bombardeo de microproyectíles, incluyen especies de monocotiledóneas tales como maíz (solicitud del PCT WO 95/06128), cebada (Rítala et ai, 1994; Hensgens et ai, 1993), trigo (patente de E.U.A. No. 5,563,055, incorporada en la presente como referencia), arroz (Hensgens et ai, 1993), avena (Torbet et ai, 1995; Torbet et ai, 1998), centeno (Hensgens et ai, 1993), caña de azúcar (Bower et ai, 1992) y sorgo (Casas et ai, 1993; Hagio et ai, 1991 ); así como muchas dicotiledóneas que incluyen tabaco (Tomes et ai, 1990; Buising y Benbow, 1994), soya (patente de E.U.A. No. 5,322,783, incorporada en la presente como referencia), girasol (Knittel et al. 1994), cacahuate (Singsít et ai, 1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (VanEck et al. 1995), y leguminosas en general (patente de E.U.A. No. 5,563,055, incorporada en la presente como referencia). En este bombardeo de microproyectiles, una o más partículas pueden ser recubiertas con por lo menos un ácido nucleico, y suministradas en células mediante una fuerza propelente. Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Uno de dichos dispositivos depende de una descarga de alto voltaje que genera una corriente eléctrica, la cual provee a su vez la fuerza motriz (Yang et ai, 1990). Los microproyectiles usados han consistido de sustancias biológicamente inertes, tales como perlas o partículas de tungsteno u oro. Ejemplos de partículas incluyen las que comprenden tungsteno, platino y de preferencia oro. Se contempla que en algunos casos no sería necesaria la precipitación de ADN en partículas de metal, para el suministro de ADN a una célula receptora usando el bombardeo de mícroproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas puedan contener ADN, más que estar recubiertas con ADN. Las partículas recubiertas de ADN pueden incrementar el nivel de suministro de ADN por medio del bombardeo de partículas, pero no son necesarias. Para el bombardeo, células en suspensión son concentradas en filtros o medio de cultivo sólido. En forma alternativa, embriones inmaduros u otras células objetivo pueden ser dispuestos en medio de cultivo sólido. Las células que serán bombardeadas son posicionadas a una distancia adecuada abajo de la placa de detención de microproyectíles. Una modalidad ilustrativa de un método para el suministro de ADN en una célula (por ejemplo, una célula vegetal) mediante aceleración, es el sistema de suministro de partículas biolístíco, el cual puede usarse para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o de Nytex, sobre la superficie de un filtro cubierta con células tales como, por ejemplo, células de plantas monocotiledóneas cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas, de modo que no son suministradas hacia las células receptoras en grandes agregados. Se cree que un tamiz interpuesto entre el aparato de proyectiles y las células que serán bombardeadas reduce el tamaño de los agregados de proyectiles, y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación reduciendo el daño causado en las células receptoras por proyectiles que sean demasiado grandes. 12. Células hospederas Como se usa en la presente, los términos "célula", "línea de células" y "cultivo de células" pueden usarse recíprocamente. Todos estos términos incluyen también su progenie, la cual es cualquier generación y todas las generaciones subsiguientes. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, el término "célula hospedera" se refiere a una célula procariótica o eucariótica, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o de expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedera puede usarse, y se ha usado, como un receptor para vectores. Una célula hospedera puede ser "transfectada" o "transformada", lo cual se refiere a un procedimiento por el cual ácido nucleico exógeno es transferido o introducido en la célula hospedera. Una célula transformada incluye la célula primaria sujeto y su progenie. Como se usa en la presente, se pretende que los términos células o células hospederas "diseñadas" y "recombínantes", se refieran a una célula en la cual una secuencia de ácido nucleico exógena tal como, por ejemplo, un vector, haya sido introducida. Por lo tanto, las células recombinantes son distinguibles de las células de ocurrencia natural, que no contienen un ácido nucleico introducido en forma recombinante. En ciertas modalidades, se contempla que moléculas de ARN o secuencias proteináceas puedan ser co-expresadas con otras moléculas de ARN o secuencias proteináceas seleccionadas, en la misma célula hospedera. La co-expresión puede lograrse co-transfectando la célula hospedera con dos o más vectores recombinantes distintos. En forma alternativa, puede construirse un vector recombinante individual que incluya regiones codificantes distintas múltiples para moléculas de ARN, las cuales podrían ser expresadas entonces en células hospederas transfectadas con el vector individual. Un tejido puede comprender una célula hospedera o células que serán transformadas con una composición de la invención. El tejido puede formar parte de un organismo, o puede estar separado del mismo. En ciertas modalidades, un tejido puede comprender, pero no está limitado a, adipocítos, tejido alveolar, amiloblastos, axón, células básales, sangre (por ejemplo, linfocitos), vaso sanguíneo, hueso, médula ósea, cerebro, mama, cartílago, cerviz, colon, córnea, tejido embrionario, endometrio, tejido endotelial, tejido epitelial, esófago, tejido facial, fibroblasto, tejido folicular, células ganglionares, células gliales, células caliciformes, riñon, hígado, pulmón, nodulo linfático, músculo, neurona, ovarios, páncreas, sangre periférica, próstata, piel, intestino delgado, bazo, células madre, estómago, testículo, anteras, tejido de ascitis, mazorcas, espigas, flores, hollejos, granos, hojas, células meristemáticas, polen, ápices radicales, raíces, seda, tallos, y todos los cánceres de los mismos. En ciertas modalidades, la célula o tejido del hospedero puede estar comprendido en por lo menos un organismo. En ciertas modalidades, el organismo puede ser, pero no está limitado a, un procarionte (por ejemplo, una eubacteria, una arqueobacteria) o un eucarionte, como lo entenderían los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la página web http://phyloqenv.arizona.edu/tree/phylogenv.html). Numerosas líneas y cultivos de células están disponibles para su uso como una célula hospedera, y pueden obtenerse a través de la American Type Culture Collection (ATCC), la cual es una organización que funciona como un archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). Un hospedero adecuado puede ser determinado por los expertos en la técnica, con base en la estructura de base del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede ser introducido en una célula hospedera procariótica para la replicación de muchos vectores. Tipos de células disponibles para la replicacíón y/o expresión de vectores incluyen, pero no están limitados a, bacterias, tales como E coli (por ejemplo, la cepa RR1 de E. coli, LE392 de E. coli, B de E. coli, X 1776 de E. coli (No. de ATCC 31537), así como W31 10 de E coli (F, lambda, prototrófica, No. de ATCC 273325), DH5a, JM109 y KC8, bacilos tales como Bacillus subtilis; y otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y varias especies de Pseudomonas, así como muchas bacterias hospederas disponibles comercialmente, tales como células competentes SURE® y células SOLOPACK Gold (STRATAGENE®, La Jolla). En ciertas modalidades, células bacterianas tales como LE392 de E. coli se contemplan particularmente como células hospederas para fagos. Ejemplos de células hospederas eucarióticas para replicación y/o expresión de un vector incluyen, pero no están limitadas a, células HeLa, NIH3T3, de Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos y PC12. Muchas células hospederas de varios tipos de células y organismos están disponibles, y serían conocidas por los expertos en la técnica. Asimismo, un vector viral puede usarse en conjunto con una célula hospedera eucariótica o procariótica, en particular una que permita la replicación o expresión del vector. Algunos vectores pueden usar secuencias de control que permiten que sean replicados y/o expresados en células procarióticas y eucarióticas. El experto en la técnica entendería además las condiciones bajo las cuales se incuban todas las células hospederas descritas anteriormente, para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También entendidas y conocidas son técnicas y condiciones que permitirían la producción de vectores a gran escala, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por los vectores y sus polipéptidos, proteínas o péptidos cognados. 13. Sistemas de expresión Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden por lo menos una parte o la totalidad de las composiciones discutidas anteriormente. Pueden usarse sistemas basados en procariontes y/o eucariontes para su uso con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipéptidos, proteínas o péptidos cognados. Muchos de dichos sistemas están disponibles comercialmente y ampliamente.

El sistema de células de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,871 ,986, 4,879,236, incorporadas en la presente como referencia, y el cual puede adquirirse, por ejemplo, bajo el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y sistema de expresión de baculovirus BACPACK™ de CLONTECH®. Otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión inducible de mamífero, COMPLETE CONTROL de STRATAGENE®, que incluye un receptor sintético inducible por ecdisona, o su sistema de expresión pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de INVITROGEN®, que posee el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión inducible de mamífero que usa el promotor del CMV de longitud completa. INVITROGEN® provee también un sistema de expresión de levadura denominado sistema de expresión de Pichia methanolica, que está diseñado para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. El experto en la técnica sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptído cognado. Se contempla que las proteínas, polípéptidos o péptidos producidos mediante los métodos de la invención pueden ser "sobreexpresados", es decir, expresados en niveles incrementados respecto a su expresión natural en células. Dicha sobreexpresión puede evaluarse mediante una variedad de métodos, que incluyen radíomarcación y/o purificación de proteínas. Sin embargo, se prefieren métodos simples y directos, por ejemplo, aquellos que implican SDS/PAGE y tinción de proteínas o western blotting, seguidos de análisis cuantitativos, tales como exploración densitométrica del gel o blot resultante. Un incremento específico en el nivel de la proteína, polipéptido o péptido recombinante en comparación con el nivel en células naturales es indicativo de sobreexpresión, como es una abundancia relativa de la proteína, polipéptido o péptido específico con relación a las otras proteínas producidas por la célula hospedera y, por ejemplo, visibles sobre un gel. En algunas modalidades, la secuencia proteinácea expresada forma un cuerpo de inclusión en la célula hospedera, y las células hospederas son usadas, por ejemplo, mediante disolución en un homogenizador de células, lavadas y/o centrifugadas, para separar los cuerpos de inclusión densos y las membranas celulares de los componentes solubles de la célula. Esta centrifugación puede realizarse bajo condiciones por las cuales los cuerpos de inclusión densos sean enriquecidos selectivamente por la incorporación de azúcares, tales como sacarosa en el regulador de pH, y centrifugación a una velocidad selectiva. Los cuerpos de inclusión pueden ser solubilizados en soluciones que contengan altas concentraciones de urea (por ejemplo, 8M) o agentes caotrópicos tales como clorhidrato de guanidina en presencia de agentes reductores, tales como beta mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol), y replegados en una conformación más deseable, como sería conocido por los expertos en la técnica.

VI. Composiciones inmunolóqicas En modalidades particulares de la invención, se usan composiciones inmunológícas. Por razones de brevedad, la siguiente sección se referirá a cualquier composición inmunológica gp36 de E. canis o gp47 de E. chaffeensis de la presente invención, tal como se describe en otra parte en la presente sólo como ejemplos de modalidades. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir la totalidad o parte de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39 de gp36 de E. canis. Asimismo, las composiciones pueden incluir la totalidad o parte de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41 de gp47 de E. chaffeensis, por ejemplo. Pueden usarse anticuerpos que se unen a un antígeno, haciendo de esta manera que la molécula sea por lo menos parcialmente ineficaz para su actividad, por ejemplo. En otras modalidades, se usan anticuerpos para el antígeno en aspectos de diagnóstico de la invención, tal como para detectar la presencia del antígeno de una muestra. Ejemplos de muestras pueden ser de un animal que se sospecha tiene infección por E canis o E. chaffeensis, de un animal susceptible a infección por E canis o E. chaffeensis, o de un animal que tiene una infección por E. canis o E. chaffeensis. Ejemplos de muestras pueden obtenerse de sangre, suero, fluido cerebroespinal, orina, heces, raspado de mejillas, aspirado del pezón, etc.

Pueden usarse composiciones inmunorreactivas purificadas o fragmentos antigénicos de las composiciones inmunorreactivas para generar nuevos anticuerpos, o para poner a prueba anticuerpos existentes (por ejemplo, como controles positivos en una prueba de diagnóstico), usando protocolos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Como es bien sabido en la técnica, la inmunogenicidad a un antígeno particular puede intensificarse mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Adyuvantes que sirven de ejemplo y se prefieren, incluyen adyuvante completo de BCG, Detox (RIBI, Immunochem Research Inc.), ISCOMS e hidróxido de aluminio (Superphos, Biosector). Incluidos en esta invención, son anticuerpos policlonales generados usando la composición inmunorreactíva o un fragmento de la composición inmunorreactiva como un inmunógeno, por ejemplo, en conejos. Se usan protocolos estándar para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales conocidos por los expertos en esta técnica. Los anticuerpos monoclonales generados mediante este procedimiento pueden identificarse por la capacidad para identificar clones de ADNc de Ehriichia recombinantes, y para distinguirlos de clones de ADNc conocidos, por ejemplo. La invención abarca no sólo un anticuerpo monoclonal intacto, sino también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, por ejemplo, un fragmento Fab o (Fab)2; una molécula de scFv de cadena sencilla diseñada; o una molécula quimérica, por ejemplo, un anticuerpo que contenga el carácter específico de unión de un anticuerpo, por ejemplo, originado de murino, y las porciones restantes de otro anticuerpo, por ejemplo, originadas de humano. En una modalidad, el anticuerpo, o fragmento del mismo, puede ser enlazado a una toxina o a una marca detectable, por ejemplo, una marca radiactiva, marca isotópica no radiactiva, marca fluorescente, marca quimíoluminíscente, marca paramagnética, marca enzimática o marca colorimétrica. Ejemplos de toxinas adecuadas incluyen toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas, ricina y toxina del cólera. Ejemplos de marcas de enzima adecuadas incluyen malato hidrogenasa, nucleasa estaf ilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa, alfa glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamílasa, acetilcolinesterasa, etc. Ejemplos de marcas radiosotópícas adecuadas incluyen 3H, 125l, 131l, 32P, 35S, 14C, etc. Isótopos paramagnéticos para propósitos de diagnóstico in vivo, pueden usarse también de conformidad con los métodos de esta invención. Existen numerosos ejemplos de elementos que son útiles en la formación de imágenes de resonancia magnética. Para discusiones sobre la formación de imágenes de resonancia magnética nuclear in vivo véase, por ejemplo, Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480; Shreve et ai, (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G. L, (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93- 95; Wesby ef ai, (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; y Runge et ai, (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415. Ejemplos de marcas fluorescentes adecuadas incluyen una marca de fluoresceína, una marca de isotiocianato, una marca de rodamina, una marca de ficoeritrina, una marca de ficocianina, una marca de aloficocianina, una marca de oftaldehído, una marca de fluorescamina, etc. Ejemplos de marcas quimioluminiscentes incluyen una marca de luminal, una marca de isoluminal, una marca de éster de acridinio aromática, una marca de luciferina, una marca de luciferasa, una marca de aequorina, etc. Los expertos en la técnica conocerán estas y otras marcas adecuadas, las cuales pueden usarse de conformidad con la presente invención. La unión de estas marcas a anticuerpos o fragmentos de los mismos, puede lograrse usando técnicas estándar conocidas comúnmente por los expertos en la materia. Técnicas típicas se describen en Kennedy et ai, (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1 -31 ; y Schurs et ai, (1977) Clin. Chim. Acta 81 , 1 -40. Las técnicas de acoplamiento mencionadas más adelante, son el método de glutaraldehído, el método de peryodato, el método de dimaleimida, el método de éster de maleimidobencil-N-hidroxi-succínimída. Todos estos métodos se incorporan en la presente como referencia.

