KR101690606B1 - 에를리히아 샤핀시스（ｖｌｐｔ）를 검출하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

에를리히아 샤핀시스（ｖｌｐｔ）를 검출하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에를리히아 샤핀시스를 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

에를리히아 샤핀시스（ＶＬＰＴ）를 검출하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF EHRLICHIA CHAFFEENSIS (VLPT)}
우선권
본 출원은 2007년 9월 21일에 출원된 미국 출원 일련 번호 60/974,196을 우선권으로 주장하며, 상기 미국 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
에를리히아(Ehrlichia)는 포유동물 숙주에서 순환성 림프구를 감염시키는 편성(obligate) 세포내 병원체이다. 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis) 및 에를리히아 샤핀시스(Ehrlichia chaffeensis)는 동일한 아속군(sub-genus group)의 일원으로서, 각각 개과동물(canine)과 사람을 감염시키고 개과동물 단핵구성 에를리히아증(CME)과 사람 단핵구성 에를리히아증(HME)을 각각 일으킬 수 있다. 상기 개과동물 질병은 발열, 림프절증(lymphadenopathy), 체중 감소 및 범혈구감소증(pancytopenia)을 특징으로 한다. 사람의 경우, 상기 질병은 발열, 두통, 근육통 및 백혈구감소증(leukopenia)을 특징으로 한다. 조기 검출 및 치료가 개과동물 에를리히아증과 사람 에를리히아증 둘 모두를 치료하는 데에 있어서 중요하다.
간접 면역형광 검정(IFA)과 효소결합 면역흡착 검정(ELISA)이 상기 질병들을 진단하는 데에 있어서 보조수단으로서 자주 이용된다. 이들 검정은 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터의 항-에를리히아 항체가 감염된 세포, 세포 용해물 또는 정제된 에를리히아 단백질에 결합하는 것을 측정하거나 다른 방식으로 이를 검출한다. 그러나, 항-에를리히아 샤핀시스 항체 또는 이의 단편을 검출하기 위한 다수의 검정은 이러한 시험에 사용되는 에를리히아 항원이 순수하지 않다는 것과 직접 관련된 감수성 및 특이성 문제로 인해 유용성이 심히 제한된다. 또한, 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 동물은 면역학적 교차반응으로 인해 에를리히아 샤핀시스에 대해 시험한 경우에 양성 결과를 나타낼 수 있다. 보다 정확한 검정을 구축하기 위해서는 고도로 정제된 특이적 시약이 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 한 가지 구체예는 50개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된, SEQ ID NO:3을 포함하는 정제된 폴리펩티드; 50개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된, SEQ ID NO:2를 포함하는 정제된 폴리펩티드; 50개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된, SEQ ID NO:1을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:1로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 정제된 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 정제된 폴리펩티드는 지시약(indicator reagent), 아미노산 스페이서(spacer), 아미노산 링커(linker), 신호 서열, 이동 정지 서열(stop transfer sequence), 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인, 단백질 정제 리간드, 이종(heterologous) 폴리펩티드, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 포함하는 하나 이상의 추가 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다. 본 발명의 정제된 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드의 아미노 말단과 카르복시 말단 중 어느 하나에서 또는 양 말단 모두에서 하나 이상의 C 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:1, 2, 3, 5 또는 6을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 정제된 폴리펩티드는 약 50개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된다. 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재함을 나타내고, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 없다는 것은 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않음을 나타낸다. 상기 복합체는 검출 단계를 수행하기 전에 지시약과 접촉될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 3, 5 또는 6이고, 상기 방법은 에를리히아 카니스 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하지 않는다. 시험 샘플 중의 항체량이 측정될 수 있다. 상기 정제된 폴리펩티드는 기질에 부착될 수 있다. 상기 정제된 폴리펩티드는 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 이종 단백질, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 포함하는 하나 이상의 추가 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:1, 2, 3, 5 또는 6을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 상기 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계, 및 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 정제된 폴리펩티드는 약 50개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된다. 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 피검체가 에를리히아 샤핀시스에 감염되어 있음을 나타내고, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 없다는 것은 피검체가 에를리히아 샤핀시스에 감염되어 있지 않음을 나타낸다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 정제된 폴리펩티는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5 또는 6이고, 상기 방법은 피검체에서 에를리히아 카니스 감염을 검출하지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 5 또는 6으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항원-결합성 항체 단편 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:1, 2, 3, 5 또는 6으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 샘플과 접촉시키는 단계, 및 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 샘플에 존재함을 나타내고, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 없다는 것은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않음을 나타낸다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 5 또는 6일 수 있고, 상기 방법은 샘플에서 에를리히아 폴리펩티드를 검출하지 않는다. 상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항원-결합성 항체 단편 또는 단일 사슬 항체일 수 있다. 상기 항체는 기질에 부착될 수 있다.
따라서, 본 발명은 에를리히아 샤핀시스를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 1b는 에를리히아 샤핀시스를 사용하여 실험적으로 감염시킨 개의 혈청 검정 결과를 도시한다. VLPT-1(SEQ ID NO:5) (도면에 "펩티드"로 표시되어 있음)과 VLPT-R(112번 위치의 X가 P인 SEQ ID NO:4) (도면에 "r-단백질"로 표시되어 있음)은 둘 모두 감염후 7일째까지 에를리히아 샤핀시스 항체를 검출할 수 있었다.
발명의 상세한 설명
에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드
본 명세서에서, 단수형으로 지칭된 용어는 달리 명확히 기재되어 있지 않은 한 복수형을 포함한다.
폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 공유결합된 2개 이상의 아미노산의 중합체이다. 폴리펩티드는 번역후 변형될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는, 세포 물질, 다른 유형의 폴리펩티드, 화학물질 전구체, 그러한 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질 또는 이들의 조합물이 실질적으로 없는 폴리펩티드 제조물(preparation)이다. 세포 물질, 배양 배지, 화학물질 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질 등이 실질적으로 없는 폴리펩티드 제조물은 약 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 그 보다 작은 비율의 다른 폴리펩티드, 배양 배지, 화학물질 전구체 및/또는 합성에 사용되는 다른 화학물질을 지닌다. 따라서, 정제된 폴리펩티드의 순도는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과이다. 정제된 폴리펩티드는, 순도가 70% 이하인, 폴리펩티드들의 미정제(unpurified) 또는 반정제(semi-purified) 세포 추출물 또는 혼합물을 포함하지 않는다.
"폴리펩티드"란 용어는 하나 또는 그 초과의 한 가지 유형의 폴리펩티드 (한 세트의 폴리펩티드)를 지칭할 수 있다. "폴리펩티드"는 또한 두 가지 이상의 다양한 유형의 폴리펩티드의 혼합물 (폴리펩티드들의 혼합물)을 지칭할 수 있다. "폴리펩티드들" 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 각각 "하나 이상의 폴리펩티드"를 또한 의미할 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6으로 제시되는 정제된 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 제공한다.
Figure 112010025584313-pct00001
모든 서열에 대해, X는 임의의 아미노산을 나타낼 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID NO:1의 경우, 1번 위치의 X는 D 또는 N이고, 6번 위치의 X는 G 또는 E이고, 7번 위치의 X는 P 또는 S이고, 8번 위치의 X는 F 또는 S이고, 9번 위치의 X는 S 또는 F이고, 13번 위치의 X는 F 또는 P이고, 14번 위치의 X는 D 또는 G이고, 22번 위치의 X는 L 또는 F이고, 24번 위치의 X는 S 또는 D이고, 26번 위치의 X는 L 또는 A이고, 27번 위치의 X는 Q 또는 K이고, 28번 위치의 X는 Q 또는 N이고, 29번 위치의 X는 S 또는 V이고, 30번 위치의 X는 S 또는 V이고, 31번 위치의 X는 N 또는 Y이다. SEQ ID NO:2 및 3의 경우, 7번 위치의 X는 P 또는 S이다. SEQ ID NO:1 내지 3 각각은 N-말단 C 잔기를 지닐 수 있다. 또한, N-말단 C 잔기는 존재하지 않을 수 있다. 폴리펩티드 VLPT-1은 아미노 말단 C 잔기를 지닌 SEQ ID NO:2 (즉, CDSDLHGPFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN; SEQ ID NO:5)이다. 폴리펩티드 VLPT-2는 아미노 말단 C 잔기를 지닌 SEQ ID NO:3 (즉, CNSDLHESSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNWY; SEQ ID N0:6)이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID NO:4를 포함하는 정제된 폴리펩티드를 포함한다:
Figure 112010025584313-pct00002
112번 위치의 X는 P 또는 S일 수 있다.
한 가지 구체예는 약 175개 이하, 150개 이하, 125개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 34개 이하, 33개 이하, 32개 이하 또는 31개 이하 (또는 31개 내지 약 175개 사이의 임의의 범위)의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된, SEQ ID NO:1 내지 6을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 정제된 폴리펩티드는 약 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상 또는 175개 이상 (또는 약 31개 내지 약 175개 사이의 임의의 범위)의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된다 (즉, 상기 정제된 폴리펩티드는 완전한 천연 에를리히아 샤핀시스 VLPT 폴리펩티드를 포함하지 않는다). 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산은 에를리히아 샤핀시스 생물체에 의해 자연적으로 생성된 임의의 폴리펩티드이다. 즉, 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시된 폴리펩티드를 포함하지만, 약 175개 이하, 150개 이하, 125개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하 또는 35개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된다.
