BRPI0611820B1

BRPI0611820B1 - Método de identificar uma infecção por e. canis ou e. chaffeensis

Info

Publication number: BRPI0611820B1
Application number: BRPI0611820-8A
Authority: BR
Inventors: Jere W. Mcbride; Christopher Kuyler Doyle
Original assignee: Research Development Foundation
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2020-09-15
Also published as: WO2006138509A3; US20200199205A1; US20170204168A1; BRPI0611820A2; CA2612302A1; WO2006138509A2; US20160084836A1; BRPI0611820B8; MX2007016189A; CA2612302C; US20140127721A1; US9645148B2; USRE46254E1; US11459379B2; US20100183654A1; US8591906B2; US9140702B2; EP1891095A2

Abstract

composição isolada, polinucleotídeo e anticorpo isolado. a presente invenção refere-se a composições imunorreativas de gp36 para e. anis e composições irrunorreativas de gp47 para e. chaffeensis. em particular, epítopos para gp36 de e. canis e gp47 de e. chaffeensis são divulgados. em certas modalidades, as composições imunorreativas compreendem repetições em tandem tendo porções de carboidrato.

Description

[0001] A presente invenção reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. Serial N° 60/691.058, depositado em 16 e Junho de 2005, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção diz respeito pelo menos aos campos de biologia molecular, biologia celular, patologia, e medicina, incluindo medicina veterinária. Em aspectos específicos, a presente invenção diz respeito a proteínas gp47 e gp36 imunorreativas em ehrlichia chaffeensis e e. Canis,respectivamente.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Ehrlichiae são bactérias gram-negativas obrigatoriamente intracelulares, transmitidas por carrapato que primariamente habitam dentro de vacúolos citoplasmáticos (no início endossomas) de fagócitos profissionais, incluindo macrófagos e neutrófilos. E. Canis causa erliquiose monocítica canina (eme), uma doença globalmente distribuída séria e algumas vezes fatal (troy e forrester, 1990). E. Chaffeensis causa eriquiose monocitotrópica humana (hme) nos estados unidos, uma doença emergente potencialmente letal em seres humanos, e também causa erliquiose suave a severa em animais caninos (breitschwerdt et al., 1998). A importância de e. Canis como um patógeno veterinário em combinação com a identificação recente de e. Chaffeensis como a causa de uma zoonose emergente transmitida por carrapato tem realçado a necessidade para diagnósticos e vacinas melhorados para erliquioses tanto veterinárias quanto humanas, e assim a necessidade para a identificação de proteínas imunorreativas.

[0004] Um subconjunto pequeno de proteínas expressadas por e. Canis e e. Chaffeensis reagem fortemente com anticorpos e são considerados serem proteínas imunorreativas principais (chen et al., 1997; chen et al., 1994; mcbride et al., 2003). Várias destas proteínas foram molecularmente caracterizadas, incluindo uma família de multigene de 200,140/120, e 28 kda de proteínas (mcbride et al., 2000a; ohashi et al,. 2001; ohashi et al., 1998a; ohashi et al., 1998b; reddy et al., 1998; yu et al., 1997; yu et al., 2000a; yu et al., 2000b), todas as quais são glicoproteínas (mcbride et al., 2003; mcbride et al., 2000; singu et al., 2005). Até recentemente, bactérias foram consideradas serem incapazes de glicosilação de proteína, mas numerosas glicoproteínas foram recentemente identificadas em várias bactérias patogênicas (tanto intracelulares quanto extracelulares), incluindo ehrlichia (benz e schmidt, 2002; mcbride et al., 2003; schmidt et al., 2003; upreti et al., 2003). Glicoproteínas em bactérias patogênicas que foram funcionalmente caracterizadas incluem adesinas, toxinas, e proteínas envolvidas na estabilidade estrutura principall ou mobilidade (upreti et al., 2003). Algumas glicoproteínas bacterianas são altamente imunogênicas, realçando um papel potencial no desenvolvimento de imunidade protetiva (benz e schmidt, 2002).

[0005] Várias glicoproteínas foram identificadas em ehrlichiaspp., incluindo proteínas expostas na superfície. A gp120 de e. Chaffeensis e gp140 de e. Canis são ortólogos de proteína de superfície imunorreativa principais que têm unidades de repetição com alto teor de serina e treonina, e estão envolvidos em ligação erliquial à célula hospedeira (popov et al., 2000). Os ortólogos de gp200 são as maiores proteínas imunorreativas principais de ehrlichiaspp. E são encontradas primariamente no citoplasma erliquial (mcbride et al., 2003). A família de multigene de p28/p30 de proteínas compreendem os constituintes principais da membrana externa e são considerados desempenhar um papel em diversidade antigênica de superfície e talvez evasão imune (ohashi et al., 1998; reddy etal., 1998; yu etal., 2000). A glicosilação e fosforilação das proteínas p28/p30 foi relatada em e. Chaffeensis (singu et al., 2005). Pelo menos alguma proteção em camundongos foi observada depois da imunização com p28/p30 recombinante (ohashi et al., 1998).

[0006] A expressão diferencial de antígenos erliquiais em células de carrapato e mamíferas foi relatada (singu et al., 2005). Antígenos erliquiais expressados no carrapato ou expressados logo depois da inoculação no hospedeiro são prováveis para serem reconhecidos mais cedo pela resposta imune do hospedeiro. A cinética da resposta do anticorpo que desenvolve para as proteínas imunorreativas principais de e. Canis foi investigada em cachorros experimentalmente infectados (mcbride et al., 2003). Duas proteínas, de aproximadamente 19 e 37 kda, foram descobertas evocar a resposta do anticorpo de fase aguda mais inicial, enquanto a resposta do anticorpo às proteínas de membrana externa principais p28/p30 assim como outras desenvolveu- se duas semanas mas tarde. Um total de oito proteínas imunorreativas principais foram reconhecidas por anticorpos em soros convalescentes seis semanas depois da inoculação (mcbride et al., 2003).

[0007] A presente invenção satisfaz uma necessidade na técnica fornecendo-se novos métodos e composições com respeito a infecções erliquiais em mamíferos.

Sumário da invenção

[0008] A erliquiose monocítica canina é um doença globalmente distribuída transmitida por carrapato causada pela bactéria intracelular obrigatória e. Canis e é um modelo útil para entender mecanismos imunes e patogênicos de e. Chaffeensis, o agente causador de erliquiose monocitotrópica humana. Em geral, a presente invenção diz respeito a composições imunogênicas erliquiais, incluindo antígenos imunoprotetivos como vacinas para doenças erliquiais, tais como vacinas subunitárias, por exemplo. A composição imunogênica pode ser utilizada por qualquer mamífero, incluindo, por exemplo, seres humanos, cachorros, gatos, cavalos, porcos, cabras, ou ovelha.

[0009] Em particular, a presente invenção diz respeito à identificação do terceiro par de ortólogos de glicoproteína imunorreativa molecular e antigenicamente divergentes principais de e. Canis (36-kd) e e. Chaffeensis (47-kd). Estas glicoproteínas têm unidades de repetição em tandem que compreendem epítopos de célula b principais com determinantes de carboidrato, que contribuem substancialmente para a imunorreatividade destas proteínas. A expressão diferencial destes glicoproteínas foi observada apenas em formas morfológicas de núcleo denso da bactéria, e a gp36 e gp47 são expostas na superfície e secretadas extracelularmente, em certos aspectos da invenção.

[00010] Especificamente, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de 36 kda imunorreativa principal de e. Canis foi identificado por uma triagem de biblioteca genômica. Proteína recombinante reagiu fortemente com soros de cachorros imunes, migrou mais do que prognosticado por sds-page, e carboidrato foi detectado, demonstrando que a proteína foi glicosilada. O ortólogo gp47 de e. Chaffeensis foi descoberto por blast que investiga sua seqüência de genoma, e proteína recombinante exibiu características similares. A microscopia imunoeletrônica determinou que gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis foram expressadas na superfície das formas infecciosas de núcleo denso das bactérias, mas não as formas reticuladas metabolicamente ativas. O polinucleotídeo que codifica gp36 de e. Canis contém seis repetições em tandem que codificam nove aminoácidos, e pelo menos algumas das serinas e treoninas nas repetições em tandem são sítios de glicosilação, em modalidades específicas da invenção. Uma única unidade de repetição expressada como uma proteína de fusão foi suficiente para a glicosilação e reconhecimento por soro de cachorro imune. Em modalidades específicas desta invenção, estas modificações fornecem suporte para imunogenicidade e função da proteína. Porelisa, por exemplo, peptídeo sintético da repetição de 9-mer sem modificação pós traducional não foi reconhecido por anti-soro contra e. Canis, e tratamento com periodato da proteína de fusão para modificar estrutura principais de carboidrato reduziu significantemente a ligação de anticorpo.

[00011] Assim, em modalidades da invenção novos ortólogos de proteína imunorreativos principais de e. Canis e e. Chaffeensis foram identificados que são glicoproteínas diferencialmente expressadas com repetições em tandem. Os região de repetição de gp36 de e. Canis de nove aminoácidos é um epítopo de anticorpo que requer carboidrato para reconhecimento, em aspectos particulares da invenção. A presente invenção fornece a primeira demonstração de dependência de glicosilação para o reconhecimento de anticorpo de uma proteína erliquial e que a e. Coli pode modificar proteínas em uma maneira similar a ehrlichia.

[00012] Além disso, resíduos de ácido na região de repetição também afetaram a mobilidade, um consenso que, em aspectos específicos da invenção, diz respeito a estas proteínas como sendo modificada nos sítios "yin-yang" com fosforilação além de glicosilação. A proteína semelhante à mucina de e. Ruminantium foi recentemente descrita para agir como uma adesina para células de carrapato. Em modalidades específicas, as modificações pós traducionais contribuem para a imunogenicidade de proteína assim como função de adesina, tornando as proteínas semelhante à mucina úteis para vacinas subunitárias erliquiais. O tratamento com periodato da proteína de fusão para modificar estrutura principais de carboidrato reduziu a ligação de anticorpo, demonstrando dependência parcial da glicosilação para o reconhecimento.

[00013] Em aspectos específicos da presente invenção, existem composições de polipeptídeo erliquiais (ou composições de polinucleotídeo que codificam todas ou parte delas) com uma ou mais das características seguintes: 1) compreende uma ou mais porções de carboidrato, que em modalidades específicas compreendem parte de um determinante de epítopo; 2) compreende cerca de quatro a cerca de dezesseis repetições em tandem, embora menos ou mais do que esta faixa podem estar presentes; 3) compreende uma ou mais porções, tais como um epítopo, que são imunogenicamente específicas de espécie; 4) é liberada extracelularmente, tal como por secreção; 5) compreende epítopos de célula b principais; 6) é exposta na superfície; 7) é associada com as formas infecciosas de núcleo denso de ehrlichiae, tal como na superfície, por exemplo; 8) é associada com membranas de mórula (organismos ehrlichiae formam microcolônias dentro de vacúolos celulares (mórulas) que abrigam muitas ehrlichiae individuais) compreendendo formas de núcleo denso; 9) compreende atividade do fator de virulência; e 10) compreende atividade de adesina. Em outros aspectos, composições de polipeptídeo recombinantes da presente invenção são capazes de serem glicosiladas em uma célula à qual ela não é nativa, tal como uma célula de e. Coli, por exemplo. O polipeptídeo recombinante depois pode ser utilizado como uma composição imunogênica, incluindo, por exemplo, uma vacina.

[00014] Em modalidades particulares da invenção, existem composições imunogênicas de e. Canis que compreendem uma seqüência de aminoácido que é imunogênica, e em outras modalidades particulares, a imunogenicidade é caracterizada por ser pelo menos parte de um epítopo. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido compreende pelo menos parte de uma composição de vacina contra um organismo erliquial, tal como e. Canis. Em modalidades específicas, a seqüência de aminoácido compreende serinas, treoninas, ou, opcionalmente, alanina, prolina, valina, e/ou ácido glutâmico; em modalidades adicionais, a seqüência de aminoácido é glicosilada. Em outras modalidades específicas, a seqüência de aminoácido compreende parte ou toda a seqüência exemplar seguinte: tedsvsapa (seq id no: 22). Em outras modalidades, a composição imunogênica de e. Canis compreende parte ou todas as seq id no: 37, seq id no: 38, seq id no: 39 exemplares, ou misturas destes. Em outras modalidades, a composição imunogênica de e. Canis é codificada por parte ou todas as seq id no: 32, seq id no: 33, ou seq id no: 34, por exemplo. Em modalidades adicionais, a seqüência de aminoácido é compreendida em um excipiente farmaceuticamente aceitável, que em alguns aspectos da invenção compreende um adjuvante.

[00015] Em modalidades particulares da invenção, existem composições imunogênicas de e. Chaffeensis que compreendem uma seqüência de aminoácido que é imunogênica, e em outras modalidades particulares, a imunogenicidade é caracterizada por ser pelo menos parte de um epítopo. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido compreende pelo menos parte de uma vacina contra um organismo erliquial, tal como e. Chaffeensis. Em modalidades específicas, a seqüência de aminoácido compreende serinas, treoninas, ou, opcionalmente, alanina, prolina, valina, e/ou ácido glutâmico; em modalidades adicionais a seqüência de aminoácido é glicosilada. Em outras modalidades específicas, a seqüência de aminoácido compreende parte ou todas as seqüências seguintes ou uma mistura destes: asvsegdavvnavsqetpa (seq id no: 23); e egnasepvvsqeaapvsesgdaanpvsssenas (seq id no: 24); estas seqüências exemplares foram identificadas em cepas de e. Chaffeensis diferentes. Outras seqüências de e. Chaffeensis podem ser identificadas a seguir do seqüenciamento de gp47 em outras cepas; cepas de e. Chaffeensis adicionais são testadas, incluindo 91he17, jax, st. Vincent, sapulpa, e v1-v8, por exemplo. Em outras modalidades, a composição imunogênica de e. Chaffeensiscompreende parte ou todas as seq id no: 40, seq id no: 41, ou misturas destes. Em modalidades adicionais, as composições imunogênicas de e. Chaffeensis são codificadas por parte ou todas as seq id no: 35 ou seq id no: 36, por exemplo. Em modalidades adicionais, a seqüência de aminoácido é compreendida em um excipiente farmaceuticamente aceitável, que em alguns aspectos da invenção compreende um adjuvante.

[00016] Em certas modalidades da presente invenção, existem composições de e. Canis de gp36 imunogênicas, e seqüências particulares das composições de gp36 podem comunicar sua imunogenicidade; por exemplo, uma região da composição de gp36 pode compreender um epítopo. Em modalidades particulares, um ou mais epítopos em uma composição de gp36 estão localizados no término c de um polipeptídeo de gp36. Em alguns aspectos da invenção, cepas de e. Canis múltiplas diferentes compreendem composições de gp36 imunogênicas, e existe identidade de seqüência significante entre as cepas em regiões das composições de gp36 que compreendem o epítopo (tal como maior do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 98 %, por exemplo). Entretanto, em algumas modalidades, pode haver identidade de seqüência significante entre as cepas em regiões das composições de gp36 que não compreendem o epítopo. Em aspectos particulares da invenção, existe uma composição de gp36 que é imunogênica para mais do que uma cepa de e. Canis, incluindo, por exemplo, north Carolina (jake), Oklahoma, e north Carolina (demon.) Outras cepas de e. Canis que podem compreender uma composição imunogênica de gp36 incluem north Carolina (dj), north Carolina (fuzzy), louisiana, florida, e em aspectos particulares o epítopo das outras cepas é seq id no: 22, embora outros epítopos também possam ser identificados. Em modalidades em que um epítopo de e. Canis gp36 alternativo para seq id no: 22 é identificado, pode ser fornecida uma composição imunogênica compreendendo uma mistura de epítopos de e. Canis gp36, tais como uma mistura incluindo seq id no: 22, por exemplo.

[00017] Em certas modalidades da presente invenção, existem composições de e. Chaffeensis de gp47 imunogênicas, e seqüências particulares das composições de gp47 podem comunicar sua imunogenicidade; por exemplo, uma região da composição de gp47 pode compreender um epítopo. Em modalidades particulares, um ou mais epítopos em uma composição de gp47 estão localizados no término c de um polipeptídeo de gp47. Em alguns aspectos da invenção, cepas de e. Chaffeensis múltiplas diferentes compreendem composições de gp47 imunogênicas, e existe identidade de seqüência significante entre as cepas em regiões das composições de gp47 que compreendem o epítopo (tal como maior do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 98 %, por exemplo). Entretanto, em algumas modalidades, pode haver identidade de seqüência significante entre as cepas em regiões das composições de gp47 que não compreendem o epítopo. Em modalidades adicionais, pode não haver identidade de seqüência significante entre as diferentes cepas em regiões das composições de gp47 que compreendem um epítopo. Assim, pode ser fornecido uma composição imunogênica compreendendo uma mistura de epítopos de e. Chaffeensis de gp47, tal como uma mistura incluindo seq id no: 23 e/ou seq id no: 24, por exemplo. Entretanto, em aspectos particulares da invenção, existe uma composição de gp47 que é imunogênica para mais do que uma cepa de e. Chaffeensis.

[00018] Em certas modalidades da invenção, composições imunogênicas de e. Canis e e. Chaffeensis compreendem uma ou mais porções de carboidrato. Em aspectos particulares, as porções de carboidrato facilitam a natureza imunogênica da composição. Em modalidades específicas, a porção de carboidrato é necessária para a imunogenicidade, enquanto que em modalidades alternativas a porção de carboidrato realça a imunogenicidade. A porção de carboidrato pode ser de qualquer tipo, contanto que ela seja adequada para permitir ou realçar a imunogenicidade. A identidade de uma porção de carboidrato pode ser determinada por quaisquer meios adequados na técnica, embora em aspectos particulares uma enzima que cliva carboidratos particulares de polipeptídeos ou peptídeos, seguido por análise do carboidrato clivado, por exemplo com espectroscopia de massa, pode ser utilizado. Em outros meios, o carboidrato é removido e analisado com uma variedade de lectinas, que são conhecidas ligar açucares específicos.

[00019] Em modalidades específicas da invenção, uma ou mais porções de carboidrato na glicoproteína são identificadas por método(s) adequado(s) na técnica, por exemplo cromatografia gasosa/ espectrometria de massa.

[00020] Em uma modalidade da invenção, existe uma glicoproteína de e. Canis de gp36 imunogênica. Em uma outra modalidade da invenção, existe uma glicoproteína de e. Chaffeensis de gp47 imunogênica. Em uma modalidade adicional da invenção, existe uma composição de e. Canis compreendendo seq id no: 22. Em aspectos específicos da invenção, a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser definida ainda como compreendendo uma ou mais porções de carboidrato, como compreendendo parte ou todo um epítopo, e/ou como um vacina, tal como uma vacina subunitária.

[00021] Em uma modalidade adicional da invenção, existe uma composição de e. Chaffeensis compreendendo seq id no: 23. Em uma modalidade específica, a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser definida ainda como compreendendo uma ou mais porções de carboidrato, como compreendendo parte ou todo um epítopo, e/ou como uma vacina, tal como uma vacina subunitária.

[00022] Em uma outra modalidade da invenção, existe uma composição de e. Chaffeensis compreendendo seq id no: 24. Em uma modalidade específica, a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser definida ainda como compreendendo uma ou mais porções de carboidrato, como compreendendo parte ou todo um epítopo, e/ou como uma vacina, tal como uma vacina subunitária.

[00023] Em uma outra modalidade da invenção, existe uma composição de e. Canis compreendendo um polipeptídeo codificado por pelo menos parte do polinucleotídeo da seq id no: 32; uma composição de e. Canis compreendendo um polipeptídeo codificado por pelo menos parte do polinucleotídeo da seq id no: 33; uma composição de e. Canis compreendendo um polipeptídeo codificado por pelo menos parte do polinucleotídeo da seq id no: 34; uma composição de e. Chaffeensis compreendendo um polipeptídeo codificado por pelo menos parte do polinucleotídeo da seq id no: 35; ou uma composição de e. Chaffeensis compreendendo um polipeptídeo codificado por pelo menos parte do polinucleotídeo da seq id no: 36.

[00024] Em uma modalidade específica, existe um polinucleotídeo isolado que codifica a seq id no: 22, um polinucleotídeo isolado que codifica a seq id no: 23, e polinucleotídeo isolado que codifica a seq id no: 24, um polinucleotídeo isolado da seq id no: 32, um polinucleotídeo isolado da seq id no: 33, um polinucleotídeo isolado da seq id no: 34, um polinucleotídeo isolado da seq id no: 35, e/ou um polinucleotídeo isolado da seq id no: 36.

[00025] Em modalidades particulares, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo: a) um polinucleotídeo que codifica a seq id no: 37; ou b) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 90 % idêntico ao polinucleotídeo de a) e que codifica um polipeptídeo de gp36 de e. Canis. Imunorreativo em uma modalidade específica, o polinucleotídeo é definido ainda como seq id no: 32.

[00026] Em uma outra modalidade da invenção, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo: a) um polinucleotídeo que codifica a seq id no: 38; ou b) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 90 % idêntico ao polinucleotídeo de a) e que codifica um polipeptídeo de gp36 de e. Canis. Imunorreativo em uma modalidade específica, o polinucleotídeo é definido ainda como seq id no: 33. Em aspectos adicionais da invenção, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo: a) um polinucleotídeo que codifica a seq id no: 39; ou b) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 90 % idêntico ao polinucleotídeo de a) e que codifica um polipeptídeo de gp36 de e. Canis. Imunorreativo em uma modalidade específica o polinucleotídeo é definido ainda como seq id no: 34.

[00027] Em uma modalidade particular adicional, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo: a) um polinucleotídeo que codifica a seq id no: 40; ou b) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 90 % idêntico ao polinucleotídeo de a) e que codifica um polipeptídeo de gp47 de e. Chaffeensis imunorreativo. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo é definido ainda como seq id no: 35.

[00028] Em uma outra modalidade particular, existe um polinucleotídeo isolado, compreendendo: a) um polinucleotídeo que codifica a seq id no: 41; ou b) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 90 % idêntico ao polinucleotídeo de a) e que codifica um polipeptídeo de gp47 de e. Chaffeensis imunorreativo. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo é definido ainda como seq id no: 36.

[00029] Polinucleotídeos da invenção podem ser compreendidos em um vetor, tal como um vetor virai ou um vetor não virai. Um vetor virai exemplar inclui um vetor adenoviral, um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adeno-associado, um vetor do vírus do hérpes, ou um vetor do vírus da vacínia. Em uma modalidade específica, o vetor não virai é um plasmídeo. Polinucleotídeos podem ser compreendidos em e/ou com lipossomos. Em um aspecto específico, vectores compreendem um promotor operavelmente ligado ao polinucleotídeo, tal como um operável em um procariota, um eucariota, ou ambos, por exemplo. Polinucleotídeos podem ser compreendidos em um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00030] Em uma modalidade adicional da invenção, existe um polipeptídeo isolado, compreendendo: a) seq id no: 22; ou b) um polipeptídeo de gp36 que é pelo menos cerca de 70 % idêntico a seq id no: 22 e que compreende atividade imunogênica. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo é compreendido em um excipiente farmaceuticamente aceitável, e/ou ele pode ser definido ainda como sendo compreendido em uma composição farmacêutica adequada como uma vacina.

[00031] Em um outro aspecto da invenção, existem anticorpos isolados que ligam um ou mais polipeptídeos da invenção. Anticorpos podem ser monoclonal, policlonal, ou fragmento de anticorpos, por exemplo.

[00032] Em uma modalidade adicional da invenção, existe um polipeptídeo isolado, compreendendo: a) seq id no: 23 ou seq id no: 24; ou b) um polipeptídeo de gp47 que é pelo menos cerca de 70 % idêntico a seq id no: 23 ou seq id no: 24 e que compreende atividade imunogênica. O polipeptídeo pode ser compreendido em um excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou pode ser definido ainda como sendo compreendido em uma composição farmacêutica adequada como uma vacina.

[00033] Em uma modalidade adicional da invenção, existe um método de fornecer resistência à infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis em um indivíduo, compreendendo a etapa de liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo gp36 ou gp47 respectivo da invenção ao indivíduo.

[00034] Em uma outra modalidade, existe um método de induzir uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a etapa de liberar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de gp36 ou gp47 da invenção. Em uma modalidade adicional da presente invenção, existe um método de inibir ou prevenir infecção por e. Canis em um paciente compreendendo as etapas de: identificar um paciente antes da exposição ou suspeito de ser exposto a ou infectado com e. Canis', e administrar um polipeptídeo da invenção em uma quantidade eficaz para inibir infecção por e. Canis.

[00035] Em um aspecto da presente invenção, existe um método de inibir ou prevenir infecção por e. Chaffensis em um paciente compreendendo as etapas de: identificar um paciente antes da exposição ou suspeito de ser exposto a ou infectado com e. Chaffeensis', e administrar um polipeptídeo da invenção em uma quantidade eficaz para inibir infecção por e. Chaffeensis. Em outros aspectos da invenção, existe um método de identificar uma infecção por e. Canis em um indivíduo, compreendendo as etapas de: fornecer uma amostra do indivíduo; e avaliar a amostra quanto a um anticorpo da invenção.

[00036] Em um aspecto adicional da invenção, existe um método de identificar uma infecção por e. Chaffeensis em um indivíduo, compreendendo as etapas de: fornecer uma amostra do indivíduo; e avaliar a amostra quanto a um anticorpo da invenção.

[00037] Em uma modalidade da invenção, existe uma composição isolada compreendendo uma glicoproteína gp36 ou gp47 de ehrlichia, compreendendo: (a) uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seq id no: 37, seq id no: 38, seq id no: 39, seq id no: 53; seq id no: 55, seq id no: 57, seq id no: 59, e seq id no: 61; (b) uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seq id no: 40, seq id no: 41, seq id no: 63, seq id no: 65, seq id no: 67, e seq id no: 69; ou (c) uma seqüência que é pelo menos cerca de 70 % idêntico a uma ou mais seqüências em (a) ou (b). A composição pode ser definida ainda como uma seqüência que é pelo menos cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, ou cerca de 95 % idêntica a uma ou mais seqüências em (a) ou (b).

[00038] A composição pode ser definida ainda como compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seq id no: 37, seq id no: 38, seq id no: 39, seq id no: 53; seq id no: 55, seq id no: 57, seq id no: 59, e seq id no: 61 e, opcionalmente, ela compreende ainda seq id no: 22. A composição também pode ser definida ainda como compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seq id no: 40, seq id no: 41, seq id no: 63, seq id no: 65, seq id no: 67, e seq id no: 69 e, opcionalmente, ela compreende ainda uma ou mais da seq id no: 23, seq id no: 24, ou seq id no: 51. A composição também pode ser definida ainda como sendo compreendida em um excipiente farmaceuticamente aceitável, como compreendendo duas ou mais porções de carboidrato, e/ou como sendo compreendida em uma composição farmacêutica adequada como uma vacina.

[00039] Em alguns aspectos da invenção a composição pode ser codificada por um polinucleotídeo compreendendo: (a) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em seq id no: 32, seq id no: 33, seq id no: 34, seq id no: 52, seq id no: 54, seq id no: 56, seq id no: 58, e seq id no: 60; (b) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em seq id no: 35, seq id no: 36, seq id no: 62, seq id no: 64, seq id no: 66, e seq id no: 68; (c) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 70 % idêntico a um polinucleotídeo de (a) ou (b) e codifica um polipeptídeo de gp36 ou gp47 de e. Canis imunorreativo; ou (d) um polinucleotídeo que hibridiza um ou mais polinucleotídeos de (a), (b), ou (c) sob condições severas. Em modalidades específicas da invenção, o polinucleotídeo de (c) é pelo menos cerca de 70 % idêntico, pelo menos cerca de 75 % idêntico, pelo menos cerca de 80 % idêntico, pelo menos cerca de 85 % idêntico, pelo menos cerca de 90 % idêntico, ou pelo menos cerca de 95 % idêntico a um polinucleotídeo de (a) ou (b) e codifica um polipeptídeo de gp36 ou gp47 de e. Canis imunorreativo.