B. Anticuerpos En ciertos aspectos de la invención, uno o más anticuerpos pueden producirse para la gp36 o gp47 expresada. Estos anticuerpos pueden usarse en varias aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico descritas en la presente. Como se usa en la presente, se pretende que el término "anticuerpo" se refiera ampliamente a cualquier agente de unión inmunológíco tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. En general, se prefieren IgG y/o IgM debido i a que son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica, y debido a que se obtienen más fácilmente en un ambiente de laboratorio. El término "anticuerpo" se usa para referirse a cualquier molécula tipo anticuerpo que tenga una región de unión a antígeno, e incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio individual (DABs), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), y similares. Las i técnicas para la preparación y el uso de varias construcciones y fragmentos basados en anticuerpos, son bien conocidas en la materia. Medios para la preparación y caracterización de anticuerpos, son también bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; cita incorporada en la presente como referencia). "Minianticuerpos" o "minicuerpos" se contemplan también para su uso con la presente invención. Los minicuerpos son cadenas de polipéptidos sFv que incluyen dominios de oligomerización en sus extremos C-terminales, separados del sFv por una región de gozne. Véase Pack et al. (1992) Biochem 31 : 1579-1584. El dominio de oligomerización comprende a- hélices de autoasociación, por ejemplo, cremalleras de leucina, que pueden ser estabilizadas además por enlaces disulfuro adicionales. El dominio de oligomerización está diseñado para ser compatible con el plegamiento vectorial a través de una membrana, un proceso que se piensa facilita el plegamiento in vivo del polípéptido en una proteína de unión funcional. En general, los minicuerpos se producen usando métodos recombinantes bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pack et ai (1992) Biochem 31 : 1579-1584; y Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126. Peptidomimétícos de unión tipo anticuerpo, se contemplan también en la presente invención. Liu et ai, Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2003 Mar; 49(2): 209-16, describen "peptidomiméticos de unión tipo anticuerpo" (ABiPs), que son péptidos que actúan como anticuerpos reducidos poco a poco y tienen ciertas ventajas de vida media en suero más larga, así como métodos de síntesis menos problemáticos. Los anticuerpos monoclonales (MAbs) son reconocidos por tener ciertas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y producción a gran escala, y su uso se prefiere generalmente. La invención provee de esta manera anticuerpos monoclonales originados de humano, murino, mono, rata, hámster, conejo e incluso pollo. Debido a la facilidad de preparación y fácil disponibilidad de reactivos, se preferirán con frecuencia los anticuerpos monoclonales de murino. Sin embargo, se contemplan también anticuerpos "humanizados", como son anticuerpos quiméricos de ratón, rata u otra especie, que poseen dominios de región variable y/o constante de humano, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos recombínantes y diseñados, y fragmentos de los mismos. Como se usa en la presente, el término inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región de estructura de humano y una o más CDRs de una inmunoglobulina no humana (usualmente un ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que provee las CDRs se denomina el "donador", y la inmunoglobulina humana que provee la estructura se denomina el "receptor". Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulína de cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada inmunizada.

C. Ejemplos de métodos para la generación de anticuerpos monoclonales Los ejemplos de métodos para la generación de anticuerpos monoclonales (MAbs), comienzan generalmente a lo largo de las mismas líneas que aquellas para la preparación de anticuerpos policlonales. En resumen, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando a un animal con una composición de LEE o CEE de conformidad con la presente invención, y colectando antisueros de ese animal inmunizado. Una amplia gama de especies animales puede usarse para la producción de antisueros. Típicamente, el animal usado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de Indias o una cabra. La elección del animal puede decidirse con base en la facilidad de manipulación, los costos o la cantidad deseada de sueros, como sería conocido por los expertos en la técnica. Los anticuerpos de la invención pueden producirse también transgénicamente a través de la generación de un mamífero o planta que sea transgénico para las secuencias de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de interés, y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de los mismos. Con relación a la producción transgénica en mamíferos, pueden producirse anticuerpos en la leche de cabras, vacas u otros mamíferos, y pueden recuperarse de la misma. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741 ,957. Como es también bien sabido en la técnica, la inmunogenicidad de una composición inmunógena particular puede intensificarse mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimuladores aceptables, tales como citocinas, quimiocinas, cofactores, toxinas, plasmodios, composiciones sintéticas o LEEs o CEEs que codifiquen para dichos adyuvantes. Adyuvantes que pueden usarse incluyen IL-1 , IL-2, IL-4, IL-7, IL- 12, ?-interferón, GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compuestos de MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A, y lípido A de monofosforilo (MPL). Se contempla también RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimícolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS) en una emulsión de escualeno a 2%/Tween 80. Pueden usarse incluso antígenos del MHC. Ejemplos de adyuvantes preferidos con frecuencia, incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis destruida), adyuvante incompleto de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio. Además de adyuvantes, puede ser deseable co-administrar modificadores de la respuesta biológica (BRM) que se ha mostrado sobrerregulan la inmunidad de células T o subregulan la actividad supresora de células. Dichos BMRs incluyen, pero no están limitados a, cimetídina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/ Klins PA); ciclofosfamida de baja dosis (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ), citocinas tales como ?-interferón, IL-2 o IL-12, o genes que codifican para proteínas implicadas en funciones auxiliares inmunes, tales como B-7. La cantidad de composición inmunógena usada en la producción de anticuerpos policlonales varía dependiendo de la naturaleza del inmunógeno, así como el animal usado para la inmunización. Puede usarse una variedad de vías para administrar el inmunógeno que incluyen, pero no están limitadas a, las vías subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraepidérmica, intravenosa e intraperitoneal. La producción de anticuerpos policlonales puede monitorearse tomando muestras de sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Puede administrarse también una segunda dosis de refuerzo (por ejemplo, provista en una inyección). El procedimiento de refuerzo y titulación se repite hasta que se logre un título adecuado. Cuando se obtenga un nivel de inmunogenícidad deseado el animal inmunizado puede ser sangrado, y el suero puede aislarse y almacenarse, y/o el animal puede usarse para generar MAbs. Para la producción de anticuerpos policlonales de conejo, el animal puede ser sangrado a través de una vena de la oreja o, en forma alternativa, mediante punción cardiaca. Se deja que la sangre removida se coagule, y entonces se centrifuga para separar los componentes del suero de las células enteras y los coágulos sanguíneos. El suero puede usarse como esté para varias aplicaciones, o también la fracción de anticuerpo deseada puede purificarse mediante métodos bien conocidos, tales como cromatografía de afinidad usando otro anticuerpo, un péptido unido a una matriz sólida o usando, por ejemplo, cromatografía de proteína o proteína G. Pueden prepararse fácilmente MAbs a través del uso de técnicas bien conocidas, tales como las ejemplificadas en la patente de E.U.A. No. 4,196,265, incorporada en la presente como referencia. Típicamente, esta técnica implica la inmunización de un animal adecuado con una composición inmunógena seleccionada, por ejemplo, una proteína, polipéptido, péptido o dominio purificado o parcialmente purificado, ya sea una composición mutante o de tipo silvestre. La composición inmunizante se administra en una forma efectiva para estimular células que producen anticuerpos. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAbs), comienzan generalmente a lo largo de las mismas líneas que aquellas para la preparación de anticuerpos policlonales. Roedores tales como ratones y ratas son animales preferidos; sin embargo, es también posible el uso de células de conejo, oveja o rana. El uso de ratas puede proveer ciertas ventajas (Goding, 1986, pp. 60 61 ), pero se prefieren ratones, siendo más preferido el ratón BALB/c, ya que éste se usa más habitualmente, y da en general un mayor porcentaje de fusiones estables. Se inyecta a los animales con antígeno, generalmente como se , describió anteriormente. El antígeno puede mezclarse con adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund. Administraciones de refuerzo con el mismo antígeno o ADN que codifica para el antígeno, ocurrirían a intervalos de aproximadamente dos semanas. Después de la inmunización, células somáticas con el potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), se i seleccionan para su uso en el protocolo de generación de MAbs. Estas células pueden obtenerse de biopsias de bazo, amígdalas o nodulos linfáticos, o de una muestra de sangre periférica. Se prefieren células de bazo y células de , sangre periférica, las primeras debido a que son una rica fuente de células que producen anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto en división, y las últimas debido a que la sangre periférica es fácilmente accesible. Con frecuencia, un panel de animales habrá sido inmunizado y el bazo de un animal con el título de anticuerpos más alto será removido, y los linfocitos del bazo se obtendrán homogenizando el bazo con una jeringa. 1 Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 linfocítos.

Los linfocitos B que producen anticuerpos del animal inmunizado son fusionados entonces con células de una línea de células de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que fue inmunizado. Las líneas de células de mieloma adecuadas para su uso en los procedimientos de fusión que producen hibridomas, de preferencia no están produciendo anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que sustentan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Puede usarse cualquiera de muchas células de mieloma, como es sabido por los expertos en la técnica (Goding, pp. 65 66, 1986; Campbell, pp. 75 83, 1984). Por ejemplo, en donde el animal inmunizado es un ratón, pueden usarse P3 X63/Ag8, X63 Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1 , Sp210 Ag14, FO, NSO/U, MPC 11 , MPC1 1 X45 GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, pueden usarse R210.RCY3, Y3 Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U 266, GM1500 GRG2, LICR LON HMy2 y UC729 6 son útiles con relación a fusiones de células humanas. Véase Yoo et al., J Immunol Methods. Marzo 1 de 2002; 261 (1-2): 1 -20, para una discusión de sistemas de expresión de mieloma. Una célula de mieloma de murino preferida, es la línea de células de míeloma NS-1 (denominada también P3-NS-1 -Ag4-1 ), que está fácilmente disponible del NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, solicitando el número de depósito de líneas de células GM3573. Otra línea de células de mieloma de ratón que puede usarse es la línea de células no productora SP2/0 de mieloma de murino de ratón, resistente a 8-azaguanina. Los métodos para la generación de híbridos de células de míeloma y de células de nodulos linfáticos o de bazo que producen anticuerpos, comprenden usualmente mezclar células somáticas con células de mieloma a una relación de 2:1 , aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1 :1 , respectivamente, en presencia de uno o varios agentes (químicos o eléctricos) que promuevan la fusión de membranas celulares. Métodos de fusión que usan virus Sendai han sido descritos por Kohier y Mílstein (1975; 1976), y aquellos que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG a 37% (v/v), por Gefter et ai, (1977). El uso de métodos de fusión inducida eléctricamente, es también adecuado (Goding pp. 71 74, 1986). Los procedimientos de fusión producen usualmente híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente 1 x 10"6 a 1 x 10"8. Sin embargo, esto no representa un problema, ya que los híbridos viables fusionados se diferencian de las células progenitoras no fusionadas (en particular las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente), mediante cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es en general uno que contenga un agente que bloquee la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo de tejidos. Ejemplos de agentes preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La amínopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo de purinas y pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea sólo la síntesis de purinas. En donde se use aminopterina o metotrexato, el medio es complementado con hípoxantina y tímidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT). En donde se use azaserina, el medio es complementado con hipoxantina. El medio de selección preferido es HAT. Sólo las células capaces de operar vías silvestres de nucleótidos, son capaces de sobrevivir en medio HAT. Las células de mieloma son defectuosas en enzimas clave de la vía silvestre, por ejemplo, hipoxantina y fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta vía, pero tienen una vida limitada en cultivo, y generalmente mueren dentro de aproximadamente dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo, son aquellos híbridos formados de células de mieloma y células B. Este cultivo provee una población de hibridomas de la cual se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células mediante la dilución de clones individuales en placas de microtítulo, seguida de la realización de pruebas de los sobrenadantes de clones individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para la reactividad deseada. La prueba debe ser sensible, simple y rápida, como es el caso de radíoinmunoensayos, ¡nmunoensayos de enzimas, pruebas de citotoxicidad, pruebas en placa, pruebas de inmunounión dot, y similares. Los hibridomas seleccionados serían entonces diluidos en serie y clonados en líneas de células individuales que producen anticuerpos, cuyos clones puedan entonces propagarse indefinidamente para proveer MAbs. Las líneas de células pueden explotarse para la producción de MAbs en dos formas básicas. Primero, una muestra del híbridoma puede inyectarse (con frecuencia en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para proveer las células somáticas y de mieloma para la fusión original (por ejemplo, un ratón singénico). Opcionalmente, los animales son cebados con un hidrocarburo, especialmente aceites tales como pristano (tetrametilpentadecano) antes de la inyección. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de células fusionadas. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascítis, pueden usarse entonces para proveer MAbs a alta concentración. Segundo, las líneas de células individuales podrían cultivarse in vitro, en donde los MAbs son secretados naturalmente en el medio de cultivo del cual pueden obtenerse fácilmente a altas concentraciones. Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) a partir de líneas de células de producción, puede mejorarse usando muchas técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión de genes de DHFR y glutamina sintetasa, son procedimientos comunes para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. Los clones de células de alta expresión pueden identificarse usando técnicas convencionales, tales como clonación por dilución limitada y tecnología Microdop. El sistema GS se discute enteramente o en parte con relación a la patente europea Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997, y la solicitud de patente europea No. 89303964.4. Los MAbs producidos mediante cualquier medio pueden purificarse además, si se desea, usando métodos de filtración, centrifugación y varios métodos cromatográfícos tales como CLAR o cromatografía de afinidad. Pueden obtenerse fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la | invención a partir de los anticuerpos monoclonales producidos de esta manera, medíante métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o por digestión de enlaces disulfuro medíante reducción ] química. En forma alternativa, pueden sintetizarse fragmentos de anticuerpos monoclonales abarcados por la presente invención, usando un sintetizador de péptidos automatizado. Se contempla también que pueda usarse un procedimiento de clonación molecular para generar anticuerpos monoclonales. En una modalidad, se preparan colecciones de fagémidos de inmunoglobulina combinatorios a partir de ARN aislado del bazo del animal inmunizado, y se seleccionan fagémidos que expresen anticuerpos adecuados mediante toma panorámica, usando células que expresen el antígeno y células de control. Las ventajas de este procedimiento sobre las técnicas de hibridoma convencionales, son que aproximadamente 104 veces tantos anticuerpos pueden producirse e identificarse en una ronda individual, y que nuevas especificidades se generan mediante la combinación de cadenas H y L que incrementan además la oportunidad de que se encuentren anticuerpos adecuados. En otro ejemplo, pueden usarse LEEs o CEEs para producir antígenos in vitro con un sistema libre de células. Estos pueden usarse como objetivos para la exploración de colecciones de anticuerpos de cadena sencilla. Esto permitiría que muchos anticuerpos diferentes sean identificados muy rápidamente sin el uso de anímales. Otra modalidad de la invención para producir anticuerpos de conformidad con la presente invención, se encuentra en la patente de E.U.A. No. 6,091 ,001 , que describe métodos para producir una célula que expresa un anticuerpo de una secuencia genómica de la célula, que comprende un locus de ¡nmunoglobulina modificado usando recombinación específica de sitio mediada por Cre. El método implica transfectar primero una célula que produce anticuerpos con un vector de determinación del blanco de homología que comprenda un sitio lox, y una secuencia de determinación del blanco homologa a una primera secuencia de ADN adyacente a la región de los loci de inmunoglobulina de la secuencia genómica, la cual será convertida a una región modificada, de modo que el primer sitio lox sea insertado en la secuencia genómica mediante recombinación homologa específica de sitio. Entonces, la célula es transfectada con un vector de determinación del blanco de lox que comprenda un segundo sitio lox adecuado para recombinacíón mediada por Cre con el sitio lox integrado, y una secuencia de modificación que convierta la región de los locí de inmunoglobulina a la región modificada.

Esta conversión se realiza por interacción de los sitios lox con Cre in vivo, de modo que la secuencia de modificación se inserte en la secuencia genómica por medio de recombinación específica de sitio de los sitios lox mediada por Cre. En forma alternativa, pueden sintetizarse fragmentos de anticuerpo monoclonales abarcados por la presente invención usando un sintetizador de péptidos automatizado, o por expresión de genes de longitud completa o de fragmentos de genes en E. coli.