폴리펩티드 SEQ ID NO:1 내지 3 및 SEQ ID NO:5 내지 6이 전장 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드 VPLT 보다 짧다는 사실이 중요하는데, 이는 짧은 폴리펩티드가 전장 폴리펩티드 검정 보다 뛰어난 특이성 및/또는 감수성을 지닐 수 있기 때문이다. 또한, 이러한 짧은 폴리펩티드는 제조에 덜 비용이 들고, 전장 폴리펩티드 보다 높은 순도로 수득될 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예는 약 175개 이하, 150개 이하, 125개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하 또는 35개 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산과 SEQ ID NO:1 내지 6의 약 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상 또는 30개 이상의 연속 아미노산인 정제된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 한 가지 구체예는 SEQ ID NO:1 내지 6의 적어도 약 10개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 50개 또는 그 초과의 연속 아미노산을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 약 35개 내지 약 40개, 약 35개 내지 약 50개, 약 35개 내지 약 100개, 또는 약 35개 내지 약 150개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 약 120번 아미노산 잔기 내지 약 177번 아미노산 잔기를 포함하거나, SEQ ID NO:4의 약 130번 아미노산 잔기 내지 약 170번 아미노산 잔기를 포함하거나, SEQ ID NO:4의 약 135번 아미노산 잔기 내지 약 168번의 아미노산 잔기를 포함한다.
폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시된 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%, 또는 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것이고, 이들은 또한 본 발명의 폴리펩티드이다. SEQ ID NO:1 내지 3의 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:1 내지 3과 적어도 97% (약 1개의 아미노산이 변경됨), 94% (약 2개의 아미노산이 변경됨), 90% (약 3개의 아미노산이 변경됨), 87% (약 4개의 아미노산이 변경됨), 84% (약 5개의 아미노산이 변경됨), 87% (약 4개의 아미노산이 변경됨), 84% (약 5개의 아미노산이 변경됨) 또는 81% (약 6개의 아미노산이 변경됨) 동일할 수 있다. SEQ ID NO:5 내지 6의 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:5 내지 6과 적어도 97% (약 1개의 아미노산이 변경됨), 94% (약 2개의 아미노산이 변경됨), 91% (약 3개의 아미노산이 변경됨), 88% (약 4개의 아미노산이 변경됨), 84% (약 5개의 아미노산이 변경됨) 또는 81% (약 6개의 아미노산이 변경됨) 동일할 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 변화 또는 다른 중요치 않은 변형을 지니며 생물학적 활성을 보유하는데, 즉, 생물학적으로 작용성인 등가물이다. 생물학적으로 활성인 등가물은 상응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 동등한 기능을 지닌다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 폴리펩티드는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 그 미만의 보존적 아미노산 치환을 지닌다.
서열 동일성 비율은 당 분야에서 인지되는 의미를 지니고, 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재한다 (참조: Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)). 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들을 정렬하기 위한 방법은, GCG 프로그램 패키지 (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Molec. Biol. 215:403 (1990)), 및 스미쓰(Smith)와 워터맨(Waterman) (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))의 국부(local) 상동성 알고리듬을 이용하는 Bestfit 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 포함하는 컴퓨터 프로그램에 기호화되어 있다. 예를 들어, FASTA 알고리듬을 이용하는 컴퓨터 프로그램인 ALIGN이 사용될 수 있는데, 이는 갭 오픈 패널티(gap open penalty)를 -12로 하고 갭 익스텐션 패널티(gap extension penalty)를 -2로 하여 아핀 갭 검색(affine gap search)을 수행한다.
특정 서열이 예를 들어 기준 서열과 약 95% 동일한 지의 여부를 측정하기 위해 서열 정렬 프로그램 중 어느 하나를 사용하는 경우, 매개변수(parameter)들은, 동일성 비율이 기준 폴리뉴클레오티드의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 폴리뉴클레오티드의 전체 뉴클레오티드 개수 중 5% 이하의 동일성 갭이 허용될 정도로 설정된다.
일반적으로 폴리펩티드 변이체는 본 발명의 폴리펩티드 서열들 중 하나를 변형시키고 이렇게 변형된 폴리펩티드가 생물학적 등가물인 지의 여부를 결정하기 위해 이의 특성을 평가함으로써 확인될 수 있다. 변이체가 면역조직화학 검정, 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 면역효소 검정 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 검정에서 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하게 반응하는 경우, 예를 들어 상기 본래의 폴리펩티드의 활성의 90 내지 110%를 지니는 경우, 그러한 변이체는 생물학적 등가물이다. 한 가지 구체예에서, 상기 검정은 경합 검정이며, 여기서 상기 생물학적으로 등가인 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드가 상응하는 반응성 항원 또는 항체에 결합하는 것을 약 80%, 95%, 99% 또는 100% 감소시킬 수 있다. 상응하는 야생형 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 또한 상기 폴리펩티드 변이체와 특이적으로 결합한다.
보존적 치환은 하나의 아미노산이 유사한 특성을 지닌 또 다른 아미노산으로 치환되는 것인데, 이로써 펩티드 화학 분야의 기술자는 폴리펩티드의 2차 구조와 친수성(hydropathic nature)이 실질적으로 변하지 않으리라고 예상할 것이다. 일반적으로, 하기 아미노산 군이 보존적 교환을 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
본 발명의 폴리펩티드는 번역과 동시에 또는 번역후에 단백질의 이동을 유도하는 신호 (또는 리더(leader)) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 이의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 (예를 들어, poly-His) 혹은 그러한 폴리펩티드가 고체 지지체에 결합되는 것을 향상시키기 위해 링커 또는 다른 서열을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역 또는 우혈청 알부민에 컨쥬게이션될 수 있다.
폴리펩티드는 자연 상태에서는 이러한 폴리펩티드에 통상적으로 결합되어 있지 않은 아미노산 서열, 즉, 이종 아미노산 서열에 공유결합되거나 비공유결합되어 있을 수 있다. 이종 아미노산 서열은 비(非)-에를리히아 샤핀시스 생물체로부터 유래될 수 있거나, 합성 서열일 수 있거나, 본 발명의 폴리펩티드의 카르복시 말단 또는 아미노 말단에 일반적으로 존재하지 않는 에를리히아 샤핀시스 서열일 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 아미노산 이외의 화합물 또는 분자, 예를 들어 지시약에 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다. 폴리펩티드는 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 면역 반응을 향상시키는 부분(즉, 폴리펩티드 또는 다른 화합물일 수 있는 작용기) (예를 들어, IL-2와 같은 사이토카인), 정제를 촉진시키는 부분 (예를 들어, 6-히스티딘 태그, trpE, 글루타티온, 말토오스 결합 단백질과 같은 친화성 태그), 또는 폴리펩티드 안정성을 촉진시키는 부분 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜; 아미노 말단 보호기, 예를 들어 아세틸, 프로필, 숙시닐, 벤질, 벤질옥시카르보닐 또는 t-부틸옥시카르보닐; 카르복실 말단 보호기, 예를 들어 아미드, 메틸아미드 및 에틸아미드)에 결합될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 단백질 정제 리간드는, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 혹은 둘 모두의 말단에 존재하는, 하나 이상의 C 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 스페이서는 자연 상태에서는 본 발명의 폴리펩티드와 결합되어 있지 않은 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1개, 5개, 10개, 20개, 100개 또는 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
요망되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부일 수 있는데, 이러한 융합 단백질은 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 신호 서열, TMR 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인과 같은 다른 아미노산 서열 뿐만 아니라 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그 및 스태필로코커스 단백질 A와 같은 단백질 정제에 유용한 리간드를 함유한다. 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드가 본 발명의 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 비(非)-에를리히아 샤핀시스 단백질 또는 비(非)-에를리히아 샤핀시스 VLPT 단백질에 작동적으로 결합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드, 이의 단편, 또는 이들의 조합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 자연 상태에서는 존재하지 않는다. "작동적으로 결합"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드가 서로에 대해 인-프레임(in-frame) 상태로 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다는 것을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 다량체 형태로 존재할 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 본 발명의 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드의 하나 이상의 카피(copy) 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 다량체 폴리펩티드는 다중 항원 펩티드(MAP)일 수 있다 (참조: Tam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996)).
본 발명의 폴리펩티드는 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체에 의해 인지되는 항원을 포함할 수 있다. 그러한 항원은 하나 이상의 에피토프 (즉, 항원 결정기)를 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 1차(sequential) 에피토프 또는 입체 에피토프일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드내에 존재하는 에피토프는 수 가지 방법에 의해 확인될 수 있다 (참조: U.S. Patent No. 4,554,101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988)). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 분리되어 스크리닝될 수 있다. 전체 폴리펩티드 서열을 함께 구성하는 일련의 짧은 펩티드는 단백질가수분해에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 30량체 폴리펩티드 단편 (또는 보다 짧은 단편)을 시작으로 하여, ELISA에서 인지되는 에피토프의 존재에 대해 각각의 단편이 시험될 수 있다. 예를 들어, ELISA 검정에서, 30량체 폴리펩티드 단편과 같은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 플라스틱 멀티-웰(multi-well) 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체에 부착시킨다. 항체 집단을 표지하고, 고체 지지체에 첨가하고, 비(非)-특이적 흡수가 차단되는 조건하에서 표지되지 않은 항원에 결합되게 하고, 임의의 결합되지 않은 항체와 다른 단백질을 세척해낸다. 항체 결합은, 예를 들어 무색 기질을 유색 반응 생성물로 전환시키는 반응에 의해 검출된다. 그 후, 확인된 30량체로부터의 점차적으로 보다 작고 중첩되는 단편들을 시험함으로써 관심있는 에피토프의 지도(map)를 만들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합적으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 벡터내로 도입될 수 있고, 이러한 재조합 발현 벡터는 당 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 적절한 발현 숙주 세포 시스템에서 발현될 수 있다. 다양한 세균, 효모, 식물, 포유동물 및 곤충 발현 시스템이 당 분야에서 이용가능하고, 그러한 발현 시스템은 어느 것이든 사용될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 무세포성(cell-free) 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 화학 합성될 수 있거나 에를리히아 샤핀시스 세포로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 6을 지닌 폴리펩티드의 에피토프를 인식하는 항체 또는 다른 면역 반응 (예를 들어, 면역계의 T-세포 반응)을 일으킬 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드의 단편일 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 단편은 약 6개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 170개 (또는 6개 내지 170개 사이의 임의의 범위) 또는 그 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 단편은 약 170개, 150개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개, 10개, 6개 (또는 170개 내지 6개 사이의 임의의 범위) 또는 그 미만의 아미노산 길이일 수 있다.