[00040] Em uma outra modalidade da invenção, existe um polinucleotídeo isolado de ehrlichia,compreendendo: a) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em seq id no: 32, seq id no: 33, seq id no: 34, seq id no: 52, seq id no: 54, seq id no: 56, seq id no: 58, e seq id no: 60; (b) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em seq id no: 35, seq id no: 36, seq id no: 62, seq id no: 64, seq id no: 66, e seq id no: 68; (c) um polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 70 % idêntico, pelo menos cerca de 75 % idêntico, pelo menos cerca de 80 % idêntico, pelo menos cerca de 85 % idêntico, pelo menos cerca de 90 % idêntico, ou pelo menos cerca de 95 % idêntico a um polinucleotídeo de (a) ou (b) e codifica um polipeptídeo de gp36 ou gp47 de e. Canis imunorreativo; ou (d) um polinucleotídeo que hibridiza a um ou mais polinucleotídeos de (a), (b), ou (c) sob condições severas.

[00041] O polinucleotídeo pode ser compreendido em um vetor, tal como um vetor virai ou um vetor não virai, em que o vetor virai pode ser um vetor adenoviral, um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adeno-associado, um vetor do vírus do hérpes, ou um vetor do vírus da vacínia e em que o vetor não virai pode ser um plasmídeo. Em outros aspectos da invenção, o vetor compreende um promotor operavelmente ligado ao polinucleotídeo em que o promotor é operável em um procariota, um eucariota, ou ambos.. O polinucleotídeo da invenção pode ser compreendido em um lipossoma e/ou compreendido em um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00042] Em certos aspectos da invenção, existe um anticorpo isolado que reage imunologicamente a um polipeptídeo da invenção, e o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, pode ser compreendido em antissoros policlonais, ou pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo.

[00043] Em outras modalidades da invenção, existe um método de induzir uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a etapa de liberar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da invenção.

[00044] Em modalidades adicionais da invenção, existe um método de inibir infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis em um paciente compreendendo as etapas de: identificar um paciente antes da exposição ou suspeito de ser exposto a ou infectado com e. Canis ou e. Chaffeensis', e administrar o polipeptídeo da invenção em uma quantidade eficaz para inibir infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis. Em outras modalidades da invenção, existe um método de identificar uma infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis em um indivíduo, compreendendo as etapas de: fornecer uma amostra do indivíduo; e avaliar a amostra quanto a um anticorpo da invenção.

[00045] O precedente descreveu mais amplamente as características e vantagens técnicas da presente invenção de modo que a descrição detalhada da invenção que segue pode ser melhor entendida. Características e vantagens adicionais da invenção serão descritas em seguida que formam o assunto das reivindicações da invenção. Deve ser avaliado por aqueles habilitados na técnica que a concepção e modalidade específica divulgadas podem ser prontamente utilizadas como uma base para modificar ou designar outras estrutura principals para realizar os mesmos propósitos da presente invenção. Também deve ser entendido por aqueles habilitados na técnica que tais construções equivalentes não divergem do espírito e escopo da invenção como apresentadas nas reivindicações anexas. Acredita-se que novos aspectos que devem ser característicos da invenção, tanto como para sua organização quanto método de operação, juntamente com outros objetivos e vantagens serão melhor entendidos a partir da descrição seguinte quando considerados em combinação com as figuras anexas. Deve ser expressamente entendido, entretanto, que cada uma das figuras é fornecida para o propósito de ilustração e descrição apenas e não é intencionado como uma definição dos limites da presente invenção.

Breve descrição dos desenhos

[00046] Para um mais completo entendimento da presente invenção, referência é feita agora às descrições seguintes tomadas em combinação com os desenhos anexos.

[00047] A fig. 1 ilustra organização genética dos ortólogos "semelhantes à mucina" conhecidos de e. Canis e e. Chaffeensis. Barras brancas representam as regiões de repetição em tandem e as barras cinzas representam comprimento (pares de base) de regiões a montante ou a jusante das repetições em tandem. Cepas de e. Canis ilustradas incluem jake (ja), Oklahoma (ok), e demon (dem), e cepas de e. Chaffeensis incluem arkansas (ark) e sapulpa (sap).

[00048] As figs. 2a a 2b fornecem imunorreatividade e detecção de carboidrato de gp36 e gp47 recombinantes. Na fig. 2a, western immunoblot de gp36 recombinante reagiu com soro de cachorro anti-e. Canis (linha 1), e detecção de carboidrato (linha 2). Na fig. 2b, western immunoblot de gp47 recombinante reagiu com soro de cachorro anti-e. Chaffeensis (linha 1) e detecção de carboidrato (linha 2).

[00049] As figs. 3a a 3b mostram immunoblots de lisato de e. Canis ou e. Chaffeensis com composições diferentes. Na fig. 3a, existe western immunoblot de lisato de e. Caniscom gp36 com anti-gp36 recombinante (linha 1) e soro de cachorro anti-e. Canis (linha 2). Na fig. 3b, existe reatividade de lisato de e. Chaffeensis com soros de paciente hme (linhas 1 a 10), gp47 de anti-e. Chaffeensis recombinante, e soro de cachorro anti-e. Chaffeensis.

[00050] A fig. 4. Mostra respostas de anticorpo cinéticas para gp36 de e. Canis (dias 0, 14 e 56) de 15 cachorros (linhas 1 a 15) experimentalmente infectados com e. Canis.

[00051] As figs. 5a a 5c fornecem western immunoblot de controle de tioredoxina (figs. 5a, 5b, 5c, linha 1) e a proteína de fusão de repetição única de gp36 de e. Canis(9 aminoácidos) (figs. 5a, 5b, linha 2) sondada com anti-tioredoxina (painel a) e soro de cachorro anti-e. Canis(fig. 5b). Western immunoblot da proteína de fusão de repetição única de gp47 de e. Chaffeensis (19 aminoácidos) (fig. 5c, linha 2) sondada com soro de cachorro anti-e. Chaffeensis (fig. 5c).

[00052] As figs. 6a-6b mostram que western immunoblot de e. Canis de gp36 e e. Chaffeensis de gp47 reagiu com anticorpo homólogo e heterólogo. Gp36 de e. Canis nativa (linha 1), proteína recombinante de repetição única de gp36 (linha 2), gp47 de e. Chaffeensis nativa (linha 3) e proteína recombinante de repetição única de gp47 reagiram com anticorpo anti-gp36 recombinante (fig. 6a) e anti-gp47 recombinante (fig. 6b).

[00053] As figs. 7a a 7c mostram contribuição de glucanos para a reatividade do anticorpo de gp36 de cepa jake de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis como determinado por elisa. A fig. 7a mostra reatividades do anticorpo de gp36 de e. Canis recombinante não tratado e tratado com periodato com soro de cachorro anti-e. Canis (#2995). A fig. 7b mostra imunoreatividades dos peptídeos de fusão de repetição recombinante de gp36 de e. Canis contendo 9-mer, 12-mer, e 18-mer comparados àqueles de peptideos sintéticos aglicosilados. A fig. 7c mostra imunoreatividades do peptídeo de fusão de repetição de gp47 de e. Chaffeensis recombinante (19-mer) e peptídeo sintético aglicosilada com soro de cachorro anti-e. Chaffeensis (#2495). Od, densidade óptica

[00054] As figs. 8a a 8b mostram uma micrografia eletrônica rotulada com imunogold de gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis. Na fig. 8a, existe localização de gp36 em mórulas contendo as formas morfológicas reticuladas de e. Canis (r) ou as de núcleo denso (dc). Na fig. 8b, existe localização de gp47 em mórulas contendo as formas morfológicas reticuladas de e. Chaffeensis (r) ou as de núcleo denso (dc).

[00055] As figs. 9a a 9b mostram proteínas imunorreativas de e. Canis e e. Chaffeensis secretadas. Na fig. 9a, existe western imunoblot de sobrenadantes concentrados de dh82 infectado por e. Canis com soro de cachorro anti-e. Canis (linha 1) e gp36 anti-e. Canis recombinante (linha 2). Na fig. 9b, existe western imunoblot de sobrenadantes de células dh82 infectadas por e. Chaffeensis com soro de cachorro anti-e. Chaffeensis (linha 1) e com gp47 anti-e. Chaffeensis recombinante (linha 2).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO l.l. Definições

[00056] De acordo com convenção de lei de patente duradoura, as palavras "um" e "uma" quando usadas no presente relatório descritivo de acordo com a palavra compreendendo, incluindo as reivindicações, denotam "uma ou mais."algumas modalidades da invenção podem consistir de ou consistir essencialmente de um ou mais elementos, etapas do método, e/ou métodos da invenção. É considerado que qualquer método ou composição descrita aqui pode ser implementada com respeito a qualquer outro método ou composição descrita aqui.

[00057] O termo "adesina" como usado aqui refere-se a uma composição que medeia a adesão de uma bactéria a uma superfície, tal como para desempenhar um papel em patogênese. Em aspectos específicos da invenção, adesinas são antígenos de superfície bacteriana que freqüentemente existem na forma de projeções filamentosas (pêlos ou fímbrias, por exemplo) e ligam-se aos receptores de célula específicos, tais como aqueles em membranas de célula epitelial.

[00058] O termo "carboidrato"como usado aqui refere-se a uma composição compreendida de carbono, hidrogênio, e oxigênio, particularmente na razão de 2h:1c:1o. O termo inclui açucares, amidos, e celuloses, por exemplo.

[00059] O termo "epítopo" como usado aqui refere-se a um sítio de uma composição à qual um anticorpo específico liga-se.

[00060] O termo "glicano," que também pode ser referido como um "polissacarídeo," como usado aqui refere-se a um carboidrato que pode ser decomposto por hidrólise em dois ou mais monossacarídeos. Em outra palavras, pode ser referido como uma cadeia de açucares simples (derivados de aldeído ou cetona de um álcool poliidrico).

[00061] O termo "imunogênico" como usado aqui refere-se a uma composição que é capaz de provocar uma resposta imune contra ela.

[00062] O termo "resposta imune" como usado aqui refere-se à reação do sistema imune para a presença de um antígeno fabricando- se anticorpos para o antígeno. Em outras modalidades específicas, imunidade para o antígeno pode ser desenvolvida em um nível celular, pelo corpo como um todo, hipersensibilidade ao antígeno pode ser desenvolvida, e/ou tolerância pode ser desenvolvida, tal como de inoculação subsequente. Em modalidades específicas, uma resposta imune requer linfócitos que identificam uma molécula antigênica como estranha e que induzem a formação de anticorpos e linfócitos capazes de reagir com ela e que a tornam menos prejudicial.

[00063] O termo "imunorreativo" como usado aqui refere-se a uma composição sendo reativa com anticorpos dos soros de um indivíduo. Em modalidades específicas, uma composição é imunorreativa se um anticorpo a reconhece, tal como por ligação a ela.

[00064] O termo "mucina" como usado aqui refere-se a uma ou mais glicoproteínas altamente glicosiladas com n-acetilgalactosamina (galnac.)

[00065] O termo "ortólogo" como usado aqui refere-se a um polinucleotídeo de uma espécie que corresponde a um polinucleotídeo em uma outra espécie; os dois polinucleotídeos são relacionados através de uma espécie ancestral comum (um polinucleotídeo homólogo). Entretanto, o polinucleotídeo de uma espécie tem evolvido para tornar diferente do polinucleotídeo da outra espécie.

[00066] O termo "vacina subunitária" como usado aqui refere-se a uma vacina em que um polipeptídeo ou fragmento deste é utilizado, em oposição a um organismo inteiro.

[00067] O termo "vacina" como usado aqui refere-se a uma composição que fornece imunidade a um indivíduo na inoculação.

[00068] O termo "fator de virulência" como usado aqui refere-se a um ou mais produtos genéticos que permitem que um microorganismo se estabeleça em ou dentro de uma espécie de hospedeiro particular e realcem sua patogenicidade. Fatores de virulência exemplares incluem, por exemplo, proteínas de superfície celular que medeiam ligação bacteriana, carboidratos e proteínas de superfície celular que protegem uma bactéria, toxinas bacterianas, e enzimas hidrolíticas que podem contribuir para a patogenicidade da bactéria.

[00069] A prática da presente invenção utilizará, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, e assim por diante que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edição (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait Ed„ 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Ed., 1987), a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller e M. P. Calos eds. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D. M. Weir e C. C. Blackwell, Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, e K. Struhl, eds., 1987), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach e W. Strober, eds., 1991); ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY; assim como monografias em protocolos tais como ADVANCES IN IMMUNOLOGY. Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações mencionadas aqui, tanto supra quanto infra, são por meio desta incorporados aqui por referência.

II.II. A Presente Invenção

[00070] A presente invenção diz respeito a composições e métodos relacionados a proteínas de ehrlichiaspp. E os polinucleotídeos que as codificam. Em aspectos particulares da invenção, existem ortólogos de proteína imunorreativos principais diferencialmente expressados e secretados de e. Canis e e. Chaffeensis que evocam respostas iniciais do anticorpo aos epítopos em repetições em tandem glicosiladas. Especificamente, a presente invenção diz respeito a uma ou mais glicoproteínas de ehrlichia spp., em modalidades específicas. Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a uma glicoproteína de ehrlichiaspp. Que é uma proteína gp36. Em modalidades adicionais, a proteína gp36 é de e. Canis. Em modalidades adicionais, a presente invenção refere-se a uma glicoproteína de ehrlichia spp. Que é uma proteína gp47. Em modalidades adicionais, a proteína gp47 é de e. Chaffeensis.

[00071] Em aspectos específicos da invenção, duas proteínas imunorreativas principais de e. Canis, 36- e 19-kda, evocam a resposta do anticorpo detectável mais inicial durante a fase aguda de erliquiose monocítica canina. Genes que codificam a proteína de 36 kda imunorreativa principal de e. Canis e um ortólogo correspondente de e. Chaffeensis (47-kda) foram identificados, e sua imunorreatividade e expressão foram determinadas. Compatível com outras proteínas erliquiais imunorreativas, carboidrato foi detectado na gp36 e gp47 recombinante, e suas massas foram substancialmente maiores do que prognosticado (26,7- e 32,9-kda, respectivamente). Cada gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis têm unidades de repetição em tandem de terminal carbóxi (cerca de quatro a dezesseis repetições) que variaram em número e seqüências de aminoácido entre isolados diferentes. Epítopos de anticorpo específicos de específica de espécie foram identificados na repetição não homóloga de terminal c compreendendo regiões de gp36 e gp47, e unidades de repetição únicas recombinantes de ambos foram reconhecidas por anticorpo. Entretanto, uma unidade de repetição de peptídeo sintético homóloga de gp36 de e. Canis não foi imunorreativa, e tratamento com periodato do peptídeo imunorreativo recombinante substancialmente reduziu a reatividade de anticorpo, demonstrando que glicanos são determinantes de epítopo importantes que são estrutura principallmente conservados nas proteínas recombinantes expressadas em e. Coli. A gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis foram diferencialmente expressadas apenas na superfície de ehrlichiae de núcleo denso. Além disso, gp36 e gp47 foram detectadas nos sobrenadantes isentos de ehrlichia, indicando que estas proteínas são liberadas extracelularmente durante a infecção. Esta invenção diz respeito a estas glicoproteínas recentemente identificadas como composições imunogênicas, tais como vacinas, incluindo vacinas subunitárias, ou antígenos de imunodiagnóstico, por exemplo.

[00072] Algumas modalidades da presente invenção são dirigidas a um método de inibir infecção por e. Canis em um paciente compreendendo as etapas de identificar um paciente antes da exposição ou suspeito de estar exposto a ou infectado com e. Canis', e administrar uma composição compreendendo um antígeno de 36-kda de e. Canis em uma quantidade eficaz para inibir infecção por e. Canis. A inibição pode ocorrer através de quaisquer meios tais como por exemplo, a estimulação das respostas imunes humorais ou celulares do paciente, ou por outros meios tais como inibir a função normal do antígeno de 36-kda, ou mesmo competir com o antígeno pela interação com algum agente no corpo do paciente, ou uma combinação destes, por exemplo.

[00073] Algumas modalidades da presente invenção são dirigidas a um método de inibir infecção por e. Chaffeensis em um paciente compreendendo as etapas de identificar um paciente antes da exposição ou suspeito de estar exposto a ou infectado com e. Chaffeensis', e administrar uma composição compreendendo um antígeno de 47-kda de e. Chaffeensis em uma quantidade eficaz para inibir infecção por e. Chaffeensis. A inibição pode ocorrer através de quaisquer meios tais como por exemplo, a estimulação das respostas imunes humorais ou celulares do paciente, ou por outros meios tais como inibir a função normal do antígeno de 47-kda, ou mesmo competir com o antígeno pela interação com algum agente no corpo do paciente, ou uma combinação destes, por exemplo.

[00074] A presente invenção também é dirigida a um método de terapia alvejada a um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar um composto a um indivíduo, em que o composto tem uma porção de alvejamento e uma porção terapêutica, e em que a porção de alvejamento é específica para a proteína gp36. Em certos aspectos, a porção de alvejamento é um anticorpo específico para gp36 ou ligando ou domínio de ligação de ligando que liga gp36. Do mesmo modo, a porção terapêutica pode compreender um radioisótopo, uma toxina, um agente quimioterapêutico, um estimulante imune, um agente citotóxico, ou um antibiótico, por exemplo.

[00075] A presente invenção também é dirigida a um método de terapia alvejada a um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar um composto a um indivíduo, em que o composto tem uma porção de alvejamento e uma porção terapêutica, e em que a porção de alvejamento é específica para proteína gp47. Em certos aspectos, a porção de alvejamento é um anticorpo específica para gp47 ou ligando ou domínio de ligação de ligando que liga gp47. Do mesmo modo, a porção terapêutica pode compreender um radioisótopo, uma toxina, um agente quimioterapêutico, um estimulante imune, um agente citotóxico, ou um antibiótico, por exemplo.

[00076] Outras modalidades da presente invenção dizem respeito a diagnose de infecção erliquial em um mamífero avaliando-se uma amostra do mamífero, tal como sangue ou soro, por exemplo, para anticorpos para uma composição de gp36 (para e. Canis) ou para uma composição de gp47 (para e. Chaffeensis).

III. lii. Composições de aminoácido de qp36 de e. Canis e qp47 de e. Chaffeensis

[00077] A presente invenção considera um polipeptídeo compreendendo gp36 de e. Canis, gp47 de e. Chaffeensis, ou uma mistura destes. Visando brevidade, a seção seguinte se referirá a quaisquer composições de aminoácido de gp36 de e. Canis e/ou gp47 de e. Chaffeensis da presente invenção, incluindo polipeptídeos e peptideos.

[00078] Em modalidades particulares, existe uma seqüência de aminoácido, em que o polipeptídeo pode ser uma proteína recombinante ou ele pode ser isolado e/ou purificado da natureza, por exemplo. Em aspectos particulares, a seqüência de aminoácido é codificada por uma seqüência de ácido nucléico. O polipeptídeo é útil como um antígeno, em modalidades específicas.

[00079] A presente invenção também é dirigida a um método de produzir a proteína recombinante, compreendendo as etapas de obter um vetor que compreende uma construção de expressão compreendendo uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido operativamente ligada a um promotor; transfectando o vetor em uma célula; e cultivando a célula sob condições eficazes da construção de expressão. A seqüência de aminoácido pode ser gerada sinteticamente, em modalidades alternativas.

[00080] Por uma "proteína substancialmente pura" é significado uma proteína que foi separada de pelo menos alguns daqueles componentes que naturalmente a acompanham. Uma composição imunorreativa substancialmente pura pode ser obtida, por exemplo, por extração de uma fonte natural; por expressão de um ácido nucléico recombinante que codifica uma composição imunorreativa; ou sintetizando-se quimicamente a proteína, por exemplo. Conseqüentemente, proteínas substancialmente puras incluem proteínas procarióticas sintetizadas em e. Coli, outros procariotas, ou qualquer outro organismo em que elas não ocorrem naturalmente.

[00081] Assim, em certas modalidades, a presente invenção diz respeito a novas composições compreendendo pelo menos uma molécula proteinácea. Como usado aqui, uma "molécula proteinácea,""composição proteinácea,""composto proteináceo,""cadeia proteinácea" ou "material proteináceo" geralmente refere-se, mas não é limitado a, uma proteína de mais do que cerca de 200 aminoácidos ou a seqüência endógena de tamanho natural traduzida de um gene; um polipeptídeo de mais do que cerca de 100 aminoácidos; e/ou um peptídeo de cerca de 3 a cerca de 100 aminoácidos. Todos os termos "proteináceos" descritos acima podem ser usados permutavelmente aqui.

[00082] Em certas modalidades o tamanho de o pelo menos uma molécula proteinácea pode compreender, mas não é limitado a, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 51, cerca de 52, cerca de 53, cerca de 54, cerca de 55, cerca de 56, cerca de 57, cerca de 58, cerca de 59, cerca de 60, cerca de 61, cerca de 62, cerca de 63, cerca de 64, cerca de 65, cerca de 66, cerca de 67, cerca de 68, cerca de 69, cerca de 70, cerca de 71, cerca de 72, cerca de 73, cerca de 74, cerca de 75, cerca de 76, cerca de 77, cerca de 78, cerca de 79, cerca de 80, cerca de 81, cerca de 82, cerca de 83, cerca de 84, cerca de 85, cerca de 86, cerca de 87, cerca de 88, cerca de 89, cerca de 90, cerca de 91, cerca de 92, cerca de 93, cerca de 94, cerca de 95, cerca de 96, cerca de 97, cerca de 98, cerca de 99, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 400, cerca de 425, cerca de 450, cerca de 475, cerca de 500, cerca de 525, cerca de 550, cerca de 575, cerca de 600, cerca de 625, cerca de 650, cerca de 675, cerca de 700, cerca de 725, cerca de 750, cerca de 775, cerca de 800, cerca de 825, cerca de 850, cerca de 875, cerca de 900, cerca de 925, cerca de 950, cerca de 975, cerca de 1000, cerca de 1100, cerca de 1200, cerca de 1300, cerca de 1400, cerca de 1500, cerca de 1750, cerca de 2000, cerca de 2250, cerca de 2500 ou mais resíduos de aminoácido, e qualquer faixa derivável nestas.

[00083] Como usado aqui, uma "molécula de aminoácido"refere-se a qualquer polipeptídeo, derivado de polipeptídeo, ou polipeptídeo mimético como seria conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Em certas modalidades, os resíduos da molécula proteinácea são seqüenciais, sem nenhuma molécula que não de aminoácido interrompendo a seqüência de resíduos da molécula de aminoácido. Em outras modalidades, a seqüência pode compreender uma ou mais porções de molécula que não de amino. Em modalidades particulares, a seqüência de resíduos da molécula proteinácea pode ser interrompida por uma ou mais porções de molécula que não de amino.

[00084] Conseqüentemente, o termo "composição proteinácea" abrange seqüências de molécula de amino compreendendo pelo menos um dos 20 aminoácidos comuns em proteínas naturalmente sintetizadas, ou pelo menos um aminoácido modificado ou incomum, incluindo mas não limitado àqueles mostrados na Tabela 1 abaixo.

[00085] Em certas modalidades a composição proteinácea compreende pelo menos uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo. Em outras modalidades, a composição proteinácea compreende uma proteína biocompatível, polipeptídeo ou peptídeo. Como usado aqui, o termo "biocompatível"refere-se a uma substância que não produz nenhum efeito desagradável significante quando aplicada a, ou administrada a, um organismo dado de acordo com os métodos e quantidades descritas aqui. Tais efeitos desagradáveis ou indesejáveis são aqueles tais como toxicidade significante ou reações imunológicas adversas.

[00086] Composições proteináceas podem ser feitas por qualquer técnica conhecida àqueles de habilidade na técnica, incluindo a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas biológicas moleculares padrão, a isolamento de compostos proteináceos de fontes naturais, ou de síntese química de materiais proteináceos, por exemplo. As seqüências de nucleotídeo e proteína, polipeptídeo e peptídeo para vários genes foram previamente divulgados, e podem ser encontrados em bases de dados computadorizados conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Duas tais bases de dados são o national center for biotecnological information’s genbank and genpept databases, por exemplo. As regiões de compilação para estes genes conhecidos podem ser amplificadas e/ou expressadas usando as técnicas divulgadas aqui ou como seria conhecido àqueles de habilidade comum na técnica. Alternativamente, várias preparações comerciais de proteínas, polipeptídeos e peptídeos são conhecidas àqueles de habilidade na técnica.

[00087] Em certas modalidades um proteináceo composto pode ser purificado. Geralmente, "purificado" se referirá a um composição específica ou proteína, polipeptídeo, ou peptídeo que foi submetido a fracionamento para remover várias outra proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos, e que composição substancialmente retém sua atividade, como pode ser avaliado, por exemplo, pelos ensaios de proteína, como seria conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica para a proteína, polipeptídeo ou peptídeo específico ou desejado. Atividades exemplares que podem ser avaliadas para a retenção na composição proteinácea purificada são atividade e imunorreatividade de ligação a ferro.

[00088] Em modalidades específicas da presente invenção, um polipeptídeo é rotulado, e qualquer rótulo detectável é adequado na invenção. O rótulo pode ser ligado ao polipeptídeo no término n, no término c, ou em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido. Um ou mais rótulos podem ser utilizados. Rótulos exemplares incluíram rótulos redioativos, rótulos florescentes, rótulos colorimétricos, e assim por diante. Em modalidades específicas, o rótulo é covalentemente ligado ao polipeptídeo.

Iv. Composições de ácido nucléico de qp36 de e. Canis e qp47 de e. Chaffeensis

[00089] Certas modalidades da presente invenção dizem respeito a um ácido nucléico de gp36 de e. Canis e/ou um de gp47 de e. Chaffeensis. Visando brevidade, a seção seguinte se referirá a qualquer composições de ácido nucléico de gp36 de e. Canis e/ou gp47 de e. Chaffeensis da presente invenção.

[00090] Em certos aspectos, um ácido nucléico compreende um ácido nucléico do tipo selvagem ou um mutante. Em aspectos particulares, um ácido nucléico codifica ou compreende um ácido nucléico transcrito. Em outros aspectos, um ácido nucléico compreende um segmento de ácido nucléico, ou um equivalente biologicamente funcional deste. Em aspectos particulares, um ácido nucléico codifica uma proteína, polipeptídeo, peptídeo.

[00091] O termo "ácido nucléico" é bem-conhecido na técnica e pode ser usado permutavelmente aqui com o termo "polinucleotídeo". Um "ácido nucléico" como usado aqui geralmente se referirá a uma molécula (isto é, um filamento) de dna, rna ou um derivado ou análogo deste, compreendendo uma nucleobase. Uma nucleobase inclui, por exemplo, uma base de purina ou pirimidina que ocorre naturalmente encontrada em dna (por exemplo, uma adenina "a," uma guanina "g," uma timina "t" ou uma citosina "c") ou rna (por exemplo, uma a, um g, uma uracila "u" ou uma c). O termo "ácido nucléico" abrange os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo," todos como um subgênero do termo "ácido nucléico". O termo "oligonucleotídeo"refere-se a uma molécula entre cerca de 3 e cerca de 100 nucleobases em comprimento. O termo "polinucleotídeo"refere-se a pelo menos uma molécula de mais do que cerca de 100 nucleobases em comprimento.

[00092] Estas definições geralmente referem-se a uma molécula de filamento único, mas em modalidades específicas também abrangerão um filamento adicional que é parcial, substancial ou completamente complementar à molécula de filamento único. Assim, um ácido nucléico pode abranger uma molécula de filamento duplo ou uma molécula de filamento triplo que compreende um ou mais filamento(s) ou "complemento(s)" complementares de uma seqüência particular compreendendo uma molécula. Como usado aqui, um ácido nucléico de filamento único pode ser denotado pelo prefixo "ss," um ácido nucléico de filamento duplo pelo prefixo "ds," e um ácido nucléico de filamento triplo pelo prefixo "ts".

A. Nucleobases

[00093] Como usado aqui uma "nucleobase"refere-se a uma base heterocíclica, tal como por exemplo uma nucleobase que ocorre naturalmente (isto é, uma a, t, g, c ou u) encontrada em pelo menos um ácido nucléico que ocorre naturalmente (isto é, dna e rna), e derivado(s) que ocorrem naturalmente ou não naturalmente e análogos de uma tal nucleobase. Uma nucleobase geralmente pode formar uma ou mais ligações de hidrogênio ("recozer" ou "hibridizar") com pelo menos uma nucleobase que ocorre naturalmente em maneira que pode substituir no lugar do pareamento de nucleobase que ocorre naturalmente (por exemplo, a ligação de hidrogênio entre a e t, g e c, e a e u).