D. Conjugados de anticuerpos La presente invención provee además anticuerpos contra proteínas, polipéptidos y péptidos gp36, generalmente del tipo monoclonal, que son enlazados a por lo menos un agente para formar un conjugado de anticuerpos. Para incrementar la eficacia de las moléculas de anticuerpo como agentes de diagnóstico o terapéuticos, es convencional enlazar o unir covalentemente o combinar por lo menos una molécula o porción deseada. Dicha molécula o porción puede ser, pero no está limitada a, por lo menos una molécula efectora o reportera. Moléculas efectoras comprenden moléculas que tienen una actividad deseada, por ejemplo, actividad citotóxica. Ejemplos no limitativos de moléculas efectoras que han sido unidas a anticuerpos incluyen toxinas, agentes antitumorales, enzimas terapéuticas, nucleótidos radiomarcados, agentes antivirales, agentes quelantes, citocínas, factores de crecimiento y oligonucleótidos o polinucleótidos. En contraste, una molécula reportera se define como cualquier porción que puede detectarse usando una prueba. Ejemplos no limitativos de moléculas reporteras que han sido conjugadas con anticuerpos incluyen enzimas, marcas radiactivas, haptenos, marcas fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimíoluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinídad, partículas coloreadas o lígandos, tales como biotína. Cualquier anticuerpo de selectividad, carácter específico o afinidad suficiente, puede usarse como la base para un conjugado de anticuerpos. Dichas propiedades pueden evaluarse usando metodología de identificación inmunológíca convencional conocida por los expertos en la técnica. Sitios para la unión a moléculas activas biológicas en la molécula de anticuerpo, además de los sitios de unión a antígeno canónicos, incluyen sitios que residen en el dominio variable que puede unirse a patógenos, superantígenos de células B, el co-receptor CD4 de células T y la cubierta del VIH-1 (Sasso et al., 1989; Shorki et ai, 1991 ; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberían et ai, 1993; Kreier et ai, 1991). Además, el dominio variable está implicado en la auto-unión de anticuerpos (Kang et ai, 1988), y contiene epítopes (idiotipos) reconocidos por antianticuerpos (Kohier et ai, 1989). Ciertos ejemplos de conjugados de anticuerpos, son aquellos conjugados en los cuales el anticuerpo es enlazado a una marca detectable. "Marcas detectables", son compuestos y/o elementos que pueden detectarse debido a sus propiedades funcionales y/o características químicas específicas, cuyo uso permite que el anticuerpo al cual se unen sea detectado, y/o además cuantíficado, si se desea. Otro de dichos ejemplos es la formación de un conjugado que comprende un anticuerpo enlazado a un agente citotóxico o anti-celular, y puede denominarse "inmunotoxina". Los conjugados de anticuerpos se prefieren generalmente para 1 su uso como agentes de diagnóstico. Los anticuerpos de diagnóstico 1 pertenecen generalmente a dos clases, aquellos para su uso en diagnóstico in vitro, tal como en una variedad de ¡nmunoensayos, y/o aquellos para su uso en protocolos de diagnóstico in vivo, generalmente conocidos como 1 "formación de imágenes dirigida por anticuerpos". I Muchos agentes de formación de imágenes adecuados se conocen en la técnica, como son métodos para su unión a anticuerpos (véase, • por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,021 ,236; 4,938,948; y 4,472,509, cada una incorporada en la presente como referencia). Las porciones de 1 formación de imágenes usadas pueden ser iones paramagnéticos; isótopos 1 radiactivos; fluorocromos; sustancias detectables por RMN; y formación de imágenes de rayos X. En el caso de iones paramagnéticos podrían mencionarse, por ejemplo, iones tales como cromo (lll), manganeso (II), hierro (lll), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (lll), samario (lll), yterbio (lll), gadolinio (lll), vanadio (II), terbio (lll), disprosio (lll), holmio (lll) y/o erbio (lll), siendo particularmente preferido gadolinio. Iones útiles en otros contextos, tales como formación de imágenes de rayos X incluyen, pero no están limitados a, lantano (lll), oro (lll), plomo (II) y especialmente bismuto (lll). i En el caso de isótopos radiactivos para aplicación terapéutica y/o de diagnóstico, podrían mencionarse astatina211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, renio186, renío188, 75selenio, 35azufre, tecnecio99 y/o ¡trio90. Con frecuencia se prefiere 125l para su uso en ciertas modalidades, y con frecuencia también se prefieren tecnecio99 y/o indio111 , debido a su baja energía y conveniencia para detección a gran escala. Pueden producirse anticuerpos monoclonales marcados radiactivamente de la presente invención, de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden yodarse anticuerpos monoclonales por contacto con yoduro de sodio y/o potasio, y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático tal como lactoperoxidasa. Los , anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención pueden marcarse con tecnecio99, mediante un procedimiento de intercambio de ligando, por ejemplo, reduciendo pertecnato con solución estanosa, quelando el tecnecío reducido sobre una columna Sephadex, y aplicando el anticuerpo a esta columna. En forma alternativa, pueden usarse técnicas de marcación directa, por ejemplo, incubando pertecnato, un agente reductor tal como SNCI2, una solución de regulador de pH tal como solución de ftalato de potasio-sodio, y el anticuerpo. Grupos funcionales intermediarios que se usan con frecuencia para unir radioisótopos que existen como iones metálicos a anticuerpos, son ácido dietílentriamínopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacétíco (EDTA).

Entre las marcas fluorescentes contempladas para su uso como conjugados, incluyen Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, azul cascada, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, verde Oregon 488, verde Oregon 500, verde Oregon 514, azul Pacífico, REG, verde rodamina, rojo rodamína, renografina, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina y/o rojo Texas. Otro tipo de conjugados de anticuerpos contemplados en la presente invención, son aquellos destinados principalmente para su uso in vitro, en donde el anticuerpo es enlazado a un ligando de unión secundario y/o a una enzima (una marca de enzima), que generará un producto coloreado tras el contacto con un substrato cromógeno. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina (de rábano picante), peroxidasa acida o glucosa oxidasa. Ligandos de unión secundarios preferidos, son compuestos de biotina y/o avidina y estreptavidina. El uso de dichas marcas es bien conocido por los expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241 ; cada una incorporada en la presente como referencia. Otro método conocido de unión específica de sitio de moléculas a anticuerpos, comprende la reacción de anticuerpos con marcas de afinidad basadas en hapteno. Esencialmente, las marcas de afinidad basadas en hapteno reaccionan con aminoácidos en el sitio de unión al antígeno, destruyendo de esta manera este sitio, y bloqueando la reacción específica del antígeno. Sin embargo, esto puede no ser ventajoso debido a que resulta en pérdida de unión al antígeno por el conjugado del anticuerpo. Moléculas que contengan grupos azido pueden usarse también para formar enlaces covalentes con proteínas a través de intermediarios de nitreno reactivos que son generados por luz ultravioleta de baja densidad (Potter y Haley, 1983). En particular, se han usado análogos de nucleótidos de purina 2- y 8-azido como fotosondas dirigidas a sitio, para identificar proteínas de unión a nucleótidos en extractos crudos de células (Owens y Haley, 1987; Atherton et ai, 1985). Los nucleótidos 2- y 8-azído se han usado también para mapear dominios de unión a nucleótidos de proteínas purificadas (Khatoon et ai, 1989; King et ai, 1989; y Dholakia et ai, 1989), y pueden usarse como agentes de unión a anticuerpos. Varios métodos se conocen en la técnica para la unión o conjugación de un anticuerpo a su porción de conjugado. Algunos métodos de unión implican el uso de un complejo de quelato de metal que usa, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como un anhídrido de ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA); ácido etilentriamínotetraacético; N-cloro-p-toluensulfonamída; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglicourilo-3 unido al anticuerpo (patentes de E.U.A. Nos. 4,472,509 y 4,938,948, cada una incorporada en la presente como referencia). Pueden hacerse reaccionar también anticuerpos monoclonales con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento, o por reacción con un isotiocianato. En la patente de E.U.A. No. 4,938,948, se logra la formación de imágenes de tumores de mama usando anticuerpos monoclonales, y las porciones de formación de imágenes detectables son unidas al anticuerpo usando enlazadores tales como p-hidroxíbencimidato de metilo o 3-(4-hidroxifenil)propionato de N-succinimidilo. En otras modalidades, se contempla la derivatización de inmunoglobulinas introduciendo selectivamente grupos sulfhidrilo en la región Fc de una inmunoglobulina, usando condiciones de reacción que no alteren el i sitio de combinación del anticuerpo. Se describen conjugados de anticuerpos ! producidos de conformidad con esta metodología que exhiben longevidad, ! carácter específico y sensibilidad mejorados (véase patente de E.U.A. No. 5,196,066, incorporada en la presente como referencia). La unión específica de sitio de moléculas efectoras o reporteras, en donde la molécula reportera o efectora es conjugada con un residuo de carbohidrato en la región Fc, se ha descrito también en la literatura (O'Shannessy et ai, 1987). Se ha reportado que este procedimiento produce anticuerpos prometedores desde el punto de vista de diagnóstico y terapéutico, los cuales están actualmente en evaluación clínica. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-gp36 son enlazados a nanocristales semiconductores tales como los que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,048,616; 5,990,479; 5,690,807; 5,505,928; y 5,262,357 (las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia); así como la publicación del PCT No. 99/26299 (publicada en mayo 27 de 1999). En particular, ejemplos de materiales para su uso como nanocristales semiconductores en las pruebas biológicas y químicas de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los descritos anteriormente, incluyendo semiconductores de los grupos ll-VI, lll-V y IV, tales como ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, AIS, AIP, AISb, PbS, PbSe, Ge y Si, y mezclas ternarias y cuaternarias de los mismos. Métodos para enlazar nanocristales semiconductores a anticuerpos se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,630,307 y 6,274,323.

E. Métodos de inmunodetección En otras modalidades, la presente invención se refiere a métodos de inmunodetección para unir, purificar, remover, cuantificar y/o detectar generalmente de otra manera, componentes biológicos tales como polipéptídos inmunorreactivos. Los anticuerpos preparados de conformidad con la presente invención pueden usarse para detectar proteínas, polipéptidos y/o péptidos de tipo silvestre y/o mutantes. Se contempla el uso de anticuerpos mutantes y/o de tipo silvestre. Algunos métodos de inmunodetección incluyen prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radíoinmunoensayo (RÍA), prueba inmunorradiométrica, fluoroinmunoensayo, prueba quimioluminiscente, prueba bioluminiscente y Western blot, por mencionar algunas. Los pasos de varios métodos de inmunodetección útiles se han descrito en la literatura científica tal como, por ejemplo, Doolittle MH y Ben-Zeev O, 1999; Gulbís B y Galand P, 1993; De Jager R et ai, 1993; y Nakamura et al., 1987, cada una de estas citas siendo incorporada en la presente como referencia. En general, los métodos de inmunounión incluyen obtener una muestra que se sospecha comprende proteína, polípéptido y/o péptido, y poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo anti-gp36 (o gp47) de conformidad con la presente invención, como puede ser el caso, bajo condiciones efectivas que permitan la formación de inmunocomplejos. Estos métodos incluyen métodos para purificar proteínas, polipéptidos y/o péptídos mutantes y/o de tipo silvestre, como pueden usarse para purificar proteínas, polípéptidos y/o péptídos mutantes y/o de tipo silvestre de muestras de pacientes, y/o para purificar proteínas, polipéptidos y/o péptidos mutantes o de tipo silvestre expresados en forma recombinante. En estos casos, el anticuerpo remueve el componente de proteína, polipéptido y/o péptido mutante y/o de tipo silvestre antigénico de una muestra. El anticuerpo será enlazado de preferencia a un soporte sólido, tal como en la forma de una matriz de columna, y la muestra que se sospecha contiene al componente antígénico de proteína mutante y/o de tipo silvestre se aplicará al anticuerpo inmovilizado. Los componentes no deseados se lavarán de la columna, dejando el antígeno inmunocombinado con el anticuerpo inmovilizado, cuyo antígeno de proteína mutante o de tipo silvestre es colectado entonces removiendo la proteína y/o péptído mutante o de tipo silvestre de la columna. Los métodos de inmunounión incluyen también métodos para detectar y cuantificar la cantidad de un componente reactivo de proteína mutante o de tipo silvestre en una muestra, y la detección y cuantificación de cualquier complejo inmune formado durante el procedimiento de unión. Aquí, se obtendría una muestra que se sospecha comprende una proteína y/o péptido mutante o de tipo silvestre, o que se sospecha comprende un organismo E. canis, y se pone en contacto la muestra con un anticuerpo contra el mutante o de tipo silvestre, y entonces se detecta y cuantifica la cantidad de complejos inmunes formados bajo condiciones específicas. En términos de la detección de antígenos, la muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra que se sospecha contiene un antígeno específico de proteína mutante o de tipo silvestre, tal como una muestra, un extracto de tejido homogenizado, una célula, formas separadas y/o purificadas de cualquiera de las composiciones que contienen proteína mutante o de tipo silvestre anteriores, o incluso cualquier fluido biológico que entre en contacto con un organismo E. canis tras la infección. La puesta en contacto de la muestra biológica elegida con el anticuerpo bajo condiciones efectivas y por un período suficiente, que permite la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios), es generalmente un asunto de añadir simplemente la composición de anticuerpo a la muestra, e incubar la muestra por un período bastante largo para que los anticuerpos formen complejos inmunes (es decir, se unan) con cualquier antígeno de proteína presente. Después de este tiempo, la composición de muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, placa de ELISA, dot blot o western blot, será lavada en general para remover cualquier especie de anticuerpo no unido específicamente, permitiendo que sólo aquellos anticuerpos unidos específicamente dentro de los complejos inmunes primarios, sean detectados. En general, la detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica, y puede lograrse a través de la aplicación de numerosos procedimientos. Estos métodos se basan en general en la detección de una marca o marcador, tal como cualquiera de aquellas marcas radiactivas, fluorescentes, biológicas y enzimáticas. Patentes de E.U.A. que se relacionan con el uso de dichas marcas incluyen las patentes Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241 , cada una incorporada en la presente como referencia. De hecho, pueden encontrarse ventajas adicionales a través del uso de un ligando de unión secundario, tal como un anticuerpo secundario y/o una disposición de unión a ligando de biotina/avidina, como es sabido en la técnica. El anticuerpo usado en la detección puede ser enlazado asimismo a una marca detectable, en donde simplemente se detectaría entonces esta marca, permitiendo de esta manera que se determine la cantidad de los complejos inmunes primarios en la composición. En forma alternativa, el primer anticuerpo que llega a ser unido dentro de los complejos inmunes primarios puede detectarse por medio de un segundo ligando de unión que tenga afinidad de unión por el anticuerpo. En estos casos, el segundo ligando de unión puede ser enlazado a una marca detectable. El segundo ligando de unión es por sí mismo con frecuencia un anticuerpo, el cual puede denominarse de esta manera un anticuerpo "secundario". Los complejos inmunes primarios se ponen en contacto con el segundo ligando de unión marcado, o anticuerpo, bajo condiciones efectivas y por un período suficiente que permita la formación de complejos inmunes secundarios. Los complejos inmunes secundarios son entonces lavados generalmente para remover cualquier ligando o anticuerpo secundario marcado no unido específicamente, y se detecta entonces la marca remanente en los complejos inmunes secundarios. Otros métodos incluyen la detección de complejos inmunes primarios mediante un procedimiento de dos pasos. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el anticuerpo, se usa para formar complejos inmunes secundarios, como se describió anteriormente. Después del lavado, los complejos inmunes secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando de unión o anticuerpo que tenga afinidad de unión por el segundo anticuerpo, de nuevo bajo condiciones efectivas y por un período suficiente que permita la formación de complejos inmunes (complejos inmunes terciarios). El tercer ligando o anticuerpo es enlazado a una marca detectable, permitiendo la detección de los complejos inmunes terciarios formados de esta manera. Este sistema puede proveer la amplificación de señales, si esto se desea. Un método de ¡nmunodetección usa dos diferentes anticuerpos. Un anticuerpo monoclonal o políclonal biotinilado del primer paso se usa para detectar los antígenos objetivo, y un anticuerpo del segundo paso se usa entonces para detectar la biotina unida a la bíotina combinada. En ese método, la muestra que se va a poner a prueba se incuba primero en una solución que contenga el anticuerpo del primer paso. Si el antígeno objetivo está presente, parte del anticuerpo se une al antígeno para formar un complejo de antígeno/anticuerpo biotinilado. El complejo de antígeno/anticuerpo se amplifica entonces por incubación en soluciones sucesivas de estreptavidina (o avidina), ADN biotinilado y/o ADN biotinilado complementario, cada paso añadiendo sitios de biotina adicionales al complejo de antígeno/antícuerpo. Los pasos de amplificación se repiten hasta que se logre un nivel de amplificación adecuado, punto en el cual la muestra se incuba en una solución que contenga al anticuerpo del segundo paso contra biotina. Este anticuerpo del segundo paso es marcado tal como, por ejemplo, con una enzima que pueda usarse para detectar la presencia del complejo de antígeno/anticuerpo mediante histoenzimología usando un substrato cromógeno. Con amplificación adecuada, puede producirse un conjugado el cual es macroscópicamente visible. Otro método de inmunodetección conocido saca ventaja de la metodología de inmuno-PCR (reacción en cadena de polimerasa). El método de PCR es similar al método de Cantor hasta la incubación con ADN biotinilado; sin embargo, en lugar de que se usen rondas múltiples de estreptavidina e incubación de ADN biotinilado, el complejo de ADN/biotina/estreptavidina/antícuerpo se lava con un regulador de pH de bajo pH o de alta concentración de sales que libere el anticuerpo. La solución de lavado resultante se usa entonces para llevar a cabo una reacción de PCR con iniciadores adecuados con controles adecuados. Por lo menos en teoría, la enorme capacidad de amplificación y el carácter específico de la PCR, pueden usarse para detectar una molécula de antígeno individual. Los métodos de inmunodeteccíón de la presente invención tienen utilidad evidente en el diagnóstico y pronóstico de condiciones tales como varias formas de enfermedades hiperproliferativas, tales como cáncer, incluyendo leucemia, por ejemplo. Aquí, se usa una muestra biológica y/o clínica que se sospecha contiene una proteína, polipéptido, péptido y/o mutante de tipo silvestre o mutante. Sin embargo, estas modalidades tienen también aplicaciones en muestras no clínicas, tales como en la titulación de muestras de antígeno o anticuerpo, por ejemplo, en la selección de hibridomas.