에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 완전하지 않은 미생물 게놈을 함유하고, 단일가닥 또는 이중가닥 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학 합성된 RNA 또는 DNA이거나 이들의 조합물일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 다른 성분, 예를 들어 단백질, 지질 및 다른 폴리뉴클레오티드가 없는 상태로 정제될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정제될 수 있다. 예를 들어 cDNA 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 분해물을 함유하는 겔 슬라이스내에 들어있는, 수 백개 내지 수 백만개의 다른 핵산 분자들 중에 존재하는 핵산 분자는 분리된 폴리뉴클레오티드로 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 설명된 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, VLPT 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시되는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 엔코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 530개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 250개 이하, 200개 이하, 150개 이하, 100개 이하 또는 90개 이하 (또는 90개 내지 530개 사이의 임의의 범위) 이하의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 90개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상 또는 530개 이상 (또는 90개 내지 530개 사이의 임의의 범위), 또는 그 초과의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 정제된 폴리뉴클레오티드는 추가의 이종 뉴클레오티드 (즉, 에를리히아 샤핀시스로부터 유래되지 않은 뉴클레오티드)와 추가의 에를리히아 샤핀시스 아미노산을 포함할 수 있는데, 단, 추가의 서열들은 에를리히아 샤핀시스 VLPT 폴리뉴클레오티드와 연속적으로 존재하지 않아야 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다른 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 링커, 신호 서열, TMR 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그 및 스태필로코커스 단백질 A와 같은 단백질 정제에 유용한 리간드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예는 SEQ ID NO: 1 내지 6을 엔코딩하는 적어도 약 6개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정제된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리될 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 자연 상태에서 이것이 결합되어 있는 5' 및 3' 플랭킹(flanking) 게놈 서열 중 하나 또는 둘 모두와 바로 연속된 상태로 존재하지 않은 천연 폴리뉴클레오티드이다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 임의의 길이를 지닌 재조합 DNA 분자일 수 있는데, 단, 천연 게놈내에서 그러한 재조합 DNA 분자를 바로 플랭킹하는 자연 상태에서 발견되는 핵산 서열은 제거되거나 존재하지 않는다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드는 비(非)-천연 핵산 분자를 포함한다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전장 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 및 폴리펩티드 변이체 또는 융합 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 축퇴성(degenerate) 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 상보서열(complement)과 적어도 약 80%, 또는 약 90%, 96%, 98%, 또는 99% 동일한 상동 뉴클레오티드 서열이 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드이다. 서열 동일성 비율은 "폴리펩티드" 단락에 설명된 바와 같이 계산될 수 있다. 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 엔코딩하지만 유전 암호의 축퇴(degeneracy)로 인해 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 핵산 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 생물학적으로 작용성인 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 엔코딩하는 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드의 상보적 DNA(cDNA) 분자, 종 동족체(species homolog) 및 변이체가 또한 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 감염된 개체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 타액 또는 조직에 존재하는 핵산 서열로부터 분리될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 자동 합성기를 사용하여 실험실에서 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 PCR과 같은 증폭 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나 자연 상태에서는 존재하지 않는 변경된 서열을 엔코딩할 수 있다. 요망되는 경우, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 또는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 다른 조절 요소를 포함하는 발현 제어 요소를 포함하는 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pUC 또는 ColE1, 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 타입 2 벡터 또는 타입 5 벡터일 수 있다. 임의로, 다른 벡터가 사용될 수 있는데, 이의 예로는 비제한적으로 신드비스(Sindbis) 바이러스, 시미안(simian) 바이러스 40, 알파바이러스(alphavirus) 벡터, 폭스바이러스(poxvirus) 벡터, 및 사이토메갈로바이러스 및 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 뮤린(murine) 육종 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스, 및 루(Rous) 육종 바이러스가 있다. 미니크로모솜(minichromosome), 예를 들어 MC 및 MCl, 박테리오파지, 파지미드, 효모 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 바이러스 입자, 바이러스-유사(virus-like) 입자, 코스미드(cosmid) (파지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드) 및 레플리콘(replicon) (세포에서 자체 제어를 받으며 복제할 수 있는 유전 요소)이 또한 사용될 수 있다.
발현 제어 서열에 작동적으로 결합된 폴리뉴클레오티드를 제조하고 이러한 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에서 발현시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,366,246). 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 유도하는 하나 이상의 발현 제어 요소와 인접한 곳에 위치하거나 그 근처에 위치하는 경우 작동적으로 결합된 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 생물학적 샘플과 같은 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 예를 들어 프로브로서 또는 PCR 프라이머와 같은 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브는 예를 들어 하이브리드화를 통해 전형적으로 서열 특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 프라이머는, 효소 조작을 지원할 수 있고 그러한 효소 조작이 일어나도록 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있는 프로브의 서브셋(subset)이다. 프라이머는 당 분야에서 이용가능한, 효소 조작을 간섭하지 않는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합물로부터 제조될 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 SEQ ID NO:1 내지 6으로 제시된 폴리펩티드를 엔코딩하는 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드일 수 있다.
핵산의 하이브리드화는 당 분야에서 잘 이해되어 있고, 본 명세서에서 검토되어 있다. 전형적으로, 프로브는 당 분야에서 이용가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합물로부터 제조될 수 있다. 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 이러한 프로브와 프라이머의 능력은 소정의 시험 샘플에 상보적 서열이 존재하는 지를 검출하는 데에 상기 프로브와 프라이머가 사용될 수 있게 할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브와 프라이머는, 타액, 가래(sputum), 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 양막액, 창상 삼출액(wound exudate) 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 시험 샘플내의, 상보적 서열에 하이브리드화될 수 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 겔 전기영동 또는 다른 크기별 분리(size separation) 기술에 적용될 수 있거나 크기별 분리없이 고정화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 표지될 수 있다. 적절한 표지 및 프로브와 프라이머를 표지하는 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 닉 번역(nick translation) 또는 키나아제에 의해 혼입되는 방사성 표지, 바이오틴 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광(bioluminescent) 표지, 금속 킬레이터 표지 및 효소 표지가 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드는 적절히 엄격한 하이브리드화 조건하에서 프로브 또는 프라이머와 접촉된다.
적용 용도에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 적용 용도의 경우, 비교적 엄격한 조건이 사용될 수 있는데, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M 염의 염 농도에 의해 제공되는 바와 같은 저염 및/또는 고온 조건이 사용될 수 있다. 더 낮은 선택도를 필요로 하는 적용 용도의 경우, 덜 엄격한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.14 M 내지 약 0.9 M 염의 염 농도가 사용된다. 시험 샘플로부터 상보적 폴리뉴클레오티드와 프로브 또는 프라이머를 포함하는 하이브리드화된 복합체가 검출된다는 것은 샘플내에 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드가 존재함을 나타낸다.
항체
본 발명의 항체는 본 발명의 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드, 본 발명의 폴리펩티드 변이체, 또는 이들의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 분자이다. 본 발명의 항체는 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드에 대해 특이적일 수 있는데, 예를 들어 SEQ ID NO:1 내지 6 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드에 대해 특이적이고, 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 대해 특이적이지 않다 (예를 들어, SEQ ID NO:1 내지 6에 대해 특이적인 항체). 당업자는 항체가 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드에 대해 특이적인 지의 여부를 본 명세서에 설명된 검정을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일 사슬 항체(scFv), 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체의 항원-결합성 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부이며, 여기서 그러한 일부는 상기 온전한 항체의 Fc 영역의 중쇄 불변 도메인이 없다. 항원-결합성 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편이 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 부류일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 항체는, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 시험관내에서 제조되거나 적절한 실험 동물로 생체내에서 제조될 수 있다. 항체를 제조하고 이를 특성화하는 수단은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Dean, Methods MoI. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods MoI. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods MoI. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods MoI. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)). 예를 들어, 폴리클로날 항체는, 본 발명의 폴리펩티드를 사람 또는 다른 영장류, 마우스, 랫트(rat), 토끼, 기니피그, 염소, 돼지, 개, 소, 양, 당나귀 또는 말과 같은 동물에게 투여함으로써 생성될 수 있다. 면역화시킨 동물로부터의 혈청을 수집하고, 예를 들어 암모늄 설페이트에 의한 침전에 이은 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의해, 항체를 혈장으로부터 정제한다. 폴리클로날 항체를 생성시키고 이를 가공하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다.
"특이적으로 결합" 또는 "~에 대해 특이적인"이라는 것은 제 1 항원, 예를 들어 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 다른 비특이적인 분자에 결합하는 것 보다 더 높은 친화성을 나타내며 본 발명의 항체를 인지하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 또한, "특이적으로 결합" 또는 "~에 대해 특이적인"이라는 것은 제 1 항체, 예를 들어 SEQ ID NO:1 내지 6에 대해 생성시킨 항체가 다른 비특이적 분자에 결합하는 것 보다 더 높은 친화성을 나타내며 SEQ ID NO:1 내지 6을 인지하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 비특이적 분자는 상기 제 1 항원과 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 비특이적 분자는 에를리히아 종(Ehrlichia sp.)으로부터 유래되지 않은 것이고, 구체적으로는 에를리히아 샤핀시스 또는 에를리히아 카니스로부터 유래되지 않은 것이다. "에를리히아 종"은 에를리히아 속(genus)의 모든 종을 지칭한다. 예를 들어, 비특이적 항원에 결합하는 것 보다 더 효율적으로 제 1 항원(예를 들어, 폴리펩티드)에 결합하는, 상기 제 1 항원에 대해 생성시킨 항체는 상기 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 설명될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합성 부분은 이것이 107 l/mol 또는 그 초과의 결합 친화도 Ka를 나타내며 결합하는 경우 SEQ ID NO:1 내지 6의 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합은, 예를 들어 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 시험될 수 있다.