[00094] Nucleobase(s) de "purina" e/ou "pirimidina" abrangem nucleobases de purina e/ou pirimidina que ocorrem naturalmente e também derivado(s) e análogo(s) destes, incluindo mas não limitados, àqueles uma purina ou pirimidina substituída por um ou mais de uma porção alquila, carboxialquila, amino, hidroxila, halógena (isto é, flúor, cloro, bromo, ou iodo), tiol ou alquiltiol. Porções alquila preferidas (por exemplo, alquila, caboxialquila, etc.) Compreendem de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, a cerca de 6 átomos de carbono. Outros exemplos não limitantes de uma purina ou pirimidina incluem uma desazapurina, uma 2,6-diaminopurina, uma 5- fluorouracila, uma xantina, uma hipoxantina, uma 8-bromoguanina, uma 8-cloroguanina, uma bromotimina, uma 8-aminoguanina, uma 8- hidroxiguanina, uma 8-metilguanina, uma 8-tioguanina, uma azaguanina, uma 2-aminopurina, uma 5-etilcitosina, uma 5- metilcitosina, uma 5-bromouracila, uma 5-etiluracila, uma 5-iodouracila, uma 5-clorouracila, uma 5-propiluracila, uma tiouracila, uma 2- metiladenina, uma metiltioadenina, uma n,n-diemetiladenina, uma azaadenina, uma 8-bromoadenina, uma 8-hidroxiadenina, uma 6- hidroxiaminopurina, uma 6-tiopurina, uma 4-(6-aminohexil/citosina), e semelhantes.

[00095] Uma nucleobase pode estar compreendida em um nucleosídeo ou nucleotídeo, usando qualquer método de síntese química ou natural descrito aqui ou conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica.

B. Nucleosídeos

[00096] Como usado aqui, um "nucleosídeo" refere-se a uma unidade química individual compreendendo uma nucleobase covalentemente ligada a uma porção ligante de nucleobase. Um exemplo não limitante de uma "porção ligante de nucleobase" é um açúcar compreendendo 5 átomos de carbono (isto é, um "açúcar de 5 carbonos"), incluindo mas não limitados a uma desoxiribose, uma ribose, uma arabinose, ou um derivado ou um análogo de um açúcar de 5 carbonos. Exemplos não limitantes de um derivado ou um análogo de um açúcar de 5 carbonos incluem um 2’-fluoro-2’-desoxiribose ou um açúcar carbocíclico onde um carbono é substituído no lugar de um átomo de oxigênio no anel de açúcar.

[00097] Tipos diferentes de ligação(ões) covalente(s) de uma nucleobase a uma porção ligante de nucleobase são conhecidos na técnica. Por via de exemplo não limitante, um nucleosídeo compreendendo uma purina (isto é, a ou g) ou uma nucleobase de 7- desazapurina tipicamente liga covalentemente a posição 9 de uma purina ou uma 7-desazapurina à posição 1 ’ de um açúcar de 5 carbonos. Em um outro exemplo não limitante, um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase de pirimidina (isto é, c, t ou u) tipicamente liga covalentemente uma posição 1 de uma pirimidina a uma posição T de um açúcar de 5 carbonos (Kornberg e baker, 1992).

C. Nucleotídeos

[00098] Como usado aqui, um "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo compreendendo ainda uma "porção de estrutura principal". Uma porção de estrutura principal geralmente liga covalentemente um nucleotídeo a uma outra molécula compreendendo um nucleotídeo, ou a um outro nucleotídeo para formar um ácido nucléico. A "porção de estrutura principal" em nucleotídeos que ocorrem naturalmente tipicamente compreende uma porção de fósforo, que é covalentemente ligada a um açúcar de 5 carbonos. A ligação da porção de estrutura principal tipicamente ocorre na posição 3’ ou 5’ do açúcar de 5 carbonos. Entretanto, outros tipos de ligações são conhecidos na técnica, particularmente quando um nucleotídeo compreende derivados ou análogos de um açúcar de 5 carbonos que ocorre naturalmente ou porção de fósforo.

D. Análogos de ácido nucléico

[00099] Um ácido nucléico pode compreender, ou ser composto inteiramente de, um derivado ou análogo de uma nucleobase, uma porção ligante de nucleobase e/ou porção de estrutura principal que pode estar presente em um ácido nucléico que ocorre naturalmente. Como usado aqui um "derivado"refere-se a uma forma quimicamente modificada ou alterada de uma molécula que ocorre naturalmente, enquanto os termos "mímico" ou "análogo"referem-se a uma molécula que pode assemelhar-se estrutura principallmente ou não a uma molécula ou porção que ocorre naturalmente, mas possui funções similares. Como usado aqui, uma "porção" geralmente refere-se a um componente químico ou molecular menor de uma estrutura principal química ou molecular maior. Análogos ou derivados de nucleobase, nucleosídeo e nucleotídeo são bem-conhecidos na técnica, e foram descritos (ver por exemplo, scheit, 1980, incorporado aqui por referência).

[000100] Exemplos não limitantes adicionais de nucleosídeos, nucleotídeos ou ácidos nucléicos compreendendo derivados ou análogos de açúcar de 5 carbonos e/ou porção de estrutura principal, incluem aqueles na patente u.s. N° 5.681.947 que descreve oligonucleotídeos compreendendo derivados de purina que formam hélices triplas com e/ou impedem a expressão de dsdna; patentes u.s. 5.652.099 e 5.763.167 que descrevem ácidos nucléicos que incorporam análogos fluorescentes de nucleosídeos encontrados em dna ou rna, particularmente para o uso como sondas de ácidos nucléicos flourescentes; patente u.s. 5.614.617 que descreve análogos de oligonucleotídeo com substituições em anéis de pirimidina que possuem estabilidade de nuclease realçada; patentes u.s. 5.670.663, 5.872.232 e 5.859.221 que descrevem análogos de oligonucleotídeo com açúcares de 5 carbonos modificados (isto é, porções de 2’- desoxifuranosila modificadas) usados em detecção de ácido nucléico; patente u.s. 5.446.137 que descreve oligonucleotídeos compreendendo pelo menos uma porção de açúcar de 5 carbonos substituída na posição 4’ com um substituinte outro que não hidrogênio que pode ser usado em ensaios de hibridização; patente u.s. 5.886.165 que descreve oligonucleotídeos tanto com desoxiribonucleotídeos com ligações de internucleotídeo 3’-5’ quanto com ribonucleotídeos com ligações de internucleotídeo 2’-5’; patente u.s. 5.714.606 que descreve uma ligação de internucleotídeo modificada em que um oxigênio de posição 3’ da ligação de internucleotídeo é substituído por um carbono para realçar a resistência à nuclease de ácidos nucléicos; patente u.s. 5.672.697 que descreve oligonucleotídeos contendo uma ou mais ligações de internucleotídeo de fosfonato de metileno 5’ que realçam resistência à nuclease; patentes u.s. 5.466.786 e 5.792.847 que descrevem a ligação de uma porção substituinte que pode compreender um medicamento ou rótulo ao carbono 2’ de um oligonucleotídeo para fornecer estabilidade de nuclease realçada e capacidade para liberar medicamentos ou porções de detecção; patente u.s. 5.223.618 que descreve análogos de oligonucleotídeo com uma ligação de estrutura principal 2 ou 3 carbonos que liga a posição 4’ e posição 3’ da porção de açúcar de 5 carbonos adjacente para a captação celular realçada, resistência a nucleases e hibridização a rna alvo; patente u.s. 5.470.967 que descreve oligonucleotídeos compreendendo pelo menos uma ligação de internucleotídeo de sulfamato ou sulfamida que são úteis como sonda de hibridização de ácido nucléico; patentes u.s. 5.378.825, 5.777.092, 5.623.070, 5.610.289 e 5.602.240 que descrevem oligonucleotídeos com três ou quatro porções ligadoras de átomo substituindo a porção de estrutura principal de fosfodiéster usada para resistência à nuclease melhorada, captação celular e regulando a expressão de rna; patente u.s. 5.858.988 que descreve agente portador hidrofóbico ligado à posição 2’-o de oligonuceotides para realçar sua permeabilidade e estabilidade de membrana; patente u.s. 5.214.136 que descreve olignucleotídeos conjugados à antraquinona no término 5’ que possuem hibridização realçada ao dna ou rna; estabilidade realçada para nucleases; patente u.s. 5.700.922 que descreve quimeras de pna-dna- pna em que o dna compreende nucleotídeos de 2’-desóxi-eritro- pentofuranosila para a resistência realçada à nuclease, afinidade de ligação, e capacidade para ativar rnase h; e patente u.s. 5.708.154 que descreve rna ligado a um dna para formar um híbrido de dna-rna.

E. Ácidos nucléicos de poliéter e peptídeo

[000101] Em certas modalidades, é considerado que um ácido nucléico compreendendo um derivado ou análogo de um nucleosídeo ou nucleotídeo pode ser usado nos métodos e composições da invenção. Um exemplo não limitante é um "ácido nucléico de poliéter", descrito na patente u.s. Serial n° 5.908.845, incorporada aqui por referência. Em um ácido nucléico de poliéter, uma ou mais nucleobases são ligadas a átomos de carbono quirais em uma estrutura principal de poliéter.

[000102] Um outro exemplo não limitante é um "ácido nucléico de peptídeo", também conhecido como um "pna", "análogo de ácido nucléico com base em peptídeo" ou "penam", descrito nas patentes u.s. Seriais n°s 5.786.461, 5.891.625, 5.773.571, 5.766.855, 5.736.336, 5.719.262, 5.714.331, 5.539.082, e wo 92/20702, cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Ácidos nucléicos de peptídeo geralmente têm propriedades de especificidade de seqüência, ligação realçadas, e resistência à degradação enzimática em comparação a moléculas tais como dna e rna (egholm etal., 1993; pct/ep/01219). Um ácido nucléico de peptídeo geralmente compreende um ou mais nucleotídeos ou nucleosídeos que compreendem uma porção de nucleobase, uma porção ligante de nucleobase que não é um açúcar de 5 carbonos, e/ou uma porção de estrutura principal que não é uma porção de estrutura principal de fosfato. Exemplos de porções ligadoras de nucleobase descritas para pnas incluem átomos de nitrogênio aza, limites de amido e/ou ureído (ver por exemplo, patente u.s. N° 5.539.082). Exemplos de porções de estrutura principal descritas para pnas incluem uma porção de estrutura principal de aminoetilglicina, poliamida, polietila, politioamida, polissulfinamida ou polissulfonamida.

[000103] Em certas modalidades, um análogo de ácido nucléico tal como um ácido nucléico de peptídeo pode ser usado para inibir amplificação de ácido nucléico, tal como em per, para reduzir falso positivos e discriminar entre mutantes de base única, como descrito na patente u.s. Serial n° 5.891.625. Outras modificações e usos de análogos de ácido nucléico são conhecidos na técnica, e são abrangidos pelo polinucleotídeo de gp36. Em um exemplo não limitante, a patente u.s. 5.786.461 descreve pnas com cadeias laterais de aminoácido ligadas à estrutura principal de pna para realçar a solubilidade da molécula. Em um outro exemplo, a propriedade captação celular de pnas é aumentada por ligação de um grupo lipofílico. Pedido u.s. Ser. N° 117.363 descreve várias porções de alquilamino usadas para realçar a captação celular de um pna. Um outro exemplo é descrito nas patentes u.s. N— 5.766.855, 5.719.262, 5.714.331 e 5.736.336, que descrevem pnas compreendendo nucleobases que ocorrem naturalmente e não naturalmente e cadeias laterais de alquilamina que fornecem melhoras em especificidade de seqüência, solubilidade e/ou afinidade de ligação em relação a um ácido nucléico que ocorre naturalmente.

F. Preparação de ácidos nucléicos

[000104] Um ácido nucléico pode ser fabricado por qualquer técnica conhecida a uma pessoa de habilidade comum no ramo, tal como por exemplo, síntese química, produção enzimática ou produção biológica. Exemplos não limitantes de um ácido nucléico sintético (por exemplo, um oligonucleotídeo sintético), incluem um ácido nucléico fabricado por síntese quimicamente in vitrousando química de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidita e técnicas de fase sólida tal como descrito na ep 266.032, incorporadas aqui por referência, ou por intermédio de intermediários de h-fosfonato desoxinucleosídeo como descrito porfroehler etal., 1986 e patente u.s. Serial n° 5.705.629, todas incorporadas aqui por referência. Nos métodos da presente invenção, um ou mais oligonucleotídeos podem ser usados. Vários mecanismos diferentes de síntese de oligonucleotídeo foram divulgados por exemplo, nas patentes u.s.. 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

[000105] Um exemplo não limitante de um ácido nucléico enzimaticamente produzido inclui um produzido por enzimas em reações de amplificação tais como pcrtm (ver por exemplo, patente u.s. 4.683.202 e patente u.s. 4.682.195, todas incorporadas aqui por referência), ou a síntese de um oligonucleotídeo descrito na patente u.s. N° 5.645.897, incorporada aqui por referência. Um exemplo não limitante de um ácido nucléico biologicamente produzido inclui um ácido nucléico recombinante produzido (isto é, duplicado) em uma célula viva, tal como um vetor de dna recombinante duplicado em bactérias (ver por exemplo, sambrook etal. 1989, incorporado aqui por referência).

G. Purificação de ácidos nucléicos

[000106] Um ácido nucléico pode ser purificado em géis de poliacrilamida, gradientes de centrifugação de cloreto de césio, ou por quaisquer outros meios conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica (ver por exemplo, sambrook et al., 1989, incorporado aqui por referência).

[000107] Em certo aspecto, a presente invenção diz respeito a um ácido nucléico que é um ácido nucléico isolado. Como usado aqui, o termo "ácido nucléico isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, uma molécula de rna ou dna) que foi isolada isenta, ou é de outro modo isenta, da maioria dos total ácidos nucléicos genômicos e transcritos de uma ou mais células. Em certas modalidades, "ácido nucléico isolado" refere-se a um ácido nucléico que foi isolado isento, ou é de outro modo isenta, da maioria de componentes celulares ou componentes de reação in vitrotais como por exemplo, macromoléculas tais como lipídeos ou proteínas, moléculas biológicas pequenas, e semelhantes.

H. Segmentos de ácido nucléico

[000108] Em certas modalidades, o ácido nucléico é um segmento de ácido nucléico. Como usado aqui, o termo "segmento de ácido nucléico," são fragmentos menores de um ácido nucléico, tal como para exemplo não limitante, aqueles que codificam apenas parte da seqüência de peptídeo ou polipeptídeo. Assim, um "segmento de ácido nucléico" pode compreender qualquer parte de uma seqüência de gene, de cerca de 2 nucleotídeos ao tamanho natural da região que codifica peptídeo ou polipeptídeo.

[000109] Vários segmentos de ácido nucléico podem ser designados com base em uma seqüência de ácido nucléico particular, e podem ser de qualquer comprimento. Determinando-se valores numéricos para uma seqüência, por exemplo, o primeiro resíduo é 1, o segundo resíduo é 2, etc., um algoritmo definindo que todos os segmentos de ácido nucléico podem ser gerados: N a n + y

[000110] Onde n é um número inteiro de 1 ao último número da seqüência e y é o comprimento do segmento de ácido nucléico menos um, onde n + y não excede o último número da seqüência. Assim, para um 10 mer, os segmentos de ácido nucléico correspondem às bases 1 a 10, 2 a 11, 3 a 12 ... E assim por diante. Para um 15-mer, os segmentos de ácido nucléico correspondem às bases 1 a 15, 2 a 16, 3 a 17 ... E assim por diante. Para um 20-mer, os segmentos de ácido nucléico correspondem às bases 1 a 20, 2 a 21,3 a 22 ... E assim por diante. Em certas modalidades, o segmento de ácido nucléico pode ser uma sonda ou iniciador. Como usado aqui, uma "sonda" geralmente refere-se a um ácido nucléico usado em um método ou composição de detecção. Como usado aqui, um "iniciador" geralmente refere-se a um ácido nucléico usado em um método ou composição de extensão ou amplificação.

I. Complementos de ácido nucléico

[000111] A presente invenção também abrange um ácido nucléico que é complementar a um ou mais outros ácidos nucléicos. Em modalidades específicas, por exemplo, um ácido nucléico é utilizado para propósitos de anti-sentido ou sirna, tais como para inibir pelo menos parcialmente a expressão de um polinucleotídeo.

[000112] Em modalidades particulares a invenção abrange um ácido nucléico ou um segmento de ácido nucléico complementar à seqüência apresentada aqui, por exemplo. Um ácido nucléico é "complemento(s)" ou é "complementar" a um outro ácido nucléico quando ele é capaz de pareamento de base com um outro ácido nucléico de acordo com as regras de complementaridade de ligação de watson-crick padrão, hoogsteen ou hoogsteen reverso. Como usado aqui "um outro ácido nucléico" pode referir-se a uma molécula separada ou uma seqüência separada espacial da mesma molécula.

[000113] Como usado aqui, o termo "complementar" ou "complemento(s)" também refere-se a um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleobases consecutivas ou nucleobases semiconsecutivas (por exemplo, uma ou mais porções de nucleobase não estão presentes na molécula) capazes de hibridizar a um outro filamento ou duplex de ácido nucléico mesmo se menos do que todas as nucleobases do par que não base com uma nucleobase em contraparte. Em certas modalidades, um ácido nucléico "complementar" compreende uma seqüência em que cerca de 70 %, cerca de 71 %, cerca de 72 %, cerca de 73 %, cerca de 74 %, cerca de 75 %, cerca de 76 %, cerca de 77 %, cerca de 77 %, cerca de 78 %, cerca de 79 %, cerca de 80 %, cerca de 81 %, cerca de 82 %, cerca de 83 %, cerca de 84 %, cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, a cerca de 100 %, e qualquer faixa derivável nestas, da seqüência de nucleobase é capaz de pareamento de base com uma molécula de ácido nucléico de filamento único ou duplo durante a hibridização. Em certas modalidades, o termo "complementar"refere-se a um ácido nucléico que pode hibridizar a um outro filamento ou duplex de ácido nucléico em condições severas, como seria entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[000114] Em certas modalidades, um ácido nucléico "parcialmente complementar" compreende uma seqüência que pode hibridizar em condições de gravidade baixa a um ácido nucléico de filamento único ou duplo, ou contém uma seqüência em que menos do que cerca de 70 % da seqüência de nucleobase é capaz de pareamento de base com uma molécula de ácido nucléico de filamento único ou duplo durante a hibridização.

J. Hibridização

[000115] Como usado aqui, "hibridização", "hibridiza" ou "capaz de hibridizar" é entendido a significar a formação de uma molécula de filamento duplo ou triplo ou uma molécula com natureza de filamento duplo ou triplo parcial. O termo "recozer" como usado aqui é sinônimo com "hibridizar". O termo "hibridização", "hibridizar" ou "capaz de hibridizar" abrange os termos "condição(ões) severa(s)" ou "gravidade alta" e os termos "gravidade baixa" ou "condição(ões) de gravidade baixa".

[000116] Como usado aqui "condição(ões) severa(s)" ou "gravidade alta" são aquelas condições que permitem a hibridização entre ou dentro de um ou mais filamentos de ácido nucléico contendo seqüência(s) complementar(es), mas impede a hibridização de seqüências aleatórias. Condições severas toleram pouca, se alguma, ligação imperfeita entre um ácido nucléico e um filamento alvo. Tais condições são bem-conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica, e são preferidas para aplicações que requerem seletividade alta. Aplicações não limitantes incluem isolar um ácido nucléico, tal como um gene ou um segmento de ácido nucléico deste, ou detectar pelo menos um transcrito de mrna específico ou um segmento de ácido nucléico deste, e semelhantes.

[000117] Condições severas podem compreender condições de sal baixo e/ou temperatura alta, tal como fornecido por cerca de 0,02 m a cerca de 0,15 m de nacl, por exemplo, em temperaturas de cerca de 50° c a cerca de 70° c ou, por exemplo, em que as ditas condições severas são hibridização a 50 a 65° c., 5x sspc, 50 % de formamida; lavagem a 50 a 65° c, 5x sspc; ou lavagem a 60° c, 0,5x ssc, 0,1 % de sds. É entendido que a temperatura e força iônica de uma gravidade desejada são determinadas em parte pelo comprimento do(s) ácido(s) nucléico(s) particular(es), pelo comprimento e teor de nucleobase da(s) seqüência(s) alvo, pela composição de carga do(s) ácido(s) nucléico(s), e para a presença ou concentração de formamida, cloreto de tetrametilamônio ou outro(s) solvente(s) em uma mistura de hibridização.

[000118] Também é entendido que estas faixas, composições e condições para a hibridização são mencionadas por via de exemplos não limitantes apenas, e que a gravidade desejada para uma reação de hibridização particular é freqüentemente determinada empiricamente por comparação a um ou mais controles positivos ou negativos. Dependendo da aplicação visionada é preferido utilizar condições variadas de hibridização para obter graus variados de seletividade de um ácido nucléico para uma seqüência alvo. Em um exemplo não limitante, a identificação ou isolamento de um ácido nucléico alvo relacionado que não hibridiza a um ácido nucléico sob condições severas podem ser obtidos por hibridização em temperatura baixa e/ou força iônica alta. Tais condições são denominadas "gravidade baixa" ou "condições de gravidade baixa", e exemplos não limitantes de gravidade baixa incluem hibridização realizada em cerca de 0,15 m a cerca de 0,9 m de nacl em uma faixa de temperatura de cerca de 20° c a cerca de 50° c. Naturalmente, está dentro da habilidade de uma pessoa na técnica modificar ainda as condições de gravidade baixa ou alta para adaptar uma aplicação particular.

IV.V. Sistemas de Expressão Com base em Ácido Nucléico

[000119] Em modalidades particulares, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ehrlichiae imunorreativo, e também inclui liberar o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou produto codificado deste, a um indivíduo em necessidade deste, tal como um indivíduo infectado com erhlichia e/ou um indivíduo suscetível para ser infectado com erhlichia. Visando brevidade, a seção seguinte se referirá a quaisquer composições de ácido nucléico de gp36 de e. Canis e/ou gp47 de e. Chaffeensis e/ou sistema de expressão com base em ácido nucléico da presente invenção.

[000120] A presente invenção é dirigida para seqüência de dna substancialmente pura e/ou isolada que codifica uma composição de ehrlichiaimunorreativa. Geralmente, a proteína codificada compreende uma seqüência de terminal n, que pode ser clivada depois da modificação pós traducional resultando na produção de proteína madura.

[000121] É bem-conhecido na técnica que por causa da degeneração do código genético (isto é, para a maioria dos aminoácidos, mais do que um tripleto de nucleotídeo (códon) codifica um único aminoácido), seqüências de nucleotídeo diferentes podem codificar um aminoácido, ou polipeptídeo particulares. Assim, as seqüências de polinucleotídeo da invenção objeto incluem qualquer uma das seqüências exemplares fornecidas ou uma variante degenerada de uma tal seqüência, por exemplo. Em aspectos particulares da invenção, uma variante degenerada compreende uma seqüência que não é idêntica a uma seqüência da invenção mas que retém ainda uma ou mais propriedades de uma seqüência da invenção.

[000122] Como usado aqui, "dna substancialmente puro" significa o dna que não é parte de um ambiente em que o dna ocorre naturalmente, em virtude de separação (purificação parcial ou total) de algumas ou todas as moléculas daquele ambiente, ou em virtude de alteração de seqüências que flanqueiam o dna reivindicado. O termo portanto inclui, por exemplo, um dna recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus autonomamente duplicação, ou no dna genômico de um procariota ou eucariota; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cdna ou um fragmento genômico ou de cdna produzido por reação em cadeia de polimerase (per) ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras seqüências. Ele também inclui um dna recombinante, que é parte de um gene híbrido que codifica seqüência de polipeptídeo adicional, por exemplo, uma proteína de fusão.

[000123] A presente invenção é dirigida ainda a um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma composição de ehrlichiae imunorreativa e capaz de expressar o polinucleotídeo quando o vetor é introduzido em uma célula. Em modalidades específicas, o vetor compreende em ligação operável o seguinte: a) uma origem de duplicação; b) um promotor; e c) uma seqüência de dna que codifica a proteína.

[000124] Como usado aqui "vetor" pode ser definido como uma construção de ácido nucléico duplicável, por exemplo, um ácido nucléico de plasmídeo ou virai. Vetores podem ser usados para amplificar e/ou expressar o ácido nucléico que codifica uma composição imunorreativa de ehrlichiae. Um vetor de expressão é uma construção duplicável em que uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo é operavelmente ligada a seqüências de controle adequadas capazes de efetuar a expressão do polipeptídeo em uma célula. A necessidade para tais seqüências de controle variará dependendo da célula selecionada e do método de transformação escolhido. Geralmente, seqüências de controle incluem um promotor e/ou realçador transcricionais, sítios de ligação de mrna ribossômico adequados, e seqüências que controlam o término da transcrição e tradução, por exemplo. Métodos que são bem-conhecidos àqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão compreendendo sinais de controle transcricionais e traducionais apropriados. Ver por exemplo, as técnicas descritas em sambrook et al., 1989, molecular cloning: a laboratory manual (2â ed.), cold spring harbor press, n.y. Uma seqüência de polinucleotídeo a ser expressada e suas seqüências de controle de transcrição são definidas como sendo "operavelmente ligadas" se as seqüências de controle de transcrição controlam efetivamente a transcrição da seqüência de polinucleotídeo. Vetores da invenção incluem, mas não são limitados a, vetores de plasmídeo e vetores virais. Vetores virais preferidos da invenção são aqueles derivados de retrovirus, adenovirus, vírus adeno- associado, vírus sv40, ou vírus da hérpes, por exemplo.

[000125] Em geral, vetores de expressão compreendem seqüências promotoras que facilitam a transcrição eficiente do polinucleotídeo a ser expressado, são usados em combinação com uma célula hospedeira. Como usado aqui, o termo "hospedeiro" é significado a incluir não apenas procariotas mas também eucariotas, tais como células de levedura, vegetal e animal. Um polinucleotídeo recombinante que codifica uma composição imunorreativa de ehrlichiae da presente invenção pode ser usado para transformar um hospedeiro usando qualquer uma das técnicas comumente conhecidas àqueles de habilidade comum no ramo. Hospedeiros procarióticos podem incluir e. Coli, s. Tymphimurium, serratia marcescens e bacillus subtilis. Hospedeiros eucarióticos incluem leveduras, tais como pichia pastoris, células de mamífero e células de inseto.

[000126] A descrição seguinte diz respeito a elementos, reagentes, e métodos exemplares para polinucleotídeos e liberação de ácido nucléico de um polinucleotídeo de ehrlichia.

A. Vetores

[000127] O termo "vetor" é usado para referir-se a uma molécula de ácido nucléico portadora em que uma seqüência de ácido nucléico pode ser inserida para a introdução em uma célula onde ela pode ser duplicada. Uma seqüência de ácido nucléico pode ser "exógena," o que significa que ela é estranha para a célula em que o vetor está sendo introduzido ou que a seqüência é homóloga a uma seqüência na célula mas em uma posição dentro do ácido nucléico da célula hospedeira em que a seqüência não é comumente encontrada. Vetores incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófago, vírus animais, e vírus vegetais), e cromossomos artificiais (por exemplo, yacs). Uma pessoa de habilidade na técnica seria bem equipada para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão (ver, por exemplo, maniatis et al., 1988 e ausubel et al., 1994, ambos incorporados aqui por referência).

[000128] O termo "vetor de expressão"refere-se a qualquer tipo de construção genética compreendendo um ácido nucléico que codifica um rna capaz de ser transcrito. Em alguns casos, moléculas de rna depois são traduzidas em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo. Em outros casos, estas seqüências não são traduzidas, por exemplo, na produção de moléculas anti-sentido ou ribozimas. Vetores de expressão podem conter uma variedade de "seqüências de controle," que referem-se às seqüências de ácido nucléico necessárias para a transcrição e possivelmente tradução de uma seqüência de codificação operavelmente ligada em uma célula hospedeira particular. Além de seqüências de controle que administram a transcrição e tradução, vetores e vetores de expressão podem conter seqüências de ácido nucléico que servem outras funções igualmente e são descritas infra.