F. ELISAs Como se detalló anteriormente, los inmunoensayos, en su sentido más simple y/o directo, son pruebas de unión. Ciertos inmunoensayos preferidos son los varios tipos de pruebas de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISAs) y/o radioinmunoensayos (RÍA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica que usa secciones de tejido, es también particularmente útil. Sin embargo, se apreciará fácilmente que la detección no se limita a dichas técnicas, y/o que pueden usarse también western blottíng, dot blotting, análisis por FACS, y/o similares. En un ejemplo de ELISA, los anticuerpos de la invención son inmovilizados sobre una superficie seleccionada que exhibe afinidad por proteínas, tal como una cavidad en una placa de microtítulo de políestireno. Entonces, una composición de prueba que se sospecha contiene al antígeno de proteína mutante y/o de tipo silvestre, tal como una muestra clínica, se añade a las cavidades. Después de unión y/o lavado para remover complejos inmunes no unidos específicamente, puede detectarse el antígeno de proteína mutante y/o de tipo silvestre unido. La detección se logra generalmente mediante la adición de otro anticuerpo que es enlazado a una marca detectable. Este tipo de ELISA es una "ELISA en sandwich" simple. La detección puede lograrse también mediante la adición de un segundo anticuerpo, seguida de la adición de un tercer anticuerpo que tenga afinidad de unión por el segundo anticuerpo, siendo enlazado el tercer anticuerpo a una marca detectable. En otro ejemplo de ELISA, las muestras que se sospecha contienen al antígeno de proteína mutante y/o de tipo silvestre, son inmovilizadas sobre la superficie de la cavidad y/o puestas entonces en contacto con los anticuerpos de la invención. Después de unión y/o lavado para remover los complejos inmunes no unidos específicamente, se detectan los anticuerpos unidos. En donde los anticuerpos iniciales son enlazados a una marca detectable, los complejos inmunes pueden detectarse directamente. De nuevo, los complejos inmunes pueden detectarse usando un segundo anticuerpo que tenga afinidad de unión por el primer anticuerpo, siendo enlazado el segundo anticuerpo a una marca detectable. Otra ELISA en la cual las proteínas, polipéptidos y/o péptidos mutantes y/o de tipo silvestre son inmovilizados, implica el uso de competencia por anticuerpos en la detección. En esta ELISA, anticuerpos marcados contra la proteína mutante o de tipo silvestre se añaden a las cavidades, se deja que se unan y/o se detectan por medio de su marca. La cantidad de antígeno de proteína mutante o de tipo silvestre en una muestra desconocida se determina entonces, mezclando la muestra con los anticuerpos marcados contra la proteína mutante y/o de tipo silvestre antes y/o durante la incubación con cavidades recubiertas. La presencia de la proteína mutante y/o de tipo silvestre en la muestra actúa para reducir la cantidad de anticuerpo contra la proteína mutante o de tipo silvestre disponible para la unión a la cavidad, y reduce de esta manera la última señal. Esto es también adecuado para detectar anticuerpos contra una proteína mutante o de tipo silvestre en una muestra desconocida, en donde los anticuerpos no marcados se unen a las cavidades recubiertas de antígeno, y reducen también la cantidad de antígeno disponible para unirse a los anticuerpos marcados.

Sin tener en cuenta el formato usado, las ELISAs tienen ciertas características en común, tales como recubrimiento, incubación y unión, lavado para remover las especies no unidas específicamente, y detección de los complejos inmunes unidos. Estas se describen a continuación. En el recubrimiento de una placa con antígeno o anticuerpo, generalmente se incubarán las cavidades de la placa con una solución del antígeno o anticuerpo, ya sea durante la noche o por un período especificado de horas. Las cavidades de la placa se lavarán entonces para remover el material incompletamente adsorbido. Cualquier superficie disponible restante de las cavidades es entonces "recubierta" con una proteína no específica que sea antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de prueba. Estas incluyen albúmina de suero de bovino (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizada, y reduce de esta manera el ambiente causado por la unión no específica de los antisueros sobre la superfície. En las ELISAs, es quizá más habitual usar medios de detección secundarios o terciarios más que un procedimiento directo. De esta manera, después de la unión de una proteína o anticuerpo a la cavidad, recubrimiento con un material no reactivo para reducir el ambiente, y lavado para remover el material no unido, la superficie de inmovilización se pone en contacto con la muestra biológica que se va a poner a prueba bajo condiciones efectivas que permitan la formación del complejo inmune (antígeno/antícuerpo). La detección del complejo inmune requiere entonces un anticuerpo o ligando de unión secundario marcado, y un anticuerpo o ligando de unión secundario en conjunto con un anticuerpo terciario marcado o un tercer ligando de unión. La expresión "bajo condiciones efectivas que permitan la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo), significa que las , condiciones incluyen de preferencia diluir los antígenos y/o anticuerpos con soluciones tales como BSA, gamma globulina de bovino (BGG) o solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS)/Tween. Estos agentes añadidos tienden también a facilitar la reducción del ambiente no específico. Condiciones "adecuadas" significan también que la incubación es a una temperatura o por un período suficiente que permita la unión efectiva. i Los pasos de incubación son típicamente de aproximadamente 1 a 2 a 4 horas poco más o menos, a temperaturas de preferencia del orden de 25°C a 27°C, o pueden ser durante la noche a aproximadamente 4°C poco más o menos. Después de todos los pasos de incubación en una ELISA, la superficie puesta en contacto se lava para remover el material no combinado. Un procedimiento de lavado preferido incluye lavado con una solución tal como PBS/Tween, o regulador de pH de borato. Después de la formación de complejos inmunes específicos entre la muestra de prueba y el material originalmente unido, y lavado subsiguiente, puede determinarse la ocurrencia de cantidades incluso diminutas de complejos inmunes.

Para proveer un medio de detección, el segundo o tercer anticuerpo tendrá una marca asociada que permita la detección. De preferencia, esta será una enzima que generará desarrollo de color tras la incubación con un substrato cromógeno adecuado. De esta manera, por ejemplo, se deseará poner en contacto o incubar el primer y segundo complejo inmune con una ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o anticuerpo conjugado con peroxidasa acida, por un período y bajo condiciones que favorezcan el desarrollo de más formación de complejos inmunes (por ejemplo, incubación por 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contenga PBS, tal como PBS-Tween). Después de incubación con el anticuerpo marcado, y después de lavado para remover el material no unido, se cuantifíca la cantidad de marca, por ejemplo, mediante incubación con un substrato cromógeno tal como urea, o púrpura de bromocresol, o ácido 2,2'-azíno-di-(3-et¡l-benztiazol¡n-6-sulfónico (ABTS), o H202, en el caso de peroxidasa como la marca de enzima. La cuantificación se logra entonces midiendo el grado de color generado, por ejemplo, usando un espectrofotómetro de espectros visibles.

G. Inmunohistoquímica Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse también en conjunto con bloques de tejido incluidos en parafina, fijados con formalina y/o congelados en fresco, preparados para estudio mediante inmunohistoquímica (IHC). El método para preparar bloques de tejido a partir de estas muestras en partículas, se ha usado exitosamente en estudios de IHC previos de varios factores de predicción, y/o es bien conocido por los , expertos en la técnica (Brown et ai, 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et ai, 1990). En resumen, pueden prepararse secciones congeladas rehidratando 50 ng de tejido "pulverizado" congelado a temperatura ambiente en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) en pequeñas cápsulas de plástico; transformando las partículas a pellas medíante centrifugación; resuspendiéndolas en un medio de inclusión viscoso (OCT); invirtiendo la cápsula y/o transformando las partículas de nuevo a pellas mediante centrifugación; congelando instantáneamente en isopentano a 70°C; cortando i la cápsula de plástico y/o removiendo el cilindro de tejido congelado; asegurando el cilindro de tejido sobre el mandril de un micrótomo-crióstato; y/o cortando 25 a 50 secciones en serie. : Pueden prepararse secciones permanentes mediante un método similar que incluye rehídratación de la muestra de 50 mg en un tubo micrófugo de plástico; transformación a pellas; resuspensión en formalina a 10% para fijación por 4 horas; lavado/transformación a pellas; resuspensión en agar a 2.5% caliente; transformación a pellas; enfriamiento en agua helada para endurecer el agar; remoción del bloque de tejido/agar del tubo; infiltración y/o inclusión del bloque en parafina; y/o corte hasta 50 secciones permanentes en serie.

H. Microscopía inmunoelectrónica Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse también en conjunto con microscopía electrónica para identificar componentes de tejido ¡ntracelulares. En resumen, una marca densa en electrones es conjugada directamente o indirectamente al anticuerpo. Ejemplos de marcas densas en electrones de conformidad con la invención son ferritina y oro. La marca densa en electrones absorbe electrones, y puede visualizarse mediante el microscopio electrónico.

I. Equipos de inmunodetección En otras modalidades, la presente invención se refiere a equipos de inmunodetección para su uso con los métodos de inmunodetección descritos anteriormente. Puesto que los anticuerpos se usan generalmente para detectar proteínas, polipéptidos y/o péptidos mutantes y/o de tipo silvestre, los anticuerpos se incluirán de preferencia en el equipo. Sin embargo, pueden proveerse equipos que incluyan ambos de dichos componentes. Los equipos de inmunodeteccíón comprenderán de esta manera, en medios contenedores adecuados, un primer anticuerpo que se une a una proteína, polípéptido y/o péptido mutante y/o de tipo silvestre, y/u opcionalmente, un reactivo de inmunodetección y/o además opcionalmente, una proteína, polipéptido y/o péptido mutante y/o de tipo silvestre. En modalidades preferidas, se usarán anticuerpos monoclonales. En ciertas modalidades, el primer anticuerpo que se une a la proteína, polipéptido y/o péptido mutante y/o de tipo silvestre puede ser unido previamente a un soporte sólido, tal como una matriz de columna y/o la cavidad de una placa de microtítulo. Los reactivos de inmunodeteccíón del equipo pueden tomar cualquiera de una variedad de formas, que incluyen aquellas marcas detectables que están asociadas y/o enlazadas al anticuerpo determinado. Se contemplan también marcas detectables que están asociadas con un ligando de unión secundario, y/o unidas al mismo. Ejemplos de ligandos secundarios, son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo. Otros reactivos de ¡nmunodetección adecuados para su uso en los presentes equipos, incluyen el reactivo de dos componentes que comprende un anticuerpo secundario que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo siendo enlazado a una marca detectable. Como se indicó anteriormente, muchos ejemplos de marcas se conocen en la técnica, y/o dichas marcas pueden usarse con relación a la presente invención. Los equipos pueden comprender además una composición adecuadamente distribuida en alícuotas, de la proteína, polípéptido y/o péptido mutante y/o de tipo silvestre, ya sea marcada y/o no marcada, como puede usarse para preparar una curva estándar para una prueba de detección. Los equipos pueden contener conjugados de anticuerpo-marca ya sea en forma completamente conjugada, en la forma de intermediarios, y/o como porciones separadas que serán conjugadas por el usuario del equipo. Los componentes de los equipos pueden ser empacados en medios acuosos y/o en forma liofilizada. Los medios contenedores de los equipos serán alojados ¡ adecuadamente, e incluirán en general por lo menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa y/u otro medio contenedor, en el cual el anticuerpo pueda ser puesto, y/o de preferencia, adecuadamente distribuido en alícuotas. i En donde se provea una proteína, polípéptido y/o péptido gp36 mutante y/o de tipo silvestre, y/o un segundo y/o tercer ligando de unión y/o componente adicional, el equipo contendrá también generalmente un segundo, tercer y/u otro contenedor adicional en el cual este ligando y/o componente pueda ser puesto. Los equipos de la presente invención incluirán también típicamente medios para contener el anticuerpo, antígeno y/o cualquier otro contenedor de reactivos, en estrecho confinamiento para venta comercial. Dichos contenedores pueden incluir contenedores de plástico moldeados por soplado y/o por inyección, en los cuales los viales deseados son retenidos.

Vil. Preparaciones farmacéuticas Se contempla también que puedan prepararse composiciones farmacéuticas usando las composiciones novedosas de la presente invención.