본 발명의 항체는, (a) SEQ ID NO:1 내지 6 또는 이의 항원 결합 단편에 결합함에 있어서 기준 항체와 경합하고/거나, (b) 기준 항체와 동일한 에피토프인, SEQ ID NO:1 내지 6 또는 이의 항원 결합 단편의 에피토프에 결합하고/거나, (c) 기준 항체와 실질적으로 동일한 Kd를 나타내며 SEQ ID NO:1 내지 6 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하고/거나, (d) 기준 항체와 실질적으로 동일한 오프 레이트(off rate)를 나타내며 SEQ ID NO:1 내지 6 또는 이의 단편에 결합하는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서 상기 기준 항체는 107 l/mol 또는 그 초과의 결합 친화도 Ka를 나타내며 SEQ ID NO:1 내지 6의 폴리펩티드 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 에피토프에 대해 생성시킨 모노클로날 항체가 또한 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 마우스와 같은 포유동물로부터의 정상 B 세포를 예를 들어 HAT-감수성 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 에를리히아 특이적 항체를 생성시키는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 이용하여 확인될 수 있고, 반고형 한천에서의 클로닝 또는 한계 희석법(limiting dilution)에 의해 분리될 수 있다. 에를리히아 특이적 항체를 생성시키는 클론은 추가의 스크리닝 작업에 의해 분리된다. 모노클로날 항체는 표준 기술을 사용하여 특이성에 대해 스크리닝될 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 미세역가(microtiter) 플레이트에 결합시키고 ELISA 검정에 의해 모노클로날 항체가 결합하는 지를 측정함으로써 이루어진다. 모노클로날 항체를 생성시키고 이를 가공하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다 (참조: Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)). 모노클로날 항체의 특정 이소타입(isotype)은, 최초 융합체로부터 선택함으로써 직접 제조될 수 있거나, 클래스-스위치(class-switch) 변이체를 분리하기 위해 sib 선택 기술을 사용함으로써 이소타입이 상이한 모노클로날 항체를 분비하는 모체 하이브리도마(parental hybridoma)로부터 2차적으로 제조될 수 있다 (참조: Steplewski et al, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al, J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984). 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 재조합 모노클로날 항체일 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,474,893; 미국 특허 번호 4,816,567). 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 만들어질 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,676,980).
본 발명의 항체는 키메라 항체 (참조: 미국 특허 번호 5,482,856), 사람화된 항체 (참조: Jones et al, Nature 321 :522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), 개과동물화된 항체, 개과동물 또는 사람 항체일 수 있다. 사람 항체는 예를 들어 직접 고정화(direct immortilization), 파지 디스플레이, 트랜스제닉 마우스(transgenic mice), 또는 트리메라(Trimera) 방법에 의해 제조될 수 있다 (참조: Reisener et al, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)).
에를리히아 샤핀시스와 특이적으로 결합하는 항체는, 동물로부터의 혈청, 혈액, 혈장, 세포, 조직, 소변, 대변 또는 타액 샘플과 같은 샘플 중에 에를리히아 샤핀시스가 존재하는 지를 검출하는 데에 특이 유용하다. 이를 위한 면역검정은 1개의 항체 또는 수 개의 항체를 사용할 수 있다. 면역검정은 예를 들어 하나의 에피토프에 대해 특이적인 모노클로날 항체, 하나의 폴리펩티드의 에피토프들에 대해 특이적인 모노클로날 항체들의 조합물, 다양한 폴리펩티드의 에피토프들에 대해 특이적인 모노클로날 항체들, 동일한 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체들, 다양한 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체들, 또는 모노클로날 항체들과 폴리클로날 항체들의 조합물을 사용할 수 있다. 면역검정 프로토콜은 예를 들어, 경합, 직접 반응, 또는 예를 들어 표지된 항체를 사용하는 샌드위치 타입 검정을 기초로 할 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 형광 표지, 화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, 콜로이드성 금속 표지, 방사성동위원소 표지 및 생체발광 표지를 포함하는, 당 분야에 공지된 임의의 유형의 표지로 표지될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 항체는 에를리히아 샤핀시스 항원과 특이적으로 결합하고, 에를리히아 카니스 항원에는 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 지지체에 결합되어 에를리히아 샤핀시스 항원의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 지지체로는 예를 들어 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 셀룰로오스 및 개질된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트가 있다.
또한, 본 발명의 항체는 면역친화성 컬럼에 의해 에를리히아 샤핀시스 생물체 또는 항원을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 이의 면역선택적 활성을 보유하도록, 예를 들어 흡착에 의해 또는 공유결합에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 임의로, 항체의 항원 결합 부위가 접근가능한 상태로 유지되도록 스페이서 그룹(spacer group)이 포함될 수 있다. 그 후, 상기 고정된 항체는, 타액, 혈청, 가래, 혈액, 소변, 대변, 뇌척수액, 양막액, 창상 삼출액 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터의 에를리히아 샤핀시스 생물체 또는 에를리히아 샤핀시스 항원과 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 결합된 에를리히아 생물체 또는 에를리히아 항원은, 예를 들어 pH를 변화시킴으로써 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
또한, 본 발명의 항체는 다양한 세포 사건 또는 생리적 조건 동안의 본 발명의 폴리펩티드의 존재 및 분포를 분석하기 위한 면역국재화(immunolocalization) 연구에서 사용될 수 있다. 또한, 항체는 수동 면역화에 관여하는 분자를 확인하기 위해 그리고 비(非)-단백질 항원의 생합성에 관여하는 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 분자를 확인하는 것은 백신을 개발하는 데에 유용할 수 있다. 예를 들어 모노클로날 항체 및 단일 사슬 항체를 포함하는 본 발명의 항체는 에를리히아 샤핀시스에 의해 초래된 질병의 개선 과정을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 동물로부터의 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 질병을 개선시키고자 하는 특정 치료 요법이 효과적인 지의 여부가 결정될 수 있다. 항체는, 예를 들어 RIA, ELISA 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 직접 결합 검정을 사용하여 검출되고/되거나 정량될 수 있다.
검출 방법
본 발명의 방법은 생물학적 샘플, 환경 샘플 또는 실험실 샘플과 같은 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 항원 또는 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 항체 또는 항원-결합성 항체 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 시험 샘플은 잠재적으로 에를리히아 종 폴리뉴클레오티드, 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드, 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드, 에를리히아 종 폴리펩티드, 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드, 에를리히아 카니스 폴리펩티드, 에를리히아 종에 대해 특이적인 항체, 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체, 및/또는 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 항체, 관련없는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물을 포함하거나, 상기 언급된 것들 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 말, 고양이, 개 또는 사람과 같은 포유동물로부터의 혈청, 혈액, 세포, 혈장, 타액, 소변, 대변 또는 조직을 포함할 수 있다. 시험 샘플은 처리되지 않거나, 침전되거나, 분별(fractionated)되거나, 분리되거나, 희석되거나, 농축되거나 정제될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 폴리펩티드/항체 복합체, 즉, 면역복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 항원에 대해 특이적인 항체에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드는 에를리히아 샤핀시스 항원에 대해 특이적인 항체에 특이적으로 결합하고, 에를리히아 카니스 항원에는 특이적으로 결합하지 않는다. 항체/폴리펨티드 복합체 결합을 검출하기 위해 사용되는 검정 및 조건은 당업자에게 익숙한 것이다. 샘플에서 폴리펩티드와 항체 사이의 복합체가 형성되는 것이 검출된다. 항체/폴리펩티드 복합체가 형성된다는 것은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 샘플에 존재함을 나타낸다. 그러한 폴리펩티드/항체 복합체가 검출되지 않는다는 것은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않음을 나타낸다.