1. Promotores e realçadores

[000129] Um "promotor" é uma seqüência de controle que é uma região de uma seqüência de ácido nucléico em que o início e taxa de transcrição são controlados. Ele pode conter elementos genéticos em que proteínas reguladoras e moléculas podem ligar, tal como rna polimerase e outros fatores de transcrição, para iniciar a transcrição específica de uma seqüência de ácido nucléico. As frases "operativamente posicionado,""operativamente ligado,""sob controle," e "sob controle transcricional" significam que um promotor é em um local funcional correto e/ou orientação em relação a uma seqüência de ácido nucléico para controlar o início transcricional e/ou expressão daquela seqüência.

[000130] Um promotor geralmente compreende uma seqüência que funciona para posicionar o sítio de início para a síntese de rna. O exemplo melhor conhecido disto é a caixa tata, mas em alguns promotores que carecem de uma caixa tata, tal como, por exemplo, o promotor para o gene de desoxinucleotidil transferase de terminal mamífero e o promotor para os genes tardios sv40, um elemento separado que sobrepõe o sítio de início por si só ajuda a fixar o local de início. Elementos promotores adicionais regulam a freqüência de início transcricional. Tipicamente, estes são localizados na região 30 110 bp a montante do sítio de início, embora vários promotores foram mostrados conter elementos funcionais a jusante do sítio de início igualmente. Para conduzir uma seqüência de codificação "sob o controle de" um promotor, uma posiciona a extremidade 5' do sítio de início da transcrição da estrutura principal de leitura transcricional "a jusante" (isto é, 3') do promotor escolhido. O promotor "a montante" estimula a transcrição do dna e promove a expressão do rna codificado.

[000131] O espaçamento entre elementos promotores freqüentemente é flexível, de modo que a função do promotor é preservada quando elementos são invertidos ou movidos em relação um ao outro. No promotor de tk, o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado para 50 bp separadamente antes que a atividade comece a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição. Um promotor pode ser usado ou não em combinação com um "realçador," que refere-se a uma seqüência reguladora que age em cis envolvida na ativação transcricional de uma seqüência de ácido nucléico.

[000132] Um promotor pode ser um naturalmente associado com uma seqüência de ácido nucléico, como pode ser obtido isolando-se as seqüências que não de codificação 5' localizadas a montante do segmento de codificação e/ou exon. Um tal promotor pode ser referido como "endógeno". Similarmente, um realçador pode ser um naturalmente associado com uma seqüência de ácido nucléico, localizada a jusante ou a montante daquela seqüência. Alternativamente, certas vantagens serão obtidas posicionando-se o segmento de ácido nucléico de codificação sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que refere-se a um promotor que não é normalmente associado com uma seqüência de ácido nucléico em seu ambiente natural. Um realçador recombinante ou heterólogo também refere-se a um realçador não normalmente associado com uma seqüência de ácido nucléico em seu ambiente natural. Tais promotores ou realçadores podem incluir promotores ou realçadores de outros genes, e promotores ou realçadores isolados de qualquer outro vírus, ou célula procariótica ou eucariótica, e promotores ou realçadores "que não ocorre naturalmente," isto é, contendo elementos diferentes de regiões reguladoras transcricionais diferentes, e/ou mutações que alteram a expressão. Por exemplo, promotores que são o mais comumente usados em construção de dna recombinante incluem os sistemas promotores de beta lactamase (penicilinase), lactose e triptofano (trp). Além de produzir seqüências de ácido nucléico de promotores e realçadores sinteticamente, seqüências pode ser produzidas usando tecnologia de clonagem recombinante e/ou amplificação de ácido nucléico, incluindo per™, em combinação com as composições divulgadas aqui (ver patentes u.s. N— 4.683.202 e 5.928.906, todas incorporadas aqui por referência). Além disso, é considerado que as seqüências de controle que conduzem a transcrição e/ou expressão de seqüências dentro de organelas não nucleares tais como mitocôndria, cloroplastos, e semelhantes, podem ser utilizadas igualmente.

[000133] Naturalmente, será importante utilizar um promotor e/ou realçador que efetivamente conduz a expressão do segmento de dna na célula, organela, tipo celular, tecido, órgão, ou organismo escolhido para a expressão. Aqueles de habilidade na técnica de biologia molecular geralmente conhecem o uso de promotores, realçadores, e combinações de tipo celular para a expressão da proteína, (ver, por exemplo sambrook et al., 1989, incorporado aqui por referência). Os promotores utilizados podem ser constitutivos, específicos de tecido, induzíveis, e/ou úteis sob as condições apropriadas para conduzir expressão de nível alto do segmento de dna introduzido, tal como é vantajoso na produção em grande escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. O promotor pode ser heterólogo ou endógeno.

[000134] O promotor pode ser um adequado para o uso em uma célula procariótica, uma célula eucariótica, ou ambas. Adicionalmente qualquer combinação de promotor/realçador (como por, por exemplo, the eukaryotic promoter data base epdb) também pode ser usada para conduzir a expressão. O uso de um sistema de expressão citoplasmática de t3, t7 ou sp6 é uma modalidade possível.

2. Sinais de início e sítios de ligação de ribossomo internos

[000135] Um sinal de início específico também pode ser necessário para a tradução eficiente de seqüências de codificação. Estes sinais incluem o códon de início de atg ou seqüências adjacentes. Sinais de controle traducional exógenos, incluindo o códon de início de atg, podem precisar ser fornecidos. Uma pessoa de habilidade comum na técnica facilmente seria capaz de determinar isto e fornecer os sinais necessários. É bem-conhecido que o códon de início deve estar "em estrutura principal" com a estrutura principal de leitura da seqüência de codificação desejada para garantir tradução da inserção inteira. Os sinais de controle traducional exógenos e códons de início podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência da expressão pode ser realçada pela inclusão de elementos realçadores de transcrição apropriados.

[000136] Em certas modalidades da invenção, o uso de elementos de sítios de entrada de ribossomo internos (ires) são usados para criar mensagens de multigene, ou policistrônicas. Elementos de ires são capazes de desviar o modelo de varredura ribossomo de tradução dependente de cap metilado em 5' e começar a tradução em sítios internos (pelletier e sonenberg, 1988). Elementos de ires de dois membros da família de picornavírus (polio e encefalomiocardite) foram descritos (pelletier e sonenberg, 1988), igualmente um ires de uma mensagem de mamífero (macejak e sarnow, 1991). Elementos de ires podem ser ligados a estrutura principais de leitura aberta heterólogas. Estruturas de leitura aberta múltiplas podem ser transcritas entre si, cada uma separada por um ires, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento de ires, cada estrutura principal de leitura aberta é acessível a ribossomos para a tradução eficiente. Genes múltiplos podem ser eficientemente expressados usando um único promotor/realçador para transcrever uma única mensagem (ver patentes u.s. N— 5.925.565 e 5.935.819, todas incorporadas aqui por referência).

3. Sítios de clonagem múltiplos

[000137] Vetores podem incluir um sítio de clonagem mútiplo (mcs), que é uma região de ácido nucléico que contém sítios de enzima de restrição múltiplos, qualquer um dos quais pode ser usado em combinação com tecnologia recombinante padrão para digerir o vetor (ver, por exemplo, carbonelli etal., 1999, levenson etal., 1998, e cocea, 1997, incorporado aqui por referência.) "digestão de enzima de restrição" refere-se à clivagem catalítica de uma molécula de ácido nucléico com uma enzima que funciona apenas em locais específicos em uma molécula de ácido nucléico. Muitas destas enzimas de restrição são comercialmente disponíveis. Uso de tais enzimas é amplamente entendido por aqueles de habilidade na técnica. Freqüentemente, um vetor é linearizado ou fragmentado usando uma enzima de restrição que corta dentro do mcs para permitir que seqüências exógenas sejam ligadas ao vetor, "ligação" refere-se ao processo de formar ligações de fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucléico, que podem ser contíguas ou não entre si. Técnicas que envolvem enzimas de restrição e reações de ligação são bem-conhecidas àqueles de habilidade no ramo da tecnologia recombinante.

4. Sítios de união

[000138] Moléculas de rna eucarióticas mais transcritas passarão por união de rna para remover introns dos transcritos primários. Vetores contendo seqüências eucarióticas genômicas podem requerer sítios de união doadores e/ou aceitantes para garantir processamento apropriado do transcrito para a expressão da proteína (ver, por exemplo, chandler et al., 1997, aqui incorporado por referência.)

5. Sinais de término

[000139] Os vetores ou construções da presente invenção geralmente compreenderão pelo menos um sinal de término. Um "sinal de término" ou "terminador" é compreendido das seqüências de dna envolvidas no término específico de um transcrito de rna por uma rna polimerase. Assim, em certas modalidades um sinal de término que termina a produção de um transcrito de rna é considerado. Um terminador pode ser necessário in vivo para obter níveis de mensagem desejáveis.

[000140] Em sistemas eucarióticos, a região terminadora também pode compreender seqüências de dna específicas que permitem clivagem específica de sítio do novo transcrito de modo a expor um sítio de poliadenilação. Isto sinaliza uma polimerase endógena especializada para adicionar um trecho de cerca de 200 resíduos a (polia) à extremidade 3’ do transcrito. Moléculas de rna modificadas com este cauda de polia parece mais estáveis e são traduzidas mais eficientemente. Assim, em outras modalidades que envolvem eucariotas, é preferido que aquele terminador compreenda um signal para a clivagem do rna, e é mais preferido que o sinal terminador promova a poliadenilação da mensagem. Os elementos terminadores e/ou de sítio de poliadenilação podem servir para realçar níveis de mensagem e para minimizar a leitura através do cassete em outras seqüências.

[000141] Terminadores considerados para o uso na invenção incluem qualquer terminador conhecido da transcrição descrita aqui ou conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica, incluindo mas não limitado, por exemplo, às seqüências de término de genes, tais como por exemplo o terminador de hormônio de crescimento bovino ou seqüências de término virai, tais como por exemplo o terminador sv40. Em certas modalidades, o sinal de término pode ser uma falta de seqüência transcritível ou traduzível, tal como devido a uma truncaçâo de seqüência.

6. Sinais de poliadenilação

[000142] Em expressão, particularmente expressão eucariótica, uma pessoa tipicamente incluirá um sinal de poliadenilação para efetuar a poliadenilação apropriada do transcrito. Acredita-se que a natureza do sinal de poliadenilação não seja crucial para a prática bem sucedida da invenção, e qualquer tal seqüência pode ser utilizada. Formas de realização preferidas incluem o sinal de poliadenilação sv40 ou o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, convenientes e conhecidos funcionarem bem em várias células alvo. A poliadenilação pode aumentar a estabilidade do transcrito ou pode facilitar o transporte citoplasmático.

7. Origens de duplicação

[000143] De modo a propagar um vetor em uma célula hospedeira, ela podem conter uma ou mais origens de sítios de duplicação (freqüentemente denominados "ori"), que é uma seqüência de ácido nucléico específica em que a duplicação é iniciada. Alternativamente uma seqüência autonomamente de duplicação (ars) pode ser utilizada se a célula hospedeira for levedura.

8. Marcadores selecionáveis e friáveis

[000144] Em certas modalidades da invenção, células contendo uma construção de ácido nucléico da presente invenção podem ser identificadas in vitroou in vivoincluindo-se um marcador no vetor de expressão. Tais marcadores confereriam uma mudança identificável para a célula permitindo facilidade de identificação de células contendo o vetor de expressão. Geralmente, um marcador selecionável é um que confere uma propriedade que leva em consideração a seleção. Um marcador selecionável positivo é um em que a presença do marcador leva em consideração sua seleção, enquanto um marcador selecionável negativo é um em que sua presença impede sua seleção. Um exemplo de um marcador selecionável positivo é um marcador de resistência medicamentosa.

[000145] Usualmente a inclusão de um marcador de seleção de medicamento ajuda na clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, dhfr, gpt, zeocina e histidinol são marcadores selecionáveis úteis. Além de marcadores que conferem um fenótipo que leva em consideração a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, outros tipos de marcadores incluindo marcadores triáveis tais como gfp, cuja base é a análise colorimétrica, também são considerados. Alternativamente, enzimas triáveis tais como timidina cinase (tk) ou cloranfenicol acetiltransferase (cat) de de vírus do hérpes simples podem ser utilizadas. Uma pessoa de habilidade na técnica também conheceria como utilizar marcadores imunológicos, possivelmente em combinação com análise facs. Acredita-se que o marcador usado não seja importante, contanto que ele seja capaz de ser expressado simultaneamente com o ácido nucléico que codifica um produto genético. Outros exemplos de marcadores selecionáveis e triáveis são bem-conhecidos a uma pessoa de habilidade na técnica.

9. Vetores de plasmídeo

[000146] Em certas modalidades, um vetor de plasmídeo é considerado para o uso para transformar uma célula hospedeira. Em geral, vetores de plasmídeo contendo réplicon e seqüências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em combinação com estes hospedeiros. O vetor comumente porta um sítio de duplicação, assim como marcando seqüências que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Em um exemplo não limitante, e. Co//é freqüentemente transformada usando derivados de pbr322, um plasmídeo derivado de uma espécie e. Coli. Pbr322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e assim fornece meios fáceis para identificar células transformadas. O plasmídeo pbr, ou outro plasmídeo microbiano ou fago também devem conter, ou serem modificados para conter, por exemplo, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para a expressão de suas próprias proteínas.

[000147] Além disso, vetores de fago contendo réplicon e seqüências de controle que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores transformantes em combinação com estes hospedeiros. Por exemplo, o fago lambda gemtm 11 pode ser utilizado em fabricar um vetor de fago recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras, tais como, por exemplo, Ie392 de e. Coli.

[000148] Outros vetores de plasmídeo úteis incluem vetores de pin (inouye et al., 1985); e vetores de pgex, para o uso em gerar proteínas de fusão solúveis em glutationa s transferase (gst) para a purificação e separação ou clivagem mas tardias. Outras proteínas de fusão adequadas são aquelas com beta galactosidase, ubiquitina, e semelhantes.

[000149] Células hospedeiras bacterianas, por exemplo, e. Coli, compreendendo o vetor de expressão são cultivadas em qualquer um de vários meios adequados, por exemplo, Ib. A expressão da proteína recombinante em certos vetores pode ser induzida, como seria entendido por aqueles de habilidade na técnica, contatando-se uma célula hospedeira com um agente específico para certos promotores, por exemplo, adicionando-se iptg aos meios ou mudando-se a incubação para uma temperatura mais alta. Depois de cultivar as bactérias durante um período adicional, geralmente entre 2 e 24 h, as células são coletadas por centrifugação e lavadas para remover meios residuais.

10. Vetores virais

[000150] A capacidade de certos vírus para infectar células ou entrar nas células por intermédio de endocitose mediada por receptor, e para integrar no genoma da célula hospedeira e expressar genes virais estável e eficientemente os tornou candidates atrativos para a transferência de ácidos nucléicos estranhos nas células (por exemplo, células de mamífero). Componentes da presente invenção podem compreender um vetor virai que codifica uma ou mais composições ou outros componentes tais como, por exemplo, um imunomodulador ou adjuvante. Exemplos não limitantes de vetores virais que podem ser usados para liberar um ácido nucléico da presente invenção são descritos abaixo.

A. Vetores adenovirais

[000151] Um método particular para liberação do ácido nucléico envolve o uso de um vetor de expressão de adenovirus. Embora vetores adenovirais sejam conhecidos terem uma capacidade baixa para a integração no dna genômico, esta característica é contrabalançada pela eficiência elevada de transferência de gene fornecida por estes vetores, "vetor de expressão de adenovirus"é significado a incluir aquelas construções contendo seqüências de adenovirus suficientes para (a) suportar o acondicionamento da construção e (b) expressar basicamente uma construção específica de tecido ou célula que foi clonada nesta. O conhecimento da organização genética ou adenovirus, um vírus de dna de filamento duplo, de 36 kb, linear, permite a substituição de partes grandes de dna adenoviral com seqüências estranhas de até 7 kb (grunhaus e horwitz, 1992).

[000152] Cartilagem, cervix, cólon, córnea, embriônico, endométrio, endotelial, epitelial, esôfago, facial, fibroblasto, folicular, células ganglionares, células gliais, células caliciformes, rins, fígado, pulmão, linfonodo, músculo, neurônio, ovários, pâncreas, sangue periférico, próstata, pele, intestino pequeno, baço, células tronco, estômago, testículos, anteras, tecido de ascite, espigas, ouvidos, flores, palhas de milho, sementes, folhas, células meristemáticas, pólen, pontas de raiz, raízes, seda, talos, e todos os cânceres destes.

[000153] Em certas modalidades, a célula ou tecido hospedeiro pode estar compreendido em pelo menos um organismo. Em certas modalidades, o organismo pode ser, porém não está limitado a, um procariota (por exemplo, uma eubactéria, uma arquea) ou um eucariócito, como seria entendido por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, webpage http://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html).

[000154] Numerosas linhagens e culturas celulares estão disponíveis para uso como uma célula hospedeira, e elas podem ser obtidas através da american type culture collection (atcc), que é uma organização que serve como um arquivo para materiais genéticos e culturas vivas (www.atcc.org). Um hospedeiro apropriado pode ser determinado por alguém versado na técnica com base na cadeia principal de vetor e o resultado desejado. Um plasmídeo ou cosmídeo, por exemplo, pode ser introduzido em uma célula hospedeira procariota para replicação de muitos vetores. Tipos celulares disponíveis para replicação e/ou expressão de vetor incluem, porém não estão limitados a, bactérias, tais como e. Coli (por exemplo, e. Coli linhagem rr1, e. Coli Ie392, e. Coli b, e. Coli x 1776 (atcc no. 31537) bem como e. Coli w3110 (f, lambda , prototrófica, atcc no. 273325), dh5Q, jm109, e kc8, bacilos tais como bacillus subtilis', e outras enterobacteriaceae tais como salmonella typhimurium, serratia marcescens, várias espécies de pseudomonas, bem como diversos hospedeiros bacterianos comercialmente disponíveis tais como sure® competent cells e solopack gold cells (stratagene®, la jolla). Em certas modalidades, as células bacterianas tais como e. Coli Ie392 são particularmente contempladas como células hospedeiras para viroses de fago.

[000155] Exemplos de células hospedeiras eucarióticas para replicação e/ou expressão de um vetor incluem, porém não estão limitados a hela, nih3t3, jurkat, 293, cos, cho, saos, e pc12. Muitas células hospedeiras de vários tipos celulares e organismos estão disponíveis e são conhecidas por alguém versado na técnica. Similarmente, um vetor virai pode ser usado em conjunto com uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica, particularmente uma que seja permissiva para replicação ou expressão do vetor.

[000156] Alguns vetores podem empregar seqüências de controle que o permitam ser replicado e/ou expresso tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Alguém versado na técnica entenderia também as condições sob as quais incubar todas as células hospedeiras acima descritas para mantê-las e permitir a replicação de um vetor. São também conhecidass as técnicas e condições que permitiriam a produção em larga escala de vetores, bem como a produção dos ácidos nucléicos codificados por vetores e seus cognatos polipeptídeos, proteínas ou peptídeos.

1.1. Sistemas de expressão

[000157] Existem numerosos sistemas de expressão que compreendem pelo menos uma parte ou o todo das composições descritas acima. Sistemas com base em procariota e/ou eucariota podem ser empregados para uso com a presente invenção para produzir seqüências de ácido nucléico, ou seus cognatos polipeptídeos, proteínas ou peptídeos. Muitos tais sistemas estão comercialmente e amplamente disponíveis.

[000158] O sistema de célula de inseto/baculovírus pode produzir um alto nível de expressão de proteína de um segmento de ácido nucléico heterólogo, tal como described nas patentes dos estados unidos nos 5.871,986, 4.879.236, ambas aqui incorporadas por referência, e que podem ser trazidas, por exemplo, sob o nome maxbac® 2.0 de invitrogen® e bacpack® baculovirus expression system from clontech®.

[000159] Outros exemplos de sistemas de expressão incluem stratagene®’s complete control inducible mammalian expression system, que envolve um receptor induzível por ecdissona sintético, ou seu pet expression system, um sistema de expressão de e. Coli.Outro exemplo de um sistema de expressão induzível ewstá disponível de invitrogen®, que transporta o sistema t-rex™ (expressão regulada por tetraciclina), um sistema de expressão mamífero induzível que usa o promotor cmv de tamanho natural. Invitrogen® também fornece um sistema de expressão de levedura chamado o sistema de expressão de pichia methanolica, que é designado para produção de alto nível de proteínas recombinantes na pichia methanolica de levedura metilotrófica. Alguém versado na técnica saberia como expressar um vetor, tal como uma construção de expressão, para produzir uma seqüência de ácido nucléico ou seu cognato polipeptídeo, proteína ou peptídeo.

[000160] Contempla-se que as proteínas, polipeptídeos ou peptídeos produzidos pelos métodos da invenção podem ser "superexpressos", isto é, expressos em níveis aumentados com relação a sua expressão natural em células. Tal superexpressão pode ser avaliada por uma variedade de métodos, incluindo radiorrotulagem e/ou purificação de proteína. Entretanto, métodos simples e diretos são preferidos, por exemplo, aqueles que envolvem sds/page e manchamento de proteína ou manchamento do oeste, seguido por análises quantitativas, tais como varredura densitométrica do gel ou mancha resultante. Um aumento específico no nível das proteína recombinante, polipeptídeo ou peptídeo em comparação com o nível em células naturais é indicativo de superexpressão, como é uma abundância relativa da proteína específica, polipeptídeos ou peptídeos com relação às outras proteínas produzidas pela célula hospedeira e, por exemplo, visíveis sobre um gel. Em algumas modalidades, a seqüência proteinácea expressa forma um corpo de inclusão na célula hospedeira, as células hospedeiras são lisadas, por exemplo, por rompimento em um homogeneizador celular, lavadas e/ou centrifugadas para sepasrar os corpos de inclusão densos e membranas celulares dos componentes celulares solúveis. Esta centrifugação pode ser realizada sob condições pelas quais os corpos de inclusão densos são seletivamente enriquecidos por modalidade de açúcares, tais como sacarose, no tampão e centrifugação em uma velocidade seletiva. Os corpos de inclusão podem ser solubilizados em soluções contendo concentrações elevadas de uréia (por exemplo 8M) ou agentes caotrópicos tais como hidrocloreto de guanidina na presença de agentes de redução, tais como beta mercaptoetanol ou DTT (ditiotreitol), e reduplicado em uma conformação mais desejável, como é conhecido por alguém versado na técnica.

V.V. Composições Imunológicas

[000161] Em modalidades particulares da invenção, composições imunológicas são empregadas. Devido à brevidade, a seção seguinte referir-se-á a quaisquer composições imunológicas de e. Canis gp36 ou e. Chaffeensis gp47 da presente invenção, tais como são descritos em outro lugar aqui como modalidades exemplares apenas. Por exemplo, as composições podem incluir o todo ou pasrte de um e. Canis gp36 seq id no:22, seq id no:37, seq id no:38, ou seq id no:39. Além disso, as composições podem incluir o todo ou parte de um e. Chaffeensis gp47 seq id no:23, seq id no:24, seq id no:40, ou seq id no:41, por exemplo. Anticorpos podem ser utilizados para ligar-se a um antígeno, desse modo tornando a molécula pelo menos parcialmente ineficaz para suas atividade, por exemplo. Em outras modalidades, anticorpos para o antígeno são empregados em aspectos diagnósticos da invenção, tal como para detectar a presença do antígeno de uma amostra. Amostras exemplares podem ser de um animal suspeito de ter infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis, de um animal suscetível à infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis, ou de um animal que tenha uma infecção por e. Canis ou e. Chaffeensis. Amostras exemplasres podem ser obtidas de sangue, soro, fluído cerebroespinhal, urina, fezes, raspas da bochecha, aspirados do mamilo, e assim em diante.

[000162] Composições imunorreativas purificadas ou fragmentos antigênicos das composições imunorreativas podem ser usados para gerar novos anticorpos ou para testar anticorpos existentes (por exemplo, como controles positivos em um ensaio diagnóstico) empregando protocolos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000163] Como é bem-conhecido na técnica, a imunogenicidade a um imunógeno particular pode ser realçada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes exemplares e preferidos incluem completos beg, detox, (ribi, immunochem research inc.), iscoms e adjuvante de hidróxido de alumínio (superphos, biosector).

[000164] Incluídos nesta invenção estão os antisoros policlonais gerados usando a composição imunorreativa ou um fragmento da composição imunorreativa como um imunógeno em, por exemplo, coelhos. Protocolos padrão para produção de anticorpo monoclonal e policlonal conhecidos por aqueles versados na técnica são empregados. Os anticorpos monoclonais gerados por este procedimento podem ser analisados quanto à sua capacidade de identificar os clones de ehrlichiacdna recombinantes, e de distingüí-los dos clones de cdna conhecidos, por exemplo.

[000165] A invenção abrange não apenas um anticorpo monoclonal intacto, porém também um fragmento de anticorpo imunologicamente ativo, por exemplo, um fragmento fab ou (fab)2; uma molécula de scfv de cadeia única construída; ou uma molécula quimérica, por exemplo, um anticorpo que contém a especificidade de ligaçãode um anticorpo, por exemplo, de origem murina, e as porções restantes de outro anticorpo, por exemplo, de origem humana.

[000166] Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento deste, pode ser ligado a uma toxina ou as um rótulo detectável, por exemplo um rótulo radioativo, rótulo isotópico não-radioativo, rótulo fluorescente, rótulo quimioluminescente, rótulo paramagnético, rótulo de enzima ou rótulo colorimétrico. Exemplos de toxinas adequadas incluem toxina da difteria, endotoxina a de pseudomonas, ricina, e toxina da cólera. Exemplos de rótulos de enzima adequados incluem malato hidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteróide isomerase, álcool desidrogenase, alfa glicerol fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- fosfato desidrogenase, glicoamilase, acetilcolinesterase, etc. Exemplos de rótulos radioisotópicos adequados incluem 3h, 125i, 131 i, 32p, 35s, 14c, etc.

[000167] Itótopos paramagnéticos para os propósitos de diagnóstico in vivo podem também ser usados de acordo com os métodos desta invenção. Existem numerosos exemplos de elementos que são úteis em imageamento de ressonância magnética. Para descrições sobre imageamento por ressonância magnética nuclear in vivo, veja, por exemplo, schaefer e outro, (1989) jacc 14, 472-480; shreve e outro, (1986) magn. Reson. Med. 3, 336-340; wolf, g.l., (1984) physiol. Chem. Phys. Med. Nmr 16, 93-95; wesby e outro, (1984) physiol. Chem. Phys. Med. Nmr 16, 145-155; runge e outro, (1984) invest. Radiol. 19, 408- 415. Exemplos de rótulos fluorescentes adequados incluem um rótulo de fluoresceína, um rótulo de isotiocialato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de optaldeído, um rótulo de fluorescamina, etc. Exemplos de rótulos quimioluminescente incluem um rótulo luminal, um rótulo isoluminal, um rótulo de éster de acridínio aromático, um rótulo de luciferina, um rótulo de luciferase, um rótulo de equorina, etc.

[000168] Aqueles versados na técnica conhecerão estes e outros rótulos adequados, que podem ser empregados de acordo com a presente invenção. A ligação destes rótulos a anticorpos ou fragmentos destes pode ser realizada empregando-se técnicas padrão comumente conhecidas por aqueles versados na técnica. Técnicas típicas são descritas por kennedy e outro, (1976) clin. Chim. Acta 70,1 -31; e schurs e outro, (1977) clin. Chim. Acta 81, 1-40. Técnicas de acoplamento mencionadas no último são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida, o método de éster de maleimidobenzil-n-hidróxi-sucinimida. Todos estes métodos são incorporados aqui por referência.

A. Anticorpos

[000169] Em certos aspectos da invenção, um ou mais anticorpos podem ser produzidos para os gp36 or gp47 expressos. Estes anticorpos podem ser usados em várias aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas descritas aqui.