En dicho caso, la composición farmacéutica comprende la composición activa novedosa de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente, sin experimentación indebida, las dosificaciones y vías de administración adecuadas del componente activo de la presente invención. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones y entidades moleculares que no producen una reacción desfavorable alérgica o similar cuando se administran a un sujeto. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo, es bien entendida en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas; o formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de que pueda prepararse también la inyección. La preparación puede ser también emulsionada. En general, una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo de gp36 de E. canis y/o un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo de gp47 de E. chaffeensis, y/o mezclas de los mismos. Una proteína puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales acidas de adición (formadas con los grupos amíno libres de la proteína), las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio o calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares. Después de la formulación, se administrarán soluciones en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente regulada en su pH si es necesario, y debe hacerse primero que el diluyente líquido sea isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, medios acuosos estériles, los cuales pueden usarse, serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 mL de solución isotónica de NaCI, y añadida a 1000 mL de fluido para hipodermoclisis, o inyectada en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", decimoquinta edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Cierta variación en la dosificación ocurrirá necesariamente, dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona a cargo de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva de uno o más agentes que eligen como objetivo un polipéptido o la secreción del mismo o agente adicional disuelto o disperso en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéutico", "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable", se refieren a composiciones y entidades moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable, cuando se administran a un animal tal como, por ejemplo, un humano, según sea adecuado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene por lo menos un agente que elige como objetivo el polipéptido o la secreción del mismo, y/o ingrediente activo adicional, será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutícal Sciences, decimoctava edición, Mack Printing Company, 1990, cita incorporada en la presente como referencia. Además, para administración en animales (por ejemplo, humanos), se entenderá que las preparaciones deben satisfacer estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza, como es requerido por la Office of Biological Standards de la FDA. Como se usa en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes tensoactivos, antioxidantes, conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antimicóticos), agentes isotónicos, agentes retardadores de absorción, sales, conservadores, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, colorantes y materiales similares, y combinaciones de los mismos, como sería conocido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, cita incorporada en la presente como referencia). Salvo en donde algún vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas. La invención puede comprender diferentes tipos de vehículos, dependiendo de si se administrará en forma sólida, líquida o en aerosol, y si necesita ser estéril para vías de administración tales como inyección. La presente invención puede administrarse intravenosamente, intradérmicamente, intraarterialmente, ¡ntraperitonealmente, intralesionalmente, intracranealmente, intraarticularmente, intraprostáticamente, intrapleuralmente, intratraquealmente, intranasalmente, intravítreamente, intravaginalmente, intrarrectalmente, tópicamente, intratumoralmente, intramuscularmente, ¡ntraperitonealmente, subcutáneamente, subconjuntivalmente, intravesicularmente, mucosamente, intrapericárdicamente, intraumbilicalmente, intraocularmente, oralmente, tópicamente, localmente, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), por inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que bañe directamente células objetivo, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en cremas, en composiciones de lípidos (por ejemplo, liposomas), o mediante otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sería conocido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, Mack Printing Company, 1990, cita incorporada en la presente como referencia). La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención administrada a un paciente animal puede determinarse medíante factores físicos y fisiológicos, tales como peso corporal, severidad de la condición, el tipo de enfermedad que está siendo tratado, intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, idiopatía del paciente, y la vía de ! administración. El profesional médico a cargo de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de ingredientes activos en , una composición, y las dosis adecuadas para el sujeto individual. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 0.1% de un compuesto activo. En otras modalidades, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente 2% y aproximadamente 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente 25% y aproximadamente 60%, por ejemplo, y cualquier escala derivable en la misma. En otros ejemplos no limitativos, una dosis puede comprender también de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 mícrogramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 milígramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier escala derivable en la misma. En ejemplos no limitativos de una escala derivable de los números enlistados en la presente, puede administrarse una escala de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., con base en los números descritos anteriormente. En cualquier caso, la composición puede comprender varios oxidantes que retardan la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de microorganismos puede ser llevada a cabo por conservadores tales como varios agentes antíbacterianos y antímicótícos que incluyen, pero no están limitados a, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, o combinaciones de los mismos.

La invención puede formularse en una composición en una forma de base libre, neutra o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales acidas de adición, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteinácea, o las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos i orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio o calcio o hidróxidos férricos; o bases orgánicas tales como isopropilamína, trimetilamina, histidina o procaína. En modalidades en donde la composición está en una forma ! líquida, un vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que comprenda, pero no esté limitado a, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glícerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas), y combinaciones de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitína; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido por dispersión en vehículos tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de agentes tensoactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de dichos métodos. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónícos tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, o combinaciones de los mismos.

En otras modalidades, pueden usarse gotas oculares, rocíos o soluciones nasales, aerosoles o inhalantes en la presente invención. Dichas composiciones se diseñan en general para que sean compatibles con el tipo de tejido objetivo. En un ejemplo no limitativo, las soluciones nasales son usualmente soluciones acuosas diseñadas para ser administradas hacia los pasajes nasales en gotas o rocíos. Se preparan soluciones nasales de modo que sean similares en muchos respectos a las secreciones nasales, a fin de que se mantenga la acción ciliar normal. De esta manera, en modalidades preferidas, las soluciones nasales acuosas son usualmente isotónicas o ligeramente reguladas en su pH para mantener un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. Además, conservadores antímicrobianos, similares a los usados en preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores adecuados de fármacos, si se requiere, pueden incluirse en la formulación. Por ejemplo, varias preparaciones nasales comerciales se conocen, e incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistamínícos. En ciertas modalidades, la composición se prepara para administración medíante vías tales como la ingestión oral. En estas modalidades, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina con cubierta blanda o dura), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, o combinaciones de los mismos. Pueden incorporarse composiciones orales directamente con el alimento de la dieta. Vehículos preferidos para administración oral comprenden diluyentes inertes, vehículos comestibles asimilables, o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral puede prepararse como un jarabe o elíxir y puede comprender, por ejemplo, por lo menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservador, un agente saborizante, un colorante, un conservador, o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades preferidas, una composición oral puede comprender uno o más aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes saborizantes, y combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un aglutinante tal como, por ejemplo, goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina, o combinaciones de los mismos; un excipiente tal como, por ejemplo, fosfato dicálcíco, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, o combinaciones de los mismos; un agente de desintegración tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de papa, ácido algíníco, o combinaciones de los mismos; un lubricante tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina, o combinaciones de los mismos; un agente saborizante tal como, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria, saborizante de cereza, saborizante de naranja, etc.; o combinaciones de los anteriores. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula puede contener, además de materiales del tipo anterior, vehículos tales como un vehículo líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, tabletas, pildoras o cápsulas pueden ser recubiertas con laca, azúcar, o ambos. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de varios pesos y formas, usualmente medicadas, para inserción en el recto, vagina o uretra. Después de la inserción, los supositorios se ablandan, se funden o se disuelven en los fluidos de la cavidad. En general, para supositorios, vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquílenglicoles, triglicéridos, o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, pueden formarse supositorios de mezclas que contienen, por ejemplo, el ingrediente activo en la escala de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10%, y de preferencia de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2%. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, suspensiones o emulsión, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado al vacío o deshidratación por congelación (liofílización), que dan un polvo del ingrediente activo más cualquier otro ingrediente deseado de un medio líquido filtrado previamente estéril del mismo. El medio líquido debe ser convenientemente regulado en su pH sí es necesario, y primero debe hacerse que el diluyente líquido sea isotónico antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. Se contempla también la preparación de composiciones altamente concentradas para inyección directa, en donde se contempla que el uso de DMSO como solvente resulta en penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos hacia un área pequeña. La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0.5 ng/mg de proteína. En modalidades particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable puede producirse mediante el uso, en las composiciones, de agentes que retarden la absorción tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina, o combinaciones de los mismos.

VIII. Ejemplos de equipos de la invención En modalidades particulares de la invención, existe un equipo alojado en un contenedor adecuado. El equipo puede ser adecuado para diagnóstico, tratamiento y/o protección de un individuo ante Ehriichia, tal como Ehriichia canis, Ehriichia chaffeensis, o ambas. En modalidades particulares, el equipo comprende un contenedor adecuado de un agente que elige como un objetivo un antígeno de gp36 de E. canis o un antígeno de gp47 de E. chaffeensis. El agente puede ser un anticuerpo, una molécula pequeña, un polinucleótido, un polipéptido, un péptido, o una mezcla de los mismos. El agente puede proveerse en el equipo en una forma adecuada, tal como estéril, liofilizada, o ambas, por ejemplo. En modalidades particulares, el equipo comprende uno o más de los siguientes: 1 ) un anticuerpo contra una o más de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39 (para E. canis); 2) un anticuerpo contra una o más de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41 (para E. chaffeensis); y/o 3) SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39 (para E canis) y/o SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41 (para E. chaffeensis), y/o proteínas relacionadas de las mismas. Pueden incluirse también otras composiciones inmunógenas relacionadas con gp36 de E canis o relacionadas con gp47 de E chaffeensis (incluyendo polipéptidos, péptidos o anticuerpos), no presentadas específicamente en la presente. El equipo puede comprender además uno o más aparatos para el suministro de una composición a un individuo que necesita de la misma. Los aparatos pueden incluir una jeringa, gotero, aguja, herramienta para biopsia, cucharada, catéter, etc., por ejemplo. En modalidades en donde el equipo se usa para un propósito de diagnóstico, el equipo puede proveer además una o más composiciones o aparatos de detección para identificar un antígeno de gp36 de E. canis, un antígeno de p47 de E. chaffeensis, o ambos. Dicha modalidad puede usar una marca detectable, tal como para un anticuerpo, por ejemplo, y la marca puede ser fluorescente, quimioluminíscente, o colorimétrica, por ejemplo.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes, representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y que puede obtener aún un resultado similar o igual sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Ejemplos de materiales y métodos Las siguientes descripciones proveen solamente ejemplos de materiales y métodos usados en la invención.

Ehriichia v purificación. Se propagaron E canis (aislados Jake, Okiahoma y Demon) y E. chaffeensis (aislados Arkansas y Sapulpa) como se describió previamente (McBride et a , 2001 ). Se purificó Ehriichia por exclusión por tamaño sobre Sephacryl S-1000 (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) como se describió previamente (Rikihisa et ai, 1992). La fracción que contenía bacterias se congeló y se usó como una fuente de ADN y antígenos.

Construcción e identificación de la colección qenómica de E. canis. Se construyó y se identificó una colección genómica de /-/pall de E. canis, como se describió previamente (McBride et al., 2001 ).

Secuenciación de ADN. Se secuenciaron inserciones de colecciones, plásmidos y productos de PCR, con un secuenciador de ADN ABl Prism 377XL (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.) en el University of Texas Medical Branch Protein Chemistry Core Laboratory.

Análisis de polinucleótídos que codifican para glucoproteínas. Se realizaron alineaciones de ácido nucleico y de aminoácidos con MegAlign (Lasergene v5.08, DNAstar, Madison, Wís.). Las secuencias de las proteínas gp36 y gp47 se pusieron a prueba para glucosilación O-enlazada tipo mucina potencial en serinas y treoninas, con el algoritmo computacional NetOGIyc (Julenius et ai, 2005). Las repeticiones en tándem de los genes que codifican para gp36 de las cepas de E. canis Jake, Okiahoma y Demon; gp47 de las cepas de E. chaffeensis Arkansas y Sapulpa; proteínas tipo mucina de las cepas de E. ruminantium Highway (AF308673; SEQ ID NO: 1 , por lo menos parte de la cual codifica para AAL08844 (SEQ ID NO: 31 )), Welgevonden (el genoma se provee en el número de acceso del GenBank CR767821 ; un ejemplo de proteína tipo mucina de la misma se provee en el número de acceso del GenBank CAI26602 (SEQ ID NO: 29)) y Gardel (el genoma se provee en el número de acceso del GenBank CR925677; un ejemplo de proteína tipo mucina de la misma se provee en el número de acceso del GenBank CAI27556 (SEQ ID NO: 30)); gp140 de la cepa de E. canis Jake (AF1 12369; SEQ ID NO: 2) y gp120 de las cepas de E. chaffeensis Arkansas (ECU49426; SEQ ID NO: 3) y Sapulpa (ECU74670; SEQ ID NO: 4), se analizaron mediante el descubridor de repeticiones en tándem (Benson, 1999) por período, tamaño, número de repeticiones y por ciento de homología entre las repeticiones. Las secuencias de las proteínas gp36 y gp47 se pusieron a prueba para la presencia de secuencias de señal con el algoritmo computacional SignalP entrenado en bacterias Gram negativas (Níelsen et ai, 1997).

Amplificación por PCR de los genes de glucoproteína de Ehriichia. Se diseñaron iniciadores para la amplificación de los genes de gp36 y gp47 de E canis y E chaffeensis, usando Primer Select (Lasergene v5.08, DNAstar, Madison Wis.). Se usaron iniciadores que correspondían a los nucleótidos 28 a 47 (5'-ATG CTT CAT TTA ACÁ ACÁ GA, delantero; SEQ ID NO: 5) y 794 a 816 dentro del marco de lectura abierto (ORF) (5'-AGA ATC TAA ATC TAA AAG TCC AG, inverso; SEQ ID NO: 6), para amplificar el gen , de gp36 de E. canis. Se amplificó ADN de E canis usando la mezcla maestra para PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) con un perfil de funcionamiento cíclico térmico de 95°C por 4 minutos y 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos y 72° por 1 minuto, seguido de una extensión a 72°C por 7 minutos y mantenimiento a 4°C. Los productos de i PCR se separaron en geles de agarosa a 1 %. Se usaron iniciadores que correspondían a los nucleótidos 4 a 22 (5'-CTT CAT TTA ACÁ ACÁ GAA A, delantero; SEQ ID NO: 7) y 902 a 924 dentro del marco de lectura abierto (5'- TTG AGC AGC CAT ATC TTC TTC AT, inverso; SEQ ID NO: 8), para amplificar el gen de gp47 de E. chaffeensis, usando las mismas condiciones de PCR. Se creó proteína recombinante que contenía el amino-terminal de gp36 de E. canis, amplificando ADN respectivo con iniciadores que correspondían con los nucleótidos 28 a 47 (5'-ATG CTT CAT TTA ACÁ ACÁ GA, delantero; SEQ ID NO: 9) y nucleótidos 321 a 345 (5'-TTG ATA AGC ATG CAC AGA AAT AAA G, inverso; SEQ ID NO: 10), y el extremo carboxilo se amplificó con iniciadores específicos para los nucleótidos 370-392 (5'-GGA AAT CCA TCA CGT CCT GCT AT, delantero; SEQ ID NO: 11 ) y 794 a 816 (5'- AGA ATC TAA ATC TAA AAG TCC AG, inverso; SEQ ID NO: 12). Se creó proteína recombinante que contenía el amino-terminal de gp47 de E. chaffeensis, amplificando ADN respectivo con iniciadores que correspondían con los nucleótidos 4 a 22 (5'-CTT CAT TTA ACÁ ACÁ GAA A, delantero; SEQ ID NO: 13) y nucleótidos 436 a 459 (5'-AAC TGG AAC CAC TAT ACT GTC ACT, inverso; SEQ ID NO: 14), y el extremo carboxílo se amplificó con iniciadores específicos para los nucleótidos 439-463 (5'-GAC AGT ATA GTG GTT CCA GTT CTT G, delantero; SEQ ID NO: 15) y 902 a 924 (5'-TTG AGC AGC CAT ATC TTC TTC AT, inverso; SEQ ID NO: 16).

Clonación y expresión de qlucoproteínas recombinantes de Ehriichia. El producto de PCR amplificado fue clonado directamente en el vector de expresión pBAD Thio TOPO® (Invitrogen, Carisbad, Calif.). TOP10 de E. coli (Invitrogen) fue transformado con el plásmido que contenía los genes de gp36 de E. canis o gp47 de E. chaffeensis, y los transformantes positivos fueron identificados mediante PCR para la presencia de la inserción y orientación, y secuenciados para confirmar el marco de lectura de los genes. Se indujo la expresión de proteína recombinante con arabinosa a 0.2% por 3 horas a 37°C. Las bacterias fueron transformadas a pellas (5,000 x g por 20 minutos), resuspendidas en PBS, y se purificaron proteínas recombinantes bajo condiciones nativas como se describió previamente (Doyle et ai, 2005).

Electroforesis en gel y Western immunoblotting. Se separaron antígenos purificados de E. canis o E. chaffeensis mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, y se realizaron Western blots como se describió previamente (McBride et ai, 2003), salvo que se diluyeron anticuerpos primarios (1 :500). Los sueros de los pacientes con HME fueron un obsequio amable de Focus Technologies (Cypress, Calif.).

Inmunización de ratones. Cinco ratones BALB/c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) fueron inmunizados con las proteínas recombínantes gp36 de E canis o gp47 de E chaffeensis. La proteína recombinante (100 µg) en 0.1 mL se mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (Sigma, St. Louis, Mo.) para la primera inyección, y con adyuvante incompleto de Freund para las inyecciones subsiguientes. A los ratones se les administraron inyecciones intraperítoneales dos veces a intervalos de dos semanas.