본 발명의 항체는, 에를리히아 샤핀시스에 감염된 것으로 의심되는 예를 들어 사람 또는 동물로부터의 시험 샘플을 수득함으로써 에를리히아 샤핀시스 감염을 진단하는 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 시험 샘플은 항체-항원 복합체 (즉, 면역복합체)의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명의 항체와 접촉된다. 항원/항체 복합체의 형성을 가능하게 하며 이를 위해 적절한 조건은 당업자에게 알려져 있다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 음성 대조 샘플에서 형성된 수준 보다 높은 수준은 에를리히아 샤핀시스 감염을 나타낸다. 음성 대조 샘플은 에를리히아 샤핀시스 및/또는 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 에를리히아 샤핀시스 및/또는 에를리히아 카니스 폴리펩티드 또는 항체를 전혀 포함하지 않는 샘플이다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 음성 대조군은 에를리히아 종에 대해 특이적인 에를리히아 종 폴리펩티드 또는 항체를 전혀 함유하지 않는다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 항체는 에를리히아 샤핀시스 항원에 대해 특이적이고, 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적이지 않다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 시험 샘플과 접촉될 수 있다. 양성 시험 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 특이적 항체는 적절한 조건하에서 항원-항체 복합체를 형성할 것이다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 에를리히아 샤핀시스 감염이 피검체에서 검출될 수 있다. 생물학적 샘플은 피검체로부터 수득된다. SEQ ID NO:1 내지 6를 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드는 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 생물학적 샘플과 접촉된다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 포유동물이 에를리히아 샤핀시스에 감염되었음을 나타낸다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출되지 않는다는 것은 포유동물이 에를리히아 샤핀시스에 감염되지 않았음을 나타낸다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 에를리히아 샤핀시스 감염은 피검체가 에를리히아 샤핀시스에 감염된 후 약 5일째, 6일째, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째, 19일째, 20일째, 21일째 또는 그 초과 일수까지 피검체에서 검출될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 에를리히아 샤핀시스 감염은 피검체가 에를리히아 샤핀시스에 감염된 후 약 21일째, 20일째, 19일째, 18일째, 17일째, 16일째, 15일째, 14일째, 13일째, 12일째, 11일째, 10일째, 9일째, 8일째, 7일째, 6일째, 5일째 또는 그 미만 일수까지 검출될 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 폴리펩티드/항체 복합체는, 항체에 결합되어 있는 지시약, 예를 들어 효소 컨쥬게이트가 검출가능한 반응을 촉매하는 경우에 검출된다. 임의로, 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약이 폴리펩티드/항체 복합체에 적용될 수 있다. 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 검출된다. 임의로, 폴리펩티드 또는 항체는 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되기 전에 지시약으로 표지될 수 있다. 이러한 방법은 임의로 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플이 기질에 첨가된다. 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체가 첨가된다. 그러한 항체는 고체상에서 사용되는 동일한 항체일 수 있거나 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 것일 수 있고, 효소 컨쥬게이트와 같은 지시약에 결합될 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계가 수행될 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 발색 반응이 전개된다. 이러한 발색 반응이 정지되고, 예를 들어 분광계를 사용하여 발색이 정량될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플이 기질에 첨가된다. 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 제 2의 항종(anti-species) 항체가 첨가된다. 이러한 제 2의 항체는 고체상 항체와 상이한 종으로부터 유래된다. 제 2의 항체와 특이적으로 결합하고 고체상 항체와는 특이적으로 결합하지 않는 제 3의 항종 항체가 첨가된다. 제 3의 항체는 효소 컨쥬게이트와 같은 지시약을 포함할 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계가 수행될 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 발색 반응이 전개된다. 이러한 발색 반응이 정지되고, 예를 들어 분광계를 사용하여 발색이 정량될 수 있다.
본 발명의 검정은 비제한적으로 경합, 직접 반응 또는 샌드위치-타입 검정을 기초로 하는 검정을 포함하고, 그 예로는 비제한적으로 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, IFA, 방사면역검정(RIA), 혈구응집(hemagglutination, HA), 형광 편광 면역검정(FPIA), 및 미세역가 플레이트 검정 (미세역가 플레이트의 하나 이상의 웰에서 수행되는 임의의 검정)이 있다. 본 발명의 한 가지 검정은 가역성 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 예를 들어 SNAP? 검정을 포함한다 (참조: 미국 특허 번호 5,726,010).
검정은 고체상 또는 기질을 사용할 수 있거나, 면역침전법에 의해 또는 고체상을 사용하지 않는 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 고체상 또는 기질이 사용되는 경우, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드는 고체상 또는 기질, 예를 들어 미세역가 웰, 마그네틱 비드(magnetic bead), 비(非)-마그네틱 비드, 컬럼, 매트릭스, 막, 합성 또는 천연 섬유 (예를 들어, 유리 또는 셀룰로오스 기반 물질 또는 열가소성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에스테르)로 구성된 섬유 매트(fibrous mat), 미립자 물질 (예를 들어, 유리 또는 다양한 열경화성 중합체)로 구성된 소결 구조물, 또는 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰 등 (성질상 대체로 합성물질임)으로 구성된 캐스트 멤브레인 필름(cast membrane film)에 직접 부착되거나 간접 부착된다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 기질은 일반적으로 다공성 폴리에틸렌으로서 알려져 있는 폴리에틸렌의 소결된 미세 입자이며, 예를 들어 크로멕스 코포레이션(Chromex Corporation, Albuquerque, NM)으로부터의 10-15 마이크론 다공성 폴리에틸렌이다. 이러한 모든 기질 물질은 적절한 형태, 예를 들어 필름, 시트(sheet) 또는 플레이트(plate) 형태로 사용될 수 있거나, 적절한 비활성 캐리어(carrier), 예를 들어 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물(fabric) 위로 코팅되거나 이에 결합되거나 적층(laminated)될 수 있다. 펩티드를 고체 위에 고정시키기 위한 적절한 방법은 이온성, 소수성, 공유성 상호작용 등을 포함한다.
한 가지 유형의 검정 포맷(format)에서, 하나 이상의 폴리펩티드가 고체상 또는 기질 위에 코팅될 수 있다. 항-에를리히아 샤핀시스 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플은, 시험 샘플의 항체와 고체상의 폴리펩티드의 항원/항체 복합체 또는 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체에 컨쥬게이션된 지시약 화합물과 고체상의 폴리펩티드의 항원/항체 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 그렇게 되게 하는 시간 동안, 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편에 컨쥬게이션된 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약과 함께 인큐베이션된다. 항-에를리히아 샤핀시스 항체에 컨쥬게이션된 지시약이 고체상에 결합하는 정도의 감소가 정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어 확립된 음성 에를리히아 샤핀시스 시험 샘플로부터 발생된 신호와 비교하여 신호가 측정가능하게 감소된다는 것은 시험 샘플에 항-에를리히아 샤핀시스 항체가 존재함을 나타낸다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플에서 항-에를리히아 샤핀시스 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 하나 이상의 본 발명의 항체가 지지체 또는 기질 위로 코팅된다. 본 발명의 폴리펩티드는 지시약에 컨쥬게이션되어 시험 샘플에 첨가된다. 이러한 혼합물은 지지체 또는 기질에 적용된다. 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이러한 항체는 지시약에 컨쥬게이션된 하나 이상의 폴리펩티드 그리고 지지체 위에 고정된 하나 이상의 폴리펩티드에 결합한다. 그 후, 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플에서 항-에를리히아 샤핀시스 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드가 지지체 또는 기질 위로 코팅된다. 시험 샘플은 지지체 또는 기질에 적용되고, 인큐베이션된다. 고체 지지체를 세척 용액으로 세척함으로써 샘플로부터의 결합되지 않은 성분이 세척된다. 에를리히아 샤핀시스 특이적 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이러한 항체는 고체상 위에 코팅된 폴리펩티드에 결합한다. 이러한 폴리펩티드/항체 복합체는 지시약에 컨쥬게이션된 제 2의 종-특이적(species-specific) 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 그 후, 폴리펩티드/항체/항종 항체 지시약 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플내의 항-에를리히아 샤핀시스 항체의 양을 정량할 수 있다.
폴리펩티드/항체 복합체 또는 폴리펩티드/항체/지시약 복합체의 형성은, 예를 들어 방사능측정(radiometric), 비색, 형광측정, 크기별 분리 또는 침전 방법에 의해 검출될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약에 커플링된 제 2의 항체를 첨가함으로써 이루어진다. 폴리펩티드/항체 복합체와 결합된 신호 발생 화합물(표지)을 포함하는 지시약은 상기 설명된 방법을 사용하여 검출될 수 있고, 색소제(chromogenic agent), 촉매, 예를 들어 효소 컨쥬게이트, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 화학발광 화합물, 예를 들어 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄, 및 루미놀, 방사성 원소, 직접적 시각 표지 뿐만 아니라 보조인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함한다. 효소 컨쥬게이트의 예로는 알칼리 포스파타아제, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제 등이 있다. 특정 표지를 선택하는 것은 중요한 것이 아니지만, 이는 그 자체로 또는 하나 이상의 추가 물질과 함께 신호를 생성시킬 수 있을 것이다.
복합체가 형성된다는 것은 시험 샘플에 항-에를리히아 샤핀시스 항체를 존재함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 동물에서 에를리히아 감염을 진단하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 시험 샘플내의 항-에를리히아 샤핀시스 항체의 양을 나타낼 수 있다. 효소 컨쥬게이트와 같은 다수의 지시약을 사용하는 경우, 존재하는 항체량은 생성된 신호에 비례한다. 시험 샘플의 유형에 따라, 이러한 샘플이 적절한 완충 시약에 의해 희석될 수 있거나, 농축될 수 있거나, 아무런 조작없이 고체상과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 항체의 존재 여부 및/또는 존재하는 항체량을 측정하기 위해, 미리 희석시킨 혈청 또는 혈장 샘플, 또는 소변과 같은 농축된 표본을 시험하는 것이 일반적으로 바람직하다.
또한, 본 발명은 샘플내의 항-에를리히아 샤핀시스 항체 또는 항원-결합성 항체 단편, 또는 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 검출하기 위한 검정 키트(assay kit) (예를 들어, 제품)를 포함한다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드와, 이러한 폴리펩티드가 샘플내의 항-에를리히아 샤핀시스 항체 또는 항체 단편에 결합하는 지를 측정하기 위한 수단을 포함한다. 키트 또는 제품은 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 항체 단편과, 이러한 항체 또는 항체 단편이 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드에 결합하는 지를 측정하기 위한 수단을 또한 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 장치와, 이러한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체를, 예를 들어 포유동물이 에를리히아 샤핀시스에 감염되었는 지를 확인하기 위해 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는, 그러한 키트의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체가 에를리히아 샤핀시스 감염을 확인하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함하는 포장 재료를 포함할 수 있다. 당 분야에 알려져 있는 다른 구성요소, 예를 들어 완충액, 대조표준 등이 그러한 시험 키트에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 검정 및 키트는, 예를 들어 환자에서 에를리히아 샤핀시스 감염의 개별 사건을 진단하는 데에 유용할 뿐만 아니라 에를리히아 샤핀시스 발생을 역학 조사하는 데에도 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 다른 생물체와 더불어 에를리히아 샤핀시스의 존재를 검출하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 검정과 병용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 심장사상충(heartworm) 및/또는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 및/또는 에를리히아 카니스 및/또는 아나플라스마 플라티스(Anaplasma platys) 및/또는 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum)을 검출하는 시약과 병용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 간단한 하이브리드화 반응에서 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 실시간 PCR 반응과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법과 조성물은 에를리히아 카니스와 같은 다른 에를리히아 종으로부터 에를리히아 샤핀시스의 존재를 차별적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
PCR 검정은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,683,195, 미국 특허 번호 4,683,202 및 미국 특허 번호 4,965,188에 기재되어 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산의 변성된 가닥에 대해 어닐링된다(annealed). 프라이머 신장 생성물은 중합효소에 의한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합반응에 의해 형성된다. 그 후, PCR은 주형 핵산을 변성시키고, 프라이머를 어닐링하고, 열경화성 중합효소의 작용에 의해 어닐링된 프라이머를 신장시키는 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 이러한 공정에 의해 시험 샘플내의 표적 에를리히아 샤핀시스 핵산이 지수적으로 증폭되는데, 이는 샘플내에 매우 낮은 농도로 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출을 가능하게 한다.