[000170] Como aqui usado, o termo "anticorpo"destina-se a referir-se amplamente a quaslquer agente de ligação imunológico tal como igg, igm, iga, igd e ige. Geralmente, igg e/ou igm são preferidos por que eles são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e por que eles são mais facilmente preparados em um ambiente de laboratório.

[000171] O termo "anticorpo" é usado para referir-se a qualquer molécula semelhante a anticorpo que tem uma região de ligação de antígeno, e inclui fragmentos de anticorpo tais como fab', fab, f(ab')2, anticorpos de domínio único (dabs), fv, scfv (fv de cadeia única), e os semelhantes. As técnicas para a preparação e uso de várias construções com base em anticorpo e fragmentos são bem-conhecidas na técnica. Métodos para a preparação e caracterização de anticorpos são também bem-conhecidos na técnica (veja, por exemplo, antibodies: a laboratory manual, cold spring harbor laboratory, 1988; incorporado aqui por referência).

[000172] "mini-anticorpos" ou "minicorpos" são também contemplados para uso com a presente invenção. Minicorpos são cadeias de polipeptídeo de sfv que incluem domínios de oligomerização em sua terminações de c, separados da sfv por uma região de articulação. Pack e outro (1992) biochem 31:1579-1584. O domínio de oligomerização compreende a-hélices de auto-associação, por exemplo, fechos de leucina, que podem ser também estabilizados por ligações de dissulfeto adicionais. O domínio de oligomerização é designado ser compatível com duplicaão vetorial através de uma membrana, um processo suposto facilitar a duplicação in vivo do polipeptídeo em uma proteína de ligação funcional. Geralmente, minicorpos são produzidos usando métodos recombinantes bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, pack e outro (1992) biochem 31:1579-1584; cumber e outro (1992) j immunology 149b:120-126.

[000173] Peptidomiméticos de ligação semelhantes a anticorpo são também contemplados na presente invenção. Liu e outro cell mol biol (noisy-le-grand). 2003 mar;49(2):209-16 descrevem "antibody like binding peptidomimetics" (abips), que são peptideos que agem como anticorpos sub-pareados e têm certas vantagens de meia-vida mais longa, bem como métodos de síntese menos complicados.

[000174] Anticorpos monoclonais (mabs) são reconhecidos ter certas vantagens, por exemplo, reproducibilidade e produção em larga escala, e seu uso é geralmente preferido. A invenção desse modo fornece anticorpos monoclonais de origem de humano, murino, macaco, rato, hamster, coelho e mesmo frango. Devido à facilidade de preparação e pronta disponibilidade de reagentes, os anticorpos monoclonais de murino frequentemente serão preferidos.

[000175] Entretanto, anticorpos "humanizados" são também contemplados, como são os anticorpos quiméricos de camundongo, rato, ou outras espécies, transportando domínios de região constante e/ou variável humanos, anticorpos bi-específicos, anticorpos recombinantes e construídos e fragmentos destes. Como aqui usado, o termo imunoglobulina "humanizada"refere-se a uma imunoglobulina que compreende uma região de estrutura principal humana e uma ou mais cdr's de uma imunoglobulina não-humana (usualmente um camundongo ou rato). A imunoglobulina não-humana fornecendo as cdr's é chamada a "doadora" e a imunoglobulina humana fornecendo a estrutura principal é chamada a "aceptora". Um "anticorpo humanizado " é um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina de cadeia leve humanizada e uma de cadeia pesada humanizada. C. Métodos exemplares para gerar anticorpos monoclonais

[000176] Métodos exemplares para gerar anticorpos monoclonais (mabs) em geral começam ao longo das mesmas linhagens como aqueles para preparar anticorpos policlonais. Brevemente, um anticorpo policlonal é preparado imunizando um animal com uma composição de lee ou cee de acordo com a presente invenção e colhendo anti-soros daquele animal imunizado.

[000177] Uma gama extensiva de espécies animais pode ser usada para a produção de anti-soros. Tipicamente o animal usado para a produção de anti-soros é um coelho, um camundongo, um rato, um hamster, uma cobaia ou uma cabra. A escolha do animal pode ser decidida na facilidade de manipulação, custos ou da quantidade desejada de soros, como seria conhecido a alguém de habilidade na técnica. Anticorpos da invenção podem também ser transgenicamente produzidos através da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada e luz de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável dela. Com relação à produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem ser produzidos, e restabelecidos, do leite de cabras, vacas, ou outros mamíferos. Vide, por exemplo, patentes u. S. Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, e 5.741.957.

[000178] Como é também bem-conhecido na técnica, a imunogenicidade de uma composição de imunógeno particular pode ser intensificada pelo uso de estimuladores não-específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes adequados incluem todos compostos imunoestimulantes aceitáveis, como citocinas, quimiocinas, co-fatores, toxinas, plasmódios, composições sintéticas ou lees ou cees codificando tais adjuvantes.

[000179] Adjuvantes que podem ser usados incluem il-1, il-2, il-4, il-7, il-12, y-interferona, gmcsp, bcg, hidróxido de alumínio, compostos de mdp, como thur-mdp e nor-mdp, cgp (mtp-pe), lipídio a, e lipídio de monofosforila a (mpl). Ribi, que contém três componentes extraídos de bactérias, mpl, dimicolato de trealose (tdm) e esqueleto de parede celular (cws) em uma emulsão de 2 % de esqualeno/tween 80 é também contemplado. Antígenos de mhc podem ainda ser usados. Adjuvantes freqüentemente preferidos exemplar incluem adjuvante de freund completo (um estimulador não-específico da resposta imune contendo mycobacterium tuberculosis morta), os adjuvantes de freund incompletos e adjuvante de hidróxido de alumínio.

[000180] Além dos adjuvantes, pode ser desejável co-administrar modificadores de resposta biológica (brm), que têm mostrado sobre- regular imunidade de células t ou sub-regular atividade de células supressoras. Tais brms incluem, mas não são limitados a, cimetidina (cim; 1200 mg/d) (smith/kline, pa); ciclofosfamida de dose baixa (cyp; 300 mg/m2) (johnson / mead, nj), citocinas como y-interferona, il-2, ou il- 12 ou genes que codificam proteínas envolvidas em funções de ajudante imune, como b-7.

[000181] A quantidade de composição de imunógeno usada na produção de anticorpos policlonais varia quanto à natureza do imunógeno como também o animal usado para imunização. Uma variedade de vias pode ser usada para administrar o imunógeno incluindo mas não limitadas a subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-epidérmica, intravenosa e intraperitoneal. A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostragem de sangue do animal imunizado em vários pontos seguindo imunização.

[000182] Uma segunda injeção auxiliar (por exemplo, fornecida em uma injeção), pode também ser dada. O processo de reforço e titulação é repetido até que uma titulação adequada seja alcançada. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e o soro isolado e armazenado, e/ou o animal pode ser usado para gerar mabs.

[000183] Para produção de anticorpos policlonais de coelho, o animal pode ser sangrado através de uma veia da orelha ou alternativamente por meio de furo cardíaco. O sangue removido é deixado coagular e depois centrifugado para separar os componentes séricos das células inteiras e coágulos sanguíneos. O soro pode ser usado como se encontra para várias aplicações ou então a fração de anticorpo desejada pode ser purificada através de métodos bem-conhecidos, como cromatografia de afinidade usando outro anticorpo, um peptídeo ligado a uma matriz sólida, ou usando, por exemplo, cromatografia de proteína a ou proteína g.

[000184] Mabs podem ser facilmente preparados mediante o uso de técnicas bem-conhecidas, como às exemplificadas na patente u. S. 4.196.265, incorporada aqui por referência. Tipicamente, esta técnica envolve imunizar um animal adequado com uma composição de imunógeno selecionada, por exemplo, uma proteína purificada ou parcialmente purificada, polipeptídeo, peptídeo ou domínio, seja esta uma composição do tipo selvagem ou mutante. A composição imunizante é administrada de uma maneira eficaz para estimular as células produtoras de anticorpo.

[000185] Os métodos para gerar anticorpos monoclonais (mabs) em geral começam ao longo das mesmas linhagens que aquelas para preparar anticorpos policlonais. Roedores como camundongos e ratos são animais preferidos, porém, o uso de células de coelho, ovelha ou de rã é também possível. O uso de ratos pode prover certas vantagens (goding, 1986, págs. 60-61), mas camundongos são preferidos, com o camundongo balb/c sendo o mais preferido, visto que este é habitualmente usado e em geral dá uma porcentagem mais alta de fusões estáveis.

[000186] Os animais são injetados com antígeno, em geral como descrito acima. O antígeno pode ser misturado com adjuvante, como o adjuvante completo ou incompleto de freund. Administrações de reforço com o mesmo antígeno ou dna que codifica o antígeno ocorreria em intervalos aproximadamente de duas semanas.

[000187] Seguindo imunização, células somáticas com o potencial para produzir anticorpos, especificamente linfócitos b (células b), são selecionadas para o uso no protocolo de geração de mab. Estas células podem ser obtidas de baços, amídalas ou linfonodos submetidos à biopsia, ou de uma amostra de sangue periférico. Células de baço e células sangüíneas periféricas são preferidas, as primeiras porque elas são uma fonte rica de células produtoras de anticorpo que estão no estágio de divisão de plasmablastos, e as últimas porque sangue periférico é facilmente acessível.

[000188] Freqüentemente, um painel de animais terá sido imunizado e o baço de um animal com a titulação de anticorpo mais alta será removido e os linfócitos do baço obtidos homogeneizando o baço com uma seringa. Tipicamente, um baço de um camundongo imunizado contém aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 linfócitos.

[000189] Os linfócitos b produtores de anticorpo do animal imunizado são depois fundidos com células de uma célula de mieloma imortal, em geral uma das mesmas espécies que o animal que foi imunizado. Linhagens celulares de mieloma adaptadas para o uso em procedimentos de fusão de produção de hibridoma preferivelmente são não produtoras de anticorpos, têm eficiência de fusão alta, e deficiências de enzima que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas).

[000190] Qualquer uma de várias células de mieloma pode ser usada, como é conhecido àqueles de habilidade na técnica (goding, págs. 65- 66, 1986; campbell, págs. 75-83, 1984). Menções). Por exemplo, onde o animal imunizado for um camundongo, pode-se usar p3 x63/ag8, x63 ag8.653, ns1/1.ag 4 1, sp210 ag14, fo, nso/u, mpc 11, mpc11 x45 gtg 1.7 e s194/5xx0 bul; para ratos, pode-se usar r210.rcy3, y3 ag 1.2.3, ir983f e 4b210; e u 266, gm1500 grg2, Her lon hmy2 e uc729 6 são todos úteis com relação às fusões de célula humanas. Vide yoo et al., j immunol methods. Março de 2002 1 ;261 (1-2): 1-20, para um debate de sistemas de expressão de mieloma.

[000191] Uma célula de mieloma murino preferida é a linhagem celular de mieloma de ns-1 (também denominada p3-ns-1-ag4-1) que está facilmente disponível do nigms human genetic mutant cell repository requerendo o número de repositório de linhagem celular gm3573. Outra linhagem celular de mieloma de camundongo que pode ser usada é a linhagem celular não-produtora de sp2/0 de mieloma murino de camundongo resistente a 8 azaguanina.

[000192] Métodos para gerar híbridos de células do baço ou linfonodos e células de mieloma produtoras de anticorpos usualmente compreendem misturar as células somáticas com as células de mieloma em uma proporção 2:1, entretanto a proporção pode variar de cerca de 20:1 a cerca de 1:1, respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promovem a fusão das membranas celulares. Métodos de fusão usando vírus de sendai foram descritos por kohler e milstein (1975; 1976), e aqueles usando polietileno glicol (peg), como 37 % (v/v) de peg, por gefter et al., (1977). O uso de métodos de fusão eletricamente induzidos é também apropriado (goding. Págs. 71- 74, 1986).

[000193] Procedimentos de fusão usualmente produzem híbridos viáveis em baixas freqüências, aproximadamente 1 x 10‘6 a 1 x 10-8. Porém, estes não propõem um problema, visto que os híbridos viáveis, fundidos são diferenciados das células parentais não-fundidas (particularmente as células de mieloma não-fundidas que normalmente continuam dividindo indefinidamente) mediante cultivo em um meio seletivo. O meio seletivo é em geral um que contém um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleotídeos nos meios de cultivo de tecido. Agentes exemplares e preferidos são aminopterina, metotrexato e azasserina. Aminopterina e metotrexato bloqueiam a síntese de novo de purinas e pirimidinas, enquanto que azasserina bloqueia apenas a síntese de purina. Onde aminopterina ou metotrexato for usado, os meios são suplementados com hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleotídeos (meio de hat). Onde azasserina for usada, os meios são suplementados com hipoxantina.

[000194] O meio de seleção preferido é hat. Apenas células capazes de operar vias de aproveitamento de nucleotídeos são capazes de sobreviver em meio de hat. As células de mieloma são defeituosas nas enzimas fundamentais da via de aproveitamento, por exemplo, hipoxantina fosforibosil transferase (hprt), e elas não podem sobreviver. As células b podem operar esta via, mas elas têm um período de vida limitado em cultura e em geral morrem dentro de aproximadamente duas semanas. Portanto, as únicas células que podem sobreviver nos meios seletivos são aqueles híbridos formados de células de mieloma e células b.

[000195] Este cultivo fornece uma população de hibridomas da qual hibridomas específicos são selecionados. Tipicamente, seleção de hibridomas é executada cultivando as células por diluição de clone de simples em placas de microtitulação, seguido testando os sobrenadantes clonais individuais (após cerca de duas a três semanas) para a reatividade desejada. O ensaio deveria ser

[000196] Sensível, simples e rápido, tais como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, ensaios de citotoxicidade, ensaios de placa, ensaios de imunoabsorção por ponto e semelhantes.

[000197] Os hibridomas selecionados, então, serão serialmente diluídos e clonados em linhagens de células que produzem anticorpo individuais, clones o quais podem, então, ser propagados indefinidamente para proporcionar mabs. As linhagens de célula podem ser exploradas para produção de mab através de duas formas básicas. Primeiro, uma amostra do hibridoma pode ser injetada (freqüentemente na cavidade peritoneal) em um animal histocompatível do tipo que foi usado para proporcionar as células de mieloma e somáticas para a fusão original (isto é, um camundongo singeneico). Opcionalmente, os animais são produzidos com um hidrocarboneto, especialmente óleos, tal como pristano (tetrametilpentadecano) antes de injeção. O animal injetado desenvolve tumores que secretam o anticorpo monoclonal específico produzido através do híbrido celular. Os fluidos corporais do animal, tais como soro ou fluido de ascite podem, então, ser utilizados para proporcionar mabs em alta concentração. Segundo, as linhagens de células individuais poderiam ser cultivadas in vitro,onde os mabs são naturalmente secretadas no meio de cultura do qual eles podem ser prontamente obtidos em altas concentrações.

[000198] Ainda, expressão de anticorpos da invenção (ou outras porções dos mesmos) a partir de linhagens de células de produção podem ser intensificados usando uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, os sistemas de expressão de gene de dhfr e sintetase de glutamina são abordagens comuns para intensificação de expressão sob determinadas condições. Clones de célula de alta expressão podem ser identificados usando técnicas convencionais, tais como clonagem por diluição limitada e a tecnologia microdrop. O sistema gs é discutido, no todo ou em parte, com relação às patentes européias nos. 0 216 846, 0 256 055 e 0 323 997 e no pedido de patente européia no. 89303964.4.

[000199] Mabs produzidos através de qualquer meio podem ser ainda purificados, se desejado, usando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos, tais como hplc ou cromatografia por afinidade. Fragmentos dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais assim produzidos através de métodos os quais incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína e/ou através de clivagem de ligações de dissulfeto através de redução química. Alternativamente, fragmentos de anticorpo monoclonal abrangidos pela presente invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador automático de peptídeo.

[000200] Também considera-se que uma abordagem de clonagem molecular pode ser usada para gerar monoclonais. Em uma modalidade, bibliotecas de fagemídeo de imunoglobulina combinatoriais são preparadas a partir de rna isolado do baço do animal imunizado e fagemídeos expressando anticorpos apropriados são selecionados através de panning usando células expressando o antígeno e células de controle. As vantagens dessa abordagem com relação às técnicas de hibridoma convencionais são que aproximadamente 104 vezes mais anticorpos podem ser produzidos e selecionados em um único ciclo e que novas especificidades são geradas através de combinação das cadeias h e I, o que aumenta adicionalmente a chance de encontrar anticorpos apropriados. Em outro exemplo, lees ou cees podem ser usados para produzir antígenos in vitrocom um sistema isento de célula. Esses podem ser usados como alvos para varredura de bibliotecas de anticorpo com cadeia simples. Isso permitiria que muitos anticorpos diferentes fossem identificados muito rapidamente sem o uso de animais.

[000201] Outra modalidade da invenção para produção de anticorpos de acordo com a presente invenção é encontrada na patente u.s. No. 6.091.001, onde métodos para produzir uma célula expressando um anticorpo a partir de uma seqüência genômica da célula compreendendo um locusde imunoglobulina modificado usando recombinação sítio-específica cre-mediada são divulgados. O método envolve, primeiro, transfecção de uma célula que produz anticorpo com um vetor de objetivação por homologia compreendendo um sítio lox e uma seqüência de objetivação homóloga a uma primeira seqüência de dna adjacente à região dos locide imunoglobulina da seqüência genômica a qual tem de ser convertida em uma região modificada, de modo que os primeiros locilox são inseridos na seqüência genômica via recombinação homóloga sítio-específica. Então, a célula é transferida com um vetor de lox-objetivação compreendendo um segundo sítio lox adequado para recombinação cre-mediada com o sítio lox integrado e uma seqüência de modificação para converter a região dos locide imunoglobulina à região modificada. Essa conversão é realizada através de interação dos sítios lox com cre In vivo, de modo que a seqüência de modificação insere na seqüência genômica via recombinação sítio- específica cre-mediada dos sítios lox.

[000202] Alternativamente, fragmentos de anticorpo monoclonal abrangidos pela presente invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador automático de peptídeo ou através de expressão do gene de comprimento total ou de fragmentos de gene em e. Coli.

A. Conjugados de anticorpo

[000203] A presente invenção ainda proporciona anticorpos contra proteínas, polipeptídeos e peptídeos de gp36, geralmente do tipo monoclonal, que são ligados a pelo menos um agente para formar o conjugado de anticorpo. De forma a aumentar a eficácia das moléculas de anticorpo como agentes diagnósticos ou terapêuticos, é convencional ligar ou ligar covalentemente ou formar complexo de pelo menos uma molécula ou porção desejada. Tal molécula ou porção pode ser, mas não está limitada a, pelo menos uma molécula efetuadora ou repórter. Moléculas efetuadoras compreendem moléculas tendo uma atividade desejado, por exemplo, atividade citotóxica. Exemplos não- limitativos de moléculas efetuadoras as quais foram presas a anticorpos incluem toxinas, agentes anti-tumor, enzimas terapêuticas, nucleotídeos radio-rotulados, agentes antivirais, agentes de quelação, citocinas, fatores de crescimento e oligo- ou poli-nucleotídeos. Em contraste, uma molécula repórter é definida como qualquer porção a qual pode ser detectada usando um ensaio. Exemplos não limitativos de moléculas repórteres as quais foram conjugadas a anticorpos incluem enzimas, radio-rótulos, haptenos, rótulos fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminescentes, cromóforos, moléculas luminescentes, moléculas de fotoafinidade, partículas ou ligantes coloridos, tal como biotina.

[000204] Qualquer anticorpo de seletividade, especificidade ou afinidade suficiente pode ser empregado como a base para um conjugado de anticorpo. Tais propriedades podem ser avaliadas usando metodologia de seleção imunológica convencional conhecida por aqueles habilitados na técnica. Sítios para ligação à moléculas biológicas ativas na molécula de anticorpo, além dos sítios de ligação a antígeno canônicos, incluem sítios que residem no domínio variável que pode se ligar a patógenos, super-antígenos de célula b, o co-receptor de célula t cd4 e o envelope do hiv-1 (sasso e outros, 1989; shorki e outros, 1991; silvermann e outros, 1995; deary e outros, 1994; lenert e outros, 1990; berberian e outros, 1993; kreier e outros, 1991). Além disso, o domínio variável está envolvido em auto-ligação de anticorpo (kang e outros, 1988) e contém epítopos (idiotipos) reconhecidos por auto-anticorpos (kohler e outros, 1989).

[000205] Determinados exemplos de conjugados de anticorpo são aqueles conjugados nos quais o anticorpo está ligado a um rótulo detectável. "rótulos detectáveis" são compostos e/ou elementos que podem ser detectados em virtude de suas propriedades funcionais específicas e/ou características químicas, o uso dos quais permite que o anticorpo ao qual eles estão presos seja detectado e/ou ainda quantificado se desejado. Outro de tais exemplos é a formação de um conjugado compreendendo um anticorpo ligado a um agente citotóxico ou anti celular e pode ser denominado "imunotoxinas".

[000206] Conjugados de anticorpo são geralmente preferidos para uso como agentes diagnósticos. Produtos diagnósticos de anticorpo geralmente caem em duas classes, aqueles para uso em diagnóstico in vitro,tal como em uma variedade de imunoensaios, e/ou aqueles para uso em protocolos de diagnóstico in vivo, geralmente conhecidos como "formação de imagem anticorpo-dirigida".

[000207] Muitos agentes de formação de imagem apropriados são conhecidos na técnica, assim como métodos para sua fixação a anticorpos (veja, por exemplo, patentes u.s. Nos. 5.021.236; 4.938.948; e 4.472.509, cada uma das quais incorporada aqui por referência). As porções de formação de imagem usadas podem ser íons paramagnéticos; isótopos radioativos; fluorocromas; substâncias nmr- detectáveis; formação de imagem por raio x.

[000208] No caso de íons paramagnéticos, menção poderia ser feita, à guisa de exemplo, a íons tais como cromo (iii), manganês (ii), ferro (iii), ferro (ii), cobalto (ii), níquel (ii), cobre (ii), neodímio (iii), samário (iii), itérbio (iii), gadolínio (iii), vanádio (ii), térbio (iii), disprósio (iii), hólmio (iii) e/ou érbio (iii), com gadolínio sendo particularmente preferido. íons úteis em outros contextos, tal como formação de imagem por raio x incluem, mas não estão limitados a, lantânio (iii), ouro (iii), chumbo (ii) e especialmente bismuto (iii).

[000209] No caso de isótopos radioativos para aplicação terapêutica e/ou diagnóstica, menção poderia ser feita a astatina211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67,152eu, gálio67,3hidrogenio, iodo123, iodo125, iodo131, índio111, 59ferro, 32fósforo, rênio186, rênio188, 75selênio, 35enxofre, tecnício99m e/ou ítrio90. 125i é freqüentemente preferido para uso em determinadas modalidades e tecnício99m e/ou índio111 também são freqüentemente preferidos em virtude de sua baixa energia e adequabilidade para detecção em longa faixa. Anticorpos monoclonais radiativamente rotulados da presente invenção podem ser produzidos de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser iodinados através de contato com iodeto de sódio e/ou potássio e um agente de oxidação química, tal como hipoclorito de sódio, ou um agente de oxidação enzimática, tal como lactoperoxidase. Anticorpos monoclonais de acordo com a invenção podem ser rotulados com tecnécio99m através do processo de troca de ligante, por exemplo, através de redução de pertecnato com solução estanosa, quelação do tecnécio reduzido sobre uma coluna de sephadex e aplicação do anticorpo a essa coluna. Alternativamente, técnicas de rotulação direta podem ser usadas, por exemplo, através de incubação de pertecnato, um agente de redução tal como snch, uma solução tampão tal como solução de ftalato de sódio-potássio e o anticorpo. Grupos funcionais intermediários os quais são freqüentemente usados para ligar radioisótopos os quais existem como íons metálicos ao anticorpo são ácido dietileno triamina pentaacético (dtpa) ou ácido etileno diamina tetraacético (edta).

[000210] Dentre os rótulos fluorescentes considerados para uso como conjugados incluem alexa 350, alexa 430, amca, bodipy 630/650, bodipy 650/665, bodipy-fl, bodipy-r6g, bodipy-tmr, bodipy-trx, cascade blue, cy3, cy5,6-fam, isotiocianato de fluoresceina, hex, 6-joe, Oregon green 488, Oregon green 500, Oregon green 514, pacific blue, reg, rhodamine green, rhodamine red, renographin, rox, tamra, tet, tetrametil-rodamina e/ou texas red.

[000211] Outro tipo de conjugados de anticorpo considerado na presente invenção são aqueles destinados primariamente a uso in vitro, onde o anticorpo é ligado a um ligante de ligação secundário e/ou a uma enzima (uma tag enzimática) que gerará um produto colorido quando de contato com um substrato cromogênico. Exemplos de enzimas adequadas incluem urease, fosfatase alcalina, peroxidase de hidrogênio (armorácia) ou oxidase de glicose. Ligantes de ligação secundários preferidos são biotina e/ou avidina e compostos de estreptavidina. O uso de tais rótulos é bem-conhecido por aqueles habilitados na técnica e é descrito, por exemplo, nas patentes u.s. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241; cada uma das quais incorporada por referência.

[000212] Ainda outro método conhecido de fixação sítio-específica de moléculas a anticorpos compreende a reação de anticorpos com rótulos de afinidade hapteno-baseados. Essencialmente, rótulos de afinidade hapteno-baseados reagem com aminoácidos no sítio de ligação a antígeno, desse modo, destruindo esse sítio e bloqueando a reação antígeno-específica. Contudo, isso pode não ser vantajoso, uma vez que ele resulta em perda de ligação ao antígeno pelo conjugado de anticorpo.

[000213] Moléculas contendo grupos azido também podem ser usadas para formar ligações covalentes à proteínas através de intermediário reativos de nitreno que são gerados através de luz ultravioleta de baixa intensidade (potter & haley, 1983). Em particular, análogos de 2- e 8-azido de nucleotídeos de purina têm sido usados como foto-sondas sítio-dirigidas para identificar proteínas de ligação a nucleotídeo em extratos brutos de célula (owens & haley, 1987; atherton e outros, 1985). Os nucleotídeos de 2- e 8-azido também têm sido usados para mapear domínios de ligação a nucleotídeo de proteínas purificadas khatoon e outros, 1989; king e outros, 1989; e dholakia e outros, 1989) e podem ser usados como agentes de ligação a anticorpo.

[000214] Vários métodos são conhecidos na técnica para a fixação ou conjugação de um anticorpo à sua porção de conjugado. Alguns métodos de fixação envolvem o uso de um complexo de quelato de metal empregando, por exemplo, um agente de quelação orgânico, tal como anidrido de ácido dietileno triamina pentaacético (dtpa); ácido etileno triamina tetraacético; n-cloro-p-tolueno-sulfonamida; e/ou tetracloro-3a, 6a, difenilglicouril-3- fixado ao anticorpo (patentes u.s. Nos. 4.472.509 e 4.938.948, cada uma incorporada aqui por referência). Anticorpos monoclonais também podem ser reagidos com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, tal como glutaraldeído ou periodato. Conjugados com marcadores de fluoresceína são preparados na presença desses agentes de acoplamento ou através de reação com um isotiocianato. Na patente u.s. No. 4.938.948, formação de imagem de tumores de mama é obtida usando anticorpos monoclonais e as porções de formação de imagem detectáveis são ligadas ao anticorpo usando ligantes, tais como metil-p- hidróxibenzimidato ou n-succinimidil-3-(4-hidróxifenil)propionato.

[000215] Em outras modalidades, derivatização de imunoglobulinas através de introdução seletiva de grupos sulfidrila na região fc de uma imunoglobulina, usando condições de reação que não alteram o sítio de combinação do anticorpo é considerada. Conjugados de anticorpo produzidos de acordo com essa metodologia são divulgados como exibindo longevidade, especificidade e sensibilidade aperfeiçoada (pat. U.s. No. 5.196.066, incorporada aqui por referência). Fixação sítio- específica de moléculas efetuadoras ou repórteres em que a molécula efetuadora ou repórter é conjugada a um resíduo de carboidrato na região fc também foi divulgada na literatura (o'shannessy e outros, 1987). Essa abordagem foi reportada como produzindo anticorpos diagnóstica e terapeuticamente promissores os quais estão atualmente em avaliação clínica.