Proteínas de fusión recombinantes. Se sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios de 27 pb (Sígma-Genosys, Woodlands, TX) que codificaban para una región de repetición de 9 partes de gp36 de E canis. La cadena codificante contenía nucleótidos 5' adicionales CACC para clonación direccional del vector TOPO (5'-CACC ACT GAA GAT TCT GTT TCT GCT CCA GCT (SEQ ID NO: 17; complemento inverso 5'-AGC TGG AGC AGA AAC AGA ATC TTC AGT; SEQ ID NO: 18). Los oligonucleótídos fueron resuspendidos en agua (200 µM), combinados y diluidos hasta 100 µM en regulador de pH de unión de oligonucleótidos (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM), calentados entonces a 95°C por 15 minutos, y dejados enfriar lentamente a temperatura ambiente. Esta mezcla se usó subsiguientemente para clonación estándar en el vector de expresión pBAD Directional TOPO® (Invitrogen) que expresa TEDSVSAPA (SEQ ID NO: 22) de nueve partes, como una proteína de fusión de tiorredoxina. Este procedimiento se repitió con la unidad de repetición de 17 partes de gp47 de E. chaffeensis (secuencias de oligonucleótidos 5' -CACC GCT AGT GTA TCT GAA GGA GAT GCA GTA GTA AAT GCT GTA AGC CAA GAA ACT CCT GCA (SEQ ID NO: 19); complemento inverso 5'-TGC AGG AGT TTC TTG GCT TAC AGC ATT TAC TAC TGC ATC TCC TTC AGA TAC ACT AGC; SEQ ID NO: 20)).

Prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Se recubrieron placas de ELISA (placas Nunc-lmmuno™ con superficie MaxiSorp™, NUNC, Roskilde, Dinamarca) con proteína o péptido (2 µg/cavidad, 10 µL) en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Se llevó a cabo tratamiento con peryodato de la proteína de fusión de repetición recombinante por 20 minutos en regulador de pH de acetato de sodio 100 mM/EDTA 5 mM con metaperyodato de sodio 10 mM. El antígeno fue absorbido a las placas de ELISA durante la noche a 4°C o por 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave, y las placas fueron lavadas subsiguientemente tres veces con TBS-Tween 20 (300 µL), bloqueadas con 1 x solución de bloqueo/diluyente de leche (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md) por 1 hora a 37°C con agitación, y lavadas de nuevo. Sueros anti-E. canis diluidos (1 :500) en diluyente de leche, se añadieron a cada cavidad (100 µL), y se incubaron a temperatura ambiente por 1.5 horas con agitación suave. Las placas se lavaron cuatro veces y se añadió un anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-perro de cabra marcado con fosfatasa alcalina (1 :3000) (Kirkegaard & Perry Laboratories) en diluyente de leche, y se incubaron por 1 hora. Las placas se lavaron cuatro veces, y se añadió substrato (100 µL) (BluePhos, Kirkegaard & Perry Laboratories) a cada cavidad. Las placas se incubaron por 30 minutos en la oscuridad con agitación, y se interrumpió el desarrollo de color con SDS a 1 %. Las placas se leyeron subsiguientemente en un lector de microplacas (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) a A650, y se analizaron los datos usando SoftmaxPro v4.0 (Molecular Devices). Los datos representan la media de tres sueros de perro independientes. Se usó un péptido p28-19 VR1 de 20 partes, con secuencia NH2-RNTTVGVFGLKQNWDGSAIS (SEQ ID NO: 21) (un obsequio amable del Dr. X. J. Yu), como un péptido de control positivo para confirmar la unión e inmunorreactividad.

Microscopía inmunoelectrónica. Se realizó microscopía electrónica Immunogold como se describió previamente (Doyle et ai, 2005).

Análisis de proteínas inmunorreactivas secretadas. Se monitorearon células DH82 infectadas con E. canis o E. chaffeensis hasta que 90 a 100% de las células de la monocapa fueron infectadas. Tres días antes de la cosecha del sobrenadante, el medio de cultivo (DMEM complementado con suero de ternera a 10%) se removió por completo y se reemplazó con DMEM libre de suero. Se colectaron los sobrenadantes de cultivo sin perturbar la monocapa de células, y se centrifugaron (5000 x g por 20 minutos) para transformar a pellas las células y bacterias. Los sobrenadantes se concentraron subsiguientemente 40 veces (dispositivos de filtro de ultracentrífuga Amícon con una limitación de pero molecular de 10 kDa; Millipore, Billerica, Mass.). Los sobrenadantes de cultivo de células (2 µL) fueron diluidos 1 :2 en regulador de pH de muestra LDS, separados mediante electroforesis en gel, transferidos a nitrocelulosa, y las proteínas inmunorreactivas fueron detectadas mediante Western immunoblotting usando anticuerpo policlonal antí-E. canis (1 :500) como se describió previamente.

Análisis indirecto de anticuerpos fluorescentes (IFA) y microscopía confocal. Se prepararon portaobjetos con antígenos de células DH82 infectadas con E. canis (aislado Jake) o E. chaffeensis (aislado Arkansas), como se describió previamente (McBride et ai, 2001 ). Suero monoespecífico de conejo producido contra la proteína recombinante de formación de enlaces disulfuro de E. canis (DsbA) (McBride et al., 2002) fue diluido 1 :100 y añadido a cada cavidad (15 µL), y se dejó que se incubara por 30 minutos. Los portaobjetos se lavaron, y se añadió antí-gp36 de ratón o anti-gp47 de ratón (dilución 1 :100), y se incubaron por 30 minutos. Se añadió anticuerpo secundario de IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor® 488 (H & L) (Molecular Probes, Eugene, OR) diluido 1 :100, y se incubó por 30 minutos, seguido de lavado y adición subsiguiente e incubación de anticuerpo secundario de IgG anti-ratón de cabra marcado con rodamina (H & L) (Kirkegaard & Perry Laboratories). Los portaobjetos se observaron en el Optical Imagíng Laboratory en UTMB, usando un microscopio confocal Zeiss LSM-510 META.

Números de acceso de las secuencias de nucleótidos. Las secuencias génicas de gp36 de los aislados Jake, Okiahoma y Demon de E. canis, y las secuencias génicas de gp47 de los aislados Arkansas y Sapulpa de E chaffeensis, fueron depositadas en el GenBank, y se les asignaron los siguientes números de acceso, respectivamente: Jake de E. canis (DQ085427; SEQ ID NO: 32, que codifica para SEQ ID NO: 37), Okiahoma de E. canis (DQ085428; SEQ ID NO: 33, que codifica para SEQ ID NO: 38), Demon de E canis (DQ085429; SEQ ID NO: 34, que codifica para SEQ ID NO: 39), Arkansas de E. chaffeensis (DQ085430; SEQ ID NO: 35, que codifica para SEQ ID NO: 40) y Sapulpa de E. chaffeensis (DQ085431 ; SEQ ID NO: 36, que codifica para SEQ ID NO: 41 ). Los ejemplos de polinucleótidos de "mucina" de las cepas de E. ruminantium Highway (SEQ ID NO: 42), Welgevonden (SEQ ID NO: 43) y Gardel (SEQ ID NO: 44), son ortólogos de gp36 y gp47.

EJEMPLO 2 Identificación molecular de la proteína inmunorreactiva mayor de 37 kDa de E. canis Un clon positivo con una inserción de 1.5 kb contenía un marco de lectura abierto (ORF) completo que codificaba para una proteína predicha con una masa molecular de 29.3 kDa (26.7 sin péptido de señal predícho de 23 aminoácidos), con homología con proteínas mucina eucarióticas altamente glucosiladas. Con la correlación previa de glucoproteínas con proteínas inmunorreactivas mayores, este candidato fue de interés particular. El gen contenía doce repeticiones en tándem en el extremo 3' del marco de lectura abierto (figura 1 ) que codificaba para 9 aminoácidos (cuadro 2). El servidor de predicción de glucosilación O-enlazada NetOGIyc, predijo que las serinas y treoninas de las repeticiones en tándem, con el ejemplo de secuencia predicha TEDSVSAPA (SEQ ID NO: 22), eran los sitios de glucosilación (letras en negritas, cuadro 1 ). El genoma de la cepa Arkansas de E. chaffeensis fue buscado por BLAST con la secuencia de gp36 de E. canis, y se identificó un marco de lectura abierto homólogo que codifica para una proteína con siete ejemplos de repeticiones en tándem de 19 partes (ASVSEGDAVVNAVSQETPA; SEQ ID NO: 23) y una masa predicha de 32.9 kDa. La secuencia de ADN hacía el extremo 5' de la región de repetición en tándem contenía un índice de similitud de 61.5% (57.0% de aminoácidos), pero las regiones de repetición en tándem no fueron homologas.

CUADRO 2 Repeticiones en tándem de qlucoproteínas inmunorreactivas mayores de Ehriichia Los genes que codifican para gp36 de las cepas Okiahoma y Demon de E. canis, así como gp47 de la cepa Sapulpa de E. chaffeensis, fueron secuenciados para identificar variaciones potenciales en la secuencia génica. Diferentes cepas de E. canis retuvieron secuencia de repetición en tándem idéntica, pero difirieron en el número de las repeticiones (cuadro 2). De modo interesante, la cepa Sapulpa de E chaffeensis codificó para una serie enteramente diferente de repeticiones en tándem (4 repeticiones completas de 33 aminoácidos) que se encontraron en la cepa Arkansas de E chaffeensis. Las secuencias génicas de gp47 de E. chaffeensis hacia el extremo 5' de la región de repetición, contenían 99.8% de homología entre las cepas, pero tuvieron un bajo grado de homología (27.7%) asociado principalmente con la región 3' hacia el extremo 3' de las repeticiones en tándem. La región apenas hacía el extremo 5' de las repeticiones en tándem de la cepa Arkansas codifica para los aminoácidos Glu-Gly-Asn, que son los primeros tres aminoácidos de la región de repetición de la cepa Sapulpa, sugiriendo un cambio de repetición en tándem más reciente. La secuencia de ácido nucleico dentro de las repeticiones en tándem de cada gen de gp47, estuvo altamente conservada (por lo menos 99%) (cuadro 2). Aunque las secuencias de repetición en tándem variaron ampliamente entre las diferentes especies y cepas, hubo una conservación del uso de aminoácidos entre las repeticiones. Se usó un total de diez aminoácidos en todas las repeticiones, con una ocurrencia particularmente alta de serina, treonina, alanina, prolina, valina y ácido glutámico. El análisis de la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína hacía el extremo 5' de las repeticiones, en comparación con aquella que ¡ncluye las repeticiones hasta el codón de terminación, demostró un incremento sustancial en el uso de estos aminoácidos (cuadro 3). Se encontraron sitios de glucosilación predichos por NetOGIyc sólo dentro de las repeticiones en tándem de las proteínas (cuadro 2). Los residuos de treonina dentro de la repetición de E. chaffeensis fueron sitios predichos para la unión de glucanos, y los residuos de serina exhibieron un alto potencial, pero no se identificaron como sitios de unión de glucanos. Asimismo, la proteína "tipo mucina" de la cepa Gardel de E. ruminantium, contenía una treonína y varios residuos de serina que estuvieron ligeramente abajo del umbral predicho como sitios de unión de glucanos.

EJEMPLO 3 Inmunorreactividad y glucosilación de qp36 y qp47 Gp36 recombinante de E canis reaccionó fuertemente con los anticuerpos en suero de un perro infectado experimentalmente con E. canis (fígura 2A, campo 1 ). Después de digestión del miembro de fusión tiorredoxína, la proteína recombinante exhibió una masa molecular de 36 kDa (datos no mostrados), que fue significativamente más grande de lo predicho por la secuencia de aminoácidos (26.7 kDa). Se detectaron carbohidratos en gp36 recombínante (figura 2A, campo 2). gp47 recombinante de E. chaffeensis exhibió también fuerte ¡nmunorreactividad (figura 2B, campo 1), mostró una masa molecular más grande de lo predicho (32.9 kDa), y se detectaron carbohidratos (figura 2B, campo 2).

EJEMPLO 4 Identificación de qp36 y qp47 nativas Una proteína nativa de E. canis de masa molecular 36 kDa, que correspondía a la proteína de aproximadamente 37 kDa descrita previamente (McBride et ai, 2003), reaccionó con antisuero monoespecífico de ratón producido contra la proteína recombínante medíante Western blot (figura 3A). Una proteína menos prominente se visualizó también a 34 kDa. gp47 anti-recombinante de ratón identificó una proteína de 47 kD en usados de células enteras de E chaffeensis (figura 3B). Se hicieron reaccionar Western immunoblots de lisados de células enteras de E chaffeensis con diez sueros de pacientes con sospecha de HME que tuvieron anticuerpos de E chaffeensis detectables mediante análisis indirecto de anticuerpos fluorescentes (IFA). Siete de diez sueros reconocieron una proteína inmunorreactiva de 47 kDa idéntica en masa a la proteína reconocida por suero de gp47 anti-recombinante (figura 3B).

EJEMPLO 5 Respuesta temprana de anticuerpos a qp36 Estudios de cinética de la respuesta del hospedero a E. canis, demostraron que un antígeno de aproximadamente 37 kDa fue reconocido más tempranamente por anticuerpos en suero de fase aguda de perros infectados experimentalmente con E canis (McBride et ai, 2003). El Western immunoblot confirmó que gp36 recombinante no fue reconocida por el suero de pre-inoculación, pero que se produjeron anticuerpos contra gp36 en la fase aguda temprana (día 14) (figura 4), confirmando la identidad de gp36 como el antígeno mayor de 37 kDa de E canis. La respuesta de anticuerpos contra gp36 continuó siendo muy fuerte a través de la convalecencia (día 56) (figura 4).

EJEMPLO 6 Inmunorreactividad de las repeticiones en tándem de qp36 y qp47 l La prueba Western immunoblotting demostró que el extremo 1 carboxilo que incluye las repeticiones en tándem, fue la porción altamente inmunorreactiva de la proteína, pero que las regiones N-terminales homologas i que preceden a las regiones de repetición en tándem de gp36 y gp47 no ' fueron inmunorreactivas (datos no mostrados). Una repetición individual expresada como una proteína de fusión recombinante, fue reconocida por suero de perro anti-E. canis (figura 5B). La proteína de fusión que contenía 9 ! partes demostró un cambio electroforético más grande que la masa predicha I , (-900 kDa), sugiriendo que el péptido fue modificado post-traducción, y i corroborando la predicción de NetOGIyc, que identificó las unidades de repetición como sitios de unión de glucanos (figura 5A). Una proteína de fusión que contenía una repetición individual de 17 partes de gp47 de E chaffeensis, fue reconocida también por suero de perro anti-E. chaffeensis (figura 5C). gp36 y gp47 fueron antigénicamente distintas, ya que no reaccionaron con antisueros heterólogos (figuras 6A y 6B). Los carbohidratos son una parte importante del determinante de epítopes de gp36. Puesto que cada unidad de repetición en tándem de gp36 de E. canis fue un sitio de glucosilacíón predicho, y se encontró contiene un epítope mayor de células B, los presentes inventores formularon la hipótesis , de que glucanos unidos fueron importantes determinantes de epítopes. Para confirmar esto, la proteína de fusión de repetición de 9 partes se trató con peryodato para poner a prueba el reconocimiento de anticuerpos después de la modificación estructural del glucano. La proteína de fusión de 9 partes sin tratar reaccionó con suero de perro anti-E. canis mediante ELISA; sin embargo, el reconocimiento de la proteína de fusión de 9 partes tratada con peryodato fue reducido ampliamente, y no se reconoció en lo absoluto un péptido sintético con la secuencia de la región de repetición, demostrando el requisito de modificación post-traducción para la unión del anticuerpo (figura 6). La modificación estructural del glucano por tratamiento con peryodato, redujo el reconocimiento de anticuerpos del epítope casi hasta el nivel de ambiente de la tiorredoxina sola, según se determinó mediante reducción en los valores de D.O. de ELISA.