실시간 PCR 검정은 신호, 예를 들어 형광 리포터 신호를 검출하는 것을 기반으로 한다. 이러한 신호는 반응에서 PCR 생성물의 양에 정비례하여 증가한다. 실시간 PCR은 진행중인 증폭 반응의 전개과정을 모니터링하는 것을 가능하게 하는 임의의 증폭 기술이다 (참조: Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989)). 각각의 사이클에서 형광 방출량을 기록함으로써, 지수기 동안 PCR 반응을 모니터링하는 것이 가능한데, 여기서 PCR 생성물의 양이 최초로 유의할 만하게 증가하는 것은 표적 주형의 최초량에 상응한다. 핵산 표적의 출발 카피 개수가 많을 수록, 형광의 유의할 만한 증가가 더욱 신속히 관찰된다.
본 발명의 한 가지 구체예는 시험 샘플내의 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드를 검출하고/거나 정량하는 방법을 제공한다. 센스 프라이머와 안티센스 프라이머가 중합효소 연쇄 반응에 적절한 조건하에서 시험 샘플에 첨가될 수 있다. 이러한 프라이머는, 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드가 시험 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물이 형성되도록, 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화한다. 증폭 생성물이 검출되고, 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드의 존재 및/또는 양이 측정된다. 증폭 생성물은, 중합효소 연쇄 반응에 적절한 조건하에서 에를리히아 샤핀시스 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 증폭 생성물은 프로브로부터의 검출 신호를 측정하고 그러한 검출 신호를 정량 표준으로부터의 제 2의 프로브 검출 신호와 비교함으로써 정량될 수 있다. 상기 정량 표준은 시험 샘플과 병렬적으로 추출될 수 있다.
에를리히아 샤핀시스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하는 방법
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 에를리히아 샤핀시스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체와 같은 항체 또는 이의 항원-결합성 단편이 사람 또는 개와 같은 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편이 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물로 동물에게 투여된다. 약제 조성물은 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 포함한다. 치료적 유효량은 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염의 증상을 완환시키거나 에를리히아 샤핀시스 생물체의 양을 감소시키는 데에 효과적인 양이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 면역원성 조성물로 존재할 수 있고, 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 면역원성 조성물 또는 면역원은 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 한 가지 결과로써 에를리히아 샤핀시스 감염의 효과를 개선시키거나 예방하는 면역 반응이 생성되도록 동물의 면역계를 감작(sensitizing)시키는 데에 특히 유용하다. 동물 모델에서 면역 반응을 유도하는 것은 예를 들어 최적 투여량 또는 투여 경로를 결정하기 위해 유용할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하는 것은 에를리히아 샤핀시스에 의해 야기된 질병 또는 감염을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개성 면역 반응, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 면역 반응은, 예를 들어 디펜신(defensin)의 생성을 촉진함으로써 전신(generalized) 숙주 반응을 촉진시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예는, 본 발명의 폴리펩티드와, 카르복실 말단 또는 아미노 말단에서 그러한 폴리펩티드에 공유결합된 하나 이상의 추가 영역 또는 부분을 포함하는 면역원을 제공한다. 각각의 영역 또는 부분은 예를 들어, 면역 반응을 향상시키거나, 면역원의 정제를 촉진시키거나, 폴리펩티드 안정성을 촉진시킬 수 있다.
에를리히아 샤핀시스에 대해 동물에 의해 항체 역가가 발생한다는 것은 감염을 방어하고 감염을 제거하는 데에 중요할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 항체 역가를 검출하고/하거나 정량하는 것이 항체 역가를 유도하는 데에 있어서 특히 효과적인 에피토프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 에를리히아 샤핀시스에 대한 강력한 항체 반응을 담당하는 에피토프는 다양한 길이를 지닌 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드에 대해 항체를 생성시킴으로써 확인될 수 있다. 그 후, 특정 폴리펩티드 에피토프에 의해 유도된 항체는, 어느 폴리펩티드가 강력한 반응을 생성시키는 데에 있어서 가장 효과적인 에피토프를 함유하는 지를 결정하기 위해 예를 들어 ELISA 검정을 사용하여 시험될 수 있다. 상기 에피토프를 함유하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질 또는 이러한 에피토프를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 구성될 수 있고, 강력한 항체 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체는, 생체내에서 항체를 유도하기 위해, 마우스, 토끼, 기니피그, 짧은꼬리 원숭이(macaque), 비비(baboon), 침팬지, 사람, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이와 같은 포유동물에게 투여되거나 닭 또는 오리와 같은 동물에게 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 주입하는 것은 구성 및 변형이 간단하다는 실용적인 이점을 지닌다. 또한, 폴리뉴크레오티드가 주입되면 숙주에서 폴리펩티드의 합성이 일어난다. 따라서, 폴리펩티드는 본래의 번역후 변형, 구조 및 입체형태를 지닌 채로 숙주 면역계에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 피검체에게 "나출(naked) DNA"로서 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체를 투여하는 것은, 생물학적 탄도총(ballistic gun) ("유전자총(gene gun))"을 사용하는 주입을 포함하는, 근내, 정맥내, 폐내, 근내, 피내, 복강내, 또는 피하 주사, 에어로졸, 비내, 주입 펌프(infusion pump), 좌약, 점막, 국소 및 경구 투여를 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체는 경구 투여를 위해 단백질 담체를 수반할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하기 위해 투여 방법들을 병용하여 사용할 수 있다. 항체는 약 0.5 mg 내지 약 200 mg의 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 항체는 약 20 내지 약 100 mg의 1일 투여량으로 투여된다.
치료 용도를 위한 약제학적으로 허용되는 담체와 희석제 및 수의학적으로 허용되는 담체와 희석제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985))]에 기재되어 있다. 담체는 그 자체가 숙주에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 한다. 이러한 담체로는 비제한적으로 느리게 대사되는 커다란 거대분자(macromolecule), 예를 들어 단백질, 다당류, 예를 들어 라텍스 작용기화된 SEPHAROSE?, 아가로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 비드 등, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 예를 들어 폴리글루탐산, 폴리리신 등, 아미노산 공중합체, 펩토이드(peptoid), 리피토이드(lipitoid), 및 비활성이고 비독성인 바이러스 입자 또는 세균 세포가 있다. 또한, 리포솜, 하이드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생체부착제(bioadhesive)가 본 발명의 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다.
또한, 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는데, 이의 예로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 또는 설폐이트와 같은 무기염 뿐만 아니라 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트와 같은 유기산염이 있다. 특히 유용한 단백질 기질은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린(thyroglobulin), 오발부민, 파상풍 톡소이드, 및 당업자에게 널리 공지된 다른 단백질이다. 또한, 본 발명의 조성물은 액체 또는 부형제, 예를 들어 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액(Ringer's solution), 행크 용액(Hank's solution), 글루코오스, 글리세롤, 덱스트로오스, 말로덱스트린, 에탄올 등을 단독으로 함유하거나 습윤제, 에멀션화제, 긴장도(tonicity) 조정제, 세정제 또는 pH 완충제와 같은 물질과 함께 함유할 수 있다. 살균제와 같은 추가의 활성 성분이 또한 사용될 수 있다.
요망되는 경우, 림프구에 면역원을 제공하는 것을 향상시키는 보조자극 분자, 예를 들어 B7-1 또는 B7-2, 또는 MIPIα, GM-CSF, IL-2 및 IL-12와 같은 사이토카인이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 임의로, 애쥬번트가 조성물에 또한 포함될 수 있다. 애쥬번트는 특정한 면역 반응을 비특이적으로 증강시키기 위해 사용될 수 있는 물질이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드와 애쥬번트는 면역계에 제공되기 전에 혼합되거나 개별적으로 제공되지만, 동물의 동일한 부위내로 제공된다. 애쥬번트로는, 예를 들어 오일 애쥬번트 (예를 들어, 프로인트 완전 애쥬번트 및 불완전 애쥬번트), 무기염 (예를 들어, Alk(SO4)2; AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카(Silica), 알룸(Alum), Al(OH)3, 및 Ca3(PO4)2), 폴리뉴클레오티드 (즉, Poly IC 및 Poly AU 산), 및 특정 천연 물질 (예를 들어, 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 왁스 D 뿐만 아니라 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라(Brucella) 속의 일원들에서 발견되는 물질)이 있을 수 있다. 사용될 수 있는 애쥬번트로는 비제한적으로 MF59-0, 알루미늄 하이드록사이드, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로 일컬어짐), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835 A, MTP-PE로 일컬어짐), 및 2% 스쿠알렌/TWEEN? 80 (폴리소르베이트) 에멀젼 중에 세균으로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는, RIBI가 있다.