[000216] Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-gp36 são ligados a nanocristais semicondutores, tais como aqueles descritos nas patentes u.s. Nos. 6.048.616; 5.990.479; 5.690.807; 5.505.928; 5.262.357 (todas as quais são incorporadas aqui em suas totalidades); bem como publicação pct no. 99/26299 (publicada em 27 de maio de 1999). Em particular, materiais exemplificativos para uso como nanocristais semicondutores nos ensaios biológicos e químicos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos acima, incluindo semicondutores dos grupos ii-vi, iii-v e do grupo iv, tais como zns, znse, znte, eds, edse, cdte, mgs, mgse, mgte, cas, case, cate, srs, srse, srte, bas, base, bate, gan, gap, gaas, gasb, inp, inas, insb, ais, alp, alsb, pbs, pbse, ge e misturas terciárias e quaternárias dos mesmos. Métodos para ligação de nanocristais semicondutores a anticorpos são descritos nas patentes u.s. Nos. 6.630.307 e 6.274.323.

B. Métodos de imunodeteccão

[000217] Em ainda outras modalidades, a presente invenção se refere a métodos de imunodetecção para ligação, purificação, remoção, quantificação e/ou de outro modo detecção em geral de componentes biológicos, tais como polipeptídeos imuno-reativos. Os anticorpos preparados de acordo com a presente invenção podem ser empregados para detectar proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos do tipo selvagem e/ou mutantes. O uso de anticorpos do tipo selvagem e/ou mutantes é considerado. Alguns métodos de imunodetecção incluem ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (elisa), radioimunoensaio (ria), ensaio imuno-radiométrico, fluoroimunoensaio, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente e western blot, para mencionar uns poucos. As etapas de vários métodos de imunodetecção úteis foram descritas na literatura científica tal como, por exemplo, doolittle mh e ben-zeev o, 1999; gulbis b e galand p, 1993; de jager r e outros, 1993; e nakamura e outros, 1987, cada um incorporado aqui por referência.

[000218] Em geral, os métodos de imunoligação incluem obtenção de uma amostra suspeita de compreender proteína, polipeptídeo e/ou peptídeo e contato da amostra com um primeiro anticorpo anti-gp36 (ou gp47) de acordo com a presente invenção, conforme possa ser o caso, sob condições eficazes para permitir a formação de imunocomplexos.

[000219] Esses métodos incluem métodos para purificação de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos do tipo selvagem e/ou mutantes, conforme pode ser empregado na purificação de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos do tipo selvagem e/ou mutantes de amostras do paciente e/ou para purificação de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos do tipo selvagem ou mutantes recombinantemente expressos. Nesses casos, o anticorpo remove o componente de proteína, polipeptídeo e/ou peptídeo do tipo selvagem e/ou mutante antigênico de uma amostra. O anticorpo, de preferência, será ligado a um suporte sólido, tal como na forma de uma matriz de coluna, e a amostra suspeita de conter o componente antigênico de proteína do tipo selvagem ou mutante será aplicada ao anticorpo imobilizado. Os componentes indesejados serão lavados da coluna, deixando o antígeno em imunocomplexo com o anticorpo imobilizado, antígeno de proteína do tipo selvagem ou mutante o qual é, então, coletado através de remoção da proteína e/ou peptídeo do tipo selvagem e/ou mutante da coluna.

[000220] Os métodos de imunoligação também incluem métodos para detecção e quantificação da quantidade de um componente reativo de proteína do tipo selvagem ou mutante em uma amostra e a detecção e quantificação de quaisquer complexos imunes formados durante o processo de ligação. Aqui, se obteria uma amostra suspeita de compreender uma proteína e/ou peptídeo do tipo selvagem ou mutante ou suspeita de compreender um organismo e. Canis e contato da amostra com um anticorpo contra a proteína e/ou peptídeo do tipo selvagem ou mutante e, então, detecção e quantificação da quantidade de complexos imunes formados sob as condições específicas.

[000221] Em termos de detecção de antígeno, a amostra biológica analisada pode ser qualquer amostra que é suspeita de conter um antígeno proteína-específico do tipo selvagem ou mutante, tal como um espécime, um extrato tecidual homogeneizado, uma célula, formas separadas e/ou purificadas de qualquer uma das composições contendo proteína do tipo selvagem ou mutante acima ou mesmo qualquer fluido biológico que entra em contato com um organismo e. Canis quando de infecção.

[000222] Contato da amostra biológica escolhida com o anticorpo sob condições eficazes e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes primários) é geralmente uma questão simplesmente de adicionar a composição de anticorpo à amostra e incubação da mistura durante um período de tempo longo o bastante para que os anticorpos formem complexos imunes, isto é, se liguem a, quaisquer antígenos de proteína presentes. Após esse período, a composição de amostra-anticorpo, tal como seção tecidual, lâmina de elisa, dot blot ou western blot, geralmente será lavada para remover quaisquer espécies de anticorpo não especificamente ligadas, permitindo que apenas aqueles anticorpos especificamente ligados dentro dos complexos imunes primários sejam detectados.

[000223] Em geral, a detecção de formação de imunocomplexo é bem-conhecida na técnica e pode ser obtida através da aplicação de numerosas abordagens. Esses métodos são, em geral, baseados sobre a detecção de um rótulo ou marcador, tal como qualquer uma daquelas tags radioativas, fluorescentes, biológicas e enzimáticas. Patentes u.s. Referentes ao uso de tais rótulos incluem 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241, cada uma incorporada aqui por referência. Naturalmente, pode-se encontrar vantagens adicionais através do uso de um ligante de ligação secundário, tal como um anticorpo secundário e/ou uma estrutura principal de ligação de ligante de biotina/avidina, conforme é conhecido na técnica.

[000224] O anticorpo empregado na detecção pode, em si, ser ligado a um rótulo detectável, em que se poderia simplesmente detectar esse rótulo, desse modo, permitindo que a quantidade de complexos imunes primários na composição fosse determinada. Alternativamente, o primeiro anticorpo que se torna ligado dentro dos complexos imunes primários pode ser detectado por meio de um segundo ligante de ligação que tem afinidade de ligação pelo anticorpo. Nesses casos, o segundo ligante de ligação pode ser ligado a um rótulo detectável. O segundo ligante de ligação é, em si, freqüentemente, um anticorpo, o qual pode, assim, ser denominado um anticorpo "secundário". Os complexos imunes primários são contatados com o ligante de ligação ou anticorpo secundário rotulado, sob condições eficazes e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários são, então, geralmente lavados para remover quaisquer anticorpos ou ligantes secundários não especificamente rotulados e o rótulo restante nos complexos imunes secundários é, então, detectado.

[000225] Outros métodos incluem a detecção de complexos imunes primários através de uma abordagem em duas etapas. Um segundo ligante de ligação, tal como um anticorpo, que tem afinidade de ligação pelo anticorpo, é usado para formar complexos imunes secundários, conforme descrito acima. Após lavagem, os complexos imunes secundários são contatados com um terceiro ligante ou anticorpo de ligação que tem afinidade de ligação pelo anticorpo secundário, novamente sob condições eficazes e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes terciários). O terceiro ligante ou anticorpo é ligado a um rótulo detectável, permitindo a detecção dos complexos imunes terciários assim formados. Esse sistema pode proporcionar amplificação de sinal se isso é desejado.

[000226] Um método de imunodetecção usa dois anticorpos diferentes. Em uma primeira etapa, um anticorpo policlonal ou monoclonal biotinilado é usado para detectar o(s) antígeno(s) alvo e, em uma segunda etapa, o anticorpo é, então, usado para detectar a biotina presa à biotina em complexo. Nesse método, a amostra a ser testada é primeiro incubada em uma solução contendo o anticorpo da primeira etapa. Se o antígeno alvo está presente, um pouco do anticorpo se liga ao antígeno para formar um complexo de anticorpo/antígeno biotinilado. O complexo de anticorpo/antígeno é, então, amplificado através de incubação em soluções sucessivas de estreptavidina (ou avidina), dna biotinilado e/ou dna biotinilado complementar, com cada etapa adicionando sítios de biotina adicionais ao complexo de anticorpo/antígeno. As etapas de amplificação são repetidas até que um nível adequado de amplificação seja obtido, ponto no qual a amostra é incubada em uma solução contendo o anticorpo da segunda etapa contra biotina. Esse anticorpo da segunda etapa é rotulado, como por exemplo como uma enzima que pode ser usada para detectar a presença do complexo de anticorpo/antígeno através de histoenzimologia usando um substrato de cromogênio. Com amplificação adequada, um conjugado pode ser produzido o qual é macroscopicamente visível.

[000227] Outro método conhecido de imunodetecção toma vantagem da metodologia de imuno-pcr (reação em cadeia de polimerase). O método de per é similar ao método cantor até a incubação com dna biotinilado, contudo, ao invés de múltiplos ciclos de incubação de dna biotinilado e estreptavidina, o complexo de dna/biotina/estreptavidina/anticorpo é lavado com um tampão com elevado teor de sal ou baixo ph que libera o anticorpo. A solução de lavagem resultante é, então, usada para realizar uma reação de per com primers adequados com controles apropriados. Pelo menos em teoria, a enorme capacidade de amplificação e especificidade de per podem ser utilizadas para detectar uma molécula de antígeno simples.

[000228] Os métodos de imunodetecção da presente invenção têm utilidade evidente no diagnóstico e prognóstico de condições tais como várias formas de doenças hiperproliferativas, tais como câncer, incluindo leucemia, por exemplo. Aqui, uma amostra biológica e/ou clínica suspeita de conter uma proteína, polipeptídeo, peptídeo e/ou mutante do tipo selvagem ou mutante é usada. Contudo, essas modalidades também têm aplicações à amostras não-clínicas, tal como na titulação de amostras de antígeno ou anticorpo, por exemplo, na seleção de hibridomas.

C. Elisas

[000229] Conforme detalhado acima, imunoensaios, em seu sentido mais simples e/ou direto, são ensaios de ligação. Determinados imunoensaios preferidos são os vários tipos de ensaios imunoabsorventes enzima-ligados (elisa) e/ou radioimunoensaios (ria) conhecidos na técnica. Detecção imunohistoquímica usando seções teciduais também é particularmente útil. Contudo, será prontamente apreciado que a detecção não está limitada a tais técnicas e/ou western blotting, dot blotting, análise porfacs e/ou semelhante podem também ser usados.

[000230] Em um elisa exemplificativo, os anticorpos da invenção são imobilizados sobre uma superfície selecionada exibindo afinidade por proteína, tal como uma cavidade em uma lâmina de microtitulação de poliestireno. Então, uma composição de teste suspeita de conter o antígeno de proteína do tipo selvagem e/ou mutante, tal como uma amostra clínica, é adicionada às cavidades. Após ligação e/ou lavagem para remover os complexos imunes não especificamente ligados, o antígeno de proteína do tipo selvagem e/ou mutante pode ser detectado. Detecção é, em geral, obtida através da adição de outro anticorpo que está ligado a um rótulo detectável. Esse tipo de elisa é um "elisa em sanduíche" simples. Detecção também pode ser obtida através da adição de um segundo anticorpo, seguido pela adição de um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, com o terceiro anticorpo sendo ligado a um rótulo detectável.

[000231] Em outro elisa exemplificativo, as amostras suspeitas de conter o antígeno de proteína do tipo selvagem e/ou mutante são imobilizadas sobre a superfície da cavidade e/ou, então, contatadas com os anticorpos da invenção. Após ligação e/ou lavagem para remover complexos imunes não especificamente ligados, os anticorpos ligados são detectados. Onde os anticorpos iniciais são ligados a um rótulo detectável, os complexos imunes podem ser detectados diretamente. Novamente, os complexos imunes podem ser detectados usando um anticorpo secundário que tem afinidade de ligação pelo primeiro anticorpo, com o segundo anticorpo sendo ligado a um rótulo detectável.

[000232] Outro elisa no qual as proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos mutantes e/ou do tipo selvagem são imobilizados envolve o uso de competição de anticorpo na detecção. Em

Parte 4

[000233] Este elisa, anticorpos marcados contra proteína do tipo selvagem ou mutante são adicionados aos poços, deixados ligar, e/ou detectados por meio de sua marcação. A quantidade de antígeno de proteína do tipo selvagem ou mutante em uma amostra desconhecida é depois determinada misturando a amostra com os anticorpos marcados contra o tipo selvagem e/ou mutante antes e/ou durante a incubação com poços revestidos. A presença da proteína do tipo selvagem e/ou mutante na amostra atua para reduzir a quantidade de anticorpo contra a proteína do tipo selvagem ou de mutante disponível para ligar ao poço e desse modo reduz o último sinal. Isto é também apropriado para detectar anticorpos contra proteína do tipo selvagem ou mutante em uma amostra desconhecida onde os anticorpos não-marcados ligam aos poços revestidos com antígeno e também reduzem a quantidade de antígeno disponível para ligar os anticorpos marcados.

[000234] Independente do formato empregado, elisas têm certas características em comum, como revestimento, incubação e ligação, lavagem para não-especificamente remover as espécies ligadas, e detectar os complexos imunes ligados. Estas são descritas abaixo.

[000235] Revestimento de uma placa ou com antígeno ou anticorpo, em geral incubar-se-á os poços da placa com uma solução do antígeno ou anticorpo, ou durante a noite ou durante um período especificado de horas. Os poços da placa depois serão lavados para remover material incompletamente adsorvido. Qualquer superfície disponível restante dos poços é depois "revestida" com uma proteína não-específica que é antigenicamente neutra com respeito aos anti-soros de teste. Estes incluem albumina de soro bovino (bsa), soluções de caseína ou de pó de leite. O revestimento permite bloquear os sítios de adsorção não- específicos na superfície de imobilização e desse modo reduz a base causada pela ligação não-específica dos anti-soros sobre a superfície.

[000236] Em elisas, é provavelmente mais habitual usar um meio de detecção secundário ou terciário ao invés de um procedimento direto. Desse modo, após ligação de uma proteína ou anticorpo ao poço, revestimento com um material não-reativo para reduzir a base, e lavagem para remover o material não-ligado, a superfície de imobilização é contatada com a amostra biológica a ser testada sob condições eficazes para permitir formação de complexo imune (antígeno/anticorpo). Detecção do complexo imune depois requer um ligando de ligação ou anticorpo secundário marcado, e um ligando de ligação ou anticorpo secundário junto com um anticorpo terciário marcado ou um terceiro ligando de ligação.

[000237] Sob condições eficazes para permitir formação de complexo imune (antígeno/anticorpo)" significa que as condições preferivelmente incluem diluir os antígenos e/ou anticorpos com soluções como bsa, globulina gama bovina (bgg) ou solução salina tamponada com fosfato (pbs)Ztween. Estes agentes adicionados também tendem a ajudar na redução da base não-específica.

[000238] As condições "adequadas" também significam a incubação está em uma temperatura ou durante um período de tempo suficiente para permitir ligação eficaz. Etapas de incubação são tipicamente de cerca de 1 a 2 a 4 horas ou assim por diante, em temperatura preferivelmente na ordem de 25° c a 27° c, ou pode ser durante a noite em cerca de 4o c ou assim por diante.

[000239] Seguindo todas as etapas de incubação em um elisa, a superfície contatada é lavada para remover o material não-complexado. Um procedimento de lavagem preferido inclui lavagem com uma solução como pbs/tween, ou tampão de borato. Seguindo a formação de complexos imunes específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado, e lavagem subseqüente, a ocorrência de quantidades ainda minuciosas de complexos imunes pode ser determinada.

[000240] Para fornecer um meio de detecção, o segundo ou terceiro anticorpo terá uma marcação associada para permitir a detecção. Preferivelmente, esta será uma enzima que gerará desenvolvimento de cor ao incubar com um substrato cromogênico apropriado. Desse modo, por exemplo, desejar-se-á contatar ou incubar o primeiro e segundo complexo imune com uma uréase, glicose oxidase, fosfatase alcalina ou anticorpo conjugado com peroxidase de hidrogênio durante um período de tempo e sob condições que favorecem o desenvolvimento de outra formação de complexo imune (por exemplo, incubação durante 2 horas em temperatura ambiente em uma solução contendo pbs como pbs- tween).

[000241] Após incubação com o anticorpo marcado, e subseqüente à lavagem para remover o material não-ligado, a quantidade de marcação é quantificada, por exemplo, por incubação com um substrato cromogênico como uréia, ou bromocresol púrpura, ou ácido 2,2’-azino- di-(3-etil-benztiazolino-6-sulfônico (abts), ou h2θ2, no caso de peroxidase como a marcação de enzima. Quantificação é depois alcançada medindo o grau de cor gerada, por exemplo, usando um espectrofotômetro de espectros visíveis.

Imunoistoquímica

[000242] Os anticorpos da presente invenção podem também ser usados juntos com ambos os blocos de tecido embebidos em parafina congelados frescos e/ou fixados em formalina preparados para estudo através de imunoistoquímica (ihc). O método de preparar os blocos de tecido destes espécimes particulados foi de forma bem sucedida usado em estudos de ihc anteriores de vários fatores prognósticos, e/ou é bem-conhecido àqueles de habilidade na técnica (bronw et al., 1990; abbondanzo et al., 1990; allred et al., 1990).

[000243] Brevemente, a seção congelada pode ser preparada reidratando 50 ng de tecido pulverizado "congelado"em temperatura ambiente em solução salina tamponada com fosfato (pbs) em cápsulas de plástico pequenas; empelotando as partículas através de centrifugação; ressuspendendo elas em um meio de embebimento viscoso (oct); invertendo a cápsula e/ou empelotando novamente através de centrifugação; congelando instantâneo em 70° c de isopentano; cortando a cápsula de plástico e/ou removendo o cilindro congelado de tecido; prendendo o cilindro de tecido em uma placa de mandril de micrótomo de criostato; e/ou cortando 25-50 seções seriais.

[000244] Seções permanentes podem ser preparadas por um método similar que envolve reidratação dos 50 mg de amostra em um tubo de microfuge de plástico; empelotamento; ressuspensão em 10 % de formalina para fixação de 4 horas; lavagem/empelotamento; ressuspensão em 2,5 % de ágar morno; empelotamento; esfriamento em água de gelo para endurecer o ágar; remoção do bloco de tecido/agar do tubo; infiltração e/ou embebimento do bloco em parafina; e/ou picamento de 50 seções permanentes seriais.

Microscopia de imunoelétron

[000245] Os anticorpos da presente invenção podem também ser usados juntos com microscopia de elétron para identificar os componentes intracelulares do tecido. Brevemente, uma marcação densa de elétrons é direta ou indiretamente conjugada com o anticorpo. Exemplos de marcações densas de elétrons de acordo com a invenção são ferritina e ouro. A marcação densa de elétrons absorve os elétrons e pode ser visualizada pelo microscópio de elétron.

Kits de imunodetecção

[000246] Em ainda modalidades adicionais, a presente invenção concerne a kits de imunodetecção para o uso com os métodos de imunodetecção descritos acima. Como os anticorpos em geral são usados para detectar proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos do tipo selvagem e/ou mutantes, os anticorpos preferivelmente serão incluídos no kit. Porém, kits incluindo ambos tais componentes podem ser fornecidos. Os kits de imunodetecção desse modo compreenderão, em meios de recipiente adequados, um primeiro anticorpo que liga a uma proteína, polipeptídeo e/ou peptídeo do tipo selvagem e/ou mutante, e/ou opcionalmente, um reagente de imunodetecção e/ou também opcionalmente, uma proteína e/ou mutante, polipeptídeo e/ou peptídeo do tipo selvagem.

[000247] Em modalidades preferidas, anticorpos monoclonais serão usados. Em certas modalidades, o primeiro anticorpo que liga à proteína, polipeptídeo e/ou peptídeo do tipo selvagem e/ou mutante pode ser pré-ligado a um suporte sólido, como uma matriz de coluna e/ou poço de uma placa de microtitulação.

[000248] Os reagentes de imunodetecção do kit podem ter qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo aquelas marcações detectáveis que estão associadas e/ou ligadas ao anticorpo dado. Marcações detectáveis que estão associadas e/ou ligadas a um ligando de ligação secundário são também contempladas. Ligandos secundários exemplares são aqueles anticorpos secundários que têm afinidade de ligação para o primeiro anticorpo.

[000249] Outros reagentes de imunodetecção adequados para o uso nos kits presentes incluem o reagente de dois componentes que compreende um anticorpo secundário que tem afinidade de ligação para o primeiro anticorpo, junto com um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação para o segundo anticorpo, o terceiro anticorpo sendo ligado a uma marcação detectável. Como observado acima, várias marcações exemplares são conhecidas na técnica e/ou todas tais marcações podem ser empregadas com relação à presente invenção.

[000250] Os kits podem também compreender uma composição adequadamente aliquotada da proteína, polipeptídeo e/ou polipeptídeo do tipo selvagem e/ou mutante, marcado e/ou não-marcado, como pode ser usado para preparar uma curva padrão para um ensaio de detecção. Os kits ou podem conter conjugados de marcação de anticorpo em forma completamente conjugada, na forma de intermediários, e/ou como metades separadas a ser conjugadas pelo usuário do kit. Os componentes dos kits podem ser empacotados em meios aquosos e/ou na forma liofilizada.

[000251] Os meios de recipiente dos kits serão adequáveis alojados e em geral incluirão pelo menos um frasco de vidro, tubo de teste, frasco, garrafa, seringa e/ou outros meios de recipiente aos quais o anticorpo pode ser colocado, e/ou preferivelmente, adequadamente aliquotado. Onde proteína, polipeptídeo e/ou peptídeo de gp36 do tipo selvagem e/ou mutante, e/ou um segundo e/ou terceiro ligando de ligação e/ou componente adicional for(em) fornecido(s), o kit também em geral conterá um segundo, terceiro e/ou outro recipiente adicional ao qual este ligando e/ou componente pode(m) ser colocado(s). Os kits da presente invenção também tipicamente incluirão um meio para conter o anticorpo, antígeno, e/ou qualquer outro recipiente de reagente em confinamento íntimo para venda comercial. Tais recipientes podem incluir injeção e/ou recipientes de plástico moldados a sopro aos quais os frascos desejados são retidos.

Preparações farmacêuticas

[000252] É também contemplado que composições farmacêuticas podem ser preparadas usando as composições novas da presente invenção. Em um tal caso, a composição farmacêutica compreende a composição ativa nova da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma pessoa tendo habilidade usual nesta técnica poderia facilmente determinar, sem experimentação imprópria, as dosagens apropriadas e vias de administração do componente ativo da presente invenção.

[000253] A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se às entidades e composições moleculares que não produzem uma reação desfavorável alérgica ou similar quando administradas a um sujeito. A preparação de uma composição aquosa contendo uma proteína como um ingrediente ativo é bem entendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, ou como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsificada.

[000254] Em geral, uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um polipeptídeo, polinucleotídeo, ou anticorpo de gp36 de e. Canis e/ou um polipeptídeo, polinucleotídeo, ou anticorpo de gp47 de e. Chaffeensis, e/ou misturas destes.

[000255] Uma proteína pode ser formulada em uma composição em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácidos hidroclóricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e outros. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e outros.

[000256] Sob formulação, soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade como é terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem como soluções injetáveis.

[000257] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deveria ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido tornado isotônico primeiro com solução salina suficiente ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos àqueles de habilidade na técnica levando em conta a descrição presente. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 ml de solução de nacl isotônica e ou adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no sítio proposto de infusão, (vide por exemplo, "remington’s pharmaceutical sciences, 15a edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá, necessariamente dependendo da condição do ser sujeito tratado. A pessoa responsável pela administração, em todo caso, determinará a dose apropriada para o sujeito individual.

[000258] Composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais agentes que alvejam um polipeptídeo ou a secreção deste ou agente adicional dissolvido ou disperso em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases "farmacêutico", "farmaceuticamente aceitável", ou "farmacologicamente aceitável"referem-se às entidades e composições moleculares que não produzem uma reação desfavorável adversa, alérgica ou outra quando administradas a um animal, como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica contendo pelo menos um agente que alveja o polipeptídeo ou a secreção deste e/ou ingrediente ativo adicional será conhecida àqueles de habilidade na técnica levando em conta a descrição presente, como exemplificado por remington’s pharmaceutical sciences, 18a ed. Mack printing company, 1990, incorporada aqui por referência. Além disso, para administração animal (por exemplo, humano), é para ser entendido que as preparações deveriam satisfazer os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e de pureza como requerido pelo fda office of biological standards.

[000259] Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, preservativos (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes retardantes de absorção, sais, preservativos, fármacos, estabilizantes de fármaco, géis, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, tinturas, como tais materiais e combinações destes, como seria conhecido a alguém de habilidade usual na técnica (vide, por exemplo, as remington’s pharmaceutical sciences, 18a ed. Mack printing company, 1990, págs. 1289-1329, incorporada aqui por referência). Desde que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplado.

[000260] A invenção pode compreender tipos diferentes de veículos dependendo se é para ser administrado na forma sólida, líquida ou de aerossol, e se necessita ser estéril para tais vias de administração como injeção. A presente invenção pode ser administrada intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intraarticular intraprostática, intrapleural, intratraqueana, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, localmente, inalação (por exemplo, inalação de aerossol), injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada banhando células-alvos diretamente, por meio de um cateter, por meio de uma lavagem, em cremes, em composições de lipídio (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação dos antecedentes como seria conhecido a alguém de habilidade usual na técnica (vide, por exemplo, remington’s pharmaceutical sciences, 18a ed. Mack printing company, 1990, incorporada aqui por referência).

[000261] A quantidade de dosagem atual de uma composição da presente invenção administrada a um paciente animal pode ser determinada através de fatores físicos e fisiológicos como peso do corpo, gravidade da condição, o tipo de doença sendo tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou simultâneas, idiopatia do paciente e da via de administração. O médico responsável pela administração, em todo caso, determinará a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual.

[000262] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1 % de um composto ativo. Em outras modalidades, o um composto ativo pode compreender entre cerca de 2 % a cerca de 75 % do peso da unidade, ou entre cerca de 25 % a cerca de 60 %, por exemplo, e qualquer faixa derivável dela. Em outros exemplos não-limitativos, uma dose pode também compreender de cerca de 1 micrograma/kg/peso do corpo, cerca de 5 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 10 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 50 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 100 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 200 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 350 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 500 microgramas/kg/peso do corpo, cerca de 1 miligrama/kg/peso do corpo, cerca de 5 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 10 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 50 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 100 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 200 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 350 miligramas/kg/peso do corpo, cerca de 500 miligramas/kg/peso do corpo, a cerca de 1000 mg/kg/peso do corpo ou mais por administração, e qualquer faixa derivável dela. Em exemplos não-limitativos de uma faixa derivável dos números listados aqui, uma faixa de cerca de 5 mg/kg/peso do corpo a cerca de 100 mg/kg/peso do corpo, cerca de 5 microgramas/kg/peso do corpo a cerca de 500 miligramas/kg/peso do corpo, etc., pode ser administrada, com base nos números descritos acima.

[000263] Em todo caso, a composição pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componente. Adicionalmente, a prevenção da ação de microorganismos pode ser provocada através de preservativos como vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo mas não limitados a parabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou combinações destes.

[000264] A invenção pode ser formulada em uma composição em uma forma de base livre, neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos de amino livres de uma composição proteinácea, ou que são formados com ácidos inorgânicos por exemplo, ácidos hidroclóricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férricos; ou tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína.

[000265] Em modalidades onde a composição está em uma forma líquida, um veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que compreende mas não é limitado a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, etc), lipídios (por exemplo, triglicerídeos, óleos vegetais, lipossomas) e combinações destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como lecitina; pela manutenção do tamanho de partícula requerido por dispersão em veículos como, por exemplo poliol líquido ou lipídios; pelo uso de tensoativos como, por exemplo hidroxipropilcelulose; ou combinações destes tais métodos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio ou combinações destes.