EJEMPLO 7 Los carbohidratos son un determinante importante de epítopes de qp36 Puesto que cada unidad de repetición en tándem de gp36 de E canis fue un sitio de glucosilación predicho y se encontró contiene un epítope mayor de células B, los inventores consideraron que los glucanos unidos fueron importantes determinantes de epítopes. Para caracterizar esto, gp36 recombinante de E canis se trató con peryodato para poner a prueba el reconocimiento de anticuerpos después de la modificación estructural del glucano. La gp36 pseudotratada reaccionó fuertemente con suero de perro anti-E. canis mediante ELISA, mientras que la gp36 recombinante tratada con peryodato fue reducida sustancialmente (figura 7A). Para caracterizar mejor esta observación, se usó ELISA para poner a prueba el reconocimiento de las proteínas de fusión recombinantes con una repetición individual (9 partes; TEDSVSAPA; SEQ ID NO: 22), 12 partes (SVSAPATEDSVS; SEQ ID NO: 45) y dos unidades de repetición en tándem (18 partes; TEDSVSAPATEDSVSAPA; SEQ ID NO: 46) de gp36, en comparación con péptidos sintéticos no glucosilados con las secuencias idénticas. Mientras que todas las proteínas recombinantes fueron reconocidas con suero de perro inmune, la repetición individual sintética (9 partes) no fue reconocida en lo absoluto, y el péptido traslapante (12 partes) exhibió reactividad mínima, demostrando la importancia de la modificación post-traducción para la unión del anticuerpo a estos péptidos (fígura 7B). El péptido sintético de la repetición en tándem (18 partes) fue reconocido por suero de perro, aunque no tan bien como el recombinante, demostrando la presencia de un epítope lineal basado en aminoácidos presente en un péptido que contiene a la unidad de repetición en tándem (18 partes) (figura 7B). El reconocimiento de la proteína de fusión de la repetición de E. chaffeensis recombinante, exhibió una absorbancia por ELISA mayor que la del péptido sintético (figura 7C).

EJEMPLO 8 Localización celular y secreción de qp36 y qp47 Ehriichia existe en dos formas morfológicas distintas conocidas como reticulada y de núcleo denso (Popov et ai, 1995). La localización de gp36 de E. canis (figura 8A) y gp47 de E. chaffeensis (figura 8B) mediante microscopía electrónica immunogold, permitió encontrar que estas proteínas fueron expresadas diferencíalmente sobre la superficie de la forma de núcleo denso de las bacterias, pero no la forma reticulada. gp36 y gp47 estuvieron asociadas también con las membranas de las mórulas que contienen a las formas morfológicas de núcleo denso de las bacterias (figuras 8A y 8B). La expresión diferencial de gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis se confirmó además mediante análisis IFA y microscopía confocal de portaobjetos de células infectadas usando anticuerpos contra la proteína Dsb de formación de enlaces disulfuro de Ehriichia, además de gp36 o gp47. El análisis IFA demostró que gp36 de E canis y gp47 de E. chaffeensis fueron expresadas en un subgrupo de Ehriichia, en comparación con la expresión de Dsb (expresada constitutivamente). gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis fueron las proteínas inmunorreactivas predominantes secretadas en el sobrenadante (figuras 9A y 9B, campo 1 ). gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis fueron identificadas concluyentemente en las fracciones de sobrenadante con anticuerpos de gp36 y gp47 anti-recombínantes (figuras 9A y 9B, campo 2). Los sobrenadantes de células DH82 no infectadas no contenían proteína alguna reconocida por antisueros contra Ehriichia (datos no mostrados).

EJEMPLO 9 Caracterización molecular de repeticiones en tándem de qp36 de E. canis y qp47 de E. chaffeensis entre aislados de diferentes localidades geográficas Con relación a las glucoproteínas ortólogas inmunorreactívas mayores de Ehriichia canis y E. chaffeensis, gp36 y gp47, los inventores caracterizaron molecularmente las repeticiones en tándem. Los genes que codifican para estas proteínas contienen repeticiones en tándem cerca del extremo carboxilo que son sitios de glucosilación O-enlazada. Las unidades de repetición individuales de gp36 y gp47 contienen epítopes que son reconocidos por antisueros de perro, pero no reaccionan en forma cruzada.

Análisis comparativos en números limitados de E canis y E chaffeensis de Norteamérica, determinaron que las repeticiones en tándem variaron en número y secuencia entre los aislados. Para caracterizar mejor la conservación global o heterogeneidad de estas proteínas, en particular con respecto a las regiones de repetición en tándem, los genes de gp36 y gp47 fueron amplificados y comparados en varias cepas continentalmente separadas de E. canis y numerosos aislados de E chaffeensis de Norteamérica dispersos geográficamente. Se diseñaron iniciadores para regiones intergénicas hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de las regiones codificantes de gp36 y gp47 de E. canis y E chaffeensis (gp36 de E. canis delantero 5'-AAT CAA TGT AGT ATG TTT CTT TTA (SEQ ID NO: 47) e inverso 5'-ATT TTA CAG GTT ATA TTT CAG TTA (SEQ ID NO: 48); gp47 de E. chaffeensis delantero 5'-TTG TGC AGG GAA AGT TG (SEQ ID NO: 49) e inverso 5'-AAT GAA AGT AAA TAA GAA AGT GTA (SEQ ID NO: 50)), y se i llevó a cabo amplificación como se describió previamente (Doyle et ai, 2006).

Las secuencias génicas de gp36 de E. canis de los aislados Louisíana , (DQ146151 ; SEQ ID NO: 52, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 53), Florida (DQ146152; SEQ ID NO: 54, polínucleótido que codifica para SEQ ID ( NO: 55), DJ (North Carolina) (DQ146153; SEQ ID NO: 56, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 57), Sao Paulo (DQ146154; SEQ ID NO: 58, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 59) y Cameroon 71 (DQ146155; SEQ ID NO: 60, polinucleótído que codifica para SEQ ID NO: 61 ), y las secuencias génicas de gp47 de E. chaffeensis de los aislados Jax (DQ146156; SEQ ID NO: 62, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 63), St. Vincent (DQ146157; SEQ ID NO: 64, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 65), V3 (Vanderbílt) (DQ146158; SEQ ID NO: 66, polinucleótido que codifica para SEQ ID NO: 67) y V8 (DQ146159; SEQ ID NO: 68, polinucleótído que codifica para SEQ ID NO: 69), fueron depositadas en la base de datos disponible públicamente del GenBank, del world wide website del National Center for Biotechnology Information. Las secuencias génicas de gp36 de E canis de los aislados Jake (DQ085427), Okiahoma (DQ085428) y Demon (DQ085429), y las secuencias génicas de gp47 de E chaffeensis de los aislados Arkansas (DQ085430) y Sapulpa (DQ085431), fueron depositadas previamente. El análisis de secuencia se realizó como se describió previamente (Doyle etal., 2006). Las secuencias de repetición en tándem de los aislados de E canis de Norteamérica, Brasil y Camerún fueron altamente conservadas, comprendiendo nueve aminoácidos (TEDSVSAPA; SEQ ID NO: 22). Sin embargo, el número de repeticiones varió entre 4 y 18 copias de la repetición (véase cuadro 4). La pre-región de repetición N-terminal (143 aminoácidos) fue altamente conservada entre todos los aislados, con las cepas Jake, Okiahoma, Demon y Louisíana conteniendo homología completa. Los aislados de Brasil y Camerún contenían las secuencias más divergentes (cuatro diferencias en aminoácidos), pero estas retenían aún 97.2% de homología de aminoácidos con la secuencia consenso.

CUADRO 4 Repeticiones en tándem de qp36 y gp47 en diferentes cepas de E. canis y E. chaffeensis Por ciento Número de Repetición en tándem Cepa de repeticiones homología gp36 de E canis Jake 12.2 100 Okiahoma 5.2 100 TEDSVSAPA (9 Demon 16.2 99 aminoácidos) (SEQ ID NO: 22) Louisíana 5.2 99 Florida 4.2 100 DJ 18.2 100 Sao Paulo 18.2 100 Cameroon 16.2 100 71 gp47 de E chaffeensis ASVSEGDAVVNAVSQETPA Arkansas 7.0 99 (19 aminoácidos; SEQ ID NO: 23) EGNASEPVVSQEAAPVSE Jax 4.5 SGDAANPVSSENAS 98 (33 aminoácidos; SEQ ID NO: 51 ) St Vincent 3.4 98 Sapulpa 4.5 99 V3 4.5 97 V8 4.5 98 Asimismo, los aislados de E chaffeensis puestos a prueba demostraron diversidad limitada de las repeticiones en tándem de gp47. La cepa Arkansas exhibió una unidad de repetición única de 19 aminoácidos en | comparación con todos los demás aislados secuenciados. Siete repeticiones de la secuencia de 19 aminoácidos se identificaron en el gen de gp47 de la ! cepa Arkansas. Cinco aislados de E chaffeensis adicionales de localidades geográficamente dispersas tuvieron una unidad de repetición conservada de 1 33 aminoácidos que exhibió variabilidad menor en la secuencia de repetición i (véase cuadro 4). El número de copias entre esta repetición fue idéntico entre i tres de cuatro aislados (4.5 repeticiones), conteniendo el aislado St. Vincent i una repetición menos (véase cuadro 4). Las pre-regiones de repetición de la l ; repetición N-terminal (154 aminoácidos), fueron completamente conservadas entre las cepas Sapulpa, St. Vincent, V3 y V8. Esta secuencia contenía 99.4% de conservación de aminoácidos (una alteración) con la pre-regíón de 5 repetición de la cepa Arkansas. Se encontró más divergencia en la cepa Jax, con 91.6% de homología de aminoácidos (13 sustituciones) en la pre-región de repetición, en comparación con el resto de las cepas. Aunque estas proteínas son altamente ¡nmunorreactivas y las unidades de repetición en tándem de gp36 y gp47 contienen los epítopes de células B (Doyle et ai, Q 2006), de modo interesante, la falta de divergencia de secuencia indica que i existe poca presión selectiva inmune sobre estas proteínas para alterar su secuencia, o deben ser conservadas para retener su función, en modalidades específicas. Asimismo, el análisis de secuencia comparativo no pudo detectar similitud significativa entre las unidades de repetición, demostrando que las repeticiones en tándem no se derivan de una secuencia común que pasó a través de mutaciones múltiples para ganar diversidad. Las repeticiones en tándem distintas de gp47 ayudarán más a diferenciar cepas variantes en ciados, y en aspectos particulares de la invención, proveen discernimiento en diferencias patogénicas entre las cepas. Puesto que estas glucoproteínas ortólogas son altamente inmunógenas (Doyle et ai, 2006), la conservación completa de repeticiones en tándem entre las cepas de E. canis alrededor del mundo y la divergencia limitada entre E chaffeensis, podrían tener implicaciones positivas para el uso futuro de estas proteínas. Con las unidades de repetición en tándem conteniendo epítopes, se desarrolló una prueba de inmunodiagnóstico sensible para E. canis usando una proteína recombinante con estas repeticiones en tándem.

EJEMPL0 10 Vacunas de la invención En aspectos particulares de la invención, las composiciones ¡nmunógenas de la presente invención son adecuadas como una vacuna, tal como una vacuna subunitaria. En otros aspectos de la invención, las composiciones inmunógenas son referidas como inmunoprotectoras. Específicamente, una o más composiciones de la invención, tales como aquellas que comprenden un epítope de gp36 de E. canis o un epítope de gp47 de E. chaffeensis, por ejemplo, se administran a un mamífero, tal como un canino. El suero del mamífero puede ponerse a prueba para una respuesta inmune, tal como detectando anticuerpos en el suero. El mamífero es sometido entonces a desafío subsiguiente con el organismo patogénico, tal como los organismos E canis o E. chaffeensis respectivos, y se determina la inmunoprotección. Pueden usarse controles, tales como inmunización con, por ejemplo, un epítope mutado o un epítope que no comprenda una porción de carbohidrato. La protección completa o parcial contra el desafío subsiguiente demuestra la naturaleza inmunoprotectora de la composición, y la composición es una vacuna. Puede definirse que la protección parcial protege del desarrollo de por lo menos un síntoma de la infección, o que brinda protección ante por lo menos un síntoma que llega a empeorar.

EJEMPL0 11 Significado de la presente invención El estudio previo de los presentes inventores, de las respuestas cinéticas de anticuerpos a E. canis, reveló dos antígenos inmunorreactivos mayores (proteínas de 36 y 19 kD) como objetivos dominantes de la respuesta inmune temprana del hospedero (McBride et ai, 2003). Se desconoce la composición antigénica de E canis en el acaro, pero antígenos reconocidos tempranamente en la respuesta inmune del hospedero, proveen evidencia de aquellos que pueden ser especialmente importantes en las etapas de infección iniciales del mamífero hospedero, y de esta manera son objetivos de alta prioridad para identificación molecular y para el desarrollo de vacunas. En esta invención, los presentes inventores han identificado concluyentemente y caracterizado molecularmente la proteína inmunorreactiva mayor de 36 kD de E. canis y, en forma similar a varias otras proteínas inmunorreactivas mayores de Ehriichia, es glucosilada. Además, se identificó un ortólogo de 47 kD divergente y antigénicamente distinto en E. chaffeensis, también una proteína inmunorreactiva mayor reconocida consistentemente por los anticuerpos de los pacientes con HME. Otras proteínas inmunorreactivas mayores que han sido caracterizadas molecularmente en E. canis, incluyen tres glucoproteínas (gp200, gp140 y p28/p30), y la identificación de gp36 en E. canis apoya además la glucosilación como una modificación post-traducción importante de Ehriichia sobre varias proteínas expuestas en la superficie. gp36 de E. canis y gp47 de E chaffeensis tienen divergencia considerable de aminoácidos y ácidos nucleicos en regiones que contienen las repeticiones en tándem ricas en serina y treonina. El análisis reciente de la secuencia del genoma de Ehriichia ruminantium (Collins et ai, 2005) y E. canis (datos no publicados), ha permitido identificar una alta frecuencia de genes que contienen unidades de repetición en tándem. Los ortólogos de gp140 de E. canis y gp120 de E chaffeensis, tienen también repeticiones en tándem más largas pero genéticamente divergentes. Ninguna de las regiones de repetición de glucoproteína conocidas comparten secuencias conservadas entre ellas, pero todas exhiben alto contenido de serina y treonina además de residuos de alanina, prolina, valina y ácido glutámico, que se ha reportado sirven como motivos de reconocimiento para la unión de O-glucanos I i (O'Connell er al., 1991 ; Thanka Chrístlet y Veluraja, 2001). Las unidades de i repetición de las glucoproteínas "tipo mucina", fueron el único sitio de unión de 1 O-glucanos predicho como fue predicho por NetOGIyc, pero no todas las j serinas y treoninas cruzaron el umbral como sitios de glucosilación probables.