본 발명의 조성물은 섭취가능한 정제, 구강정(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐, 엘릭서(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer), 주사용 제형, 구강세척액(mouthwash), 치마분(dentifrice) 등으로 제형화될 수 있다. 그러한 조성물 및 제제내의 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체의 비율은 단위의 중량의 0.1% 내지 60%로 달라질 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체의 투여는 적어도 1주일, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 또는 그 초과의 기간 동안 지속되는 면역 반응을 동물에서 유도할 수 있다. 임의로, 면역 반응은, 최초 주입 후 1개월째, 3개월째, 6개월째, 1년째 또는 그 초과의 기간째에 1회 이상의 부스터(booster) 주입을 제공함으로써 동물에서 유지될 수 있다. 요망되는 경우, 본 발명의 조성물의 투여 전에, 혹은 투여 후에 혹은 투여와 함께, 보조자극 분자 또는 애쥬번트가 또한 제공될 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 이들의 조합물을 포함하는 본 발명의 조성물은, 사용되는 특정 조성물과 양립할 수 있는 방식으로 그리고 예를 들어 ELISA에 의해 검출되는 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 폴리뉴클레오티드는 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0.001 mg/kg, 0.1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 투여량으로 비비, 침팬지, 개 또는 사람과 같은 포유동물에게 근내 주입될 수 있다. 폴리펩티드 또는 항체는 0.01, 0.05, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 투여량으로 포유동물에게 근내 주입될 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체, 또는 이들의 조합물은 에를리히아 샤핀시스로 감염되지 않는 동물에게 투여되거나, 에를리히아 샤핀시스로 감염된 동물에게 투여될 수 있다. 면역학적 유효량 또는 치료적 유효량은, 에를리히아 샤핀시스 감염의 치료, 개선 또는 예방에 효과적인 양을 개체에 1회 투여로 또는 일련의 투여 중 일부로서 투여하는 것을 의미한다. 조성물내의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체의 특정 투여량은 비제한적으로 종, 연령, 성별, 동반 약물투여, 그러한 조성물이 투여되는 포유동물의 전반적 상태, 및 그러한 조성물의 투여 방식을 포함하는 다수의 인자에 좌우된다. 본 발명의 조성물의 유효량은 정례적 실험만을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 다른 학술 또는 기술 문헌은 그 전문에 참조로 포함된다. 본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 적절하게는, 본 명세서에 구체적으로 기재되어 있지 않은 임의의 요소(들), 제한(들)없이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 명세서에서 각각의 경우, "포함하는", "필수 성분으로 하는" 및 "구성된"이라는 용어는 그 통상의 의미를 유지하며 나머지 두 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어와 표현은 제한이 아닌 설명을 위한 용어로서 사용된 것이고, 그러한 용어와 표현을 사용함에 있어서 제시되고 설명된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 일부를 제외시킬 의도가 없지만, 다양한 변형이 특허청구된 본 발명의 범위내에서 가능한 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명이 구체예에 의해 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기재된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변화가 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 그러한 변형 및 변화가 상기 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다고 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹(Markush group) 또는 그 밖의 택일적 기재에 의하여 기술된 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 개개의 구성원에 의해 또는 그러한 그룹의 구성원들의 하위그룹(subgroup)에 의해 또한 기술된다는 것을 인지할 것이다.
실시예
실시예 1
직접 ELISA 검정 플레이트 및 프로토콜
SEQ ID NO:5 및 6에 제시된 폴리펩티드를 BSA에 컨쥬게이션시키고, 그러한 컨쥬게이트를 IMMULON? 4 플레이트 위에 코팅하였다. 코팅 완충액은 0.05M 탄산나트륨 (pH 9.6)이었다. 웰 당 100 uL의 희석된 폴리펩티드를 피펫에 의해 플레이트 위로 전달하였다. 플레이트에 덮개를 하고, 2℃ 내지 8℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 폴리펩티드 용액을 플레이트로부터 흡출하고, 플레이트를 HW PetChek? 세척 완충액 (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook ME)으로 4회 세척하였다. 웰 당 0.1M Tris (pH 7.6) 중의 1% BSA 300 uL를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트에 덮개를 하고 실온에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. BSA를 흡출하고, 웰 당 0.1M Tris (pH 7.6) 중의 2.5% 수크로오스 300 uL를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트에 덮개를 하고 2℃ 내지 8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 수크로오스를 플레이트로부터 흡출하고, 플레이트를 가볍게 두드려서 잉여 액체를 제거하였다. 플레이트를 진공 챔버에서 4시간 동안 건조시켰다. 플레이트를 이중 플라스틱 백(plastic bag)내에서 건조제(desiccant)와 함께 2℃ 내지 8℃에서 보관하였다.
SEQ ID NO:1 및 2에 제시된 폴리펩티드를 HRPO에 컨쥬게이션시켰다. 희석된 폴리펩티드:HRPO를 각각의 웰에 첨가하고 (100 uL/웰), 대조군과 혈청 샘플 (순수한(neat) 상태)을 첨가하였다 (50 uL/웰). 에를리히아 샤핀시스에 대한 양성 대조표준을 음성 대조표준과 함께 사용하였다. 플레이트를 아주 가볍게 두드리고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 HW PetChek? 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 웰 당 100 uL의 TMB 기질을 웰에 첨가하고, 플레이트를 10분간 인큐베이션시켰다. 웰 당 50 uL의 정지 용액을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 A650에서 판독하였다. 음성 컷오프(cutoff)를 2 x 음성 대조표준 O.D. 값으로서 측정하였다.
실시예 2
간접 ELISA 검정 플레이트 및 프로토콜
SEQ ID NO:4, 5 및 6으로 제시된 폴리펩티드를 Immulon? 1 플레이트 위에 코팅하였다. 코팅 완충액은 코팅 완충액은 0.05M 탄산나트륨 (pH 9.6)이었다. 웰 당 100 uL의 희석된 펩티드를 플레이트에 첨가하고, 플레이트에 덮개를 하여 실온(RT)에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 폴리펩티드를 플레이트로부터 흡출하고, 플레이트를 HW PetChek? 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 웰 당 0.1M Tris (pH 7.6) 중의 2% TWEEN? (폴리소르베이트) 20/2.5% 수크로오스 200 uL를 웰에 첨가하고, 플레이트에 덮개를 하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 용액을 흡출하고, 플레이트를 가볍게 두드려서 잉여 액체를 제거하였다. 플레이트를 마일라 백(mylar bag)내에서 6 플레이트 당 2개 (27g) 건조제를 사용하여 실온에서 밤새 건조시켰다. 플레이트를 2℃ 내지 8℃에서 보관하였다.
희석된 대조표준과 혈청 샘플을 웰 당 100 uL로 피펫에 의해 웰내로 전달하였다. 에를리히아 샤핀시스에 대한 양성 대조표준을 음성 대조표준과 함께 사용하였다. 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 HW PetChek? 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 웰 당 100 uL의 희석된 토끼 항-개:HRPO를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 HW PetChek? 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 웰 당 50 uL의 TMB 기질을 플레이트에 첨가하고, 10분간 인큐베이션시켰다. 웰 당 50 uL의 정지 용액을 첨가하였다. 플레이트를 A650에서 판독하였다. 음성 컷오프를 2 x 음성 대조표준 O.D. 값으로서 측정하였다.
간접 (α 종) 및 직접 (Ag:Ag) 검정 포맷에 대한 최종적인 최적 플레이트 조건이 표 1에 제시되어 있다.
분석물 펩티드 간접 검정 포맷 직접 검정 포맷
코팅
[ug/ml]		 샘플
희석도		 컨쥬게이트 희석도 코팅
[ug/ml)		 컨쥬게이트
[ug/ml]
에를리히아 샤핀시스 VLPT-1 1.0 1:50 1:1000 1.0 0.5
에를리히아 샤핀시스 VLPT-R 0.15 1:100 1:1000 na na
실시예 3
VLPT 폴리펩티드 검정
VLPT-I (SEQ ID NO:5)와 VLPT-2 (SEQ ID NO:6)를 상기 설명된 바와 같이 간접 검정에서 사용하여, 에를리히아 샤핀시스에 감염된 개와 감염되지 않은 개에서 에를리히아 감염을 검출하였다. 표 2에 있는 양성 샘플 ("(+)"로 표시되어 있음)은 에를리히아 샤핀시스에 대해 양성이지만 에를리히아 카니스에 대해서는 음성인 현장 샘플(field sample)이었다. 샘플 희석도는 1:100이었고, 토끼 항-개 항체 희석도는 1:2000이었다. 결과는 표 2에 제시되어 있다. VLPT-1 및 VLPT-2는 양성 대조표준에서 에를리히아 샤핀시스를 정확하게 검출하였고, 음성 샘플과 음성 대조표준에 대해서는 양성 결과를 제공하지 않았다. VLPT-1은 7개의 양성 샘플 중 6개에서 양성 결과를 나타내었다. VLPT-2는 7개의 양성 샘플 중 5개에서 양성 결과를 나타내었다.
Figure 112010025584313-pct00003
VLPT-1 (SEQ ID NO:5)과 VLPT-2 (SEQ ID NO:6)를 상기 설명된 바와 같이 직접 검정에 사용하여, 에를리히아 샤핀시스에 감염된 개와 감염되지 않은 개에서 에를리히아 감염을 검출하였다. 표 3에 있는 양성 샘플 ("(+)"로 표시되어 있음)은 에를리히아 샤핀시스에 대해 양성이지만 에를리히아 카니스에 대해서는 음성인 현장 샘플이었다. 플레이트를 0.5 및 1.0 ug/ml로 코팅하고, 폴리펩티드:HRPO를 0.5 및 1.0 ug/ml로 시험하였다. VLPT-1 및 VLPT-2는 양성 대조표준에서 에를리히아 샤핀시스를 정확하게 검출하였고, 음성 샘플과 음성 대조표준에 대해서는 양성 결과를 제공하지 않았다. VLPT-1와 VLPT-2는 둘 모두 6개의 양성 샘플 중 6개에서 양성 결과를 나타내었다.