[000266] Em outras modalidades, pode-se usar colírios, soluções nasais ou pulverizações, aerossóis ou inalantes na presente invenção. Tais composições são em geral projetadas para ser compatíveis com o tipo de tecido alvo. Em um exemplo não-limitativo, as soluções nasais são soluções usualmente aquosas projetadas para ser administradas às passagens nasais em gotas ou pulverizações. Soluções nasais são preparadas de forma que elas sejam em muitos aspectos similares às secreções nasais, de forma que ação ciliar normal seja mantida. Desse modo, em modalidades preferidas as soluções nasais aquosas são usualmente isotônicas ou ligeiramente tamponadas para manter um ph de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Além disso, preservativos antimicrobianos, similares àqueles usados em preparações oftálmicas, fármacos, ou estabilizantes de fármaco apropriados, se preciso for, podem ser incluídos na formulação. Por exemplo, várias preparações nasais comerciais são conhecidas e incluem fármacos como antibióticos ou anti-histamínicos.

[000267] Em certas modalidades, a composição é preparada para administração portais vias como ingestão oral. Nestas modalidades, a composição sólida pode compreender, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina de casca dura ou macia), formulações de liberação contínua, composições bucais, trociscos, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, ou combinações destes. Composições orais podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta. Veículos preferidos para administração oral compreendem diluentes inertes, veículos comestíveis assimiláveis ou combinações destes. Em outros aspectos da invenção, a composição oral pode ser preparada como um xarope ou elixir. Um xarope ou elixir, e pode compreender, por exemplo, pelo menos um agente ativo, um agente adoçante, um conservante, um agente aromatizante, uma tintura, um conservante, ou combinações destes.

[000268] Em certas modalidades preferidas uma composição oral pode compreender um ou mais aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes aromatizantes, e combinações destes. Em certas modalidades, uma composição pode compreender um ou mais dos seguintes: um aglutinante, como, por exemplo, tragacanto de goma, acácia, amido de milho, gelatina ou combinações destes; um excipiente, como, por exemplo, fosfato de dicálcio, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio ou combinações destes; um agente desintegrante, como, por exemplo, amido de milho, amido de batata, ácido algínico ou combinações destes; um lubrificante, como, por exemplo, estearato de magnésio; um agente adoçante, como, por exemplo, sucrose, lactose, sacarina ou combinações destes; um agente aromatizante, como, por exemplo hortelã, óleo de gaultéria, condimento de cereja, condimento de laranja, etc.; ou combinações destes antecedentes. Quando a forma de unidade de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, veículos como um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para do contrário modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, tabletes, pílulas, ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos.

[000269] Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios. Supositórios são formas de dosagem de sólidas de vários pesos e formas, usualmente medicativas, para inserção no reto, vagina ou uretra. Após inserção, supositórios amolecem, fundem ou dissolvem-se nos fluidos de cavidade. Em geral, para supositórios, os veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis, triglicerídeos ou combinações destes. Em certas modalidades, os supositórios podem ser formados de misturas contendo, por exemplo, o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5 % a cerca de 10 %, e preferivelmente cerca de 1 % a cerca de 2 %.

[000270] Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido através de esterilização filtrada. Em geral, dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril contendo o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsão, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou secagem por esfriamento que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de um meio líquido previamente filtrado estéril destes. O meio líquido deveria ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente. A preparação de composições altamente concentradas para injeção direta é também contemplada, onde o uso de DMSO como solvente é pressentido resultar em penetração extremamente rápida, liberando concentrações altas dos agentes ativos a uma área pequena.

[000271] A composição deve ser estável sob as condições de manufatura e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de microorganismos, como bactérias e fungos. Será apreciado que contaminação de endotoxina deveria ser mantida mínima em um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína.

[000272] Em modalidades particulares, absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que tardam a absorção, como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações destes.

KITS EXEMPLARES DA INVENÇÃO

[000273] Em modalidades particulares da invenção, é alojado um kit em um recipiente adequado. O kit pode ser adequado para diagnose, tratamento, e/ou proteção para um indivíduo de ehrlichia,como ehrlichia canis, ehrlichia chaffeensis, ou ambos. Em modalidades particulares, o kit compreende em um recipiente adequado e um agente que alveja um antígeno de gp36 de e. Canis ou um antígeno de gp47 de e. Chaffeensis. O agente pode ser um anticorpo, uma molécula pequena, polinucleotpideo, um polipeptídeo, um peptídeo, ou uma mistura destes. O agente pode ser fornecido no kit em uma forma adequada, tal como estéril, liofilizada, ou ambas, por exemplo. Nas modalidades particulares, o kit compreende um ou mais dos seguintes: 1) um anticorpo contra uma ou mais das seq id no: 22, seq id no: 37, seq id no: 38 ou seq id no: 39 (para e. Canis)', 2) um anticorpo contra uma ou mais das seq id no: 23, seq id no: 24, seq id no: 40 ou seq id no: 41 (para e. Chaffeensis)',e/ou 3) seq id no: 22, seq id no: 37, seq id no: 38 ou seq id no: 39 (para e. Canis) e/ou seq id no: 23, seq id no: 24, seq id no: 40 ou seq id no: 41 (para e. Chaffeensis) e/ou suas proteínas relacionadas. Outras composições relacionadas imunogênicas relacionadas a e. Canis gp36 ou e. Chaffeensis gp47 (incluindo polipeptídeos, peptídeos ou anticorpos) não especificamente aqui apresentadas podem também ser incluídas.

[000274] O kit pode ainda compreender um ou mais aparelhos para liberação de uma composição a um indivíduo em necessidade deste. O aparelho pode incluir uma seringa, conta-gotas oculares, agulha, ferramenta de biópsia, cureta, cateter, e assim por diante, por exemplo.

[000275] Nas modalidades em que o kit seja empregado para finalidades de diagnóstico, ele pode ainda fornecer uma ou mais composições de detecção ou aparelhos para identificar um antígeno de e. Canis gp36, um antígeno de e. Chaffeensis gp47, ou ambos. Uma tal modalidade pode empregar um rótulo detectável, tal como para um anticorpo, por exemplo, e o rótulo pode ser fluorescente, quimioluminescente ou colorimétrico, por exemplo.

Exemplos

[000276] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado por aqueles de experiência na técnica, que as técnicas apresentadas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção e, assim, podendo ser consideradas como constituindo modalidades preferidas para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica devem, à luz do presente relatório descritivo, observar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são apresentadas, e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1

[000277] As seguintes descrições fornecem materiais e métodos meramente exemplares utilizados na invenção.

[000278] Ehrlichiae and purification. E. Canis (isolados de jake, Oklahoma e demon) e e. Chaffeensis (isolados de arkansas e sapulpa) foram propagados como anteriormente descrito (mcbride et al., 2001). Ehrlichiae foram purificados por exclusão de tamanho através de sephacryl s-1000 (amersham biosciences, piscataway, n.j.) Como anteriormente descrito (rikihisa et al., 1992). A fração contendo bactérias foi congelada e utilizadas como um antígeno e fonte de dna. Construction and screening of the e. Canisgenomic library. An e. Canis hpaii genomic library was constructed and screened as previously described (mcbride et al., 2001).

[000279] Seqüenciação de dna. Os insertos, plasmídeos e produtos de per da biblioteca foram seqüenciados com urn sequenciador de dna abi prism 377xl (perkin-elmer applied biosystems, foster city, Califórnia) na university of texas medical branch protein chemistry core laboratory.

[000280] Análise de polinucleotídeos de glicoproteína. Os alinhamentos do ácido nucléico e do aminoácido foram realizados com megalign (lasergene v5.08, dnastar, madison, Wisconsin). As seqüências de proteínas gp36 e gp47 foram testadas quanto à glicosilação ligada em o do tipo de mucina potencial sobre serinas e treoninas com o algoritmo computacional netoglyc (julenius et al., 2005). As repetições em tandem dos genes codificando gp36 das cepas de e. Canisjake, Oklahoma, e demon; gp47 das cepas de e. Chaffeensis arkansas e sapulpa; proteínas iguais à mucina das cepas de e. Ruminantiumhighway [af308673; seq id no: 1, pelo menos parte das quais codifica aal08844 (seq id no: 31)], welgevonden [o genoma é fornecido no genbank acesso n° cr767821; uma sua proteína exemplar como a mucina é fornecida no genbank accesso n° cai26602 (seq id no: 29)], e gardel [o genoma é fornecido no genbank accesso n° cr925677; uma sua proteína exemplar como a mucina é fornecida no genbank accesso n° cai27556 (seq id no: 30)]; gp140 da cepa de e. Canis jake (af112369; seq id no: 2), d gp120 das cepas de e. Chaffeensis arkansas (ecu49426; seq id no: 3) e sapulpa (ecu74670; seq id no: 4) foram analisadas pelo visor de repetição em tandem (benson, 1999) quanto à extensão do período, número de repetições e percentual de homologia entre as repetiçõies. As seqüências das proteínas gp36 e gp47 foram testadas quanto à presença de seqüências de sinal com o algoritmo computacional signalp colocado sobre as bactérias gram-negativas (nielsen etal., 1997).

Amplificação de per dos genes de qlicoproteínas de ehrlichia.

[000281] Iniciadores para a amplificação dos genes gp36 e gp47 de e. Canis e e. Chaffeensis foram projetados com o uso do primer select (lasergene v5.08, dnastar, madison wis.). Iniciadores correspondentes aos nucleotídeos 28 a 47 (5’-atg ett cat tta aca aca ga, dianteiros; seq id no: 5) e 794 a 816 dentro da orf (5’-aga ate taa ate taa aag tcc ag, reversos; seq id no: 6) foram usados para amplificar o gene gp36 de e. Canis. O dna de e. Canis foi amplificado com o uso da mistura per master (f. Hoffmann-la roche ltd., basel, suíça) com um perfil de ciclagem térmica de 95 °c por 4 minutos e 30 ciclos de 95 °c por 30 s, 55 °c por 30 s e 72 °c por 1 minuto, seguido por uma extensão de 72 °c por 7 minutos e uma retenção de 4 °c. Os produtos da per foram separados em géis de agarose a 1 %. Iniciadores correspondentes aos nucleotídeos 4 a 22 (5’-ctt cat tta aca aca gaa a, dianteiros; seq id no: 7) e 902 a 924 dentro da orf (5’-ttg age age cat ate ttc ttc at, reversas; seq id no: 8) foram usados para amplificar o gene gp47 de e. Chaffeensis com o uso das mesmas condições da per. A proteína recombinante contendo o término amino de gp36 de e.canis foi criada pela amplificaçãodo ddna respectivo com os iniciadores correspondentes com os nucleotídeos 28 a 47 (5’-atg ett cat tta aca aca ga, dianteiros; seq id no: 9) e nucleotídeos 321 a 345 (5’-ttg ata age atg cac aga aat aaa g, reversos; seq id no: 10), e o término carboxila foi amplificado com iniciadores específicos para os nucleotídeos 370 a 392 (5’- gga aat cea tea cgt cct get at, dianteiros; seq id no: 11) e 794 a 816 (5’- aga ate taa ate taa aag tcc ag, reversos; seq id no: 12). A proteína recombinante contendo o término amino de gp47 de e. Chaffeensis foi criada pela amplificação do dna respectivo com iniciadores correspondentes com os nucleotídeos 4 a 22 (5’- ctt cat tta aca aca gaa a, dianteiros; seq id no: 13) e nucleotídeos 436 a 459 (5’- aac tgg aac cac tat act gtc act, reversos; seq id no: 14) e o término carboxila foi amplificado com iniciadores específicos para os nucleotídeos 439 a 463 (5’- gac agt ata gtg gtt cca gtt ctt g, dianteiros; seq id no: 15) e 902 a 924 (5 - ttg age age cat ate ttc ttc at, reversos; seq id no: 16).

[000282] Clonagem e expressão das glicoproteínas recombinantes de ehrlichia.O produto de per amplificado foi clonado diretamente no vetor de expressão pbad thio topo® (invitrogen, carlsbad, Califórnia). Top10 e. Coli (invitrogen) foram transformados com o plasmídeo contendo os genes gp36 de e. Canis ou gp47 de e. Chaffeensis, e os transformantes positivos foram analisados porper quanto à presença do inserto e orientação e seqüenciados para confirmar a matriz de leitura dos genes. A expressão da proteína recombinante foi induzida com 0,2 % de arabinose por 3 horas em 37 °c. As bactérias foram pelotizadas (5.000 x g por 20 minutos), recolocadas em suspensão em pbs, e as proteínas recombinantes foram purificadas sob condições nativas como anteriormente descrito (doyle et al., 2005).

[000283] Eletroforese em gel e western immunoblotting. Antígenos purificados de e. Canis ou e. Chaffeensis foram separados por sds- page, transferidos para nitrocelulose, e os western blots foram realizados como anteriormente descrito (mcbride et al., 2003), exceto os anticorpos primários que foram diluídos (1:500). Os soros dos pacientes de hme foram uma espécie de presente da focus technologies (cypress, Califórnia).

[000284] Imunicação de camundongos. Cinco camundongos balb/c (jackson laboratories, bar harbor, me) foram imunizados com as proteínas gp36 de e. Canisou gp47 de e. Chaffeensis.A proteína recombinante (100 pig) em 0,1 ml foi misturada com um volume igual de adjuvante completo de freund (sigma, st. Louis, mo.) Para a primeira injeção, e com adjuvante incompleto de freund para as injeções subseqüentes. Os camundongos receberam injeções intraperitoneais por duas vezes em intervalos de duas semanas.

[000285] Proteínas de fusão recombinantes. Dois oligonucleotídeos complementares 27-bp (sigma-genosys, woodlands, tx) codificando uma região de repetição de 9-meros de gp36 de e. Canis foram sintetizados. O filamento codificador continha os nucleotídeos de 5’ adicionais cacc para clonar o vetor topo direcional (5’- cacc act gaa gat tct gtt tct get cca get (seq id no: 17; complemento reverso 5’- age tgg age aga aac aga ate ttc agt; seq id no: 18). Os oligos foram recolocados em suspensão em água (200 Dm), combinados e diluídos até 100 Dm em tampão de tratamento pelo calor dos oligonucleotídeos (tris 10 mm-hcl, ph 7,5, nacl 100 mm, edta 1 mm), depois aquecidos a 95 °c por 15 minutos e deixados esfriar lentamente até temperatura ambiente. Esta mistura foi subseqüentemente usada para clonagem padrão no vetor de expressão pbad directional topo® (invitrogen) para expressar o 9-meros, tedsvsapa (seq id no: 22), como uma proteína de fusão de tiorredoxina. Este procedimento foi repetido com a unidade de repetição de 17-mero do gp47 de e. Chaffeensis,[seqüências oligo 5’- cacc get agt gta tct gaa gga gat gea gta gta aat get gta age caa gaa act cct gea (seq id no: 19); complemento reverso 5’- tgc agg agt ttc ttg get tac age att tac tac tgc ate tcc ttc aga tac act age; seq id no: 20)].

[000286] Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (elisa). As placas do elisa (placas nunc-immuno® com superfície maxisorp®, nunc, roskilde, dinamarca) foram revestidas com proteína ou peptídeo (2 pg/reservatório, 100 pl) em solução salina tamponada de fosfato (pbs). O tratamento de periodato da proteína de fusão de repetição recombinante foi realizado por 20 minutos em tampão de acetato de sódio 100 mm/edta 5 mm com metaperiodato de sódio 10 mm. O antígeno foi absorvido nas placas do elisa durante a noite em 4 °c ou por 2 horas na temperatura ambiente com agitação suave, e subseqüentemente foi lavado por três vezes com tbs-tween 20 (300 pl), bloqueado com 1x diluente de leite/solução de bloqueio (kirkegaard &perry laboratories, gaithersburg, md) por 1 hora em 37 °c com agitação, e lavado novamente. Os soros anti-e. Canis diluídos (1:500) em diluente de leite foram adicionados a cada reservatório (100 pl) e incubados na temperatura ambiente por 1,5 hora com agitação suave. As placas foram lavadas por quatro vezes e um anticorpo secundário de igg anti- cão de cabra rotulado de fosfatase alcalina (h+l) (1:3000) (kirkegaard &perry laboratories) em diluente de leite foi adicionado e incubado por 1 hora. As placas foram lavadas quatro vezes e o substrato (100 pl) (bluephos, kirkegaard &perry laboratories) foi acrescentado a cada reservatório. As placas foram incubadas por 30 minutos no escuro com agitação, e o desenvolvimento da cor foi interrompido com 1 % de sds. As placas foram subseqüentemente lidas em uma leitora de microplacas (versamax, molecular devices, sunnyvale, Califórnia) em a650 e os dados foram analisados por softmaxpro v4.0 (molecular devices). Os dados representam a média de três soros de cães independentes. Um peptídeo p28-19 vr1 20-meros, seqüência nh2-rnttvgvfglkqnwdgsais (seq id no: 21) (um presente amável do dr. X. J. Yu), foi usado como um peptídeo de controle positivo para confirmar a ligação e a imunorreatividade.

[000287] Microscopia de imunoelétrons. A microscopia de elétrons imunoouro foi executada como anteriormente descrito (doyle et al., 2005).

[000288] Análise de proteínas imunorreativas secretadas. Células dh82 infectadas por e. Canis ou e. Chaffeensis foram monitoradas até 90 a 100 % das células de monocamada foram infectadas. Três dias antes da colheita do sobrenadante, o meio de cultura (dmem suplementado com 10 % soro de bezerro) foi completamente removido e substituído com dmem livre de soro. Os sobrenadantes de cultura foram coletados sem incomodar a monocamada de células e centrifugados (5000 x g durante 20 min) em células e bactérias em pelotas. Os sobrenadantes foram subseqüentemente concentrados 40 vezes (amicon ultra centifugal filter devices com um corte de 10-kda mw; millipore, billerica, mass.). Os sobrenadantes da cultura celular (2 pl) foram diluídos 1:2 no tamponante de amostra Ids, separados por eletroforese, transferidos para nitrocelulose e proteínas imunorreativas detectadas por western imunoblotting usando anticorpo policlonal anti- e. Canis (1:500) como descrito anteriormente.

[000289] Análise de anticorpo fluorescente indireta (ifa) e microscopia confocal. Lâminas de antígeno foram preparadas de células dh82 infectadas com e. Canis (isolado jake) ou e. Chaffeensis (isolado arkansas) como descrito anteriormente (mcbride et al., 2001). Soro de coelho monoespecífico produzido contra a proteína em formação ligada a dissulfeto de e. Canis recombinante (dsba) (mcbride et al,. 2002) foi diluído 1:100 e adicionado a cada reservatórios (15 pl) e deixado incubar durante 30 min. As lâminas foram lavadas, e anti-gp36 de camundongo ou anti-gp47 de camundongo (diluição de 1:100) foi adicionado e incubado durante 30 min. Anticorpo secundário de anti-coelho de cabra igg (h &I) alexa fluor® 488 (molecular probes, eugene, or) diluído 1:100 foi adicionado e incubado durante 30 min, seguido por lavagem e subseqüente adição e incubação de anticorpo secundários de anti- camundongo de cabra rotulado por rodamina igg (h & I) (kirkegaard &perry laboratories). As lâminas foram observadas no optical imaging laboratory at utmb usando um microscópio confocal zeiss Ism-510 meta.

[000290] Números de acesso da seqüência de nucleotideo. As seqüências genéticas de e. Canisgp36 da jake, Oklahoma, e isolados demon e as seqüências genéticas de e. Chaffeensis gp47 da arkansas e isolados sapulpa foram depositados no genbank e designados os seguintes números de acesso, respectivamente: e. Canis jake (dq085427; seq id no:32, que codifica a seq id no:37), e. CanisOklahoma (dq085428; seq id no:33, que codifica a seq id no:38), e. Canisdemon (dq085429; seq id no:34, que codifica a seq id no:39), e. Chaffeensis arkansas (dq085430; seq id no:35, que codifica a seq id no:40), e. Chaffeensis sapulpa (dq085431; seq id no:36, que codifica a seq id no:41).

[000291] Os polinucleotídeos de "mucina" exemplares das cepas de e. Ruminantiumhighway (seq id no:42), welgevondon (seq id no:43) e gardel (seq id no:44) são ortólogos de gp36 e gp47.

Exemplo 2 Identificação molecular da proteína imunorreativa principal da e. Canis 37-kda

[000292] Um clone positivo com uma inserção 1,5-kb continha uma estrutura principal de leitura aberta completa (orf) que codifica uma proteína prognosticada com uma massa molecular de 29,3-kda (26,7 sem o peptídeo de sinal de 23 aminoácidos predito) com homologia às proteínas de mucina eucariótica altamente glicosilada. Com a correlação anterior de glicoproteínas com as proteínas imunorreativas principais, este candidato foi de interesse particular. O gene continha doze repetições em tandem na extremidade 3’ do orf (fig. 1) que codifica 9 aminoácidos (tabela 2). O servidor de prognóstico de glicosilação o- ligado netogly prognosticou que as serinas e treoninas das repetições em tandem, com seqüência prognosticada exemplar tedsvsapa (seq id no:22), era os sítios de glicosilação (letras em negrito, tabela 1). O genoma da cepa e. Chaffeensis arkansas foi pesquisado por blast com a seqüência de e. Canis gp36, e uma estrutura principal de leitura aberta homóloga que codifica uma proteína com sete repetições em tandem 19-mer exemplares (asvsegdavvnavsqetpa; seq id no:23) e uma massa predizível de 32,9-kda foi identificada. A seqüência de dna a montante da região de repetição em tandem continha um índice de similaridade de 61,5 % (57,0 % aminoácido), mas as regiões de repetição em tandem não eram homólogas. Tabela 2. Repetições em tandem de Ehrlichia das glicoproteínas imunorreativas principais.

[000293] Os genes que codificam gp36 das cepas de e. Canis Oklahoma e demon assim como a gp47 da cepa e. Chaffeensis sapulpa foram seqüenciadas para identificar as variações potenciais na seqüência genética. As cepas de e. Canis diferentes retiveram a seqüência de repetição em tandem idêntica, mas elas diferenciaram no número de repetições (tabela 2). De maneira interessante, a cepa sapulpa de e. Chaffeensis codificou uma série inteiramente diferente de repetições em tandem (4 repetições completas de 33 aminoácidos) do que a encontrada na cepa de e. Chaffeensis arkansas. As seqüências genéticas de e. Chaffeensis gp47 a montante da região de repetição continham 99,8 % de homologia entre as cepas, mais possuíam um grau baixo de (27,7 %) homologia principalmente associada com a região 3’ a jusante das repetições em tandem. A região exatamente a montante das repetições em tandem arkansas codifica os aminoácidos glu-gly-asn, que são os 1o três aminoácidos da repetição da cepa sapulpa, que sugere uma mudança de repetição em tandem mais recente. A seqüência de ácido nucléico dentro das repetições em tandem de cada gene gp47 foi altamente conservada (pelo menos 99 %) (tabela 2).

[000294] Embora as seqüências de repetição em tandem variaram muito entre as espécies diferentes, existiu uma conservação de uso de aminoácido entre as repetições. Um total de dez aminoácidos foram usados no total das repetições, com uma ocorrência particularmente elevada de serina, treonina, alanina, prolina, valina e ácido glutâmico. A análise da seqüência de aminoácido da glicoproteína a montante das repetições comparadas com aquela que inclui as repetições até que o códon de término demonstrou um aumento substancial no uso dos aminoácidos (tabela 3). Os sítios de glicosilação preditos por netoglyc foram observados apenas dentro das repetições em tandem das proteínas (tabela 2). Os resíduos de treonina dentro da repetição e. Chaffeensis eram sítios predizíveis para a ligação de glicano, e os resíduos de serina apresentaram um potencial elevado, mas não foram identificados como sítios de ligação ao glicano. Similarmente, a proteína "semelhante a mucina" de cepa e. Ruminantium gardel continha uma treonina e vários resíduos de serina que estava, ligeiramente abaixo do valor limiar predito como os sítios de ligação ao glicano. Tabela 3. Análise de aminoácido de glicoproteínas erliquiais

EXEMPLO 3 IMUNORREATMDADE E GLICOSILAÇÃO DE GP36 E GP47

[000295] A e. Canis gp36 recombinante reagiu fortemente com os anticorpos no soro de um cachorro experimentalmente infectado com e. Canis (fig. 2a, caminho 1). Seguinte a clivagem do par de fusão tiorredoxina, a proteína recombinante apresentou uma massa molecular de 36-kda (dados não mostrados), que foi significativamente maior do que o predito pela seqüência de aminoácido (26,7 kda). O carboidrato foi detectado na gp36 recombinante (fig. 2a, caminho 2). A e. Chaffeensis gp47 recombinante também apresentou forte imunorreactividade (fig. 2b, caminh 1), migrada maior do que a massa predita (32,9 kda), e o carboidrato foi detectado (fig. 2b, caminho 2).

Exemplo 4 Identificação de gp36 e gp47 nativos

[000296] Uma proteína de e. Canis nativa de massa molecular 36-kda, que correspondeu à proteína de ~37-kda anteriormente descrita (mcbride et al., 2003), reagiu com o anti-soro de camundongo monoespecífico produzido contra a proteína recombinante por western blot (fig. 3a). Uma proteína menos proeminente foi também visualizada em 34-kda. A gp47 anti-recombinante de camundongo identificou uma proteína 47-kd nos lisatos celulares inteiros de e. Chaffeensis (fig. 3b). As western imunoblots dos lisatos celulares inteiros de e. Chaffeensis foram reagidas com dez soros de pacientes suspeitos que tinham anticorpos de e. Chaffeensis detectáveis pela análise de anticorpo fluorescente indireta (ifa). Sete dos dez soros reconheceram uma proteína de 47-kda imunorreativa idêntica na massa à proteína reconhecida pelo soro gp47 anti-recombinante (fig. 3b).

Exemplo 5 Resposta de anticorpo precoce à gp36

[000297] Estudos cinéticos da resposta de hospedeiro à e. Canis demonstrou que um antígeno ~37-kda foi reconhecido no princípio por anticorpos nos soros da fase aguda de cachorros experimentalmente infectados com e. Canis (mcbride et al., 2003). A western imunoblot confirmou que a gp36 recombinante não foi reconhecida pelos soros de pré-inoculação, mas que os anticorpos foram produzidos contra a gp36 na fase aguda prematura (dia 14) (fig. 4), confirmando a identidade do gp36 como o antígeno 37-kda principal de e. Canis. A resposta de anticorpo contra a gp36 permaneceu muito forte do começo ao fim da convalescença (dia 56) (fig. 4).

Exemplo 6 Imunorreatividade das repetições em tandem de gp36 and gp47

[000298] Western immunoblottingdeterminou que a terminação carboxila incluindo as repetições em tandem era a porção altamente imunorreativa da proteína, mas regiões n- terminais homólogas localizadas antes das regiões de repetição em tandem de gp36 e gp47 não eram imunorreativas (dados não mostrados). Uma única repetição expressa como uma proteína de fusão recombinante foi reconhecida por soro de cachorro anti-e. Canis (fig. 5b). A proteína de fusão contendo a 9-mer demonstrou um deslocamento eletroforético maior do que a massa prevista (~900 kda), sugerindo que o peptídeo foi modificado pós-traducionalmente e corroborando a previsão de netoglyc, que identificou a unidade de repetição como sítios de ligação de glicana (fig. 5a). Uma proteína de fusão contendo uma única repetição de 17-mer da gp47 de e. Chaffeensis também foi reconhecida por soro de cachorro anti-e. Chaffeensis (fig. 5c). As gp36 e gp47 eram antigenicamente distintas, já que nenhuma delas reagiu com antisoro heterólogo (fig. 6a e 6b).

[000299] O carboidrato é uma parte importante do determinante de epítopo de gp36. Já que cada unidade de repetição em tandem de gp36 de e. Canis foi um sítio previsto de glicosilação e descoberto contendo um epítopo principal de célula b, os presentes inventores formularam a hipótese de que glicanas ligadas eram um importante determinante de epítopo. Para confirmar isso, a proteína de fusão de 9-mer foi tratada com periodato para testar reconhecimento de antígeno após modificação estrutura principall da glicana. A proteína de fusão de 9- mer não tratada foi grandemente reduzida e um peptídeo sintético com a seqüência da região de repetição não foi reconhecido de modo algum, demonstrando a necessidade de modificação pós-traducional para ligação de anticorpo (fig. 6). Modificação estrutura principall da glicana por tratamento com periodato reduziu o reconhecimento de antígeno do epítopo quase para o nível basal de tireodoxina sozinha como determinado por redução nos valores de o.d. De elisa.