I ¡ Sin embargo, puesto que NetOGIyc se desarrolló con datos de glucoproteínas ' eucarióticas, es bastante probable que el umbral para la glucosilación de Ehriichia sea menor, y que éstas sean sitios de glucosilación. Como con otros , ortólogos de glucoproteína de Ehriichia conocidos, gp36 y gp47 son ¡ antigénícamente divergentes. La divergencia e inmunodominancia consistente de las repeticiones en tándem, sugieren que la respuesta inmune crea fuertes ' presiones selectivas que alteran la secuencia de las repeticiones. Sin embargo, todas las cepas de E canis puestas a prueba contenían repeticiones en tándem idénticas, pero tuvieron números de repetición variables (5 a 16). E. chaffeensis exhibió más divergencia (secuencia de aminoácidos y número de repeticiones) en las regiones de repetición en tándem de dos aislados que se examinaron (Arkansas y Sapulpa). Tres de diez sueros de pacientes con HME puestos a prueba no reaccionaron con gp47 de la cepa Arkansas de E chaffeensis, y la divergencia en la región de repetición podría explicar la inconsistencia del reconocimiento de gp47 por diferentes pacientes. Una búsqueda de secuencias de ADN de repeticiones en tándem ortólogas a través del genoma, no detecta pseudogenes u otras fuentes para las repeticiones nacientes, de modo que el mecanismo para la divergencia de las repeticiones continúa siendo evasivo. El descubrimiento de un nuevo par de ortólogos expresados en la superficie con unidades de repetición, es un punto de interés en un organismo intracelular obligado que ha sufrido evolución genómica reductiva, y de esta manera lleva a la especulación de que puede haber una ventaja selectiva que incrementa y retiene las unidades de repetición glucosiladas de estas proteínas. Aunque gp36 y gp47 tienen homología considerable en las regiones N-termínales hacia el extremo 5' de las regiones de repetición, las regiones inmunorreactivas se localizaron hacia la región del extremo carboxilo de las proteínas, que contiene a las repeticiones en tándem. Los presentes inventores determinaron que repeticiones individuales de gp36 de E. canis (9 partes) y gp47 de E. chaffeensis (19 partes) expresadas como proteínas recombinantes, fueron suficientes para el reconocimiento de los anticuerpos por sueros inmunes, demostrando que contienen epítopes mayores repetidos. Asimismo, las regiones de repetición de gp120 de E. canis y gp140 de E. chaffeensis contienen epítopes mayores de anticuerpos. De modo interesante, los péptidos sintéticos de la repetición de gp36 de E. canis (9 partes) y la repetición de E chaffeensis (27 partes) no fueron reconocidos por el suero inmune, y el tratamiento de la unidad de repetición recombinante con peryodato casi suprimió el reconocimiento de los anticuerpos, proveyendo la primera evidencia de que los determinantes de epítopes son complejos y requieren modificación post-traducción para el reconocimiento de anticuerpos. En ausencia de organelos para el tráfico de proteínas, se pensó desde hace tiempo que los procariontes no contenían la maquinaria celular necesaria para modificar proteínas con carbohidratos. Incluso E coli, usada por muchos años para expresar proteínas eucarióticas aglucosiladas, se ha encontrado modifica sus propias proteínas con porciones de carbohidratos (Lindenthal y Elsinghorst, 1999). Se han descubierto ahora varias bacterias patógenas de humanos que expresan glucoproteínas (Benz y Schmidt, 2002; Schmidt et ai, 2003; Upreti et ai, 2003), y las pocas glucoproteínas procarióticas funcionalmente caracterizadas contribuyen a adhesión, estabilidad estructural y movilidad, y son también objetivos del sistema inmune. Estas características demuestran las funciones potenciales de las glucoproteínas bacterianas en patogénesis e inmunidad (Benz y Schmidt, 2002). En forma significativa, el reconocimiento por anticuerpos dependiente de carbohidratos, de gp36 y gp47 recombinantes expresadas en E. coli, demuestra que glucanos y sitios de unión están conservados entre proteínas de Ehriichia nativas y glucoproteínas recombinantes expresadas en E. coli. Esto indica que los mecanismos para la glucosilación están conservados entre Ehriichia y E. coli. Sin embargo, no se han identificado glucosiltransferasas homologas a aquellas presentes en E. coli en el genoma de E. canis (datos no publicados), sugiriendo que estas enzimas contienen secuencias únicas y están entre las proteínas hipotéticas con función desconocida. Con base en las masas de proteína idénticas y la dependencia de la modificación post-traducción para la reactividad de los epítopes de glucoproteínas, las glucoproteínas recombinantes de Ehriichia parecen ser idénticas a las proteínas nativas en estructura y composición, y de esta manera son sustitutos adecuados para proteínas nativas en estudios para determinar su función como antígenos inmunoprotectores. Los presentes inventores han observado que gp36 y gp47 están presentes en abundancia relativamente baja en lisados de células enteras, en comparación con otras proteínas de la membrana exterior, tales como p28/p30. Varias proteínas de Ehriichia se han identificado fuera de la célula bacteriana, incluyendo gp120 y la proteína de unión a ion férrico. Además, se ha demostrado que gp120 de E. chaffeensis es expresada díferencialmente sobre la superficie de E. chaffeensis de núcleo denso y extracelularmente en la matriz de la mórula. La microscopía electrónica immunogold demostró que gp36 de E. canis y gp47 de E. chaffeensis son también expresadas diferencialmente sobre la superficie de Ehriichia de núcleo denso. Se piensa que las formas morfológicas de célula reticulada y de núcleo denso de Ehriichia, son homologas a la forma de cuerpo elemental infecciosa de Chlamydia trachomatis y de cuerpo reticulado metabólicamente activo, respectivamente. Esta observación índica que estas glucoproteínas ortólogas pueden desempeñar una función importante en la infección por Ehriichia. La expresión de estas glucoproteínas en la superficie de la célula índica que funcionan como adhesinas, en modalidades específicas de la invención. Interacciones entre carbohidratos y lectina son medios comunes de adhesión bacteriana, y se ha demostrado que E chaffeensis usa L y E selectinas que medían la unión celular (Zhang et ai, 2003). Se ha demostrado que proteínas de Anaplasma margínale que contienen repeticiones, así como el ortólogo de proteína "tipo mucina" de Ehriichia ruminantium, confieren la capacidad para adherirse a las células de acaro (de la Fuente etal., 2004). gp36 y gp47 son constituyentes menores en usados de células enteras, pero los presentes inventores encontraron cantidades sustanciales de ambas en los sobrenadantes de células infectadas. De modo interesante, estas fueron las proteínas inmunorreactivas abundantes presentes en los sobrenadantes en los cuales no se detectaron otras proteínas de superficie conocidas tales como p28/p30, indicando que gp36 fue por supuesto secretada, y no estuvo asociada con membranas exteriores intactas en los sobrenadantes. La secreción de gp36 en la glándula salival de ácaros o en el mamífero hospedero, daría una explicación parcial de la respuesta inmune temprana del hospedero a esta glucoproteína. Además, la secreción de estos ortólogos de glucoproteína (gp36 y gp47) sugiere que pueden ser factores de virulencia, y que desempeñan una función importante en patobiología. Se identificó una secuencia de señal en gp36, sugiriendo la implicación de un mecanismo de secreción dependiente de sec, tal como de tipo II o tipo IV (Nagai y Roy, 2003). Se han identificado genes que codifican para la maquinaria de secreción tipo IV en E. canis, E. chaffeensis y E. ruminantium (Collins et al., 2005; Felek et ai, 2003; Ohashí et ai, 2002), ya que la función de la secreción tipo IV de factores de virulencia bacterianos está llegando a ser mejor reconocida.

El reconocimiento inmune temprano de gp36 por la respuesta inmune de mamíferos hospederos, indica la posibilidad de que este antígeno desempeñe una función importante en la infección del acaro por Ehriichia, o en la transmisión y etapas tempranas de la infección, en modalidades específicas de la invención. Aunque muy poco se sabe acerca de la expresión de los antígenos de Ehriichia en el acaro, se ha demostrado expresión diferencial de proteínas de la superficie exterior de Borrelia burgdorferi en el acaro, y se ha reportado restricción de las variantes msp2 de A. margínale en ácaros (Rurangirwa et ai, 1999; Schwan y Hinnebusch, 1998). La infección exitosa de los ácaros o mamíferos hospederos puede determinarse por la expresión de proteínas específicas de la membrana exterior requeridas para la unión a la célula hospedera, o aquellas implicadas en el establecimiento de infección intracelular. La cinética de la respuesta de los anticuerpos y la reactividad de los anticuerpos de gp36 de E canis, indica que este antígeno es útil en el desarrollo de inmunodiagnóstico y de vacunas. Las pruebas de diagnóstico actuales disponibles comercialmente para la ehrlichiosis canina, se basan en las proteínas p28/p30, y gp36 podría proveer sustancialmente mejor sensibilidad para esta aplicación. Además, el antígeno de gp36 no reaccionó con sueros inmunes de perros con E. chaffeensis, lo cual podría ser útil en el desarrollo de pruebas de inmunodiagnóstico específicas de especie. Se ha reportado carácter específico de especie serológíca similar con gp120/gp140, así como ortólogos de gp200 de E. canis y E. chaffeensis. Estas observaciones indican que la reactividad cruzada serológica reportada entre E. canis y E chaffeensis, no es inducida por estos antígenos inmunorreactivos mayores. Este hallazgo tiene también relevancia para el desarrollo de vacunas subunitarias, indicando que estos antígenos son efectivos contra homólogos, en aspectos específicos de la invención. Vacunas que pudieran bloquear potencialmente la infección durante la transmisión, contendrían de preferencia antígenos expresados en el acaro, y de esta manera en modalidades específicas, se determina la expresión de gp36 en el acaro vector. El descubrimiento de otra serie de ortólogos de glucoproteínas inmunorreactivas mayores de Ehriichia, demuestra su importancia como objetivos del sistema inmune, y su utilidad como antígenos inmunoprotectores.

REFERENCIAS Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación, son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la cual la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente como referencia, al mismo grado como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación individual se incorpora en la presente como referencia.

Patentes y solicitudes de patente Patente de E.U.A. No. 5,681 ,947 Patente de E.U.A. No. 5,652,099 Patente de E.U.A. No. 5,763,167 Patente de E.U.A. No. 5,614,617 Patente de E.U.A. No. 5,670,663 Patente de E.U.A. No. 5,872,232 Patente de E.U.A. No. 5,859,221 Patente de E.U.A. No. 5,446,137 Patente de E.U.A. No. 5,886,165 Patente de E.U.A. No. 5,714,606 Patente de E.U.A. No. 5,672,697 Patente de E.U.A. No. 5,466,786 Patente de E.U.A. No. 5,792,847 ! Patente de E.U.A. No. 5,223,618 Patente de E.U.A. No. 5,470,967 Patente de E.U.A. No. 5,378,825 i | Patente de E.U.A. No. 5,777,092 i Patente de E.U.A. No. 5,623,070 I ' Patente de E.U.A. No. 5,610,289 ¡ Patente de E.U.A. No. 5,602,240 i Patente de E.U.A. No. 5,858,988 i Patente de E.U.A. No. 5,214,136 Patente de E.U.A. No. 5,700,922 í Patente de E.U.A. No. 5,708,154 ' Patente de E.U.A. No. 5,786,461 | Patente de E.U.A. No. 5891 ,625 Patente de E.U.A. No. 5,773,571 I Patente de E.U.A. No. 5,766,855 Patente de E.U.A. No. 5,736,336 Patente de E.U.A. No. 5,719,262 Patente de E.U.A. No. 5,714,331 Patente de E.U.A. No. 5,539,082 Patente de E.U.A. No. 5,766,855 Patente de E.U.A. No. 5,719,262 [ Patente de E.U.A. No. 5,714,331 Patente de E.U.A. No. 5,736,336 Documento WO 92/20702 i Publicaciones i Benson, G. 1999. Tándem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res. 27: 573-580. I I i Benz, I. y M. A. Schmidt. 2002. Never say never again: protein i glycosylation in pathogenic bacteria. Mol. Microbiol. 45: 267-276. Breitschwerdt, E. B., B. C. Hegarty y S. I. Hancock. 1998.

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; Zhang, J. Z., J. W. McBride y X. J. Yu. 2003. L-selectin and E- ? selectin expressed on monocytes mediating Ehriichia chaffeensis attachment onto host cells. FEMS Microbiol. Lett. 227: 303-309. | Aunque la presente invención y sus ventajas se han descrito en 5¡ detalle, debe entenderse que varios cambios, sustituciones y alteraciones i i pueden hacerse en la misma, sin que se aparten del espíritu y alcance de la ¡ invención como se define mediante las reivindicaciones anexas. Además, no i I se pretende que el alcance de la presente solicitud se limite a las modalidades ¡ particulares del procedimiento, máquina, fabricación, composición de materia, ? medios, métodos y pasos descritos en la especificación. Como el experto en la técnica apreciará fácilmente a partir de la descripción de la presente invención, procedimientos, máquinas, fabricación, composiciones de materia, medios, métodos o pasos, actualmente existentes o que se desarrollarán i ' después, que realicen sustancialmente la misma función o que logren 5 sustancialmente el mismo resultado que las modalidades correspondientes descritas en la presente, pueden usarse de conformidad con la presente invención. Por consiguiente, se pretende que las reivindicaciones anexas incluyan dentro de su alcance dichos procedimientos, máquinas, fabricación, composiciones de materia, medios, métodos o pasos.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición aislada que comprende una glucoproteína gp36 o gp47 de Ehriichia, que comprende: (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 ; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69; o (c) una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a una o más secuencias en (a) o (b).

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también es una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica a una o más secuencias en (a) o (b).

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también es una secuencia que es por lo menos aproximadamente 90% idéntica a una o más secuencias en (a) o (b).

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque también comprende SEQ ID NO: 22.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque también comprende una o más de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 51.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende dos o más porciones de carbohidrato.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también está comprendida en una composición farmacéutica adecuada como una vacuna.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadaademás porque está codificada por un polinucleótido que comprende: (a) un polinucleótído seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60; (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68; (c) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico a un polínucleótido de (a) o (b), y que codifica para un polipéptído gp36 y gp47 inmunorreactivo de E. canis; o (d) un polinucleótido que hibrida con uno o más polinucleótidos de (a), (b) o (c) bajo condiciones severas.

12.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el polinucleótido de (c) es por lo menos aproximadamente 80% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y codifica para un polipéptído gp36 y gp47 inmunorreactivo de E canis.

13.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el polinucleótido de (c) es por lo menos aproximadamente 90% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y codifica para un polipéptido gp36 y gp47 inmunorreactivo de E. canis.

14.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque está comprendido en un vector.

15.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el vector es un vector viral o un vector no viral.

16.- El polinucleótído de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector viral es un vector adenoviral, un vector retroviral, un vector lentiviral, un vector adenoasociado, un vector de virus del herpes, o un vector de virus de la vaccinia.

17.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector no viral es un plásmido.

18.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque está comprendido en un liposoma. I

19.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, l ! caracterizado además porque el vector comprende un promotor enlazado ! operablemente al polinucleótido.

20.- El polínucleótido de conformidad con la reivindicación 19, ! caracterizado además porque el promotor es operable en un procarionte, un eucarionte, o ambos. i |

21.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque está comprendido en un excipiente ¡ farmacéuticamente aceptable. i

22.- Un polinucleótído de Ehriichia aislado, que comprende: (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: : 56, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60; (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68; (c) un polinucleótido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico a un polinucleótido de (a) o (b), y que codifica para un polipéptído gp36 y gp47 inmunorreactivo de E. canis; o (d) un polinucleótído que híbrida con uno o más polinucleótidos de (a), (b) o (c) bajo condiciones severas.

23.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque está comprendido en un vector.

24.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23, ' caracterizado además porque el vector es un vector viral o un vector no viral. !

25.- El polínucleótido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el vector viral es un vector adenoviral, un vector 1 retroviral, un vector lentiviral, un vector adenoasociado, un vector de virus del I 1 herpes, o un vector de virus de la vaccinia.

26.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 24, ' caracterizado además porque el vector no viral es un plásmido.

27.- El polínucleótido de conformidad con la reivindicación 22, | caracterizado además porque está comprendido en un liposoma. 1

28.- El polínucleótido de conformidad con la reivindicación 23, i ¡ caracterizado además porque el vector comprende un promotor enlazado operablemente al polinucleótido.

29.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el promotor es operable en un procarionte, un eucarionte, o ambos.

30.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22, 1 caracterizado además porque está comprendido en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

31.- Un anticuerpo aislado que reacciona inmunológicamente con un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

32.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, está comprendido en antisueros policlonales, o es un fragmento de anticuerpo.

33.- El uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 para preparar una vacuna útil para inducir una respuesta inmune en un individuo.

34.- El uso del polipéptído de conformidad con la reivindicación 1 para preparar una vacuna útil para inhibir la infección por E canis o E. chaffeensis en un sujeto.

35.- Un método para identificar una infección por E canis o E. chaffeensis en un individuo, que comprende los pasos de: proveer una muestra del individuo; y poner a prueba la muestra para un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 31.