Figure 112010025584313-pct00004
VLPT-1 (SEQ ID NO:5)를 상기 설명된 바와 같이 직접 검정에 사용하여 에를리히아 카니스 백신접종된 개 샘플을 검정하였다. 이러한 검정은 VLPT-1이 에를리히아 카니스 백신접종된 개에서 양성 결과를 제공하는 지의 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 2차 부스터 백신접종 후에 개로부터 시험 샘플을 채취하였다. 플레이트를 1.0 ug/ml로 코팅하고, 폴리펩티드:HRPO를 0.5 ug/ml의 농도로 사용하였다. SNAP? 4Dx? 검정을 사용하여, 백신접종된 개에서 항-에를리히아 카니스 항체 반응이 유도됨을 밝혀내었다. 이러한 검정은 심장사상충 항원, 에를리히아 카니스 항체, 보렐리아 부르그도르페리 항체 및 아나플라스마 파고사이토필룸 항체를 스크리닝한다. 결과는 표 4에 제시되어 있다. SNAP? 4Dx? 시험에서 에를리히아 카니스 항체에 대한 양성 결과는 항체 반응이 백신접종 후에 유도되었음을 나타낸다. VLPT-1는 직접 검정에서 에를리히아 카니스 백신접종된 개로부터의 샘플로 시험된 경우 양성 결과를 제공하지 않는다. 따라서, VLPT-1 (SEQ ID NO:5)은 에를리히아 샤핀시스 감염에 대해 특이적이고, 에를리히아 카니스 백신접종된 개로부터의 혈청과는 반응하지 않는다.
Figure 112010025584313-pct00005
VLPT-1 (SEQ ID NO:5)과 VLPT-R (112번 위치의 X가 P인 SEQ ID NO:4)을 상기 설명된 바와 같이 간접 검정에서 사용하여, 실험적으로 에를리히아 카니스로 감염된 개 샘플을 검정하였다. 이러한 검정은 VLPT-1과 VLPT-R이 에를리히아 카니스로 감염된 개에서 양성 결과를 생성시키는 지의 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 플레이트를 0.15 ug/ml (VLPT-R) 그리고 1 ug/ml (VLPT-1)로 코팅하였다. 샘플 희석도는 VLPT-R에 대해 1:100이었고, VLPT-1에 대해 1:50이었다. 토끼 항-개:HRPO 컨쥬게이트를 1:1000의 희석도로 사용하였다. 결과는 표 5에 제시되어 있다.
Figure 112010025584313-pct00006
대체로, VLPT-1 (SEQ ID NO:5)과 VLPT-R (112번 위치의 X가 P인 SEQ ID NO:4)은 에를리히아 카니스로 감염된 개로부터의 샘플로 시험된 경우 양성 결과를 제공하지 않는다. 그러나, VLPT-R과 VLPT-1은 둘 모두 장기적 시점에서 약간 상승된 수준을 나타내는 하나의 샘플을 지닌다. 그러나, 이러한 양성 신호는 양성 대조표준에 비해 약했고, 그러한 신호는 에를리히아 카니스와의 교차 반응이 실제로 일어난 경우에 예측되는 바와 같이 백신접종 후 시간 경과에 따라 증가하지 않았다. 따라서, VLPT-1와 VLPT-R은 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적이고 에를리히아 카니스에 대해서는 특이적이지 않다.
VLPT-1 (SEQ ID NO:5)와 VLPT-R (112번 위치의 X가 P인 SEQ ID NO:4)을 간접 검정에서 사용하여, 감염후의 수 가지 시점에서 실험적으로 에를리히아 샤핀시스로 감염된 개로부터의 혈청을 시험하였다. 플레이트를 VLPT-R에 대해서는 0.15 ug/mL로 코팅하고, VLPT-1에 대해서는 1 ug/mL로 코팅하였다. VLPT-R에 대한 샘플 희석도는 1:100이었고, VLPT-1에 대해서는 1:50이었다. 토끼 항-개:HRPO를 1:1000의 희석도로 사용하였다. 결과는 표 6 그리고 도 1a와 1b에 제시되어 있다. VLPT-R과 VLPT-1은 둘 모두 적어도 감염후 7일째까지 에를리히아 샤핀시스를 검출할 수 있었다.
Figure 112010025584313-pct00007
VLPT-1를 직접 검정에 사용하여, 에를리히아 카니스는 발견되지만 에를리히아 샤핀시스는 존재하지 않는 아리조나(Arizona) 지역의 개로부터의 공지된 양성 및 음성 현장 혈청 샘플을 시험하였다. 플레이트를 1 ug/mL로 코팅하고, 펩티드:HRPO를 0.5 ug/mL의 농도로 사용하였다. 결과는 표 7에 제시되어 있다. VLPT-1은 에를리히아 카니스 양성 샘플 또는 에를리히아 카니스 음성 샘플에 대해 양성 결과를 나타내지 않았다. 따라서, VLPT-1은 에를리히아 샤핀시스 항체에 대해 특이적이고, 에를리히아 카니스 항체에 대해서는 특이적이지 않다.
Figure 112010025584313-pct00008
SEQUENCE LISTING <110> O'Connor, Thomas P Slauenwhite, Jill Krah, Eugene R <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF EHRLICHIA CHAFFEENSIS (VLPT) <130> 07-885-US <150> 60/974,196 <151> 2007-09-21 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X can be any amino acid <400> 1 Xaa Ser Asp Leu His Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Leu Xaa Xaa Pro Ser 1 5 10 15 Lys Glu Glu Val Gln Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X can be any amino acid <400> 2 Asp Ser Asp Leu His Gly Xaa Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser 1 5 10 15 Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X can be any amino acid <400> 3 Asn Ser Asp Leu His Glu Xaa Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser 1 5 10 15 Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr 20 25 30 <210> 4 <211> 177 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (112)..(112) <223> X can be any amino acid <400> 4 Met Ser Gln Phe Ser Glu Asp Asn Ile Gly Asn Ile Gln Met Pro Phe 1 5 10 15 Ser Asn Leu Gln Glu Ser Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu 20 25 30 Lys Val Ile His Leu Glu Ser Gly Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp 35 40 45 Ser His Glu Pro Ser His Leu Glu Leu Pro Ser Leu Ser Glu Glu Val 50 55 60 Ile Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Asp Leu His 65 70 75 80 Gly Ser Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Phe Lys Glu Ala Val Gln 85 90 95 Leu Gly Asn Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asp Ser Asp Leu His Gly Xaa 100 105 110 Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu 115 120 125 Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe 130 135 140 Val Glu Leu Pro Gly Pro Ser Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp 145 150 155 160 Ala Lys Asn Val Val Tyr Gly Gln Asp His Val Ser Leu Ser Glu Leu 165 170 175 Gly <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <400> 5 Cys Asp Ser Asp Leu His Gly Pro Phe Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro 1 5 10 15 Ser Lys Glu Glu Val Gln Leu Glu Ser Asp Leu Gln Gln Ser Ser Asn 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Ehrlichia chaffeensis <400> 6 Cys Asn Ser Asp Leu His Glu Ser Ser Phe Val Glu Leu Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ser Lys Glu Glu Val Gln Phe Glu Asp Asp Ala Lys Asn Val Val Tyr 20 25 30

Claims (23)

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  6. (a) 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:2, 3, 5 또는 6을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 정제된 폴리펩티드가 50개 미만의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된 것인 단계; 및
    (b) 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하여, 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재함을 나타내고, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 없다는 것은 에를리히아 샤핀시스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하지 않음을 나타내는, 시험 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 (b)를 수행하기 전에, 단계 (a)의 복합체를 지시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5를 포함하고, 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis) 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 검출하지 않는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 시험 샘플내의 항체량이 측정되는 방법.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 정제된 폴리펩티드가 기질에 부착되어 있는 방법.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 정제된 폴리펩티드가 지시약, 아미노산 스페이서, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 이종 단백질, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 또는 6을 포함하는 하나 이상의 추가의 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물에 결합되어 있는 방법.
  12. 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염을 검출하기 위한 정제된 폴리펩티드 로서, 상기 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2, 3, 5 또는 6을 포함하고, 50개 미만의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된, 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염을 검출하기 위한 정제된 폴리펩티드.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5이고, 상기 피검체내의 에를리히아 카니스 감염은 검출하지 않는 정제된 폴리펩티드.
  14. SEQ ID NO:2, 3, 5 또는 6으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항원-결합성 항체 단편, 또는 단일 사슬 항체인 항체.
  16. (a) 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:2, 3, 5 또는 6으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 검출하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드가 샘플에 존재함을 나타내는, 샘플에서 에를리히아 샤핀시스 폴리펩티드를 검출하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5이고, 샘플내의 에를리히아 카니스 폴리펩티드는 검출하지 않는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항원-결합성 항체 단편, 또는 단일 사슬 항체인 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 항체가 기질에 부착되어 있는 방법.
  20. (a) 인간이 아닌 피검체에서 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 SEQ ID NO:2, 3, 5 또는 6을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 상기 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계로서, 상기 정제된 폴리펩티드가 50개 미만의 연속적인 천연 에를리히아 샤핀시스 아미노산으로 구성된 것인 단계;
    (c) 상기 폴리펩티드/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하여, 인간이 아닌 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염을 검출하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 인간이 아닌 피검체가 에를리히아 샤핀시스에 감염되었음을 나타내는, 인간이 아닌 피검체에서 에를리히아 샤핀시스 감염을 검출하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5이고, 상기 피검체내의 에를리히아 카니스 감염은 검출하지 않는 방법.
  22. 제 12항에 있어서, SEQ ID NO: 3에서 X는 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro)이고, SEQ ID NO:2에서 X는 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro)인, 정제된 폴리펩티드.
  23. 제 12항에 있어서, SEQ ID NO: 3에서 X는 세린(Ser)이고, SEQ ID NO:2에서 X는 세린(Ser)인, 정제된 폴리펩티드.
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