Exemplo 7 Carboidrato é um importante determinante de epítopo de gp36

[000300] Já que cada unidade de repetição em tandem de gp36 de e. Canis foi um sítio previsto de glicosilação e descoberto contendo um epítopo principal de célula-b, os inventores consideraram que glicanas ligadas eram importantes determinantes de epítopo. Para caracterizar isso, gp36 de e. Canis foi tratada com periodato para testar reconhecimento de antígeno após modificação estrutura principall da glicana. A gp36 não tratada reagiu fortemente com soro de cachorro anti-e. Canis por elisa, enquanto que a gp36 tratada com periodato foi substancialmente reduzida (fig. 7a). Para caracterizar ainda mais essa observação, elisa foi usado para testar o reconhecimento de proteínas de fusão recombinantes com uma única repetição (9-mer; tedsvsapa; seq id no: 22), uma 12-mer (svsapatedsvs; seq id no: 45), e duas unidades de repetição em tandem (18-mer; tedsvsapatedsvsapa; seq id no: 46) de gp36 em comparação com peptídeos sintéticos não glicosilados com seqüências idênticas. Enquanto todas as proteínas recombinantes foram reconhecidas com soro imune de cachorro, a repetição única sintética (9-mer), não foi reconhecida de modo algum, e o peptídeo superposto (12-mer) exibiu reatividade mínima, demonstrando a importância de modificação pós-traducional para ligação de anticorpo a esses peptideos (fig. 7b). O peptídeo sintético com repetição em tandem (18-mer) foi reconhecido por soro de cachorro, embora não tão bem quanto o recombinante, demonstrando a presença de um epítopo baseado em aminoácido linear presente em um peptídeo contendo unidade de repetição em tandem (18-mer) (fig. 7b). Reconhecimento da proteína de fusão de repetição de e. Chaffeensis recombinante exibiu uma absorbância por elisa maior do que aquela do peptídeo sintético (fig. 7c).

Exemplo 8 Localização celular e secreção de gp36 e gp47

[000301] Ehrlichias existem em duas formas morfológicas distintas conhecidas como reticulada e de núcleo denso (popov et al., 1995). A localização de gp36 e. Canis (fig. 8a) e gp47 e. Chaffeensis (fig. 8b) por microscopia de eletrônica imuno-ouro descobriu que essas proteínas eram expressas diferencialmente sobre a superfície da forma de núcleo denso da bactéria, mas não da forma reticulada. As gp36 e gp47 também estavam associadas com as membranas de mórula contendo as formas morfológicas de núcleo denso da bactéria (figs. 8a e 8b). Expressão diferencial de gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis foi ainda confirmada por análise de ifa e microscopia confocal de lâminas de células infectadas usando anticorpos contra a proteína conservada dsb de formação de ligação dissulfeto de ehrlichia além de gp36 ou gp47. O ifa demonstrou que gp36 de e. Canis gp47 de e. Chaffeensis estavam expressos em um subgrupo de ehrlichias em comparação com a expressão de dsb (expressa constitutivamente).

[000302] A gp35 de e. Canis gp47 de e. Chaffeensis eram as proteínas imunorreativas predominantes secretadas no sobrenadante (fig. 9a e 9b, raia 1). A gp36 de e. Canisgp47 de e. Chaffeensisforam conclusivamente identificadas nas frações do sobrenadante com anticorpos anti- gp36 e gp47 recombinante (fig. 9a e 9b, raia 2). Os sobrenadantes de células dh82 não infectadas não continham nenhuma proteína reconhecida por antisoros contra ehrlichias (dados não mostrados).

Exemplo 9 Caracterização molecular de repetições em tandem de gp35 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis entre isoaldos de diferentes localidades geográficas

[000303] Em relação às principais glicoproteínas ortólogas imunorreativas de ehrlichia canis e e. Chaffeensis, gp36 e gp47, os inventores caracterizaram as repetições em tandem molecularmente. Os genes que codificam essas proteínas contêm repetições em tandem, próximo da terminação carboxila que são sítios de glicosilação o-ligada. Unidades de repetição única de gp36 e gp47 contêm epítopos que são reconhecidos por antisoros de cachorro e não fazem reação cruzada. Análises comparativas em números limitados de e. Canis e e. Chaffeensis norte americanos determinaram que as repetições em tandem variaram em número e seqüência entre os isolados. Para caracterizar ainda mais a conservação global ou heterogeneidade dessas proteínas, particularmente com relação às regiões de repetição em tandem, os genes de gp36 e gp47 foram amplificados e comparados em várias cepas separadas pelos continentes de e. Canis e vários isolados de e. Chaffeensis norte americano. Os iniciadores foram desenhados para regiões intergênicas à montante e à jusante das regiões codificantes de gp36 e gp47 de e. Canis e e. Chaffeensis (gp36 de e. Canis sentido direto 5'-aat caa tgt agt atg ttt ctt tta (seq id no: 47) e reverso 5'- att tta cag gtt ata ttt cag tta (seq id no: 48); gp47 de e. Chaffeensis sentido direto 5'- ttg tgc agg gaa agt tg (seq id no: 49) e reverso 5'- aat gaa agt aaa taa gaa agt gta (seq id no: 50)), e a amplificação foi realizada como descrito anteriormente (doyle et al., 2006). As seqüências do gene de gp36 de isolados de e. Canis da louisiana (dq146151; polinucleotídeo de seq id no: 52 que codifica seq id no: 53), flórida (dq146152; polinucleotídeo de seq id no: 54 que codifica seq id no: 55), dj (Carolina do norte) (dq 146153; polinucleotídeo de seq id no: 56 que codifica seq id no: 57), são paulo (dq146154; polinucleotídeo de seq id no: 58 que codifica seq id no: 59), e camarões 71 (dq146155; polinucleotídeo de seq id no: 60 que codifica seq id no: 61) e seqüências do gene gp47 de e. Chaffeensis dos isolados de jax (dq146156; polinucleotídeo de seq id no:62 que codifica seq id no: 63), são vincente (dq146157; polinucleotídeo de seq id no: 64 que codifica seq id no: 65), v3 (vanderbilt) (dq146158; polinucleotídeo de seq id no: 66 que codifica seq id no:67) e v8 (dq146159; polinucleotídeo de seq id no: 68 que codifica seq id no: 69) foram depositados na base de dados disponível ao público genbank da rede de alcance mundial do national center for biotechnology information.As seqüências do gene gp36 de e. Canisgp36 dos isolados de jake (dq085427), Oklahoma (dq085428), e demon (dq085429) e as seqüências do gene de gp47 de e. Chaffeensis dos isolados de arkansas (dq085430) e sapulpa (dq085431) foram depositadas anteriormente. Análise de seqüência foi realizada como descrito anteriormente (doyle et al., 2006)

[000304] A seqüência de repetição em tandem dos isolados de e. Canis norte americanos, brasileiros e de camarões era completamente conservada, compreendendo nove aminoácidos (tedsvsapa; seq id no: 22). Entretanto, o número de repetições variou entre 4 e 18 cópias da repetição (veja tabela 4). A região pré-repetição n-terminal (143 aminoácidos) era altamente conservada entre os isolados, com as cepas de jake, Oklahoma, demon, e louisiana contendo homologia completa. Os isolados do brasil e camarões continham as seqüências mais divergentes (quatro diferenças de aminoácido), mas elas ainda mantiveram 97,2% de homologia de aminoácido com o consenso. Tabela 4: Repetições em tandem de gp36 e gp47 em diferentes cepas de E. Canis e E. Chaffeensis

[000305] De forma semelhante, os isolados de e. Chaffeensis testados demonstraram diversidade limitada de repetições em tandem de gp47. A cepa do arkansas exibiu uma unidade de repetição de 19 aminoácidos singular comparada com todos os outros isolados seqüenciados. Sete repetições da seqüência de 19 aminoácidos foram identificadas no gene de gp47 da cepa do arkansas. Cinco isolados de e. Chaffeensis adicionais de localidades geograficamente dispersas tinham uma unidade de repetição de 33 aminoácidos conservada que exibiu menor variabilidade em seqüência de repetição (veja tabela 4). O número de cópias entre essa repetição foi idêntico entre três de quatro isolados (4,5 repetições), com a de são vivente contendo uma repetição menor (veja tabela 4). As regiões pré-repetição da repetição n-terminal (154 aminoácidos) eram completamente conservadas entre as cepas de sapulpa, são vicente, v3, e v8. Essa seqüência continha 99,4% de conservação de aminoácido (uma alteração) com a região pré-repetição da cepa de arkansas. Mais divergência foi encontrada na cepa de jax, com 91,6% de homologia de aminoácido (13 substituições) na região de pré-repetição comparado com o resto das cepas. Embora essas proteínas sejam altamente imunorreativas e unidades de repetição em tandem de gp36 e gp47 contenham os epítopos de célula b (doyle et al,. 2006), de forma interessante, a falta de divergência de seqüência indica que há menos pressão imuno seletiva sobre essas proteínas para alterar sua seqüência ou elas devem ser conservadas para manter função, em modalidades específicas. Similarmente, análise de seqüência comparativa falhou em detectar similaridade significativa entre as unidades de repetição, demonstrando que as repetições em tandem não são derivadas de seqüência comum que sofreu múltiplas mutações para ganhar diversidade. As repetições em tandem distintas de gp47 auxiliarão ainda na diferenciação de cepas variantes em ciados, e em aspectos particulares da invenção fornecem percepção em diferenças patogênicas ente as cepas. Como essas glicoproteínas homólogas são altamente imunogênicas (doyle et al., 2006), a conservação completa de repetições em tandem entre cepas de e. Canis em todo o mundo e divergência limitada entre e. Chaffeensis poderia ter implicações positivas para uso futuro dessas proteínas. Com os epítopos contendo unidades de repetição em tandem, um ensaio de imunodiagnóstico sensível para e. Canis é desenvolvido usando uma proteína recombinante com essas repetições em tandem.

EXEMPLO 10 VACINAS DA INVENÇÃO

[000306] Em aspectos particulares da invenção, as composições imunogênicas da presente invenção são adequadas como uma vacina, tal como uma vacina de subunidade, em outros aspectos da invenção, as composições imunogênicas soa referidas como imunoprotetoras.

[000307] Especificamente, uma ou mais composições da invenção, tais como aquelas que compreendem um epítopo de gp35 de e. Canis ou um epítopo de gp47 de e. Chaffeensis, por exemplo, são administrados a um mamífero, tal como um canino. Soro do mamífero pode ser testado para uma resposta imune, tal como pela detecção de anticorpos no soro. O mamífero é então submetido a desafio subseqüente com o organismo patogênico, tais como os respectivos organismos e. Canis ou e. Chaffeensis, e a imunoproteção é determinada. Controles podem ser empregados, tal como, imunização com, por exemplo, epítopo mutado ou um epítopo que não compreende uma porção de carboidrato. Proteção completa ou parcial contra o desafio subseqüente demonstra a natureza imunoprotetora da composição, e a composição é uma vacina. Proteção parcial pode ser definida como protetora do desenvolvimento de pelo menos um sintoma da infecção ou protetora de pelo menos um sintoma se tornar pior.

Exemplp 11 Significado da presente invenção

[000308] O estudo anterior dos presentes inventores das respostas cinéticas de anticorpo a e. Canis revelou dois antígenos imunorreativos principais (proteínas de 36- e 19-kd) como alvos dominantes da resposta imune precoce do hospedeiro (mcbride et al., 2003). A composição antigênica de e. Canis no carrapato não é conhecida, mas antígenos reconhecidos inicialmente na resposta imune do hospedeiro fornecem evidencia daqueles que podem ser especialmente importantes nos estágios iniciais de infecção do hospedeiro mamífero, e dessa forma são alvos prioritários para identificação molecular e para desenvolvimento de vacina. Nessa invenção os presentes inventores identificaram de forma conclusiva e caracterizaram molecularmente a proteína imunorreativa principal de 36 kd de e. Canis, e da mesma forma que varias outras proteínas imunorreativas principais de ehrlichia, ela é glicosilada. Além disso, um ortólogo de 47-kd divergente e antigenicamente distinto em e. Chaffeensis, também uma proteína imunorreativa principal consistentemente reconhecida por anticorpos de paciente de hme, foi identificada. Outras proteínas imunorreativas principais que foram caracterizadas molecularmente em e. Canis incluem três glicoproteínas (gp200, gp140, e p28/p30), e a identificação da gp36 em e. Canis ainda suporta glicosilação como uma importante modificação pós-traducional em ehrlichia em várias proteínas expostas na superfície.

[000309] A gp36 de e. Canis e gp47 de e. Chaffeensis tem considerável divergência de ácido nucleico e aminoácido em regiões que contêm as repetições em tandem ricas em serina/treonina. A recente análise de seqüência do genoma de ehrlichia ruminantium (collins et al., 2005) e e. Canis (dados não publicados) identificou uma alta freqüência de genes contendo unidades de repetição em tandem. Os ortólogos de gp140 de e. Canis e de gp120 de e. Chaffeensis também têm repetições em tandem mais longas, mas geneticamente divergentes. Nenhuma das regiões conhecidas de repetição de glicoproteína compartilha seqüências conservadas entre elas, mas todas exibem alto conteúdo de resíduos de serina e treonina além de alanina, prolina, valina e ácido glutâmico que foram relatados pata servir como motivos de reconhecimento para ligação de o-glicana (o’connell et al., 1991; thanka christlet & veluraja, 2001). As unidades de repetição das glicoproteínas "semelhantes a mucina" foram a única localização da ligação de o-glicana prevista como previsto por netoglyc, mas nem todas serinas e treoninas cruzaram o limite como sítios prováveis de glicosilação. Entretanto, como netoglyc foi desenvolvido com dados de glicoproteínas eucarióticas, é bem possível que o limite para glicosilação de ehrlichia seja menor e que esses sejam sítios de glicosilação. Como com outros ortólogos de glicoproteína de ehrlichia conhecidos, as gp36 e gp47 são antigenicamente divergentes. Imunodominãncia consistente e divergência de repetições em tandem sugerem que a resposta imune cria forntes pressões seletivas para alterar a seqüência de repetições. Entretanto, todas as cepas de e. Canis testadas continham repetições em tandem idênticas, mas tinham números de repetições variáveis (5 a 16). E. Chaffeensis exibiu mais divergência (seqüência de aminoácido e número de repetição) nas regiões de repetição em tandem de dois isolados que foram examinados (arkansas e sapulpa). Três de dez soros de pacientes de hme testados não reagiram com a gp47 da cepa de arkansas de e. Chaffeensis, e a divergência na região de repetição poderia explicar a inconsistência do reconhecimento de gp47 por diferentes pacientes. Uma pesquisa por seqüências de dna de repetição em tandem ortólogas através do genoma não detecta pseudogenes ou outras fontes para as repetições nascentes, então o mecanismo para divergência de repetição permanece indefinido. A descoberta de um novo par de ortólogos expressos na superfície com unidades de repetição é um ponto de interesse em um organismo intracelular obrigatório que sofreu evolução do genoma redutiva, e assim leva a especulação de que possa haver uma vantagem seletiva para aumentar a manter as unidades de repetição glicosiladas dessas proteínas.

[000310] Embora a gp36 e gp47 tenham homologia considerável nas regiões n-terminais à montante das regiões de repetição, as regiões imunorreativas estavam localizadas na região da terminação carboxila das proteínas, que contem as repetições em tandem. Os presentes inventores determinaram que repetições únicas de gp36 de e. Canis (9- mer) e gp47 de e. Chaffeensis (19-mer) expressos como proteínas recombinantes eram suficientes para reconhecimento de antígeno por soros imunes, demonstrando que elas contem epítopos repetidos principais. Similarmente, as regiões e repetição da gp120 de e. Canis e gp140 de e. Chaffeensis gp140 contêm epítopos de anticorpo principais. De forma interessante, peptídeos sintéticos da repetição de gp36 de e. Canis (9-mer) e repetição de e. Chaffeensis (27-mer) não foram reconhecidas por soro imune e tratamento com periodato de unidade de repetição recombinante quase aboliu o reconhecimento de antígeno, fornecendo a primeira evidencia de que os determinantes de epítopo são complexos e requerem modificação pós-traducional para reconhecimento de antígeno. Na ausência de organelas para trafico de proteína, há muito se acreditou que procariotos não continham o maquinário celular necessário para modificar proteínas com carboidratos. Até mesmo e. Coli, usada por muitos anos para expressar proteínas eucarióticas aglicosiladas, foi descoberta como modificando suas próprias proteínas com porções de carboidrato (lindenthal &elsinghorst, 1999). Vários patógenos bacterianos humanos foram descobertos agora como expressando glicoproteínas (benz & schmidt, 2002; schmidt etal., 2003; upreti etal., 2003) e as poucas glicoproteínas funcionalmente caracterizadas contribuem para adesão, estabilidade estrutura principall, e mobilidade também são alvos do sistema imune. As características demonstram os papéis potenciais de glicoproteínas bacterianas na patogênese e imunidade (benz & schmidt, 2002). De forma significativa, o reconhecimento de anticorpo dependente de carboidrato de gp36 e gp47 recombinantes expressas em e. Coli demonstra que as glicanas e sítios de ligação são conservados entre proteínas de ehrlichia nativas e glicoproteína expressa em e. Coli. Isso indica que os mecanismos para glicosilação são conservados entre ehrlichiae e. Coli. Entretanto, glicosiltransferases homólogas àquelas presentes em e. Coli não foram identificadas no genoma de e. Canis (dados não publicados), sugerindo que esas enzimas contêm seqüências singulares e estão entre as proteínas hipotéticas com função desconhecida. Com base nas massas de proteína idênticas e na dependência de modificação pós-traducional para reatividade de epítopo de glicoproteína, as glicoproteínas de ehrlichia recombinantes perecem ser idênticas às proteínas nativas em estrutura principal e composição, e assim são substitutos apropriados pata proteínas nativas em estudos para determinar a função e papel como antígenos imunoprotetores.

[000311] Os presentes inventores observaram que as gp36 e gp47 estão presentes em abundância relativamente baixa em lisados de célula total em comparação com outras proteínas de membrana externa tais como p28/p30. Várias proteínas de ehrlichia foram identificadas fora da célula bacteriana incluindo a gp120 e proteína de ligação de íon férrico. Além disso, a gp120 de e. Chaffeensis gp120 foi demonstrada como sendo expressa diferencialmente sobre a superfície de e. Chaffeensis de núcleo denso e extracelularmente na matriz da mórula. Microscopia eletrônica imuno-ouro demonstrou que gp36 de e. Canis e e gp47 de chaffeensis também são diferencialmente expressas sobre a superfície de ehrlichias de núcleo denso. Acredita-se que as formas morfológicas de núcleo denso e célula reticulada de ehrlichiasejam homólogas ao corpo elementar infeccioso de chlamydia trachomatise corpo reticulado metabolicamente ativo, respectivamente. Essa observação indica que essas glicoproteínas ortólogas podem desempenhar um papel importante na infecção por ehrlichia. A expressão de superfície celular dessas glicoproteínas indica que elas funcionam como adesinas, em modalidades específicas da invenção. Interações carboidrato-lectina são meios comuns de mediar ligação celular (zhang et al., 2003). Proteínas contendo repetições de anaplasma marginaleassim como o ortólogo de proteína "semelhante a mucina" de ehrlichia ruminantium foram demonstrados como conferindo habilidade de aderir a células de carrapato (de la fuente et al., 2004).

[000312] As gp36 egp47 são constituintes menos importantes em lisados de célula total, mas os presentes inventores encontraram quantidades substanciais de ambas nos sobrenadantes das células infectadas. De forma interessante essas foram as proteínas imunorreativas abundantes encontradas nos sobrenadantes nos quais outras proteínas de superfície conhecias tais como p28/p30 não foram detectadas, indicando que a gp36 era de fato decretada e não estava associada com membranas externas intactas nos sobrenadantes. A secreção de gp36 na glândula salivar de carrapato ou no hospedeiro mamífero poderia fornecer uma explicação parcial para a resposta imune inicial do hospedeiro a essa glicoproteína. Além disso, secreção desses ortólogos de glicoproteína (gp36 e gp47) sugere que eles podem ser fatores de virulência e desempenham um papel importante na patobiologia. Uma seqüência de sinal foi identificada na gp36, sugerindo o envolvimento de um segundo mecanismo de secreção dependente tal como tipo ii ou tipo iv (nagai & roy, 2003). Genes que codificam o maquinário de secreção de tipo iv forma identificados em e. Canis, e. Chaffeensis, e e. Ruminantium (collins et al., 2005; felek et al., 2003; ohashi et al., 2002) já que o papel de secreção de tipo iv de fatores de virulência bacterianos está se tornando mais bem reconhecido.

[000313] A resposta imune inicial de gp36 pela resposta imune de mamífero indica a possibilidade de que esse antígeno desempenhe um papel importante em infecção de ehrlichia do carrapato ou na transmissão nos estágios iniciais de infecção, em modalidades específicas ada invenção. Embora muito pouco seja conhecido com relação à expressão de antígeno de ehrlichia no carrapato, expressão diferencial de proteínas de superfície externa de borrelia burgdorferifoi demonstrada no carrapato e restrição de variantes de msp2 de a. Marginaleem carrapatos foi relatada (rurangirwa etal., 1999; schwan & hinnebusch, 1998). Infecção bem sucedida dos carrapatos ou hospedeiro mamífero pode ser determinada pela expressão das proteínas de membrana externa especificas necessárias para ligação da célula hospedeira ou aquelas envolvidas no estabelecimento de infecção intracelular.

[000314] A cinética da resposta do anticorpo e reatividade do anticorpo da gp36 de e. Canis indica que esse antígeno é útil em desenvolvimento de vacina e imunodiagnóstico. Ensaios de diagnóstico comercialmente disponíveis atuais para ehrlichiose canina são baseados nas proteínas p28/p30, a a gp36 poderia fornecer sensibilidade substancialmente maior para essa aplicação. Além disso, o antígeno gp36 não reagiu com soro imune de cachorros e. Chaffeensi , o que poderia ser útil no desenvolvimento de ensaios de imunodiagnóstico espécie-específicos. Especificidade de espécies sorológicas semelhantes foi relatada com a gp120/gp140 assim como com os ortólogos e gp200 de e. Canis e e. Chaffeensis. Essas observações indicam que a reatividade cruzada sorológica relatada entre e. Canis e e. Chaffeensis não é criada por esses antígenos imunorreativos principais. Esse achado também tem relevância para desenvolvimento de vacina de subunidade, indicando que esses antígenos são eficazes contra homólogos em aspectos específicos da invenção. Vacinas que poderiam bloquear potencialmente a infecção durante a transmissão poderiam preferivelmente conter antígenos expressos no carrapato, e assim em modalidades especificas a expressão de gp36 no vetor de carrapato é determinada.

[000315] A descoberta de outro grupo de ortólogos de glicoproteína imunorreativa principal de ehrlichia demonstra sua importância como alvos do sistema imune e sua utilidade como antígenos imunoprotetores.

Referências

[000316] Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são indicativas do nível daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Todas as patentes e publicações estão aqui incorporadas por referência com a mesma extensão do que se cada publicação individual fosse especificamente indicada por ser incorporada por referência.

PATENTES E PEDIDOS DE PATENTE

[000317] Patente U.S. N° 5.681.947

[000318] Patente U.S.N0 5.652.099

[000319] Patente U.S. N° 5.763.167

[000320] Patente U.S.N0 5.614.617

[000321] Patente U.S. N° 5.670.663

[000322] Patente U.S. N° 5.872.232

[000323] Patente U.S. N° 5.859.221

[000324] Patente U.S.N0 5.446.137

[000325] Patente U.S.N0 5.886.165

[000326] Patente U.S. N° 5.714.606

[000327] Patente U.S. N° 5.672.697

[000328] Patente U.S. N° 5.466.786

[000329] Patente U.S. N° 5.792.847

[000330] Patente U.S. N° 5.223.618

[000331] Patente U.S.N0 5.470.967

[000332] Patente U.S. N° 5.378.825

[000333] Patente U.S. N° 5.777.092

[000334] Patente U.S. N° 5.623.070

[000335] Patente U.S. N° 5.610.289

[000336] Patente U.S. N° 5.602.240

[000337] Patente U.S. N° 5.858.988

[000338] Patente U.S. N° 5.214.136

[000339] Patente U.S. N° 5.700.922

[000340] Patente U.S. N° 5.708.154

[000341] Patente U.S. N° 5.786.461

[000342] Patente U.S. N° 5891.625

[000343] Patente U.S. N° 5.773.571

[000344] Patente U.S. N° 5.766.855

[000345] Patente U.S. N° 5.736.336

[000346] Patente U.S. N° 5.719.262

[000347] Patente U.S. N° 5.714.331

[000348] Patente U.S. N° 5.539.082

[000349] Patente U.S. N° 5.766.855

[000350] Patente U.S. N° 5.719.262

[000351] Patente U.S. N° 5.714.331

[000352] Patente U.S. N° 5.736.336 WO 92/20702 PUBLICAÇÕES Benson, G. 1999. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res. 27:573-580. Benz, I. And M. A. Schmidt. 2002. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Mol.Microbiol. 45:267-276. Breitschwerdt, E. B., B. C. Hegarty, and S. I. Hancock. 1998. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J. Of Clin. Microbiol. 36:2645-2651. Chen, S. M., J. S. Dumler, H. M. Feng, and D. H. Walker. 1994. Identification of the antigenic constituents of Ehrlichia chaffeensis. Am.J.Trop.Med.Hyg. 50:52-58. Chen, S. M., L. C. Cullman, and D. H. Walker. 1997. Western immunoblotting analysis of the antibody responses of patients with human monocytotropic ehrlichiosis to different strains of Ehrlichia chaffeensis and E. Canis.Clin.Diagn.Lab Immunol. 4:731-735. Collins, N. E., J. Liebenberg, E. 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[000353] Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas em detalhe, deve ser entendido que várias mudanças, substituições e alterações podem ser feitas aqui sem desconsiderar o espírito e escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas. Além disso, o escopo do presente pedido não é pretendido por ser limitado às modalidades particulares do processo, máquina, fabricação, composição de matéria, meios, métodos e etapas descritas na especificação. Como um versado na técnica reconhecerá facilmente a partir da descrição da presente invenção, processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, ou etapas que existem no momento ou para serem desenvolvidas posteriormente que realizam substancialmente a mesma função ou obtêm substancialmente o mesmo resultado que as modalidades correspondentes descritas aqui podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Conseqüentemente, as reivindicações anexas são pretendidas por incluir dentro do seu escopo tais processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas.

Claims

1. Método de identificar uma infecção por E. Canis ou E. Chaffeensis utilizando uma amostra em um indivíduo suspeito de apresentar tal infecção, caracterizado pelo fato de que compreende testar a amostra para um anticorpo que imunologicamente se liga a um polipeptídeo consistindo em: (a) uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:22; ou (b) uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, Em que a amostra é testada por meio de ELISA ou immunoblot onde os anticorpos da amostra, se presentes, se ligarão a um polipeptídio imobilizado compreendendo a sequência de (a) ou (b) ou uma sequência 90% idêntica às mesmas, e ainda em que anticorpos ligados são detectados por meio de marcadores detectáveis.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo imunologicamente se liga ao polipeptídio consistindo na SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 22.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a amostra é testada pelo contato de um polipeptídio imobilizado compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 22, ou uma sequência 90% idêntica às mesmas, com a dita amostra e detectar ligação imunológica do anticorpo à mesma.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga imunologicamente ao polipeptídio que consistindo na SEQ ID NO: 22.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é testada pelo contato de um polipeptídio imobilizado compreendendo SEQ ID NO: 22 ou uma sequência 90% idêntica às mesmas, com a dita amostra e detectar ligação imunológica do anticorpo à mesma.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga imunologicamente ao polipeptídio que consistindo na SEQ ID NO 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amostra é testada pelo contato de polipeptídio imobilizado compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24, ou uma sequência 90% idêntica às mesmas, com a dita amostra e detectar ligação imunológica do anticorpo à mesma.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga imunologicamente ao polipeptídio que consistindo na SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID NO 25, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24, ou uma sequência 90% idêntica às mesmas, com a dita amostra e detectar ligação imunológica do anticorpo à mesma.